CN105246495A - 来自非哺乳动物组织的脱细胞化的生物材料 - Google Patents

Abstract

有尾目动物胞外基质(ECM)和伴随的皮肤组织的生长因子谱，结缔组织基质成分以及免疫豁免状态，加上其中抗微生物肽的存在，使得有尾目动物来源的组织成为用于异种移植的生物学骨架的理想来源。特别地，可通过以下方法获得生物学骨架生物材料，所述方法包括(A)从有尾目动物获得组织样品，其中所述组织包含ECM，包括基膜，以及(B)使所述组织样品进行脱细胞化过程，从而通过保留其纤维状蛋白质和非纤维状蛋白质、糖胺聚糖(GAG)和蛋白聚糖而维持胞外基质的结构和功能完整性，同时出于异种移植目的充分除去样品的细胞成分以降低或消除抗原性和免疫原性。所得有尾目动物来源的生物材料可用于增强皮肤稳态的恢复，降低手术后炎症的严重性、持续时间以及由其引起的相关损害，以及促进自然愈合和再生过程的进展。此外，所述生物材料促进了在质量、功能以及顺应性方面与未损害的人组织相当的重塑组织的形成。

Description

来自非哺乳动物组织的脱细胞化的生物材料

相关申请的交叉引用

本申请根据35USC§119(e)要求于2013年1月9日提交的美国临时申请61/750,555的权益，其全部内容通过引用以其整体并入本文。

发明背景

正在进行组织工程学努力以产生用于替代生物学功能，通常是修复或替代整个组织或其一部分的方法和材料。在这点上，伤口处理和皮肤修复是主要关注的领域，因为由于疾病或损伤造成的皮肤完整性的损失可导致慢性的危及生命的并发症。

伤口愈合涉及细胞、生长因子和胞外基质(ECM)成分之间复杂的相互作用，以在损伤后重构组织。已经很好地表征了成年哺乳动物组织中的伤口愈合过程，其可以被分为三个阶段-炎症、增殖和重塑。

通常，响应于切口或创伤，身体输送血液、血液制品以及蛋白质到伤口处形成的空隙(void)(也称为腔或负空间(negativespace))中。在早期的炎症期间，在炎症介质的影响下以及由于血管舒张，伤口渗出物开始形成。存在于凝结血液中的血纤蛋白和纤连蛋白提供骨架(scaffold)，在该骨架之上，细胞(例如角质形成细胞、血小板和白细胞)迁移到伤口部位。吞噬并除去细菌和碎片，并且释放出刺激成纤维细胞迁移和分裂的生长因子。

随后的伤口愈合阶段涉及随着称为肉芽组织(由成纤维细胞、巨噬细胞和新血管构成)的纤维结缔组织替代血纤蛋白凝块，新组织形成。在这个阶段期间，新血管形成，成纤维细胞增殖并通过分泌胶原蛋白和纤连蛋白产生临时ECM。几乎所有的哺乳动物细胞都需要粘附到表面以使得增殖并正确地发挥功能。ECM实现了这一功能。最初，临时ECM包含III型胶原蛋白(一种迅速产生的较弱形式的胶原蛋白)的网络。随后其被更强的I型胶原蛋白(其有助于瘢痕形成)所替代。与此同时，发生表皮的再上皮化。在此过程中，上皮细胞增殖并由于在迁移细胞前缘的蛋白酶(例如金属蛋白酶(MMP))和胶原酶帮助侵入凝块而迁移到新形成的组织之上。除了生长因子信号转导(细胞-细胞相互作用)和细胞-ECM相互作用(来自细胞、整合素(细胞表面受体)、层粘连蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白和其他ECM蛋白质之间相互作用的信号转导)，这些酶还刺激细胞迁移进入伤口以及ECM降解。

最后，在重塑阶段中，胶原蛋白被重塑并沿着张力线(tensionline)重新排列，并且通过凋亡除去不再需要的细胞。随着成纤维细胞通过其与ECM蛋白和生长因子的相互作用转化为肌成纤维细胞，发生伤口收缩。然后，肌成纤维细胞与胶原蛋白、玻连蛋白和其他ECM蛋白相互作用以收缩伤口。随着重塑阶段的进行，纤连蛋白和透明质酸被向组织提供强度的胶原蛋白束所替代。

通过对组织修复和再生应用生物学、化学和工程学的原理，组织工程师们已经开发出用于促进组织修复和再生过程的可移植产品。恢复受损组织的生物力学功能的能力提出了真正的挑战。作为回应，已经开发出模拟(在一定程度上)组织结构和机械特性的合成和生物学骨架产品两者以促进组织修复。对于受损的、病变的或缺失的组织，这样的产品充当机械上和功能上的临时替代物。

理想地，可移植骨架产品应支持细胞粘附、增殖和分化，并在新的组织形成之前作为细胞临时的合成胞外基质(ECM)起作用。骨架材料应为生物相容的、生物可降解的且表现出低的抗原性。植入物应该以与新组织形成大致相等的速率降解。一旦被植入，骨架必须具有临时提供结构支持所必需的机械性能，直到形成新的组织。此外，骨架产品必须是多孔的，从而为营养物传输和组织向内生长提供合适的路径。组织骨架还应促进快速愈合并促进在外观和功能上均类似于正常宿主组织之新组织的发育或再生。为此，植入的骨架产品应该提供(i)生物活性刺激，例如，蛋白质和分子信号转导以促进细胞迁移、增殖和分化，和(ii)用于这些过程的机械或结构支持。

现今，合成骨架的开发是一个活跃的研究领域。已由化合物(例如纤维状聚合物、明胶、磷灰石、和聚合物/陶瓷复合物、聚乳酸、胶原蛋白)制造了合成骨架。这些骨架被设计为模拟天然存在的ECM的结构并在骨组织工程方面显示出一些成功。

除了合成骨架产品之外，获自哺乳动物组织的生物学骨架是市售的，其可用作同种异体移植物(来自相同物种供体的移植细胞或组织)或异种移植物(来自不同物种供体的移植细胞或组织)。生物学骨架由哺乳动物ECM构成，所述哺乳动物ECM是从例如多种哺乳动物包括人(活体供者或尸体)、猪、牛和马的真皮、膀胱、小肠、间皮、心包、骨或羊膜(aminioticmembrane)中收获的。这些市售产品通常用于修复和重建受损的或缺失的组织和器官，例如软组织、腱、心脏组织、神经组织、慢性伤口、硬脑膜、骨和角膜。

除了由组织产生并进行脱细胞化过程的胞外基质，生物学骨架产品还可包含皮肤细胞。其与伤口部位接触以对作为伤口愈合过程一部分的细胞迁移和增殖提供机械支持。此外，也可提供促进伤口愈合过程的因子，例如生长因子或其他蛋白质。认为生物学骨架的机械和材料性能以及宿主组织对这些生物材料的响应受到材料的三维构型和生产加工方法的影响。还认为生长因子、表面配体的表面拓扑结构和分布以及宿主先天免疫应答的调节都有助于用于组织修复或重建的生物学骨架的最终功能表现。Tottey等，Biomaterials32：128-36(2011)。

在移植中使用人羊膜(AM)具有特别的优势，原因是其相对厚的基膜结构，相关的失活(devitalize)羊膜上皮细胞和基质以及相应的生长因子谱和结构蛋白质组成。Meller等，DtschArzteblInt′1108：243-8(2011)。例如，AM包含表皮生长因子(EGF)和角质形成细胞生长因子(KGF)，这是用于促进伤口愈合的重要生长因子。此外，存在于AM中的层粘连蛋白和VII型胶原蛋白引起趋上皮效应。AM也被认为降低多种生长因子和促炎性细胞因子的表达，同时释放抗炎性细胞因子(例如IL-10、IL-1受体拮抗剂)，从而调节对于伤口愈合有利的炎症反应。AM是免疫豁免的(immumoprivileged)，而且，有可能由于低的MHCI表达，所以AM组织的排斥是罕见的。这些特征使得AM成为例如关于眼表重建、骨盆重建以及在溃疡的治疗，尤其是伤口愈合应用中的理想基材(substrate)。

然而，常规的组织骨架产品的使用也并不是没有缺点。从人供体收获的组织可产生不希望的后果，例如与用于捐献之皮肤的移除相关的供体部位的发病或感染。疾病传播风险和样品间的变化是与生物学骨架产品相关的另外的缺点。此外，可能难以获得覆盖大面积受损组织所必需的充分的组织成分。另外，常规的生物学材料和合成材料可能成本昂贵，在许多情况下没有效果并且可用性有限。

因此，持续需要在移植中使用的合适的组织基材生物材料以促进组织再生，同时恢复功能。研究行业和医学移植界两者都将受益于这样的产品，这样的产品易于获得，不对供体或接受者造成额外的并发症(例如需要额外的手术来收获基材)，并表现出反映自然组织之生理化学、电化学和生物化学特性的所有或一些固有材料功能。

发明内容

本发明的生物材料是从有尾目动物(urodele)的组织获得的。“有尾目动物”在这里表示两栖纲中的有尾目(orderUrodela)(也称为orderCaudata)的蝾螈(salamander)。按照系统发生，相关的科包括钝口螈科(Ambystomatidae)、隐鳃鲵科(Cryptobranchidae)、两栖鲵科(Amphiumidae)、洞螈科(Proteidae)和鳗螈科(Sirenidae)。参见Wiens等，Syst.Biol.54：91-110(2005)，其内容通过引用以其整体并入全文。因此，有尾目动物种类包括，例如，太平洋大鲵(PacificGiantSalamander)(中国大鲵(Andriasdavidianus))、虎纹钝口螈(Ambystomatigrinum)以及墨西哥钝口螈(Ambystomamexicanum)。本发明人已经认识到有尾目动物的皮肤和ECM具有类似于AM特征的所期望的特征，这使得它们成为用于异种移植之生物材料的一种理想来源。

有尾目动物ECM和组织再生

作为两栖动物，大多数有尾目动物在幼体状态以水生动物开始生活，并经历从具有鳃的幼年形式到具有肺的陆生的呼吸空气的成体形式的变态。在变态过程中，有尾目动物的身体特征改变以准备在陆地上生活。这些改变包括尾鳍的再吸收、皮肤的增厚、真皮腺体的发育和鳃的吸收。在此期间在大多数有尾目动物中也发生性成熟。一些科的有尾目动物是“幼态持续的”，这意味着，这样科中的个体可表现出幼体特征，例如鳃和鳍，甚至是在达到性成熟后亦如此。事实上，幼态持续的有尾目动物在其生命的整个时期内往往保留其水生的(幼体的)形式。因此，墨西哥蝾螈(MexicanAxolotl)通常在其整个成体生活中保持幼态持续状态，但是，在某些情况下，其可经历变态并转变成陆生形式。

蝾螈还因其再生切断的身体部位的能力而闻名，这通常导致受损肢体或器官的结构和功能两者的完全恢复。水生蝾螈在伤口愈合和肢体再生期间(这两者都是无瘢痕过程(scar-lessprocess))经历迅速的再上皮化。类似地，变态的陆生蝾螈保留许多幼体的皮肤特征，并且还表现出无瘢痕的伤口愈合，尽管愈合速率比其水生的预变态的对应体要慢。

在蝾螈中的愈合过程与在成年哺乳动物中观察到的不同。蝾螈的过程更类似于胎儿和胚胎伤口的无瘢痕愈合过程。因此，这样的伤口也表现出以比出生后的哺乳动物的相应事件以更快的速率(是“增强的”)发生的再上皮化和基膜再形成(reformation)。

此外，就蝾螈的皮肤由融合的外胚层的中胚层构成方面而言，蝾螈的皮肤和皮下结构类似于羊膜/绒毛膜界面的结构。蝾螈的皮肤也富含生长因子和抗微生物肽，类似于AM。此外，蝾螈ECM是免疫豁免的，并且尤其包含胶原蛋白III和金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)，也类似于AM。

更一般地，对于移植目的特别重要的是人类新生儿(例如，胎儿真皮)和AM的免疫学豁免状态(一种通过蝾螈ECM反映的状态)，因此很少表现免疫原性。由于与成年人相比降低的免疫应答和普遍降低的炎症反应，新生儿和蝾螈皮肤愈合同样地不以如在成人伤口愈合中观察到的加速组织吸收为特征。相反，在伤口愈合期间，除了增强的再上皮化，有尾目动物和新生儿组织的生长因子谱、酶活性、结构组成和免疫调节作用同样地有利于适当地分阶段地移除结构骨架以及使组织生长到所产生的负空隙空间中。这导致了最佳的伤口愈合环境和过程。另外，存在于AM和有尾目动物组织中的高浓度抗微生物肽还有助于在伤口愈合期间观察到的有利的环境以及增强的再上皮化。

本发明的一个关键方面是本发明人认识到有尾目动物ECM和伴随的皮肤组织的生长因子谱、结缔组织基质成分以及免疫豁免状态，加上其中抗微生物肽的存在，使得有尾目动物来源的组织成为用于异种移植的生物学骨架的理想来源。

因此，根据本发明，提供了生物学骨架生物材料，所述生物材料为以下方法的产物，所述方法包括(A)从有尾目动物获得组织样品，其中所述组织包括ECM，包含基膜，以及(B)使所述组织样品进行脱细胞化过程，所述脱细胞化过程通过保留其纤维状蛋白质和非纤维状蛋白质、糖胺聚糖(glycoaminoglycan，GAG)和蛋白聚糖而维持了胞外基质的结构和功能完整性，同时出于异种移植目的充分除去了样品的细胞成分以降低或消除抗原性和免疫原性。还提供了使用有尾目动物来源的生物材料的方法，以增强皮肤稳态的恢复、降低手术后炎症的严重性、持续时间以及由其引起的相关损害，以及促进自然愈合和再生过程的进展。此外，本发明的生物材料促进了在质量、功能以及顺应性方面与未损害的人组织相当之重塑组织的形成。

脱细胞化

本发明的生物材料是通过使从有尾目动物获得的组织样品脱细胞化而产生的。所得有尾目动物生物材料的主要成分是ECM，可能具有失活的上皮细胞，其可以保持水分并且以其他方式保护伤口愈合的环境。

有尾目动物皮肤是用于本发明的合适的原材料的一个实例。因此，进行脱细胞化的原材料可包括具有或不具有表皮的有尾目动物真皮和基膜。而且，即使在脱细胞化后，本发明的生物材料可包括与ECM一起的可以通过该过程变得无活力的相邻上皮细胞。或者，非皮肤的有尾目动物组织可充当本发明的原材料，特别是包含形成多种体腔内衬的基膜或上皮组织的那些，即，例如在胸腔、腹腔和心包中发现的壁间皮组织(parietalmesothelialtissue)。含有大量纤维结缔组织的组织(例如软骨、腱、骨、硬脑膜和筋膜)也都是本发明合适的原材料的实例。

通过任何常规的脱细胞化的方法来实现，对有尾目动物组织进行脱细胞化以除去免疫原性的细胞抗原(其可诱导炎症反应或免疫介导的组织排斥)，同时保留相关ECM的结构完整性和组成。通常，在脱细胞化后，其中许多(如果不是全部的话)均保持完整的ECM结构组分被异种接受者良好地耐受。可存在于本发明最终生物材料中的ECM成分包括蛋白质例如胶原蛋白(例如，纤维状胶原蛋白I和胶原蛋白III以及非纤维状胶原蛋白IV、胶原蛋白V和胶原蛋白VII)、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、血小板反应蛋白(thrombosponsdin)、骨桥蛋白和生腱蛋白，加上GAG(例如，蛋白聚糖、核心蛋白聚糖(decoran)和多功能蛋白聚糖以及硫酸化的GAG例如硫酸肝素、硫酸角质素、硫酸皮肤素和硫酸软骨素)以及生长因子(例如VEGF、BMP、TGF和FGF)。对于一些适应症，当通过组织学和免疫组织染色观察时，脱细胞化后的材料包含大约为脱细胞化前水平之量的至少胶原蛋白IV、层粘连蛋白、硫酸化GAG和一种或更多种生长因子。

依照本发明，用于使组织脱细胞化的合适的技术包括物理方法，例如冷冻、直接加压、超声和搅拌。另外地或在替代方案中，可采用化学方法，例如碱和酸处理，施加洗涤剂(包括两性、阳离子、阴离子和非离子型洗涤剂)、有机溶剂、低渗或高渗溶液和螯合剂。包括蛋白酶消化以及用一种或更多种核酸酶处理的酶促方法也可用于使有尾目动物组织脱细胞化。另外地或替代地，对有尾目动物组织进行清洗、灭菌、消毒、抗生素处理和/或病毒灭活。

根据本发明的一个方面，提供了生物材料。所述材料通过包括以下的方法产生：(A)从有尾目动物获得组织样品，所述组织样品包含胞外基质，以及(B)使所述样品脱细胞化以保持结构和功能完整性，同时充分除去样品的细胞成分，以降低或消除生物材料作为异种移植物的抗原性。在一些实施方案中，脱细胞化包括对所述组织样品进行碱处理。在一些实施方案中，所述方法还可包括对所述样品进行灭菌。在一些实施方案中，所述方法还可包括使细胞失活。

根据本发明的一个方面，提供了组织移植物。所述移植物包含来源于有尾目动物的胞外基质成分。在一些实施方案中，所述胞外基质成分基本上不合当作为异种移植物植入时诱导免疫应答的成分。在一些实施方案中，所述胞外基质成分无毒。

根据本发明的一个方面，提供了脱细胞化的有尾目动物ECM。在任何实施方案中，脱细胞化的ECM可来源于蝾螈组织。在任何实施方案中，脱细胞化的ECM可包含基膜。在任何实施方案中，可用对有尾目动物来说为异种的物质(agent)注入(infuse)脱细胞化的ECM、可用对有尾目动物来说为异种的物质包被脱细胞化的ECM、可用对有尾目动物来说为异种的物质与脱细胞化的ECM组合有或者使脱细胞化的ECM共价地或非共价地附着至对有尾目动物来说为异种的物质。在任何实施方案中，所述物质可以是生长因子、细胞因子、趋化因子、蛋白质、碳水化合物、糖、类固醇、抗微生物剂、合成聚合物，粘合剂、药物和/或人的物质(humanagent)(即，在人中发现的分离的，合成或重组产生的物质)中的任意一种或任意组合。此外，在下文中更详细地描述了形成本发明一部分的这些物质。在一些实施方案中，所述物质是细胞，任选人细胞。在一些实施方案中，所述物质是祖细胞，任选人祖细胞。此外，在下文中更详细地描述了形成本发明一部分的这些细胞。在任何实施方案中，脱细胞化的ECM可呈现任何多种形状，因为材料可以成形、层压、均化、凝胶化等。在一些实施方案中，ECM是片(sheet)。所述片任选地可包含穿孔。所述片任选地可包含背衬和/或粘合剂。所述背衬可以是生物可降解的或可以是不可生物降解的。在一些实施方案中，所述脱细胞化的ECM是干粉。在一些实施方案中，所述脱细胞化的ECM是重构凝胶。在任何实施方案中，所述ECM可以是无菌的。

根据本发明的一个方面，提供了包装(package)。所述包装包含无菌、脱细胞化的有尾目动物ECM或来源于无菌、脱细胞化的有尾目动物ECM的有尾目动物级分。所述包装可包含上述的任意ECM。例如，所述包装可包含脱细胞化的有尾目动物ECM的片、干粉或重构凝胶。所述包装可包含任何产品，例如包含无菌、脱细胞化的有尾目动物ECM或来源于无菌、脱细胞化的有尾目动物ECM的有尾目动物级分的任何植入物。这样的植入物的整体或仅一小部分可由本发明的ECM构成。

本发明还提供了无菌的医学植入物，其包含脱细胞化的有尾目动物ECM或来源于脱细胞化的有尾目动物ECM的有尾目动物级分。这样的医学植入物的实例包括生物相容的片、网、凝胶、移植物、栓(plug)、组织或装置。装置包括，例如涂层支架、骨替代物、关节替代物、可植入硬件等。植入物可完全或部分地由ECM来制造。植入物也可以封装本发明的ECM、可用本发明的ECM注入植入物、可用本发明的ECM包被植入物、可用本发明的ECM浸渍植入物、可用本发明的ECM层压植入物、或者将植入物共价地或非共价地附着至本发明的ECM。

本发明还提供了这样的材料，所述材料被分离的、脱细胞化的有尾目动物ECM或来源于分离、脱细胞化的有尾目动物ECM的有尾目动物级分包被、被分离的、脱细胞化的有尾目动物ECM或来源于分离、脱细胞化的有尾目动物ECM的有尾目动物级分浸渍，所述材料封装分离的、脱细胞化的有尾目动物ECM或来源于分离、脱细胞化的有尾目动物ECM的有尾目动物级分或具有附着的分离的、脱细胞化的有尾目动物ECM或来源于分离、脱细胞化的有尾目动物ECM的有尾目动物级分。所述材料可以是天然的或合成的。实例是金属、塑料、陶瓷和纤维。

根据本发明的一个方面，提供了组织培养系统。所述系统包括：(a)分离的脱细胞化的有尾目动物ECM，(b)组织培养基和(c)对有尾目动物来说为异种的细胞。所述细胞可以来自动物，并且在一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。所述细胞可以是任何类型的能够培养的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是人细胞，任选祖细胞。

根据本发明的一个方面，提供了条件化的(conditioned)组织培养基，所述培养基(其可以是在液体组织培养中常用的任何培养基)经分离的脱细胞化的有尾目动物ECM或来源于分离的、脱细胞化的有尾目动物ECM的有尾目动物级分条件化。许多液体组织培养基是市售的并且是本领域普通技术人员公知的。

根据本发明的一个方面，提供了装置。所述装置是分离的脱细胞化的有尾目动物ECM之至少两个彼此层压的片。所述片可来自相同或不同的组织。片可以是定向的，并且可以以相同的方向定向或彼此以一定角度定向。片还可包含对有尾目动物来说为异种的任何物质，所述物质可被包被在一个或更多个层压的片上，可被注入或浸渍在一个或更多个层压的片内，或以其他方式附着至在一个或更多个层压的片。

在上述涉及片的任何实施方案中，所述片还可包含背衬和/或粘合剂。

根据本发明的一个方面，提供了产品。所述产品通过从有尾目动物分离有尾目动物ECM，使所述ECM脱细胞化，并对脱细胞化的ECM灭菌而制备。装置的制备还可包括任何一个或更多个以下的步骤(不以特定的顺序呈现)：使ECM成形，使ECM均化，将ECM层压成材料，将物质与ECM组合，例如通过包被、浸渍或其他方式使物质附着至ECM等等。

根据本发明的一个方面，提供了制备生物材料的方法。所述方法包括(A)从有尾目动物获得组织样品，所述组织样品包含胞外基质，以及(B)使所述样品脱细胞化以充分除去样品的细胞成分，以降低或消除生物材料作为异种移植物的抗原性。在一些实施方案中，所述方法还可包括以充分保持ECM结构和功能完整性的方式进行脱细胞化，以允许所述ECM可用作细胞可在其上和其内生长的基质。在任何实施方案中，所述方法还可包括使ECM均化以形成颗粒或粉末。在一些实施方案中，所述方法还可包括将粉末重构为凝胶。在任何实施方案中，所述方法还可包括使ECM灭菌。在任何实施方案中，所述方法还可包括使ECM附着至对有尾目动物来说为异种的物质。

根据本发明的另一个方面，所述材料(例如植入物、装置、片、凝胶和粉末)可用于治疗对象的方法中，其中通常所述材料被施加至伤口、手术床(surgicalbed)以及内部组织和外部组织，以防止粘连、提供组织支持，例如用于缝合组织，用于治疗疝或作为组织栓，用于治疗烧伤和皮肤擦伤以及如下所述其他病症。

在任何上述的实施方案中，ECM是分离的或可被分离。

附图说明

图1示出了制备用于组织学检查以鉴定EC要素的天然蝾螈组织样品。

图2天然蝾螈真皮组织和人羊膜的苏木精和伊红(H&E)以及爱茜蓝染色(40×放大率)。

图3示出了通过物种特异性的胶原蛋白IV和层粘连蛋白抗体对天然蝾螈真皮组织和人羊膜组织的免疫组织化学染色，40×放大率。

图4描绘了制备用于组织学检查以鉴定EC要素的螈蝾皮肤和人羊膜样品。

图5示出了H&E染色的、成对的天然和处理后的螈蝾真皮组织切片的组织学评估。

图6显示了处理前和处理后螈蝾组织的DNA含量的ELISA数据，以及来自人羊膜组织的比较数据。

具体实施方式

定义

“抗微生物多肽”(或“AMP”)意指具有针对广泛微生物(包括细菌、病毒、真菌、原生动物、寄生物、朊病毒和肿瘤/癌症细胞)之广谱活性的长度、序列和结构可变的小肽(参见，例如，Zaiou，JMolMed，2007；85：317；在此通过引用以其整体并入)。AMP具有广谱的迅速发生的杀伤活性，以及潜在低水平的诱发的抗性和伴随的广泛抗炎作用。抗微生物多肽包括防卫素，例如α-防卫素(例如，嗜中性粒细胞防卫素1、防卫素α1、嗜中性粒细胞防卫素3、嗜中性粒细胞防卫素4、防卫素5、防卫素6)，β-防卫素(例如，β-防卫素1、β-防卫素2、β-防卫素103、β-防卫素107、β-防卫素110、β-防卫素136)和θ-防卫素。抗微生物多肽包括cathelicidin，例如hCAP18。

“生物相容”意指组合物和其体内的正常降解产物在对象中在有用的、实际的和/或可接受的耐受性范围内是基本上无毒和非致癌的。

“细胞相容”意指组合物可维持细胞群的生存力和生长。

“脱细胞化的ECM”意指基本不含细胞成分的胞外基质，以将胞外基质的抗原性消除或降低至其中在基质作为异种移植物时将被视为无毒的程度。

“分离的”在与本发明的ECM结合使用时，意指与其他有尾目动物组织分离。

“无毒的”意指当组合物被植入对象中时，其对体内的细胞和组织产生很少或不产生不良反应或重大伤害，以及对体内的细胞和组织不会产生大量的不良反应或重大伤害，例如，所述组合物不引起坏死、感染或大量的免疫应答，不引起来自植入的或施加的组合物造成的对组织造成的伤害。

“祖细胞”意指在一定条件下可分化成更加分化之细胞类型的细胞。祖细胞的非限制性实例包括干细胞，其可以是全能的、多潜能的、多能干细胞，或称为祖细胞。祖细胞的另外的非限制性实例包括血管周围干细胞、胚基细胞和多谱系祖细胞。

“保留结构和功能完整性”在与本发明的ECM结合使用时，意指保持充分的结构和功能，以允许和支持使用基质作为基材用于体内或体外的细胞生长。

“对象”意指动物。在一些实施方案中，动物是哺乳动物。所述哺乳动物可以是狗、猫、马、牛、山羊、绵羊、猪或非人灵长类动物。在任何实施方案中，所述哺乳动物可以是人。

“治疗”意指通过任何合适的剂量装置、方案和途径以向对象施用或施加组合物，目的在于实现理想的临床/医学目的，例如帮助伤口愈合、组织闭合、膨胀组织，防止组织粘连、给组织提供结构支持、提供保护屏障、校正缺陷等。

“来源于脱细胞化的有尾目动物ECM的有尾目动物级分”意指脱细胞化的有尾目动物ECM的提取物或分离物，其在两个(或三个，或四个，或五个或更多个)化学实体的化学结构和/或相对化学浓度方面，维持提取物或分离物中有尾目动物的充分特征以通过电子显微术、HPLC、免疫组织化学等中的任何一种或更多种方法来区分从有尾目动物获得的提取物。

通用的制备方法

根据本发明，用于脱细胞化而获得的有尾目动物组织样品可以用在US2008/0046095或US2010/0104539中详述的方式进行处理。因此，可以对组织样品进行清洗和化学去污。以这种方式，在室温或接近室温下，在含有18％NaC1(高渗盐水)溶液的无菌槽中将组织样品洗涤约10到30分钟。使用无菌海绵轻轻擦去可见的细胞碎片(例如邻近组织基膜的上皮细胞)以暴露于基膜。也使用钝器、细胞刮刀或消毒纱布除去任何残留的碎片或污染物。其他技术包括但不限制于，冷冻膜，使用细胞刮刀进行物理去除，或者使细胞暴露于非离子型洗涤剂、阴离子洗涤剂并且还可使用核酸酶来除去细胞。

在一个实施方案中，使用碱处理使有尾目动物组织脱细胞化。

将组织放入无菌容器，例如Nalgene广口瓶中，以进行下一步的化学去污。因此，每个容器无菌地填充有18％的盐水溶液并密封(或用顶封闭)。然后将该容器放置在摇床(rockerplatform)上并搅拌30至90分钟，这进一步清除了污染物的组织。

在无菌环境中使用无菌镊子将组织轻轻地从含有18％高渗盐水溶液的容器中移出，并放入空的容器中。然后将该含有所述组织的空容器无菌地填充预先混合的抗生素溶液。优选地，预混合的抗生素溶液是由抗生素(例如硫酸链霉素和硫酸庆大霉素)构成的混合物。其他抗生素(例如硫酸多黏菌素B和杆菌肽，或者现在或将来可用的类似的抗生素)也是合适的。优选地，当添加时抗生素溶液为室温，以便它不会改变组织的温度或以其他方式损害组织。然后密封该含有组织和抗生素的容器或将其封闭，并放置在摇床上且搅拌优选60分钟至90分钟。在抗生素溶液中组织的这种摇摆或搅拌进一步清除了污染物和细菌的组织。

在无菌环境中，打开容器，并使用无菌镊子将组织轻轻移出并放置在含有无菌水或生理盐水(0.9％盐水溶液)的无菌槽中。使得组织在无菌水/生理盐水溶液中适当地浸泡至少10至15分钟。可将组织轻轻搅拌以促进抗生素溶液和任何其他污染物从组织中的去除。

在一些情况下，本发明涉及使用如在和程序中所示出的化学灭菌方法处理有尾目动物组织，任选地与如在系统中轻轻搅拌化学制剂的机械方法组合。因此，对有尾目动物组织进行氧化和/或碱处理以及渗透处理以分解细胞壁、灭活病原体并除去细菌。此外，也可对组织进行脱脂、溶剂脱水(以允许组织在常温下贮存而不损坏胶原蛋白结构)和/或低剂量的γ辐照以确保最终产品的无菌性。

可通过多种已知的手段验证经脱细胞化后有效的细胞去除，包括组织学分析以检测核和细胞质结构，免疫组织化学或免疫荧光测定以指示细胞内蛋白质以及DNA检测。在最终有尾目动物来源的骨架生物材料中，所期望成分的性质根据治疗的临床适应症而不同。一旦鉴定了特定的适应症，知识丰富的临床医师可确定在有尾目动物组织样品中哪些成分应当被保留在最终的骨架产品中，并且可采用标准的方法以确保所期望的成分在脱细胞化后仍存在。

可在脱细胞化之前、期间和/或之后在组织学上观察样品以监测该过程并确认细胞成分去除所达到的期望程度。例如，可以分析组织的细胞骨架含量以评估充分的脱细胞化。也可测定细胞内蛋白质的含量以确定脱细胞化是否充分。另外，可以监测组织样品的厚度和化学组成以确定何时已经达到充分的脱细胞化。在处理过程中的定期监测使得实时响应所观察到的组织性质。

在一些情况下，充分脱细胞化的组织包含每毫克ECM干重不超过50ng的dsDNA。或者，对于一些适应症，充分脱细胞化的组织在用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)或苏木精和伊红(H&E)染色的组织切片中缺乏可见的核材料。

在需要除去相邻上皮细胞层的情况下，可使用本领域已知的技术评估在样品中是否存在剩余的上皮细胞。例如，在除去上皮细胞层后，将来自加工工艺(processinglot)的代表性组织样品放置到标准的显微镜检查载玻片上。然后使用伊红Y染色对组织样品进行染色并如以下所述进行评估。然后将样品覆盖，并使其静置。一旦允许经过足够长的时间进行染色，在放大倍率下进行目视观察。细胞和细胞材料的存在将显得比已经去上皮化的区域更暗。

一旦已经充分地进行了细胞移除，采用常规的方法确认剩余ECM骨架期望的结构和功能特性的保持。应根据最终骨架产品的预期临床应用来进行特定的结构测试。在一些情况下，可以在脱细胞化之前、期间和之后监测有尾目动物组织原材料，以确保在最终产品中维持所期望的结构组分和构型。

用于确定所期望的ECM成分是否存在的一种方法涉及对平行的组织切片进行染色以及对其进行组织学检查以确定有尾目动物组织所期望的组分和结构取向是否已被保存。例如，可用H&E和免疫过氧化物酶对有尾目动物组织的层粘连蛋白进行染色，以评估ECM和层粘连蛋白的保存。一般而言，当通过组织学染色观察时，保留在最终生物材料骨架产品中的ECM成分的三维构型应接近于脱细胞化前材料的三维构型。可以测定的另一成分是AMP，因为本发明的ECM富含AMP。

因此，本发明有尾目动物来源的生物材料包含可用于指导增强的再上皮化并促进有效的组织再生或伤口愈合的ECM成分。本发明的生物材料也用作基质以及生物活性肽(例如生长因子、粘附蛋白和AMP)的贮存库(reservoir)。因此，生物材料有效地起着用于组织再生的生物学骨架的作用，从而提供了必需的生物活性刺激和结构支持两者。所述产品可以这样使用，切成更小的块或形状、层压到其自身或其他材料、预穿刺以提供用于固定附件的开口，使其成为所期望的三维形状以及下面更详细讨论的其他形式。

粉末和凝胶

在一些实施方案中，可将骨架进一步加工成小颗粒或粉末。细小颗粒可以在水、盐水或合适的缓冲液或者培养基中水合以产生糊状物(paste)或者凝胶。可将由其产生的这种细小材料、糊状物或凝胶用于下面更详细描述的多种目的。

虽然存在许多方法，但是可使用两种示例性的方法来产生颗粒形式的骨架。第一种方法涉及将消毒的材料冻干，然后将样品浸入液氮中。然后用搅拌机(blender)将速冻材料变成小块，以使得颗粒足够小以放置在转刀磨(rotaryknifemill)中，如Wiley磨。#60筛可用于将所收集的粉末的尺寸限制到所需的尺寸，例如小于250mm。声频筛或其他分级装置可用于除去较大的颗粒和/或以获得所需范围内的粒度分布。第二种方法与前面的方法类似，不同之处在于将样品先浸泡于30％(w/v)NaCl溶液中5分钟。然后将材料在液氮中快速冷冻以沉淀盐晶体，并冷冻干燥以除去残留水。然后如上所述将该材料粉碎。通过使样品内的NaCl沉淀，预计包埋的盐晶体将导致材料断裂成更均匀尺寸的颗粒。然后将所述颗粒悬浮在去离子水中并以1000rpm离心5分钟，进行三次以除去NaCl。将混悬液再次快速冷冻并冻干。最后，将粉末放置在转刀磨中以解集单个颗粒。

在有或没有其他胶凝材料以补充胶凝的情况下，可将粉末水合以产生凝胶。

可在无需进一步加工的情况下施加粉末、糊状物或凝胶以治疗对象。可将其喷、涂、注射或以其他方式施加至伤口或手术部位。凝胶可以成形。也可将粉末、糊状物或凝胶放置在“包(bag)”内部，例如聚合的合成材料或如本文所述的ECM片内部以产生更大的三维结构，例如用于软骨修复(例如，膝或TMJ软骨修复)的矫形植入物，或者用于乳房重建或增大的植入物。在这种情况下，期望尺寸和形状的包由ECM材料或其他生物相容聚合物材料的片形成，然后用本文所述组织的来源的粉末或凝胶填充所述包或覆盖物。装置或植入物的形状可随着其预期的用途而变化。可在用本文所述的骨架材料填充模塑包之前，通过任何可用的模塑技术将所述包模塑成可用的形状，例如用于耳、鼻、膝、TMJ、肋等之软骨的形状。在一个实例中，将生物可降解的聚合物基质(例如，PEUU或PEEUU)喷在或电沉积到模具上。然后可用材料填充所得的模塑覆盖物。例如，可使用热密封所述覆盖物。

添加剂

在另一个实施方案中，将至少一种对有尾目动物来说为异种的物质添加至ECM或其有尾目动物级分，之后将其植入对象中，以其他方式施用至对象或在细胞培养物中使用。一般而言，所述物质包括在细胞培养物中可用的任何物质或作为治疗剂或治疗性助剂。可将所述物质包被在、注入或以其他方式共价地或非共价地附着至本发明的ECM或并入至本发明的ECM上或并入本发明的ECM中。所述物质还可以另外的方式与包含ECM的产品组合，例如，如通过将物质和ECM的粉末混合在一起。每种物质可与本发明的ECM单独使用或其他物质组合使用。这些物质的非限制性实例包括抗微生物剂、生长因子、细胞因子、趋化因子、软化剂(emollient)、类视黄醇、类固醇和细胞，包括但不限制于对象自身的细胞。

在某些非限制性的实施方案中，所述物质是生长因子。生长因子的非限制性实例包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子1和2(IGF-1和IGF-2)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、基质衍生因子1α(SDF-1α)、神经生长因子(NGF)、睫状神经营养因子(CNTF)、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白4、神经营养蛋白-5、多营养因子蛋白(神经突生长促进因子1(neuritegrowth-promotingfactor1))、中期因子蛋白(神经突生长促进因子2)、脑源性神经营养因子(BDNF)、肿瘤血管生成因子(TAF)、促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)、转化生长因子α和β(TGF-α和TGF-β)、白介素-8(IL-8)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素和干扰素。多种生长因子，包括神经营养因子和血管生成因子的商业制品是购自R&DSystems，Minneapolis，Minn.；Biovision，Inc，MountainView，Calif.；ProSpec-TanyTechnoGeneLtd.，Rehovot，Israel；和CellSciences.RTM.，Canton，Mass.。

在某些非限制性实施方案中，治疗剂是抗微生物剂，例如但不限制于抗微生物肽、异烟肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、链霉素、氨苯吩嗪(clofazimine)、利福布丁、氟喹诺酮类、氧氟沙星、司帕沙星、利福平、阿奇霉素、克拉霉素、氨苯砜、四环素、红霉素、环丙沙星、多西环素、氨苄青霉素、两性霉素B、酮康唑、氟康唑、乙胺嘧啶、磺胺嘧啶、克林霉素、林可霉素、喷他脒、阿托伐醌、巴龙霉素、diclazaril、阿昔洛韦、三氟尿芬(trifluorouridine)、膦甲酸、青霉素、庆大霉素、更昔洛韦、伊曲康唑(iatroconazole)、咪康唑、吡硫锌和银盐例如氯化物、溴化物、碘化物和高碘酸盐。

在某些非限制性实施方案中，治疗剂是抗炎剂，例如但不限制于，NSAID例如水杨酸、吲哚美辛、吲哚美辛钠三水合物、水杨酰胺、萘普生、秋水仙碱、非诺洛芬(fenoprofen)、舒林酸、二氟尼柳、双氯芬酸(diclofenac)、吲哚洛芬、水杨酰胺钠；抗炎细胞因子；抗炎蛋白；甾体抗炎剂；或抗凝血剂，例如肝素。

也可包括可促进伤口愈合和/或组织再生的其他药物。

通过任何有用的方法来将所述物质分散在骨架内，例如，通过吸附和/或吸收。例如，治疗剂可以溶解于溶剂(如DMSO)中，并添加至骨架。在另一个实施方案中，所述物质与载体聚合物(例如聚乳酸-乙醇酸微粒、琼脂糖、聚(氨基甲酸乙酯)脲弹性体(PEUU)或聚(醚-氨基甲酸乙酯)脲弹性体(PEEUU))混合，随后分散在骨架内或被施加至骨架。通过将物质与载体聚合物或弹性聚合物掺合，可通过聚合物降解的速率和/或通过扩散或其他方式从聚合物的释放来控制治疗剂的释放速率。同样地，如在制药领域中已知的，可以以用于延长释放的任何可溶的基质形式来提供治疗剂，包括糖或多糖基质。所述物质还可包括在粉末状的ECM中并与粉末状的ECM胶凝。所述物质可共价地附着至本发明的ECM。前述意指非限制性的实例。

提取物

除了为其天然状态或磨碎为颗粒或粉末的脱细胞化的ECM外，本发明还提供了脱细胞化的ECM的提取物和分离物。如上所述，有尾目动物ECM装载有抗微生物肽、生长促进因子、胶原蛋白和层粘连蛋白，并且根据本发明ECM的有尾目动物级分是有用的。

提取缓冲液在本领域中是已知的。一种这样的缓冲液是各自在pH7.4的50mMTris-HCl中制备的4M胍和2M脲。可以将ECM的粉末形式悬浮在含有各自为1mM的苯甲基磺酰氟、N-乙基马来酰亚胺和苯甲脒(蛋白酶抑制剂)的相关提取缓冲液(例如，25％w/v)中，并于4℃下剧烈搅拌24小时。然后将提取混合物离心，并收集上清液。可在提取缓冲液中洗涤不溶材料，离心，并且将洗液与原始上清液合并。上清液可与去离子水渗析。然后可将渗析液离心以除去任何不溶材料，并且将上清液立即使用或冻干以用于长期贮存。这样的分离物将包含对有尾目动物浓度特定的生长因子。

在另一个方面，通过条件化培养基完成提取。制备有尾目动物组织特异性提取物的方法如下：获取粉末状ECM，形成溶液，从而产生上清液和颗粒，其中上清液是提取物，并且使所述提取物与颗粒分离。还可以使细胞在ECM上生长，并在细胞生长一段时间后分离上清液。

合成材料

合成的生物相容和细胞相容的材料可与ECM组合，例如，(a)用于ECM的片或凝胶的结构支持，(b)用于使ECM成形的结构支持，(c)用于ECM的包衣(或含有微粒ECM的包衣)，补充的胶凝剂或(d)用于颗粒ECM或其分离物的缓释材料。已知这样的聚合物将被应用到其他ECM材料作为背衬片，包括本身为生物可降解的材料。基质合适的合成材料可以是生物相容的以阻止迁移和免疫学并发症，并且能够支持细胞生长和分化的细胞功能。有些是可再吸收的，允许用于完全地自然组织替代。有些可以被配置成多种形状并具有足够的强度，以防止植入后的塌陷。研究表明，由聚乙醇酸制成的生物可降解的聚酯聚合物满足所有这些标准(Vacanti等，J.Ped.Surg.23：3-9(1988)；Cima等，Biotechnol.Bioeng.38：145(1991)；Vacanti等，Plast.Reconstr.Surg.88：753-9(1991))。其他合成的生物可降解的支持基质包括合成的聚合物，例如聚酐类、聚原酸酯类和聚乳酸。合成聚合物的其他实例和将细胞并入或包埋入这些基质的方法也是本领域中已知的。参见，例如U.S.专利号4,298,002和5,308,7。

作为一个非限制性实例，可将粉末与三嵌段共聚物进行配制。参见国际公布申请WO2012131104和WO2012131106，其各自通过引用以其整体并入本文。其他实例包括泊洛沙姆，其由聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中央疏水链和侧翼的两个聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))亲水链构成的非离子三嵌段共聚物。泊洛沙姆也以商品名Pluronics(BASF)为人所知。某些泊洛沙姆用作药物的持续释放材料。

本发明的颗粒也可以封装在聚合物、水凝胶和/或外科封闭剂中。作为一个非限制性实例，聚合物、水凝胶或外科封闭剂可以是PLGA、乙烯乙酸乙烯酯(EVAc)、泊洛沙姆、(Nanotherapeutics，Inc.Alachua，Fla.)、(HalozymeTherapeutics，SanDiegoCalif.)、外科封闭剂例如纤维蛋白原聚合物(EthiconInc.Cornelia，Ga.)，(BaxterInternational，IncDeerfield，Ill.)、基于PEG的封闭剂和(BaxterInternational，IncDeerfield，Ill.)。在另一个实施方案中，颗粒可被封装到本领域已知的任何聚合物中，其在被注射入对象时可形成胶凝。作为另一个非限制性实例，颗粒可被封装到生物可降解的聚合物基质中。用于控制释放和/或靶向递送的聚合物的其他实例还可包括至少一种控制释放包衣。控制释放包衣包括但不限于，聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、EUDRAGITEUDRAGIT和纤维素衍生物，例如乙基纤维素水分散体(和)。

用途

本文描述的脱细胞化的ECM可在几乎任何体内、离体或体外的用途中用于培养细胞、组织、器官。ECM可用作基材以促进细胞的生长和/或分化。在体外，ECM可用作细胞生长基材，以在细胞培养物中支持生长，包括几乎任何类型的细胞或细胞系，包括干细胞、祖细胞或分化的细胞。在一个实施方案中，所述细胞是癌细胞。在一个实施方案中，当在ECM上生长时，所述癌细胞形成结节。基材上的细胞也可生长成组织、器官或身体部分的前体，或甚至成熟的组织或结构。生长在ECM上的细胞可用于移植、用于伤口敷料、用于体外药物测试、用于模拟分化等。细胞可以与ECM在组织细胞类型上匹配或不匹配。细胞是异种的。

本发明的ECM在体内可用作细胞生长骨架，以用于任何有用目的的组织生长，包括修复、替代或增强人或动物对象中的组织。例如，材料可用于修复和/或替代在创伤或手术期间损失的或损伤的组织，例如在肿瘤移除后组织的损失。所述材料可用于结构修复，例如在减肥手术或肺切除、脐疝移植(umbilicalherniagraft)、佩罗尼修复移植(Peyronie′srepairgrafts)、切口移植和瘘管插入期间，诸如腹股沟疝修复、造口旁(parastomal)加固、软组织加固、外科用缝合线加固(surgicalstaple-linereinforcement)。所述材料可用于伤口敷料，例如对于烧伤、移植物和分层移植覆盖物(split-thicknessgraftcovering)，溃疡包括褥疮性溃疡以及皮肤擦伤过程。所述材料可用于美容目的，例如在乳房、唇或臀部增大中。对于抗粘连外科用途特别吸引人的本发明的一个方面是基膜的特性，其抑制或防止粘连。AMP的存在使得本发明的ECM的特别适合于上述应用。

如上所述，本文所述的材料可被模塑或包含在结构内以形成所需的形状，例如，通过在所述材料中接种例如软骨细胞和/或软骨祖细胞来用于软骨修复或替代。所述材料可被磨成粉末并用于重构和/或形成凝胶，作为细胞培养添加剂、作为粉末、喷雾、液体、混悬剂或包衣应用于(a)伤口，(b)植入物，(c)伤口敷料等。

在一个实施方案中，例如，脂肪干细胞在本文所述的细胞生长骨架中增殖。脂肪干细胞是中胚层来源。它们通常是多能的，并且具有发育为中胚层组织的能力，例如：成熟的脂肪组织；骨；心脏，包括但不限制于，心包、心外膜、心肌外膜、心肌、心包和瓣膜组织；真皮结缔组织；血管(hemangial)组织；肌肉组织；泌尿生殖组织；胸膜和腹膜组织；内脏；中胚层腺组织；和基质组织。细胞不仅可以分化成成熟的(完全分化的)细胞，它们也可以分化成合适的前体细胞(例如但不限制于，前脂肪细胞、前肌细胞、前骨细胞)。此外，根据培养条件，细胞也可表现出发育表型，例如胚胎、胎儿、造血、神经原性或neuralgiagenic的发育表型。

在一个实施方案中，对象自身的细胞分散在基质内。例如，在软骨组织的产生中，软骨细胞和/或软骨祖细胞可在植入前分散在基质中并任选地离体生长。同样地，在植入到对象受损伤的皮肤表面(例如烧伤或擦伤)上之前，对象的皮肤细胞可以分散在骨架内。

当用作凝胶时，一个非限制性的实例是在期望部位(例如在伤口中)将凝胶注射入到对象中。在一种情况下，可将所述凝胶注射到骨断裂处中或在骨中钻的孔中以促进结构的修复和/或粘附，例如向骨替换韧带。在另一种用途中，可将细微粉碎的颗粒喷到对象的表面上，例如在大表面的擦伤或稍伤的情况下。也可将骨架喷到皮肤缝合处上以抑制瘢痕形成。可在如上面所提到的手术部位将本发明的ECM合适地放置到或缝合到体内。本发明涵盖所有的这些处理。

有尾目动物脱细胞化的ECM还可用于将治疗性分子、蛋白质或代谢物持续地递送到宿主中的部位。参见，例如U.S.2004/0181240，其描述了覆盖组织表面的羊膜，其可防止粘连、排除细菌或抑制细菌活性，或者促进愈合或组织的生长以及U.S.专利No.4,361,552，其涉及交联羊膜的制备以及其在用于治疗烧伤和伤口的方法中的用途。可以以相同的方式使用本发明的ECM。

药物制剂

虽然本文提供的药物组合物的描述主要涉及适合施用于人的药物组合物，但是本领域技术人员可以理解的是，这样的组合物一般适合于施用至任何其他动物，例如非人动物，例如非人哺乳动物。很好理解的是，对于适合施用于人的药物组合物进行改变以使所述组合物适合施用于多种动物，并且拥有普通技能的兽医药理学家可用仅仅普通的实验(如果有任何实验的话)就可以设计和/或进行这样的改变。

可通过药理学领域中已知的任何方法来制备本文所述的药物组合物。一般而言，这样的制备方法包括将活性成分与赋形剂和/或一种或更多种其他辅助成分联合的步骤，然后(如果必要和/或期望的话)，将产品分成、成形为和/或包装成所期望的单次使用或多次使用的构型。

根据本发明的ECM可作为单一单位剂量和/或作为多个单一单位剂量批量制备、包装和/或出售。例如，组合物可包含0.1％至100％(w/w)的ECM。当包含其他活性剂时，本领域普通技术人员将知道与本发明的ECM组合的物质的相对量，类似于现有技术中配制时用于与ECM组合的那些量。相对量还可以根据治疗对象的身份、尺寸和/或病症以及进一步根据所述ECM将被施用的途径而改变。

药物制剂可另外地包含如本文所使用的可药用赋形剂，其包括但不限制于，适合所期望之特定剂型的任何和所有的溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体载剂、分散剂或助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂等。用于配制药物组合物的多种赋形剂和用于制备组合物的技术是本领域中已知的。参见Remington：THESCIENCEANDPRACTICEOFPHARMACY(第21版)，A.R.Gennaro，Lippincott，Williams&Wilkins(Baltimore，Md.，2006)，其通过引用以其整体并入本文。

实施例

实施例1.处理蝾螈真皮

可如下使蝾螈真皮样品脱细胞化：从健康的或愈合的蝾螈真皮组织制备离体样品，然后对所述样品进行低渗/高渗浸泡以裂解细胞、溶剂脱水以及烘箱干燥。这些移植物的具体处理包括存储在15％-26％的NaCl中，多次低渗/高渗浸泡(利用NaCl溶液和水)，然后使用乙醇进行溶剂脱水，然后用空气干燥或在37℃下用烘箱干燥蒸发溶剂。

对天然蝾螈真皮组织进行组织学检查来鉴定显著的ECM要素的存在，例如基膜。参见图1和图4。对天然蝾螈真皮组织和人羊膜进行比较组织学和免疫组织化学分析来比较ECM的结构和成分，并评估关键成分的相对浓度和分布。参见图2、图3和图4。图3示出了通过物种特异性胶原蛋白IV和层粘连蛋白抗体对天然的蝾螈真皮组织和人羊膜组织进行的免疫组织化学染色，40×放大率。图2示出了天然蝾螈真皮组织和人羊膜的H&E和爱茜蓝染色(40×)，并且其证明了这两种组织中相当的组织结构以及硫酸化糖胺聚糖的存在。用苏木精和伊红染色的成对的天然和处理后的蝾螈真皮组织切片的组织学评估，(参见图5)示出胞外基质组织结构的处理后保存和不存在细胞或任意显著浓度的细胞碎片。

实施例2.无细胞脱水蝾螈真皮的分裂和层压

可通过机械分裂器分裂脱细胞化的脱水蝾螈真皮以将不均匀基质分离成均匀的切片。然后可以将期望厚度的分离切片再水合和冻干以获得具有正面表面特征(facialsurfacefeature)之期望取向的多层层状结构。更特别地，可构建具有从真皮基质的网状真皮区域获得之内部开口多孔基质的双面基膜结构，以获得所期望的正面表面特性。或者，对于所期望的临床结果，可以以天然形式使用分离的天然切片。例如，网状真皮的开口多孔均匀基质可用来获得软组织结构的增强。

可得到在两个正面表面具有硫酸gags的层状的定制构造以及胶原蛋白IV和层粘连蛋白以用于临床益处的理想的双表面、抗粘附特性和抗微生物特性。此外，可以构建多层结构以延长移植物的体内耐久性。

实施例3.溶解的无细胞脱水蝾螈真皮、心包、阔筋膜、骨膜、腹膜、或硬脑膜的制备

可通过将脱细胞化的软组织结构切为1cm²的切片，并在Warring搅拌机(～100g组织)中于水性1M冰醋酸中将所述切片均化30秒至60秒，来制备无细胞有尾目动物结缔组织基质之脱细胞化的脱水蝾螈天然的或分离的切片。可通过添加不同体积的水，然后在期望几何形状的模具中将浆料进行中和并冻干来获得海绵状的制备物。所得的孔隙率将与添加到基质的水的体积有关。此外，在中和之前，可将所选范围的生物活性提取物添加至浆料，包括从消化的人或有尾目动物矿化和非矿化的结缔组织(例如去矿化骨基质、弹性蛋白或骨形态发生蛋白)中提取的颗粒的或小的蛋白质成分，其可共价地装载入构建体中。中和后，提取物将共价地与胶原蛋白纤维结合并返回生理状态，在此将发生原纤堆形成。随后，在体内的蛋白水解降解过程中，将发生生物活性成分的释放，并且确保在体内急性炎症期间分子不被消耗或暴露。或者，可在中和前将NaCl水溶液添加至该浆料以获得用于注射的持久的低粘度的溶液，其在室温下是稳定的。通过离子选择性膜注射浆料将除去盐离子并允许在注射后发生原纤堆形成以及形成三维基质。

实施例4.无菌颗粒或粉末形式的矿化和非矿化的脱细胞化且脱水的有尾目动物结缔组织基质的制备

在矿化胶原蛋白的有尾目动物结缔组织切片脱细胞化之后，可进行类似于Urist所采用的去矿化处理，以及切片化的无细胞去矿化、矿化或未矿化的有尾目动物结缔组织胞外基质的溶剂或冻干脱水、低温球磨(cryomilling)，从而获得具有保存之组织结构和功能的颗粒或粉末形式的ECM。根据低温球磨后的持续时间和筛分，最终的粒径分布可以为125至850微米变化。低剂量的冷γ辐照或电子束辐照(＜25Kgy)可以用来对无细胞的ECM片、颗粒或粉末以及定制改造的构建体进行灭菌。

实施例5.无细胞的矿化的和非矿化的有尾目动物健康的或愈合的结缔组织基质的体外表征

通过一系列的体外分析，可以证实脱细胞化的胞外基质构建体和/或颗粒(包括多层层压的构建体，例如双面基膜片基质或分离的天然均匀开口多孔基质或溶解的、冻干的以及装载ECM衍生的胶原海绵)的脱细胞化以及天然的或定制改造的功能和结构特性的保存。DNA含量作为细胞碎片的标志可用于定量地评估脱细胞化，其使用单一的基于乙醇的提取技术，利用荧光染料Quant-iTPicoGreen(MolecularProbes，USA)在96孔板中以170μL工作溶液与30μL样品/标准品的比进行。可以进行成对的天然和处理后分析，并与市售的组织ECM进行比较以验证可接受性。参见图6。

可进行ELISA分析以量化生物活性成分以及天然和处理后的蛋白水解吸收谱。在用胶原酶(232-262mg/单位活性)消化后，将脱细胞化并且脱水的有尾目动物ECM组织或构建体(Sigma，USA)之对表面积归一化权重的(normalized-weight-to-surface-area)切片在pH7.6缓冲液(50mMTris-HCl，200mMCaCl₂，50mMNaCl)中于37℃下保持24小时，可以在不同时间点进行分析以构建处理前和处理后组织的相对吸收曲线，以验证组织结构的保存。可在消化后使用Sircol试剂盒(BiocolorLtd.，UK)评估酸/盐洗涤之消化物的100μL等分试样中溶解的胶原蛋白。具体来说，可在消化后通过市售的ELISA试剂盒(R&DSystems，Minneapolis，MN)评估BMP2/4和TGF-1生长因子或硫酸化gags的水平。可通过标准布拉德福德吸光度测定(Bradfordabsorbanceassay)测量1∶10稀释的消化物中的蛋白质含量。

可通过在4％多聚甲醛中固定和石蜡包埋，以5μm切片以及常规组织染色(Histoserv，USA)进行样品的显微评估。可用苏木精和伊红对纵向截面进行染色。可使用标准明场技术在OlympusIM倒置显微镜上获取并分析图像。可在经梯度乙醇系列(15％、30％、50％、70％、95％和100％)脱水，在CO₂中进行临界点干燥以及用金溅射涂层后，使用扫描电子显微术对样品进行分析。可在FEIQuanta600FEG扫描电子显微镜中观察样品，并且可以获取骨架超微结构的代表性图像。

可在24小时时进行用于定性地细胞生存力评估的直接细胞接触法(IS010993，第5部分)以用于细胞毒性测试，并且在延长的时间点(48和72小时)来评估细胞增殖和粘附效率。在进行培养孔的胰蛋白酶化和转移之后，可在血细胞计数器中对未粘附的细胞进行人工计数。四天后，可以进行CellTiter96测定以量化存活的细胞。活/死细胞染色试剂盒也可用作在24小时和第4天通过荧光显微术观察骨架，由此来验证生物相容性。

Claims (33)

1.通过以下方法产生的脱细胞化的生物材料，所述方法包括(A)从有尾目动物获得组织样品，所述组织样品包含胞外基质，以及(B)使所述样品脱细胞化以保留结构和功能的完整性，同时充分除去所述样品的细胞成分以降低或消除所述生物材料作为异种移植物的抗原性。

2.根据权利要求1所述的脱细胞化的生物材料，其中所述脱细胞化包括对所述组织样品进行碱处理。

3.根据权利要求1所述的脱细胞化的生物材料，其中所述方法还包括对所述样品进行灭菌。

4.根据权利要求1所述的脱细胞化的生物材料，其还包含失活的细胞。

5.组织移植物，其包含来源于有尾目动物的胞外基质成分。

6.分离的脱细胞化的有尾目动物ECM。

7.根据权利要求6所述的分离的ECM，其中所述ECM来源于蝾螈组织。

8.根据权利要求6所述的分离的ECM，其中所述ECM包含基膜。

9.根据权利要求6所述的分离的ECM，其中用对有尾目动物来说为异种的物质注入所述ECM、用对有尾目动物来说为异种的物质包被所述ECM、或将所述ECM附着至对有尾目动物来说为异种的物质，所述物质是生长因子、细胞因子、趋化因子、蛋白质、碳水化合物、糖、类固醇、抗微生物剂、合成聚合物、粘合剂、药物或人的物质。

10.根据权利要求6所述的分离的ECM，其中所述物质是细胞，任选地是人细胞。

11.根据权利要求6所述的分离的ECM，其中所述ECM是片。

12.根据权利要求11所述的分离的ECM，其中所述片包含穿孔。

13.根据权利要求6所述的分离的ECM，其中所述ECM是干粉。

14.根据权利要求6所述的分离的ECM，其中所述ECM是重构凝胶。

15.根据权利要求6至13中任一项所述的分离的ECM，其中所述ECM是无菌的ECM。

16.包装，其包含无菌的分离的脱细胞化的有尾目动物ECM或来源于所述无菌的分离的脱细胞化的有尾目动物ECM的有尾目动物级分。

17.根据权利要求17所述的包装，其中所述无菌的分离的脱细胞化的有尾目动物ECM或来源于所述无菌的分离的脱细胞化的有尾目动物ECM的有尾目动物级分是分离的脱细胞化的有尾目动物ECM的片。

18.根据权利要求17所述的包装，其中所述无菌的分离的脱细胞化的有尾目动物ECM或来源于无菌的分离的脱细胞化的有尾目动物ECM的有尾目动物级分是干粉。

19.根据权利要求17所述的包装，其中所述无菌的分离的脱细胞化的有尾目动物ECM或来源于无菌的分离的脱细胞化的有尾目动物ECM的有尾目动物级分是凝胶。

20.无菌的医学植入物，其包含无菌的分离的脱细胞化的有尾目动物ECM或来源于所述分离的脱细胞化的有尾目动物ECM的无菌有尾目动物级分。

21.根据权利要求19所述的无菌的医学植入物，其中所述植入物是生物相容的片、网、凝胶、移植物、组织或装置。

22.材料，其被分离的脱细胞化的有尾目动物ECM或来源于所述分离的脱细胞化的有尾目动物ECM的有尾目动物级分包被、被分离的脱细胞化的有尾目动物ECM或来源于所述分离的脱细胞化的有尾目动物ECM的有尾目动物级分浸渍、封装分离的脱细胞化的有尾目动物ECM或来源于所述分离的脱细胞化的有尾目动物ECM的有尾目动物级分或具有附着的分离的脱细胞化的有尾目动物ECM或来源于所述分离的脱细胞化的有尾目动物ECM的有尾目动物级分。

23.组织培养系统，其包括(a)分离的脱细胞化有尾目动物ECM，(b)组织培养基，以及(c)对所述有尾目动物来说为异种的细胞。

24.根据权利要求22所述的组织培养系统，其中所述细胞是人细胞。

25.经分离的脱细胞化的有尾目动物ECM或来源于所述分离的脱细胞化的有尾目动物ECM的有尾目动物级分条件化的组织培养基。

26.装置，其包含分离的脱细胞化的有尾目动物ECM之至少两个彼此层压的片。

27.产品，其通过从有尾目动物分离有尾目动物ECM、使所述ECM脱细胞化并对脱细胞化的ECM灭菌来制备。

28.制备生物材料的方法，其包括(A)从有尾目动物获得组织样品，所述组织样品包含胞外基质，以及(B)使所述样品脱细胞化从而形成脱细胞化的ECM，以充分除去所述样品的细胞成分从而降低或消除所述生物材料作为异种移植物的抗原性。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述方法还包括以充分保留所述脱细胞化的ECM的结构和功能完整性的方式进行所述脱细胞化，以允许所述脱细胞化的ECM可用作细胞可在其上和其内生长的基质。

30.根据权利要求29所述的方法，其还包括使所述脱细胞化的ECM均化以形成粉末。

31.根据权利要求30所述的方法，其还包括使所述粉末重构为凝胶。

32.根据权利要求29所述的方法，其还包括对所述脱细胞化的ECM灭菌。

33.根据权利要求29所述的方法，其还包括将所述脱细胞化的ECM附着至对有尾目动物来说为异种的物质。