KR102284982B1 - 비-포유류 조직으로부터의 세포제거된 생체재료 - Google Patents

비-포유류 조직으로부터의 세포제거된 생체재료 Download PDF

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Abstract

성장 인자 프로파일, 결합조직 기질 구성성분, 및 유미목 양서류 세포외 기질(ECM) 및 수반하는 피부 조직의 면역학적 특권이 부여된 상태가 그 안의 항균성 펩타이드 존재에 더하여 이종이식을 위한 생물학적 스캐폴드에 대한 이상적인 공급원인 유미목 양서류-유래 조직을 제공한다. 특히, 생물학적 스캐폴드 생체재료는 (A) 유미목 양서류로부터 조직 샘플을 얻는 단계(여기서 조직은 기저막을 비롯한 ECM을 포함함), 및 (B) 섬유성 및 비섬유성 단백질, 글라이코아미노글라이칸(GAG) 및 프로테오글라이칸을 보유하는 한편 이종이식 목적을 위해 항원성 및 면역원성을 감소 또는 제거시키기 위해 샘플의 충분한 세포 구성성분을 제거함으로써 조직 샘플에 상기 세포외 기질의 구조적 및 기능적 완전성을 유지하는 세포제거 과정을 실시하는 단계를 수반하는 방법에 의해 얻을 수 있다. 얻어진 유미목 양서류-유래 생체재료는 피부 항상성의 회복을 향상시키기 위해, 중증도, 지속기간 및 수술후 염증에 의해 야기된 관련된 손상을 감소시키기 위해, 그리고 천연 치유 및 재생 과정을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 추가로, 생체재료는 손상되지 않은 인간 조직과 품질, 기능 및 순응도가 비슷한 리모델링된 조직의 형성을 촉진한다.

Description

비-포유류 조직으로부터의 세포제거된 생체재료{DECELLULARIZED BIOMATERIAL FORM NON-MAMMALIAN TISSUE}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2013년 1월 9일 출원된 미국 가출원 특허 제61/750,555호에 대해 미국 특허법(35 USC § 119(e)) 하에서 유익을 주장하며, 이 기초출원의 전문 내용은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
전체 조직 또는 이의 부분을 전형적으로 수복 또는 대체하는 생물학적 기능을 대체하기 위한 방법 및 재료를 생성하기 위한 조직 유전자 조작의 노력이 진행 중에 있다. 이와 관련하여, 질병 또는 손상에 기인하는 피부 통합성(skin integrity)의 상실이 만성의 생명을 위협하는 합병증을 야기할 수 있기 때문에 상처 치료 및 피부 수복은 지배적인 중점의 영역이다.
상처 치유는 손상 후에 조직을 재구성하기 위해 세포, 성장 인자 및 세포외 기질(extracellular matrix: ECM) 구성성분 간의 복잡한 상호작용을 수반한다. 성체 포유류 조직에서 상처 치유 과정은 잘 특성규명되어 있으며, 3가지 단계로 분할될 수 있다 - 염증, 증식 및 리모델링.
전형적으로, 절개 또는 외상에 반응하여, 신체는 혈액, 혈액 생성물 및 단백질을 상처에서 형성된 빈 공간(또한 공동 또는 음화적 공간(negative space)으로 지칭됨)으로 나른다. 초기 염증 동안, 상처는 염증 매개체의 영향하에서 그리고 혈관 확장의 결과로서 상처 삼출물을 형성하기 시작한다. 응고 혈액에 존재하는 피브린 및 피브로넥틴은 케라틴세포, 혈소판 및 백혈구와 같은 세포가 상처 부위로 이동하는 스캐폴드를 제공한다. 박테리아 및 파편은 식균 작용되고 제거되며, 섬유아세포의 이동 및 분화를 자극하는 성장인자가 방출된다.
상처 치유의 후속 단계는 섬유상 결합조직으로서 새로운 조직 형성을 수반한하고, 지칭되는 과립 조직(섬유아세포, 대식세포 및 혈관신생으로 구성됨)은 피브린괴를 대체한다. 이 단계 동안 새로운 혈관이 형성되며, 섬유아세포가 증식하고, 콜라겐 및 피브로넥틴을 배출함으로써 일시적 ECM을 생성한다. 거의 모든 포유류 세포는 적절하게 증식하고 기능하기 위해 표면에 대한 부착을 필요로 한다. ECM은 이 기능을 이행한다. 초기에, 일시적 ECM은 빠르게 생성된 더 약한 콜라겐 형태인 III형 콜라겐의 네트워크를 수용한다. 이는 이후에 더 강한 I형 콜라겐(흉터 형성에 기여함)에 의해 대체된다. 동시에, 표피의 재상피화가 일어난다. 이 과정 동안, 이동하는 세포의 앞 가장자리에서 메탈로프로티나제(MMP) 및 콜라게나제와 같은 프로테아제가 응괴를 침습하게 하기 때문에 상피 세포는 새로 형성되는 조직 이상으로 증식하고 이동한다. 성장 인자 신호전달(세포-세포 상호작용) 및 세포-ECM 상호작용(세포(세포, 인테그린(세포 표면 수용체), 라미닌, 콜라겐, 피브로넥틴 및 기타 ECM 단백질 간의 상호작용으로부터의 신호 전달)에 추가로 이들 효소는 상처 및 ECM 분해로의 세포 이동을 자극한다.
최종적으로, 리모델링 단계에서, 콜라겐은 리모델링되고, 장력선을 따라 재배열되며, 더 이상 필요하지 않은 세포는 세포자멸사에 의해 제거된다. 상처 수복은 섬유아세포가 그들의 ECM 단백질 및 성장인자와의 상호작용을 통해 근섬유아세포로 전환됨에 따라 일어난다. 이어서, 근섬유아세포는 상처를 수축시키기 위해 콜라겐, 비트로넥틴 및 다른 ECM 단백질과 상호작용한다. 리모델링 단계가 진행됨에 따라, 피브로넥틴 및 하이알루론산은 조직에 대해 내구성을 제공하는 콜라겐 번들에 의해 대체된다.
조직 수복 및 재생에 생물학적, 화학적 및 유전자 조작 원칙을 적용함으로써, 조직 엔지니어는 조직 수복 및 재생 과정을 촉진하는데 사용하기 위한 이식가능한 생성물을 개발하였다. 손상된 조직의 생체역학적 기능을 회복하기 위한 능력은 진정한 도전을 제시한다. 이에 대응하여, 조직 수복을 촉진하기 위한 조직 구조 및 기계적 거동을 (일정한 정도로) 모방하는 합성 스캐폴드 생성물과 생물학적 스캐폴드 생성물이 둘 다 개발되었다. 이러한 생성물은 손상된, 병에 걸린 또는 없는 조직에 대해 역학적으로 그리고 기능적으로 일시적 대체물로서 작용한다.
이상적으로, 이식가능한 스캐폴드 생성물은 세포 부착, 증식 및 분화를 지지하여야 하고, 새로운 조직의 형성 전에 세포에 대해 잠정적 합성 세포외 기질(ECM)로서 작용한다. 스캐폴드 재료는 생체적합하고, 생분해성이어야 하고, 낮은 항원성을 나타내어야 한다. 이식물(implant)은 새로운 조직 형성의 속도와 거의 동일한 속도로 분해되어야 한다. 일단 이식되면, 스캐폴드는 새로운 조직이 형성될 때까지 구조적 지지체를 일시적으로 제공하는데 필요한 기계적 특성을 가져야 한다. 추가적으로, 스캐폴드 생성물은 다공성이어서 영양소 전달 및 조직 내생(ingrowth)을 위한 적절한 통로를 제공하여야 한다. 조직 스캐폴드는 또한 빠른 치유를 촉진해야 하며, 외관과 기능 둘 다에서 정상 숙주 조직과 유사한 새로운 조직의 발생 또는 재생을 용이하게 하여야 한다. 이를 위하여, 이식된 스캐폴드 생성물은 (i) 생활성 자극, 예를 들어, 세포 이동, 증식 및 분화를 조장하는 단백질 및 분자 신호 전달, 및 (ii) 이들 방법을 위한 기계적 또는 구조적 지지체를 제공하여야 한다.
오늘날, 합성 스캐폴드의 개발은 적극적인 연구 영역이다. 합성 스캐폴드는 섬유성 중합체, 젤라틴, 인회석, 및 중합체/세라믹 조성물, 폴리락트산, 콜라겐과 같은 화학적 화합물로부터 제조되었다. 이들 스캐폴드는 천연으로 생기는 ECM의 구조를 모방하도록 설계되며, 조직 유전자 조작에서 일부 성공을 나타내었다.
합성 스캐폴드 생성물에 추가로, 포유류 조직으로부터 얻은 생물학적 스캐폴드는 이형이식편(allograft)(동일종의 공여체로부터의 이식 세포 또는 조직) 또는 이종이식편(xenograft)(상이한 종의 공여체로부터의 이식 세포 또는 조직)으로서 사용을 위해 상업적으로 입수가능하다. 생물학적 스캐폴드는, 예를 들어 인간(살아있는 공여체 또는 시체), 돼지, 소 및 말을 포함하는 다양한 포유류의 진피, 방광, 소장, 중피세포, 심막, 뼈 또는 양막으로부터 채취된 포유류 ECM으로 구성된다. 이들 상업적으로 입수가능한 제품은 연조직, 힘줄, 심근 조직, 신경 조직, 만성 상처, 뇌경막, 뼈 및 각막과 같은 손상 또는 상실된 조직 및 기관의 수복 및 재건을 위해 통상적으로 사용된다.
생물학적 스캐폴드 생성물은 조직에 의해 생성된 세포외 기질에 추가적으로 피부 세포를 포함할 수 있고, 세포제거(decellularization) 과정이 실시될 수 있다. 그들은 상처 부위와 접촉되어 상처 치유 과정의 부분으로서 세포 이동 및 증식을 위한 기계적 지지체를 제공한다. 추가로, 상처 치유 과정을 촉진하는 인자, 예컨대 성장인자 또는 다른 단백질이 또한 제공될 수 있다. 이들 생체재료에 대한 생물학적 스캐폴드 및 숙주 조직 반응의 기계적 및 재료적 특성은 재료 및 생성 처리 방법의 3차원 입체배치에 의해 영향받는 것으로 믿어진다. 추가로, 성장 인자, 표면 위상 및 표면 리간드의 분포 및 숙주 고유의 면역 반응은 모두 조직 수복 또는 재건을 위한 생물학적 스캐폴드의 종국적인 기능적 성능에 기여하는 것으로 믿어진다. 문헌[Tottey et al., Biomaterials 32: 128-36 (2011)].
이식에서, 인간 양막(amniotic membrane: AM)의 사용은 상대적으로 두꺼운 기저막의 구조, 관련된 탈활력화된(devitalized) 양막의 상피 세포 및 간질, 및 대응하는 성장인자 프로파일 및 구조적 단백질 조성물에 기인하여 특정 이점을 가진다. 문헌[Meller et al., Dtsch Arztebl Int'l 108: 243-8 (2011)]. 예를 들어, AM은 상처치유를 촉진하는데 중요한 성장인자인 표피성장인자(epidermal growth factor: EGF) 및 케라틴세포 성장인자(KGF)를 함유한다. 추가로, AM에 존재하는 라미닌 및 VII형 콜라겐은 상피친화성 효과를 유발한다. AM은 또한 다양한 성장 인자 및 전염증 사이토카인의 발현을 감소시키는 한편, IL-10, IL-1 수용체 길항제와 같은 항염증 사이토카인을 방출시키고, 따라서 상처 치유에 유리하게 염증 반응을 조절하는 것으로 생각된다. 게다가, AM은 아마도 낮은 MHC I 발현 때문에 면역학적 특권을 가지며, 따라서 AM 조직의 거부는 흔치않다. 이들 특징은, 예를 들어 특히 상처-치유 적용범위 중에서도 안구 표면 재건에 대해, 골반 재건에서 그리고 궤양의 치료에서 AM을 이상적인 기질로 만든다.
그러나, 통상적인 조직 스캐폴드 생성물의 사용은 문제점이 없지 않다. 인간 공여체로부터의 조직 채취는 공여 부위 이환율 또는 공여를 위한 피부의 제거와 관련된 감염과 같은 바람직하지 않은 결과를 생성할 수 있다. 질환 전염 위험 및 샘플간 변이는 생물학적 스캐폴드 생성물과 관련된 추가적인 문제점이다. 추가로, 거대 면적의 손상된 조직을 커버하는데 필요한 충분한 조직 구성성분을 얻는 것은 어려울 수 있다. 더 나아가, 통상적인 생물학적 및 합성 재료는 다수의 예에서 값이 비싸고 효과적이지 않을 수 있고, 이용가능성이 제한된다.
따라서, 조직 재생을 촉진하는 한편 기능성을 회복하기 위해 이식에서 사용하기 위한 적합한 조직 기질 생체재료에 대한 지속적인 필요가 존재한다. 연구 산업과 의학적 이식 커뮤니티는 둘 다 용이하게 이용가능한 생성물로부터 유익을 얻으며, 공여체 또는 수용자에 대한 추가적인 문제(예컨대 기질을 채취하기 위해 추가적인 수술을 필요로 하는 것)를 부과하지 않고, 천연 조직의 이화학적, 전기화학적 및 생화학적 특성을 기능적으로 반영하는 모든 또는 일부 내재한 재료를 나타낸다.
본 발명의 생체재료는 유미목 양서류의 조직으로부터 얻어진다. 여기서 "유미목 양서류"는 양서강(Amphibia)에서 도롱뇽목(Caudata)으로서도 알려진 유미목(Urodela)의 도롱뇽을 의미한다. 계통발생에 대해 적절한 과(family)는 점박이도롱뇽과(Ambystomatidae), 장수도롱뇽과(Cryptobranchidae), 엠피우마도롱뇽과(Amphiumidae), 동굴영원과(Proteidae) 및 사이렌과(Sirenidae)를 포함한다. 본 명세서에 전문이 참고로 포함되는 문헌[Wiens et al., Syst. Biol . 54: 91-110 (2005)] 참조. 따라서, 유미목 양서류 카테고리는, 예를 들어, 태평양큰도롱뇽(중국 장수도롱뇽), 호랑이 도롱뇽(범 도롱뇽) 및 멕시코 도롱뇽(멕시코도롱뇽)을 포함한다. 본 발명자들은 유미목 양서류의 피부 및 ECM이 그들을 이종이식을 위한 이상적인 생체재료로 만드는 AM의 특징과 유사한 바람직한 특징을 가진다는 것을 인식하였다.
유미목 양서류 ECM 및 조직 재생
양서류로서, 대부분의 유미목 양서류는 애벌레 상태로 수생동물로서의 삶을 시작하고, 아가미를 지니는 어린 형태로부터 폐를 지니는 성체, 육생, 공기-호흡 형태로 변태를 겪는다. 변태 동안, 유미목 양서류의 신체적 특징은 육지에서의 생활에 대한 준비로 변용된다. 이들 변용은 꼬리지느러미 재흡수, 피부의 비후화, 피부샘의 발생 및 아가미의 재흡수를 포함한다. 대부분의 유미목 양서류에서 이 시기 동안 성성숙이 또한 일어난다. 유미목 양서류의 일부 과는 "유태보존적(neotenic)"인데, 이는 이러한 과에 의한 개체가 성성숙에 도달된 후조차 아가미 및 지느러미와 같은 어린 특징을 나타낼 수 있다는 것을 의미한다. 사실, 유태보존적 유미목 양서류는 종종 그들의 수명의 지속 기간 동안 그들의 수생(어린) 형태를 유지한다. 따라서, 멕시코 도롱뇽은 정상적으로 특정 환경하에서 그것이 변태를 겪고 육생 형태로 전환될 수 있지만, 그의 성체 수명 전반적으로 유태보존적 상태로 남아있는다.
아홀로틀(Axolotl)은 또한 전형적으로 손상된 사지 또는 기관의 구조와 기능 둘 다의 완전한 회복을 초래하는 그들의 말단 결손된 신체 부분을 재생하는 능력에 대해 알려져 있다. 수생 아홀로틀은 상처 치유 및 사지 재생 동안 빠른 재생피화를 겪는데, 이들 둘 다 흉터가 없는 과정이다. 유사하게, 변태 육생 아홀로틀은 몇몇 유생 피부 특징을 보유하고, 또한 그들의 수생, 변태전 상대보다 더 느린 속도일지라도 흉터없는 상처 치유를 나타낸다.
아홀로틀에서의 치유 과정은 성체 포유류에서 관찰된 것과 다르다. 아홀로틀 과정은 태아 및 배아 상처의 무흉터 치유 과정과 더 밀접하게 유사하다. 따라서, 이러한 상처는 마찬가지로 출생 후 포유류에서 대응하는 사건보다 더 빠른 속도로 일어나는("향상된") 재생피화 및 기저막 재형성을 나타낸다.
게다가, 아홀로틀의 피부 및 피하 구조는 아홀로틀 피부가 융합된 외배엽 및 중배엽을 구성한다는 점에서 양막/융모막 계면의 구조와 유사하다. 아홀로틀 피부는 또한 AM과 유사하게 성장인자 및 항균성 펩타이드가 풍부하다. 더 나아가, 아홀로틀 ECM은 면역학적 특권을 가지며, 특히 또한 AM과 유사하게 콜라겐 III 및 메탈로프로테이나제(TIMP)의 조직 저해제를 함유한다.
일반적으로는 아홀로틀 ECM에 의한 거울같은 상태인 인간 신생아(예를 들어, 태아 진피) 및 AM의 면역학적으로 특권이 있는 상태가 이식 목적을 위해 특히 중요하며, 이에 의해 면역원성은 거의 나타나지 않는다. 성체 인간에 비해 감소된 면역 반응 및 일반적으로 감소된 염증 반응 때문에, 성체 인간 상처 치유에서 관찰된 바와 같이 신생아 및 아홀로틀 피부 치유는 비슷하게 가속화된 조직 재흡수를 특징으로 하지 않는다. 오히려, 유미목 양서류 및 신생아 조직의 성장 인자 프로파일, 효소 활성, 구조적 조성 및 면역조절 효과는 비슷하게 상처 치유 동안 향상된 재생피화에 추가로 얻어진 음화적 빈 공간 내로 구조적 스캐폴딩 및 조직 성장의 적절하게 단계화된 제거에 유리하다. 이는 최적의 상처 치유 환경 및 과정을 초래한다. 또한 AM 및 유미목 양서류 조직에 존재하는 고농도의 항균성 펩타이드는 바람직한 환경 및 상처 치유 동안 관찰된 향상된 재생피화에 추가로 기여한다.
본 발명의 중요한 양태는 성장 인자 프로파일, 결합조직 기질 구성성분, 및 유미목 양서류 ECM 및 수반하는 피부 조직의 면역학적 특권이 부여된 상태가 그 안의 항균성 펩타이드 존재에 더하여 이종이식을 위한 생물학적 스캐폴드를 위한 이상적인 공급원인 유미목 양서류-유래 조직을 제공한다는 본 발명자들의 인식이다.
따라서 본 발명에 따르면, (A) 유미목 양서류로부터 조직 샘플을 얻는 단계(여기서 조직은 기저막을 비롯한 ECM을 포함함) 및 (B) 섬유성 및 비섬유성 단백질, 글라이코아미노글라이칸(GAG) 및 프로테오글라이칸을 유지하는 한편, 이종이식 목적을 위해 항원성 및 면역원성을 감소 또는 제거하기 위해 샘플의 충분한 세포 구성성분을 제거함으로써, 세포외 기질의 구조적 및 기능적 완전성을 유지하는 세포제거 과정을 조직 샘플에 실시하는 단계를 포함하는 방법의 생성물인 생물학적 스캐폴드 생체재료가 제공된다. 또한 피부 항상성의 회복을 향상시키기 위해, 중증도, 지속기간 및 수술후 염증에 의해 야기된 관련된 손상을 감소시키기 위해, 그리고 천연 치유 및 재생 과정을 촉진하기 위해 유미목 양서류-유래 생체재료를 이용하는 방법이 제공된다. 추가로, 본 발명의 생체재료는 손상되지 않은 인간 조직에 대해 품질, 기능 및 순응도가 비슷한 리모델링된 조직의 형성을 촉진한다.
세포제거
본 발명의 생체재료는 유미목 양서류로부터 얻은 조직 샘플의 세포제거에 의해 생성된다. 얻어진 유미목 양서류 생체재료의 주된 구성성분은 가능하게는 탈활력화된 상피 세포를 지니는 ECM인데, 이는 수분을 보유하고 다르게는 상처 치유 환경을 보호할 수 있다.
유미목 양서류 피부는 본 발명을 위한 적절한 출발 물질의 일 예이다. 따라서, 세포제거가 실시된 출발 물질은 표피와 함께 또는 표피 없이 유미목 양서류 진피 및 기저막을 포함할 수 있다. 게다가, 세포 제거 시조차, 본 발명의 생체재료는 상기 과정에 의해 생존할 수 없게 제공될 수 있는 인접한 상피 세포를 ECM과 함께 포함할 수 있다. 대안적으로, 비-피부 유미목 양서류 조직, 특히 다양한 체강의 내벽을 형성하는 기저막 또는 상피 조직, 즉, 예를 들어 흉강, 복강 및 심막에서 발견된 부분적 중피조직을 포함하는 것이 본 발명의 출발 물질로서 작용할 수 있다. 실질적인 양의 섬유성 결합조직, 예컨대, 연골, 힘줄, 뼈, 뇌경막 및 근막을 함유하는 조직은 또한 본 발명의 적절한 출발 물질을 예시한다.
임의의 전통적인 세포제거 방법을 통해 달성되면, 유미목 양서류 조직 세포제거는 염증 반응 또는 염증-매개 조직 거부를 유발할 수 있는 면역원성 세포 항원을 제거하는 한편, 관련된 ECM의 구조적 통합 및 조성을 보존하도록 수행된다. 일반적으로, ECM 구조적 구성성분은 이들 중 모두는 아니지만 다수가 세포제거 후 무결함으로 남아있다면, 이종이식편 수용자에 의해 잘 용인된다. 본 발명의 최종 생체재료에 존재할 수 있는 ECM 구성성분은 단백질, 예컨대 콜라겐(예를 들어, 섬유성 콜라겐 I 및 콜라겐 III뿐만 아니라 비-섬유성 콜라겐 IV, 콜라겐 V 및 콜라겐 VII), 엘라스틴, 라미닌, 비트로넥틴, 트롬보스폰딘, 오스테오폰틴 및 테나신에 더하여 GAG(예를 들어, 프로테오글라이칸, 데코란 및 베르시칸 및 황산화 GAG, 예를 들어, 황산헤파린, 황산케라탄, 황산더마탄 및 황산콘드로이틴) 및 성장인자, 예컨대 VEGF, BMP, TGF 및 FGF를 포함한다. 일부 적응증에 대해, 세포제거후 재료는 조직학적 및 면역조직학적 염색을 통해 볼 때 세포제거전 수준과 비슷한 양으로 적어도 콜라겐 IV, 라미닌, 황산 GAG 및 하나 이상의 성장인자를 포함한다.
본 발명에 의하여 조직의 세포를 제거하기 위한 적합한 기법은 물리적 방법, 예컨대 냉동, 직접적 압력 적용, 초음파 처리 및 교반을 포함한다. 추가로 또는 대안적으로, 화학적 방법, 예컨대 알칼리 및 산처리, 세정제 도포(양쪽성, 양이온성, 음이온성 및 비이온성 세정제), 유기 용매, 저장성 또는 고장성 용액 및 킬레이트제가 사용될 수 있다. 프로테아제 분해 및 1종 이상의 뉴클레아제로 처리를 포함하는 효소적 접근이 또한 유미목 양서류 조직의 세포를 제거하는데 사용될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 유미목 양서류 조직에 세정, 멸균화, 소독, 항생제 처리 및/또는 바이러스 불활성화가 실시된다.
본 발명의 일 양태에 따라, 생체재료가 제공된다. 재료는 (A) 유미목 양서류로부터 세포외 기질을 포함하는 조직 샘플을 얻는 단계, 및 (B) 샘플의 구조적 및 기능적 완전성을 유지하도록 세포를 제거하는 한편, 샘플의 충분한 세포 구성성분을 제거하여 이종이식편으로서 생체재료의 항원성을 감소 또는 제거하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된다. 일부 실시형태에서, 세포제거 단계는 상기 조직 샘플에 알칼리 처리를 실시하는 단계를 포함한다. 실시형태에서, 상기 방법은 상기 샘플에 멸균화를 실시하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 실시형태에서, 상기 방법은 세포를 탈활력화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 조직 접합이 제공된다. 접합은 유미목 양서류로부터 유래된 세포외 기질 구성성분을 포함한다. 실시형태에서, 세포외 기질 구성성분은 이종이식편으로서 이식될 때 면역 반응을 유발하는 구성성분이 실질적으로 없다. 실시형태에서, 세포외 기질 구성성분은 비-독성이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 세포제거된 유미목 양서류 ECM이 제공된다. 임의의 실시형태에서, 세포제거된 ECM은 아홀로틀 조직으로부터 유래될 수 있다. 임의의 실시형태에서, 세포제거된 ECM은 기저막을 포함할 수 있다. 임의의 실시형태에서, 세포제거된 ECM은 유미목 양서류에 대해 이종성인 작용제에 주입되거나, 코팅되거나, 조합되거나 또는 공유적으로 또는 비공유적으로 부착될 수 있다. 임의의 실시형태에서, 작용제는 성장인자, 사이토카인, 케모카인, 단백질, 탄수화물, 당, 스테로이드, 항균제, 합성 중합체, 접착제, 약물 및/또는 인간 작용제(즉, 단리되고, 합성적으로 또는 재조합적으로 생성된, 인간에서 발견되는 작용제) 중 임의의 하나 또는 임의의 조합일 수 있다. 추가로 본 발명의 부분을 형성하는 이러한 작용제는 이하에 더욱 상세하게 기재된다. 일부 실시형태에서, 작용제는 세포, 선택적으로 인간 세포이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 조상 세포, 선택적으로 인간 조상 세포이다. 추가로, 본 발명의 부분을 형성하는 이러한 세포는 이하에 더 상세하게 기재된다. 임의의 실시형태에서, 세포제거된 ECM은 재료가 형성, 적층, 균질화, 겔화 등이 될 수 있기 때문에 임의의 다양한 형상을 취할 수 있다. 일부 실시형태에서, ECM은 시트이다. 시트는 선택적으로 천공을 포함할 수 있다. 시트는 선택적으로 뒤판 및/또는 접착제를 포함할 수 있다. 뒤판은 생분해성일 수 있거나 비-생분해성일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포제거된 ECM은 건조 분말이다. 일부 실시형태에서, 세포제거된 ECM은 재구성된 겔이다. 임의의 실시형태에서, ECM은 멸균일 수 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 패키지가 제공된다. 패키지는 멸균의, 세포제거된 유미목 양서류 ECM, 또는 멸균의, 세포제거된 유미목 양서류 ECM으로부터 유래된 유미목 양서류 분획을 함유한다. 패키지는 상기 기재된 임의의 ECM을 함유할 수 있다. 예를 들어, 패키지는 세포제거된 유미목 양서류 ECM의 시트, 건조 분말 또는 재구성된 겔을 포함할 수 있다. 패키지는 임의의 생성물, 예를 들어 멸균의, 세포제거된 유미목 양서류 ECM, 또는 멸균의, 세포제거된 유미목 양서류 ECM으로부터 유래된 유미목 양서류 분획을 포함하는 임의의 이식물을 함유할 수 있다. 이러한 이식물은 본 발명의 ECM의 전체로 또는 단지 부수적 부분으로 만들어질 수 있다.
본 발명은 또한 세포제거된 유미목 양서류 ECM, 또는 세포제거된 유미목 양서류 ECM로부터 유래된 유미목 양서류 분획을 포함하는 멸균 의료용 이식물(sterile medical implant)을 제공한다. 이러한 의료용 이식물의 예는 생체에 적합한 시트, 메쉬, 겔, 이식편(graft), 플러그, 조직 또는 장치를 포함한다. 장치는, 예를 들어, 코팅 스텐트, 뼈 대체물, 관절 대체물, 이식가능한 하드웨어 등을 포함한다. 이식물은 ECM으로부터 전체적으로 또는 부분적으로 제작될 수 있다. 이식물은 또한 캡슐화될 수 있고, 본 발명의 ECM에 대해 주입되거나, 코팅되거나, 침윤되거나, 적층되거나 또는 공유적으로 또는 비공유적으로 부착될 수 있다.
본 발명은 또한 재료를 제공하되, 상기 재료는 그것에 단리되고 세포제거된 유미목 양서류 ECM 또는 단리되고, 세포제거된 유미목 양서류 ECM으로부터 유래된 유미목 양서류 분획에 코팅, 침윤, 캡슐화 또는 부착된다. 상기 재료는 천연일 수 있고 또는 합성일 수 있다. 예는 금속, 플라스틱, 세라믹 및 섬유이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 조직 배양 시스템이 제공된다. 시스템은 (a) 단리된 유미목 양서류 세포제거된 ECM, (b) 조직 배양 배지, 및 (c) 유미목 양서류에 대해 이종성인 세포를 포함한다. 세포는 동물로부터 유래될 수 있고, 일부 실시형태에서, 세포는 포유류 세포이다. 세포는 배양할 수 있는 임의의 유형의 세포일 수 있다. 실시형태에서, 세포는 인간 세포, 선택적으로 조상 세포이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 조건화된 조직 배양 배지가 제공된다. 액체 조직 배양물에서 임의의 통상적으로 사용될 수 있는 배지는 단리된 유미목 양서류 세포제거된 ECM 또는 단리되고, 세포제거된 유미목 양서류 ECM으로부터 유래된 유미목 양서류 분획으로 조건화된다. 수많은 액체 조직 배양 배지는 상업적으로 입수가능하고, 당업자에게 잘 공지되어 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 장치가 제공된다. 장치는 서로에 대해 적층되는 단리된 유미목 양서류 세포제거된 ECM의 적어도 2개 시트이다. 시트는 동일 또는 상이한 조직으로부터 유래될 수 있다. 시트는 배향성일 수 있고, 동일 방향으로 배양되거나 서로에 대해 기울어져서 배양될 수 있다. 시트는 추가로 유미목 양서류에 이종이식인 임의의 작용제를 포함할 수 있으며, 이 작용제는 적층된 시트 중 하나 이상에 코팅되거나, 주입되거나 또는 침윤되거나 또는 달리 부착될 수 있다.
시트를 수반하는 상기 기재한 임의의 실시형태에서, 시트는 뒤판 및/또는 접착제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 생성물이 제공된다. 생성물은 유미목 양서류로부터 유미목 양서류 ECM을 단리시키는 단계, ECM의 세포를 제거하는 단계 및 세포제거된 ECM을 멸균화하는 단계에 의해 제조된다. 장치의 제조는 다음의 단계 중 임의의 하나 이상을 추가로 수반할 수 있다(특정 순서로 제시되지 않음): ECM을 형상으로 형성하는 단계, ECM을 균질화하는 단계, ECM을 재료에 적층하는 단계, ECM에 작용제를 코팅, 침윤 또는 달리 부착하는 것과 같이 ECM에 작용제를 조합하는 단계 등.
본 발명의 일 양태에 따르면, 생물학적 재료를 제조하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 (A) 유미목 양서류로부터 세포외 기질을 포함하는 조직 샘플을 얻는 단계, 및 (B) 샘플의 충분한 세포 구성성분을 제거하도록 샘플의 세포를 제거하여 이종이식편으로서 생체재료의 항원성을 감소 또는 제거하는 단계를 수반한다. 실시형태에서, 상기 방법은 ECM이 세포가 그 위에서 또는 그 안에서 성장할 수 있는 기질로서 유용하게 되는데 충분하게 ECM의 구조적 및 기능적 완전성을 유지하는 방식으로 세포제거를 수행하는 단계를 추가로 수반할 수 있다. 임의의 실시형태에서, 상기 방법은 ECM을 균질화하여 미립자 또는 분말을 형성하는 단계를 추가로 수반할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 겔로서 분말을 재구성하는 단계를 추가로 수반할 수 있다. 임의의 실시형태에서, 상기 방법은 ECM을 멸균하는 단계를 추가로 수반할 수 있다. 임의의 실시형태에서, 상기 방법은 유미목 양서류에 대해 이종성인 작용제에 ECM을 부착하는 단계를 추가로 수반할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 재료가 상처에, 수술층에, 그리고 내부 및 외부 조직에 도포되는 경우, 이식물, 장치, 시트, 겔 및 분말과 같은 재료는, 일반적으로 부착을 방지하고 조직 지지체를 제공하기 위해, 예를 들어 조직 봉합을 위해, 탈장을 치료하기 위해 또는 조직 플러그로서, 화상 및 피부 찰상뿐만 아니라 이하에 기재된 다른 병태를 치료하기 위해, 대상체를 치료하기 위한 방법에서 사용될 수 있다.
상기 임의의 실시형태에서, ECM은 단리되고 또는 단리될 수 있다.
도 1은 EC 구성요소를 동정하기 위한 조직학적 시험을 위해 준비한 천연 아홀로틀 조직 샘플을 도시한 도면.
도 2 천연 아홀로틀 진피 조직 및 인간 양막의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 및 알시안블루(Alcian Blue) 염색(40x 배율)을 도시한 도면;
도 3은 40x 배율에서 천연 아홀로틀 진피 조직 및 인간 양막 조직의 종-특이적 콜라겐 IV 및 라미닌 항체를 통한 면역조직화학적 염색을 도시한 도면;
도 4는 EC 구성요소를 동정하기 위한 조직학적 시험을 위해 준비한 아홀로틀 피부 및 인간 양막 샘플을 도시한 도면;
도 5는 아홀로틀 진피 조직의 H&E-염색된, 짝지어진 천연 절편과 가공 후 절편의 조직학적 평가를 도시한 도면;
도 6은 인간 양막 조직으로부터의 데이터에 비해 가공 전 및 가공 후 아흘로톨 조직에서 DNA 함량에 대한 ELISA 데이터를 도시한 도면.
정의
"항균성 폴리펩타이드"(또는 "AMP")는 박테리아, 바이러스, 진균, 원생동물, 기생충, 프리온 및 종양/암 세포를 포함하는 다양한 범위의 미생물유기체에 대해 넓은 범위의 활성을 지니는 가변적 길이, 서열 및 구조의 작은 펩타이드를 의미한다. (예를 들어, 문헌[Zaiou, J Mol Med, 2007; 85:317] 참조, 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨). AMP는 잠재적으로 낮은 수준의 유도된 내성 및 수반되는 넓은 항-염증 효과를 지니는 사멸 활성의 넓은 범위의 빠른 개시를 가진다.
항-미생물 폴리펩타이드는 디펜신, 예컨대 a-디펜신(예를 들어, 호중구 디펜신 1, 디펜신 알파 1, 호중구 디펜신 3, 호중구 디펜신 4, 디펜신 5, 디펜신 6), β-디펜신(예를 들어, 베타-디펜신 1, 베타-디펜신 2, 베타-디펜신 103, 베타-디펜신 107, 베타-디펜신 110, 베타-디펜신 136), 및 θ-디펜신을 포함한다. 항균성 폴리펩타이드는 hCAP 18과 같은 카텔리시딘을 포함한다.
"생체적합성"은 생체내 조성물 및 그의 정상 분해 산물이 유용한 실행적 및/또는 허용가능한 용인 내에서 대상체에서 실질적으로 비-독성 및 비-발암성이라는 것을 의미한다.
"세포질 적합성"은 조성물이 세포 집단의 생존능력 및 성장을 지속할 수 있다는 것을 의미한다.
"세포제거된 ECM"은 기질이 이종이식편으로서 비독성인 것으로 고려되는 정도로 세포외 기질의 항원성을 제거 또는 감소시키는 세포 구성성분이 충분히 없는 세포외 기질을 의미한다.
본 발명의 ECM과 관련하여 사용될 때 "단리된"은 다른 유미목 양서류 조직으로부터 분리되는 것을 의미한다.
"비-독성"은 대상체에 이식될 때 조성물이 신체 내 세포 및 조직에 대해 유해한 반응 또는 실질적인 유해함을 거의 또는 전혀 야기하지 않으며, 신체 내 세포 및 조직에 대해 실질적인 유해 반응 또는 실질적인 유해함을 야기하지 않고, 예를 들어, 조성물은 이식된 또는 도포된 조성물로부터 조직에 대해 유해함을 초래하는 괴사, 감염 또는 실질적인 면역 반응을 야기하지 않는다는 것을 의미한다.
"전구체 세포"는 특정 조건 하에서 더 분화된 세포 유형으로 분화될 수 있는 세포를 의미한다. 조상 세포의 비-제한적 예는 전능성, 만능성, 다능성 줄기 세포일 수 있거나, 또는 조상 세포로서 지칭될 수 있는 줄기 세포를 포함한다. 조상 세포의 추가적인 비-제한적 예는 혈관주위 줄기 세포, 아체 세포, 및 다계통 조상 세포를 포함한다.
본 발명의 ECM과 관련하여 사용되는 "구조적 및 기능적 완전함을 유지하는"은 생체내 또는 시험관내 세포의 성장을 위한 기질로서 기질의 사용을 허용하고 지지하는 충분한 구조 및 기능을 유지하는 것을 의미한다.
"대상체"는 동물을 의미한다. 일부 실시형태에서, 동물은 포유류이다. 포유류는 개, 고양이, 말, 소, 염소, 양, 돼지 또는 비-인간 영장류일 수 있다. 임의의 실시형태에서, 포유류는 인간일 수 있다.
"치료" 또는 "치료하는"은 상처 치유, 조직 폐쇄, 조직 팽화, 조직 부착 방지, 조직에 대한 구조적 지지체의 제공, 보호 장벽 제공, 결함의 수정 등을 보조하는 것과 같이 바람직한 임상적/의학적 종점을 달성하는 목적을 지니는 조성물의 임의의 적합한 투약 수단, 요법 및 경로에 의해 대상체에 투여 또는 적용되는 것을 의미한다.
"세포제거된 유미목 양서류 ECM으로부터 유래된 유미목 양서류 분획"은 전자현미경, HPLC, 면역조직화학 등 중 임의의 하나 이상에 의해 유미목 양서류로부터 얻은 추출물을 구별하기 위해 추출물 또는 단리물 내 2개(또는 3 또는 4, 또는 5개 이상)의 화학적 독립체의 화학 구조 및/또는 상대적 화학 농도에 대해 유미목 양서류의 충분한 특징을 유지하는 세포제거된 유미목 양서류 ECM의 추출물 또는 단리물을 의미한다.
일반적 제조 방법
본 발명에 따르면, 세포제거로부터 얻은 유미목 양서류 조직 샘플은 미국 특허 제2008/0046095호 또는 미국 특허 제2010/0104539호에서 상술된 방식으로 처리될 수 있다. 따라서, 조직 샘플은 세정 및 화학적 탈오염이 실시될 수 있다. 이 방식에서, 조직 샘플은 실온에서 또는 거의 실온에서 18% NaCl(초등장성(hyperisotonic) 식염수) 용액을 함유하는 멸균 수반(basin)에서 대략 10 내지 30분 동안 세척된다. 조직 기저막에 인접한 상피 세포와 같은 가시적 세포 파편은 기저막에 노출을 위해 멸균 스펀지를 사용하여 부드럽게 씻겨진다. 평활 기기, 세포 스크레이퍼 또는 멸균 게이지를 사용하여, 임의의 잔여 파편 또는 오염재료가 또한 제거된다. 막의 냉동, 세포 스크레이퍼를 사용하는 물리적 제거 또는 비이온성 세정제에 대한 세포의 노출, 음이온성 세정제 및 뉴클레아제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다른 기법이 또한 세포를 제거하기 위해 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 유미목 양서류 조직은 알칼리 처리를 사용하여 세포제거된다.
조직은 화학적 탈오염의 다음 단계를 위해 날진(Nalgene) 용기와 같은 멸균 용기에 위치된다. 따라서, 각각의 용기는 18% 식염수 용액으로 무균 상태로 채워지고, 밀봉된다(또는 상부가 폐쇄됨). 이어서, 용기는 로커 플랫폼 상에 위치되고, 30분 내지 90분 동안 교반되고, 추가로 오염재료의 조직을 세정한다.
멸균 환경에서, 멸균 포셉을 이용하여 조직은 18% 초등장성 식염수 용액을 함유하는 용기로부터 부드럽게 제거되고, 비어있는 용기 내로 위치된다. 이어서, 조직을 지니는 이런 비어있는 용기는 사전 혼합된 항생물질 용액으로 무균 상태로 채워진다. 바람직하게는, 사전혼합된 항생물질 용액은 스트렙토마이신 설페이트 및 겐타마이신 설페이트와 같은 항생물질의 칵테일을 포함한다. 다른 항생물질, 예컨대 폴리믹신 B 설페이트 및 바시트라신 또는 현재 또는 장래에 입수가능한 유사한 항생물질이 마찬가지로 적합하다. 항생물질 용액은 조직의 온도를 변화시키거나 또는 달리 손상시키지 않도록 첨가될 때 실온인 것이 바람직하다. 이어서, 조직 및 항생물질을 함유하는 이 용기는 밀봉 또는 폐쇄되고 로커 플랫폼 상에 위치되며, 바람직하게는 60 내지 90분 동안 교반된다. 항생물질 용액 내에서 조직의 이러한 로킹(rocking) 또는 교반은 오염재료 및 박테리아의 조직을 추가로 세정한다.
멸균 환경에서, 용기는 개방되고, 멸균 포셉을 이용하여 조직이 부드럽게 제거되며, 멸균수 또는 정상 식염수(0.9% 식염수 용액)를 함유하는 멸균 수반에 위치된다. 조직은 적어도 10분 내지 15분 동안 멸균수/정상 식염수 용액 중에서 제자리에서 침지된다. 조직은 조직으로부터 항생물질 용액 및 임의의 다른 오염재료의 제거를 용이하게 하기 위해 약하게 교반될 수 있다.
일부 경우에, 본 발명은 투타플라스트(Tutaplast)(등록상표) 및 알로워시(Allowash)(등록상표) 절차를 설명한 바와 같은 화학적 멸균 방법을 이용하여 선택적으로 바이오클린스(BioCleanse)(등록상표) 시스템에서와 같이 화학적 작용제를 부드럽게 교반시키는 기계적 공정과 조합하여, 유미목 양서류 조직을 치료하는 것을 수반한다. 따라서, 유미목 양서류 조직은 세포벽을 분해하고, 병원균을 불활성화시키며, 박테리아를 제거하기 위해 산화적 및/또는 알칼리 처리뿐만 아니라 삼투 처리가 실시된다. 추가로, 조직은 최종 생성물의 멸균성을 보장하기 위해 탈지질화, 용매 탈수(콜라겐 구조를 손상시키는 일 없이 조직의 실온 저장을 허용하기 위함) 및/또는 저선량 감마선 조사가 실시될 수 있다.
세포제거 시 효율적인 세포 제거는 핵 및 세포질 구조, 세포내 단백질을 나타내기 위한 면역조직화학 또는 면역형광 분석 및 DNA 검출을 비롯한 다양한 공지된 수단에 의해 확인될 수 있다. 최종 유미목 양서류-유래 스캐폴드 생체재료에서 바람직한 구성성분의 특성은 치료되는 임상적 적응증에 따라서 다르다. 일단 특정 적응증이 동정되면, 지식이 있는 임상의는 유미목 양서류 조직 샘플 내 구성성분이 최종 스캐폴드 생성물 중에서 유지되어야 한다는 것을 결정할 수 있고, 목적으로 하는 구성성분이 세포제거 후 존재한다는 것을 보장하기 위해 표준 방법이 사용될 수 있다.
샘플은 과정을 모니터링하고 목적으로 하는 세포 성분 제거 정도에 도달된 것을 확인하기 위해 세포 제거 전에, 제거 동안 및/또는 제거 후에 조직학적으로 살펴볼 수 있다. 예를 들어, 조직은 충분한 세포제거를 측정하기 위해 세포골격 함량에 대해 분석될 수 있다. 세포 내 단백질 함량은 또한 세포 제거가 충분하지 여부를 결정하기 위해 분석될 수 있다. 추가로, 조직 샘플 두께 및 화학적 구성은 세포제거가 달성되었을 때 결정하기 위해 모니터링될 수 있다. 가공 동안 주기적 모니터링은 관찰된 조직 특성에 대한 실시간 반응을 허용한다.
일부 경우에, 충분하게 세포제거된 조직은 ㎎ ECM 건조 중량 당 50ng 이하의 dsDNA를 포함한다. 대안적으로, 일부 적응증에 대해, 충분하게 세포제거된 조직은 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 또는 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색한 조직 절편 내 가시적 핵 재료가 없다.
인접한 상피 세포층의 제거가 필요한 시나리오에서, 샘플 내 남아있는 상피 세포의 존재 또는 부재는 당업계에 공지된 기법을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 상피 세포층의 제거 후에, 가공 로트로부터의 대표적인 조직 샘플은 표준 현미경 시험 슬라이드 상에 위치된다. 이어서, 조직 샘플은 에오신 Y 염색을 이용하여 염색되고, 이하에 기재된 바와 같이 평가된다. 이어서, 샘플을 덮고 방치한다. 일단 염색이 되도록 적절한 양의 시간이 지난다면, 확대 하에 시각적 관찰을 행한다. 세포 및 세포 재료의 존재는 탈상피화된 영역보다 더 어둡게 나타날 것이다.
일단 세포 제거가 충분하게 진행되면, 남아있는 ECM 스캐폴드의 목적으로 하는 구조적 및 기능적 특성의 보유를 확인하기 위해 전통적인 방법을 사용한다. 수행되어야 하는 구체적 구조 시험은 최종 스캐폴드 생성물의 의도된 임상적 적용에 의존한다. 일부 경우에, 유미목 양서류 조직 출발 물질은 목적으로 하는 구조적 성분 및 배치가 최종 생성물에서 유지되는 것을 보장하기 위해 세포제거 전에, 제거동안 및 제거 후에 모니터링될 수 있다.
목적으로 하는 ECM 구성성분이 제공되는지 여부를 결정하기 위한 한 방법은 유사 조직 절편을 염색하는 단계 및 유미목 양서류 조직의 목적으로 하는 구성성분 및 구조적 배향이 보존되었는지 여부를 결정하기 위해 그들을 조직학적으로 시험하는 단계를 수반한다. 예를 들어, 유미목 양서류 조직은 ECM 및 라미닌의 보존을 평가하기 위해 라미닌에 대해 H&E 및 면역과산화효소 염색으로 염색될 수 있다. 일반적으로, 최종 생체재료 스캐폴드 생성물에 남아있는 ECM 구성성분의 3-차원 입체배치는 조직학적 염색을 통해 관찰할 때 사전 세포제거된 재료에 가까웠다. 본 발명의 ECM은 AMP가 풍부하기 때문에 다른 구성성분에 대한 분석은 AMP에 대한 것이다.
따라서, 본 발명의 유미목 양서류-유래 생체재료는 향상된 재생피화를 지시하고, 효율적인 조직 재생 또는 상처 치유를 촉진하는데 유용한 ECM 구성성분을 포함한다. 본 발명의 생체재료는 또한 성장인자, 부착 단백질 및 AMP와 같은 생활성 펩타이드에 대한 기질 및 저장소로서 작용한다. 따라서, 생체재료는 필수적 생활성 자극과 구조적 지지체를 둘 다 제공하는 조직 재생을 위한 생물학적 스캐폴드로서 효과적으로 작용한다. 생성물은 더 작은 조각 또는 형상으로 절단되고, 그 자체 또는 다른 재료에 적층되며, 부착물을 고정시키기 위한 개구부를 제공하도록 사전 천공되고, 목적으로 하는 3차원 형상뿐만 아니라 다른 형식으로 형성되며, 이하에 더 상세하게 논의되는 바와 같이 사용될 수 있다.
분말 및 겔
실시형태에서, 스캐폴드는 작은 과립 또는 분말로 추가로 가공될 수 있다. 미립자는 물, 식염수 또는 적합한 완충제 또는 매질 중에서 수화되어 페이스트 또는 겔을 생성한다. 그것으로부터 생성된 이 미세한 재료, 페이스트 또는 겔은 다수의 목적을 위해 사용될 수 있으며, 이하에 더 상세하게 기재된다.
수많은 방법이 존재하지만, 스캐폴드의 미립자 형태를 생성하기 위해 2가지 예시적 방법이 사용될 수 있다. 제1 방법은 소독된 재료를 동결시키는 단계 및 이어서, 액체 질소 중에 샘플을 침지시키는 단계를 수반한다. 이어서, 순간 냉동시킨 재료는 배합기를 이용하여 작은 조각으로 줄이고, 따라서 입자는 윌리밀(Wiley mill)과 같은 회전식 나이프 밀에 위치되기에 충분히 작다. 수집된 분말 크기를 목적으로 하는 크기, 예를 들어 250㎜ 미만으로 제한하기 위해 #60 스크린을 사용할 수 있다. 더 큰 입자를 제거하고/하거나 목적으로 하는 범위 내에서 입자 크기 분포를 얻기 위해 초음파 선별기(Sonic sifter) 또는 다른 분류 장치를 사용할 수 있다. 제2 방법은 샘플이 30%(w/v) NaCl 용액 중에 5분 동안 처음 침지된 것을 제외하고 이전의 방법과 유사하다. 이어서, 재료는 액체 질소 중에서 순간 냉동되어 염 결정을 침전시키고, 잔여 물을 제거하기 위해 동결건조된다. 이어서, 이 재료는 상기에 기재한 바와 같이 분쇄된다. 샘플 내에서 NaCl을 침전시킴으로써, 포매된 염 결정은 재료가 더 균일한 크기의 입자로 분획화되게 하는 것으로 예상된다. 이어서, 입자는 탈이온수 중에서 현탁되고, 1000rpm에서 5분 동안 3회 원심분리되어 NaCl을 제거한다. 현탁액은 순간 냉동되고, 다시 동결건조된다. 최종적으로, 분말은 로터리 나이프 밀에 위치되어 개개 입자를 분해한다.
분말은 겔화를 보충하기 위해 다른 겔화 재료과 함께 또는 겔화 재료 없이 겔을 생성하기 위해 수화될 수 있다.
분말, 페이스트 또는 겔은 대상체를 치료하기 위해 추가 가공 없이 적용될 수 있다. 상처 또는 수술 부위에 분무, 페인팅, 주사 또는 달리 적용될 수 있다. 겔은 형상화될 수 있다. 분말, 페이스트 또는 겔은 또한 중합체 합성 재료 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 ECM 시트와 같은 "백" 내부에 위치되어 더 큰 3차원 구조, 예컨대 연골 수복을 위한 정형 외과적 이식물(예를 들어, 무릎 또는 TMJ 연골 수복) 또는 유방 재건 또는 확대를 위한 이식물을 생성할 수 있다. 이러한 경우에, 바람직한 크기 및 형상의 백은 ECM 재료 또는 다른 생체적합성 중합체 재료의 시트로부터 형성되고, 이어서, 백 또는 커버는 본 명세서에 기재된 조직-유래 분말 또는 겔로 충전될 수 있다. 장치 또는 이식물의 형상은 그의 의도된 사용에 따라 다를 수 있다. 백은 임의의 유용한 몰딩 기법에 의해 유용한 형상, 예컨대 귀, 코, 무릎, TMJ, 늑골 등에 대한 연골의 형상으로 성형된 후에, 본 명세서에 기재된 스캐폴드 재료로 성형된 백을 충전할 수 있다. 일 예에서, 생분해성 중합체 기질(예를 들어, PEUU 또는 PEEUU)은 주형으로 분무 또는 전착된다. 이어서, 얻어진 성형 커버는 재료로 충전될 수 있다. 가열은, 예를 들어, 커버를 밀봉하기 위해 사용될 수 있다.
첨가제
다른 실시형태에서, 유미목 양서류에 이종이식된 적어도 하나의 작용제는, 그것이 대상체에 이식되거나, 대상체에 달리 투여되거나 또는 세포 배양물에서 사용되기 전에 ECM 또는 이의 유미목 양서류 분획에 첨가된다. 일반적으로, 작용제는 세포 배양에 유용한 임의의 작용제 또는 치료제 또는 치료적 애주번트를 포함한다. 작용제는 본 발명의 ECM 상에 코팅되거나, ECM 내로 주입되거나 또는 ECM에 대해 달리 공유적으로 또는 비-공유적으로 부착되거나 또는 ECM 상에 또는 내로 혼입될 수 있다. 작용제는 또한, 예를 들어, 작용제 및 ECM의 분말을 함께 혼합함으로써, ECM을 함유하는 생성물과 달리 조합될 수 있다. 각각의 작용제는 본 발명의 ECM 단독으로 또는 다른 작용제와 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 작용제의 비제한적 예는 항균제, 성장인자, 사이토카인, 케모카인, 유연제, 레티노이드, 스테로이드 및 세포(대상체 자체의 세포를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않음)를 포함한다.
특정 비제한적 실시형태에서, 작용제는 성장인자이다. 성장 인자의 비제한적 예는 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor: bFGF), 산성 섬유아세포 성장인자(acidic fibroblast growth factor: aFGF), 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor: VEGF), 간세포성장인자(hepatocyte growth factor: HGF), 인슐린-유사 성장인자 1 및 2(IGF-1 및 IGF-2), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 간질 유래 인자 1 알파(SDF-1 알파), 신경 성장 인자(NGF), 섬모 향신경성 인자(CNTF), 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, 뉴로트로핀-5, 플레이오트로핀 단백질(신경돌기 성장-촉진 인자 1), 미드카인 단백질(신경돌기 성장-촉진 인자 2), 뇌-유래 신경영양인자(brain-derived neurotrophic factor: BDNF), 종양 혈관형성 인자(tumor angiogenesis factor: TAF), 부신피질자극 호르몬 방출인자(corticotrophin releasing factor: CRF), 형질전환 성장인자 .알파, 및 .베타.(TGF-.알파. 및 TGF-.베타.), 인터류킨-8(IL-8), 과립세포-대식세포집락자극인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor: GM-CSF), 인터류킨 및 인터페론을 포함한다. 신경영양 및 혈관생성 인자를 포함하는 다양한 성장인자의 상업적 제조는 문헌[R & D Systems, Minneapolis, Minn.; Biovision, Inc, Mountain View, Calif; ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., Rehovot, Israel; and Cell Sciences. RTM., Canton, Mass]으로부터 이용가능하다.
특정 비제한적 실시형태에서, 치료제는 항균제, 예컨대, 항미생물 펩타이드, 아이소나이아지드, 에탐부톨, 피라진아마이드, 스트렙토마이신, 클로파지민, 리파부틴, 플루오로퀴놀론, 오플록사신, 스파르플록사신, 리팜핀, 아지트로마이신, 클라리트로마이신, 다프손, 테트라사이클린, 에리트로마이신, 시프로플록사신, 독시사이클린, 암피실린, 암포테리신 B, 케토코나졸, 플루코나졸, 피리메타민, 설파다이아진, 클린다마이신, 린코마이신, 펜타미딘, 아토바쿠온, 파로모마이신, 디클라자릴, 아시클로비르, 트라이플루오로유리딘, 포스카르넷, 페니실린, 겐타마이신, 간시클로비르, 이아트로코나졸, 미코나졸, Zn-피리티온 및 은 염, 예컨대 염소, 브롬, 요오드 및 과요오드산염이다.
특정 비제한적 실시형태에서, 치료제는 항염증제, 예컨대 제한 없이, NSAID, 예컨대 살리실산, 인도메타신, 인도메타신 나트륨 3수화물, 살리실아마이드, 나프록센, 콜히친, 페노프로펜, 설린닥, 디플루니살, 디클로페낙, 인도프로펜, 살리실아마이드나트륨; 항-염증성 사이토카인; 항염증성 단백질; 스테로이드 항염증제; 또는 항응고제, 예컨대 헤파린이다.
상처 치유 및/또는 조직 재생을 촉진할 수 있는 다른 약물이 또한 포함될 수 있다.
작용제는 임의의 유용한 방법에 의해, 예를 들어 흡착 및/또는 흡수에 의해 스캐폴드 내에 분산될 수 있다. 예를 들어, 치료제는 용매(예를 들어, DMSO) 중에 용해될 수 있고, 스캐폴딩에 첨가될 수 있다. 다른 실시형태에서, 작용제는 담체 중합체(예를 들어, 폴리락트산-글라이콜산 미립자, 아가로스, 폴리(에스터 유레탄) 유레아 탄성중합체(PEUU) 또는 폴리(에터 에스터 유레탄) 유레아 탄성중합체(PEEUU))와 혼합되며, 이는 후속적으로 분산되거나 또는 스캐폴드에 적용된다. 담체 중합체 또는 탄성중합체와 작용제를 배합함으로써, 치료제의 방출 속도는 중합체 분해 속도에 의해 및/또는 확산 또는 다른 것에 의해 중합체로부터의 방출에 의해 제어될 수 있다. 마찬가지로, 치료제는 당 또는 다당류 기질을 포함하는, 약제학적 분야에서 공지된 바와 같이 연장된 방출을 위해 임의의 용해성 기질로 제공될 수 있다. 작용제는 또한 분말 ECM을 포함하고 분말 ECM과 함께 겔화될 수 있다. 작용제는 본 발명의 ECM에 공유적으로 부착될 수 있다. 앞의 언급은 비제한적 예를 의미한다.
추출물
미립자 또는 분말로서 그의 천연 상태 또는 분쇄물 중의 세포제거된 ECM에 추가로, 본 발명은 또한 이의 추출물 및 단리물을 제공한다. 상기 언급한 바와 같이, 유미목 양서류 ECM은 항균성 펩타이드, 성장 촉진 인자, 콜라겐 및 라미닌과 함께 장입되고, ECM의 유미목 양서류 분획은 본 발명에 따라 유용하다.
추출 완충제는 당업계에 잘 공지되어 있다. 하나의 이러한 완충제는 50mM 트리스-HCl, pH 7.4 중에서 각각 준비한 4M 구아니딘 및 2M 유레아이다. ECM의 분말 형태를 각각 1mM에서 페닐메틸 설포닐 플루오라이드, N-에틸말레이미드 및 벤즈아미딘(프로테아제 저해제)를 함유하는 적절한 추출 완충제(예를 들어, 25% w/v) 중에 현탁시키고, 4℃에서 24시간 동안 격렬하게 교반시킬 수 있다. 이어서, 추출 혼합물을 원심분리시키고 나서, 상청액을 수집할 수 있다. 불용성 재료를 추출 완충제 중에서 세척하고 나서, 원심분리시키고, 세척물을 본래 상청액과 합할 수 있다. 상청액을 탈이온수에 대해 투석할 수 있다. 이어서, 투석물을 원심분리시켜 임의의 불용성 재료를 제거하고, 상청액을 즉시 사용하거나 장기간 저장을 위해 동결건조시킬 수 있다. 이러한 단리물은 유미목 양서류에 대해 특이적인 농도로 성장 인자를 함유할 것이다.
다른 양태에서, 추출물은 배지를 조건화시킴으로써 행해진다. 분말 ECM을 취하는 단계, 용액을 형성함으로써 상청액 및 미립자를 생성하는 단계(상청액은 추출물임) 및 미립자로부터 추출물을 단리시키는 단계에 의한 유미목 양서류 조직-특이적 추출물의 제조방법. 또한 ECM 상에서 세포를 성장시키고, 일정한 세포 성장 시간 후에 상청액을 단리시킬 수 있었다.
합성 재료
합성 생체적합성 및 세포질-적합성 재료를 ECM, 예를 들어, (a) ECM의 시트 또는 겔에 대한 구조적 지지체, (b) ECM을 형상화하기 위한 구조적 지지체, (c) ECM에 대한 코팅(또는 미립자 ECM을 함유하는 코팅), 보충적 겔화제, 또는 (d) 미립자 ECM 또는 이의 단리물에 대한 지속 방출 재료와 조합할 수 있다. 이러한 중합체는 그 자체가 생분해성인 재료를 포함하는 뒤판 시트로서 다른 ECM 재료에 적용되는 것으로 알려져 있다. 기질에 대한 적합한 합성 재료는 이동 및 면역학적 합병증을 불가능하게 하기 위해 생체적합성일 수 있고, 세포 성장 및 분화 세포 기능을 지지할 수 있다. 완전히 천연 조직 대체물을 고려하는 일부는 재흡수성이다. 일부는 다양한 형상으로 설정 가능할 수 있으며, 염증 시 붕괴를 방지하기 위한 충분한 내구성을 가진다. 연구는 폴리글라이콜산으로 구성된 생분해성 폴리에스터 중합체가 모든 이들 기준을 충족시킨다는 것을 나타낸다(Vacanti, et al. J. Ped. Surg. 23:3-9 (1988); Cima, et al. Biotechnol. Bioeng. 38: 145 (1991); Vacanti, et al. Plast. Reconstr. Surg. 88:753-9 (1991)). 다른 합성 생분해성 지지체 기질은 합성 중합체, 예컨대 폴리 무수물, 폴리오쏘에스터 및 폴리락트산을 포함한다. 합성 중합체 및 이들 기질에 세포를 혼입 또는 포매하는 방법의 추가적인 예는 또한 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,298,002호 및 제5,308,7호를 참조.
비제한적 예로서, 분말은 3-블럭 공중합체로 제형화될 수 있다. 국제 특허 출원 공개 WO2012131104호 및 WO2012131106호를 참고하며, 이들 각각은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 다른 예는 폴록사머를 포함하는데, 이는 폴리옥시에틸렌(폴리(에틸렌 옥사이드))의 2개의 친수성 쇄에 측접하는 폴리옥시프로필렌(폴리(프로필렌 옥사이드))의 중심 소수성 쇄로 구성된 비이온성 3블록 공중합체이다. 폴록사머는 또한 상표명 플루로닉스(Pluronics)(바스프(BASF))에 의해 공지되어 있다. 특정 폴록사머는 약제용의 지속 방출 재료로서 유용하다.
본 발명의 입자는 또한 중합체, 하이드로겔 및/또는 수술 봉합제로 캡슐화될 수 있다. 비제한적 예로서, 중합체, 하이드로겔 또는 수술 봉합제는 PLGA, 에틸렌 비닐 아세테이트(EVAc), 폴록사머, 겔사이트(GELSITE)(등록상표)(플로리다주 앨라추아에 소재한 나노쎄라퓨틱스 인코포레이티드(Nanotherapeutics, Inc.)), 하일레넥스(HYLENEX)(등록상표)(캘리포니아주 샌디에이고에 소재한 할로자임 쎄라퓨틱스(Halozyme Therapeutics)), 수술 봉합제, 예컨대 피브리노겐 중합체(조지아주 코넬리아에 소재한 에티콘 인코포레이티드(Ethicon Inc.)), 티셀(TISSELL)(등록상표)(디어필드 111에 소재한 박터 인터네셔날 인코포레이티드(Baxter International, Inc)), PEG-계 봉합제 및 COSEAL(등록상표)(디어필드 111에 소재한 박터 인터네셔날 인코포레이티드)일 수 있다. 다른 실시형태에서, 입자는 대상체에게 주사될 때 겔을 형성할 수 있는 당업계에 공지된 임의의 중합체로 캡슐화될 수 있다. 다른 비제한적 예로서, 입자는 생분해성일 수 있는 중합체 기질로 캡슐화될 수 있다. 제어 방출 및/또는 표적화된 전달을 위한 중합체의 추가적인 예는 또한 적어도 하나의 제어 방출 코팅을 포함할 수 있다. 제어된 방출 코팅은 오파드라이(OPADRY)(등록상표), 폴리비닐피롤리돈/비닐 아세테이트공중합체, 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 유드라지트(EUDRAGIT) RL(등록상표), 유드라지트 RS(등록상표) 및 셀룰로스 유도체, 예컨대 에틸셀룰로스 수성 분산물(아쿠아코트(AQUACOAT)(등록상표) 및 서릴리스(SURELEASE)(등록상표))을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
용도
본 명세서에 기재된 세포제거된 ECM은 사실상 임의의 생체내, 생체밖 또는 시험관내 용도에서 세포, 조직, 기관을 성장시키는데 유용하다. ECM은 세포의 성장 및/또는 분화를 용이하게 하는 기질로서 사용될 수 있다. 시험관내에서, ECM은 줄기 세포, 조상 세포 또는 분화된 세포를 포함하는 사실상 임의의 유형의 세포 또는 세포주를 비롯한 세포 배양물 중에서의 성장을 지지하는 세포 성장 기질로서 유용하다. 일 실시형태에서, 세포는 암세포이다. 일 실시형태에서, 암세포는 ECM 상에서 성장될 때 결절을 형성한다. 기질 상의 세포는 또한 조직, 기관 또는 신체 부분 전구체 또는 심지어 성숙 조직 또는 구조로 성장될 수 있다. ECM 상에서 성장시킨 세포는 이식을 위해, 상처 드레싱을 위해, 시험관내 약물 시험을 위해, 모델링 분화 등을 위해 사용될 수 있다. 세포는 ECM에 조직 세포 유형으로 매칭될 수 있고 혹은 매칭되지 않을 수도 있다. 세포는 이종이식편이다.
본 발명의 ECM은 인간 또는 동물 중 하나의 대상체에서 조직의 수복, 대체 또는 증대를 포함하는 임의의 유용한 목적을 위해 조직 성장을 위한 세포 성장 스캐폴드로서 생체내에서 유용하다. 예를 들어, 재료는 외상 또는 수술 동안 상실 또는 손상된 조직의, 예를 들어 종양 제거 후 조직의 상실에서 수복 및/또는 대체에서 유용하다. 재료는, 구조적 수복, 예컨대 서혜부 탈장 수복, 장루 주위 강화, 연조직 강화, 수술적 스테이플 선 강화(예를 들어, 비만대사 수술 또는 폐 절제술 동안), 제대탈장 접합, 페이로니 수복 접합(Peyronie's repair graft), 절개 접합 및 누공 플러그에 대해 유용하다. 재료는 상처 드레싱, 예컨대 화상, 중간층 이식 덮기, 욕창 궤양을 포함하는 궤양 및 피부 찰과상 절차에 대해 유용하다. 재료는 미용적 목적에 대해, 예를 들어 유방, 입술 또는 궁둥이 확대에서 유용하다. 항-부착 수술 용도에 대해 특히 호소하는 본 발명의 양태는 부착을 저해 또는 방지하는 기저막의 특성이다. AMP의 존재는 앞서 언급한 적용에 특히 적합한 본 발명의 ECM을 생성한다.
상기 언급한 바와 같이, 본 명세서에 기재된 재료는, 예를 들어 연골세포 및/또는 연골조상세포와 함께 재료를 파종함으로써, 예컨대 연골수복 또는 대체를 위해 목적으로 하는 형상을 형성하기 위해 구조 내에서 성형 또는 수용될 수 있다. 재료는 분말로 분쇄되고 세포 배양 첨가물로서, (a)상처, (b) 이식물, (c) 상처 드레싱 등에 적용을 위한 분말, 스프레이, 액체, 현탁액 또는 코팅으로서 겔을 재구성 및/또는 형성하기 위해 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 예를 들어, 지방 줄기 세포는 본 명세서에 기재된 세포 성장 스캐폴드에서 증식된다. 지방 줄기 세포는 중배엽 유래이다. 그들은 전형적으로 만능성이고, 중배엽 조직, 예컨대: 성숙 지방 조직; 뼈; 심막, 심외막, 심근 외막, 심근, 심막 및 판막 조직을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 심장; 진피 결합조직; 혈관 조직; 근육 조직; 비뇨생식기 조직; 늑막 및 복막 조직; 내장; 중배엽 선상 조직; 및 간질 조직으로 발생되는 능력을 가진다. 세포는 성숙(완전히 분화된) 세포로 분화될 수 있을 뿐만 아니라, 적절한 전구체 세포로 분화될 수 있다(예를 들어 제한 없이, 지방선구세포, 프리미오사이트(premyocyte), 선 골세포(preosteocytes)). 또한, 배양 조건에 따라서, 세포는 또한 발생 표현형, 예컨대 배아, 태아, 백혈구생성, 신경성 또는 신경유전적 발달 표현형을 나타낼 수 있다.
일 실시형태에서, 대상체 자체의 세포는 기질 내에서 분산된다. 예를 들어, 연골 조직의 생성에서, 연골세포 및/또는 연골조상 세포는 기질 내에서 분산되고 선택적으로 이식 전에 생체 밖에서 성장될 수 있다. 마찬가지로, 대상체의 피부 세포는 화상 또는 찰과상과 같은 대상체의 손상된 피부 표면 상의 이식 전에 스캐폴딩 내에서 분산될 수 있다.
겔로서 사용될 때, 비제한적 예는 상처에서와 같이 바람직한 부위에서 대상체에 겔을 주입하는 것이다. 일 예에서, 겔은 뼈 골절에 또는 뼈 내의 드릴링된 구멍에 주사되어 뼈에 대해 대체 인대와 같은 구조의 수복 및/또는 부착을 용이하게 할 수 있다. 다른 용도에서, 미세하게 세분된 입자는 거대 표면 찰과상 또는 화상의 경우에서와 같이 대상체의 표면 상에 분사될 수 있다. 스캐폴드는 또한 흉터를 억제하기 위해 피부 봉합선 상에 분사될 수 있다. 본 발명의 ECM은 상기 언급한 바와 같은 수술 부위에서 신체 내부의 제자리에 위치되거나 또는 봉합될 수 있다. 모든 이들 치료는 본 발명에 의해 포괄된다.
유미목 양서류 세포제거된 ECM은 또한 숙주의 부위에 대해 치료적 분자, 단백질 또는 대사산물의 지속 전달을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 부착을 방지하거나, 박테리아를 제외하거나 또는 박테리아 활성을 저해하거나, 혹은 조직의 치유 또는 성장을 촉진하기 위해 조직 표면에 대한 양막 덮기를 기재하는 미국 특허 제2004/0181240호 및 화상 및 가교된 암모니아막의 제조 및 상처를 치료하기 위한 방법에서 그들의 이용방법에 관해 미국 특허 제4,361,552호 참조. 본 발명의 ECM은 동일한 방식으로 사용될 수 있다.
약제학적 제형
본 명세서에 제공된 약제학적 조성물의 설명은 원칙적으로 인간에 대한 투여에 적합한 약제학적 조성물에 관한 것이지만, 이러한 조성물은 일반적으로 임의의 다른 동물에게, 예를 들어 비-인간 동물, 예를 들어 비-인간 포유류에게 투여에 적합하다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 다양한 동물에 대한 투여에 적합한 조성물을 제공하기 위하여 인간에 대한 투여에 적합한 조성물의 변형은 잘 이해되고 있고, 보통의 숙련된 수의약리학자는 만약에 있다면 단지 보통의 실험을 이용하여 이러한 변형을 설계 및/또는 수행할 수 있다.
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 약리학 분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 부속 성분과 함께 활성성분을 운반하는 단계, 및, 이어서, 필요하고/하거나 바람직하다면, 목적으로 하는 단일- 또는 다회용 입체배치로 생성물을 분할, 형상화 및/또는 포장하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 ECM은 단일 단위 용량으로서 및/또는 복수의 단일 단위 용량으로서 대량으로 제조, 포장 및/또는 시판될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 0.1% 내지 100%(w/w)의 ECM을 포함할 수 있다. 다른 활성제가 포함될 때, 본 발명의 ECM과 조합된 상대적 양의 작용제는 선행기술에서 제형화된 바와 같이 ECM과 조합되어 사용된 해당량과 유사하게 당업자에게 공지될 것이다. 상대적 양은 또한 치료 중인 대상체의 신원, 크기 및/또는 병태에 따라서, 그리고 추가로 ECM이 투여될 경로에 따라서 다를 수 있다.
약제학적 제형은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 목적으로 하는 특정 투약량에 적합하게 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 희석제 또는 다른 액체 비히클, 분산물 또는 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장제, 증점제 또는 유화제, 보존제 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 약제학적 조성물에 대한 다양한 부형제 및 조성물을 제조하기 위한 기법은 당업계에 공지되어 있다. 본 명세서에 전문이 참고로 포함되는 문헌[Remington: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (21st Ed.), A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins (Baltimore, Md., 2006)] 참조.
실시예
실시예 1. 아홀로틀 진피의 처리
아홀로틀 진피 샘플을 건강한 또는 치유된 아홀로틀 진피 조직으로부터 절단한 샘플을 준비하고, 이어서, 세포 용해를 위한 저장성/고장성 담지를 샘플에 실시하고, 용매 탈수 및 오븐 건조에 의해 세포제거할 수 있다. 이들 접합의 구체적 과정은 15 내지 26% NaCl 중에 저장, 다회 저장성/고장성 담지(NaCl 용액 및 물을 이용), 및 이어서, 에탄올을 이용하는 용매 탈수, 및 이어서 공기 건조 또는 37℃에서 오븐 건조를 이용하는 용매의 증발을 포함한다.
천연 아홀로틀 진피 조직의 조직학적 시험을 수행하여 기저막과 같은 주목할 만한 ECM 구성요소의 존재를 동정하였다. 도 1 및 도 4를 참조. 천연 아홀로틀 진피 조직 및 인간 양막의 비교 조직학적 및 면역조직화학적 분석을 수행하여 ECM 구조와 구성성분을 비교하고, 중요한 구성성분의 상대 농도 및 분포를 평가하였다. 도 2, 도 3 및 도 4 참조. 도 3은 40x 배율에서 천연 아홀로틀 진피 조직 및 인간 양막 조직의 종-특이적 콜라겐 IV 및 라미닌 항체를 통한 면역조직화학적 염색을 나타낸다. 도 2는 천연 아홀로틀 진피 조직 및 인간 양막의 H&E 및 알시안 블루(Alcian Blue) 염색(40x)을 나타내고, 조직 둘 다에서 비슷한 조직 구조 및 황산 글라이코사미노글라이칸을 입증한다. 아홀로틀 진피 조직의 헤마톡실린 및 에오신-염색된, 짝지어진 천연 및 가공후 절편을 이용하는 조직학적 평가(도 5 참조)는 세포외 기질 조직구조의 가공 후 보존 및 세포의 부재 또는 세포 파편의 임의의 상당한 농도를 나타내었다.
실시예 2. 무세포 탈수 아홀로틀 진피의 분열 및 적층.
세포제거된 탈수 아홀로틀 진피를 기계적 스플리터를 통해 분열시켜 이종성 기질을 동종 절편으로 단리시킬 수 있다. 이어서, 목적으로 하는 두께의 단리된 절편을 재수화시키고, 동결건조시켜 안면 특징에 의해 목적으로 하는 배향의 다층 적층 구조를 얻을 수 있다. 더 구체적으로, 목적으로 하는 안면 특성을 얻기 위해 진피 기질의 망상 진피 영역으로부터 얻은 내부의 개방 다공성 기질을 지니는 양면 기저막 구조를 구성할 수 있다. 대안적으로, 단리된 천연 절편을 목적으로 하는 이상 결과를 위한 천연 형태에서 사용할 수 있다. 예를 들어, 망상 진피의 개방 다공성 균질 기질을 사용하여 연조직 구조의 증가를 얻을 수 있다.
안면 둘 다에 황화 점다당질을 지니는 적층된 관습적 작제물 및 콜라겐 IV 및 라미닌을 임상적 이점을 위해 바람직한 양면, 항-부착 및 항균성 특성에 대해 얻을 수 있었다. 추가로, 다층 구조는 접합의 생체내 내구성을 연장시키도록 구성될 수 있었다.
실시예 3 가용화된 무세포 탈수 아홀로틀 진피, 심막, 대퇴근막, 골막, 배막 또는 뇌경막의 준비
세포제거된 연조직 구조를 1㎠ 절편으로 절편화하고, 수성 1M 빙초산 중에서 30 내지 60초 동안 워링(Warring) 배합기 내에서 절편을 균질화함으로써(~100그램의 조직) 무세포 유미목 양서류의 결합 조직 기질의 세포제거된 탈수 아홀로틀 천연 또는 단리된 절편을 준비할 수 있다. 물의 용적을 달리하여 첨가하고, 이어서 목적으로 하는 기하학적 형상의 주형에서 슬러리를 중화 및 동결건조함으로써 스펀지 제제를 얻을 수 있다. 얻어진 다공성은 기질에 첨가한 물의 용적과 상관관계가 있을 것이다. 추가적으로, 작제물에 공유적으로 부하될 수 있는 분해된 인간 또는 유미목 양서류 무기염화된 및 비무기염화된 결합조직, 예컨대 세포제거된 골기질, 엘라스틴 또는 뼈형성 단백질로부터 추출된 미립자 또는 소 단백질 구성성분을 포함하는, 선택된 범위의 생활성 추출물을 중화 전에 슬러리에 첨가할 수 있다. 추출물은 중화 후 콜라겐 섬유와 공유적으로 결합되고, 피브리노겐화가 일어나는 생리적 조건으로 복귀할 것이다. 생활성 구성성분의 후속 방출은 생체내 단백질 분해 동안 일어날 것이고, 분자가 생체내 급성 염증 동안 소모 또는 노출되지 않는 것을 보장한다. 대안적으로, 중화 전에 수성 NaCl을 슬러리에 첨가하여 실온에서 안정한 주사용의 지속된 저점성 용액을 얻을 수 있다. 이온-선택적 막을 통한 슬러리의 주사는 염 이온을 제거할 것이고, 주사 및 3차원 기질의 형성 후에 피브리노겐형성이 일어나게 한다.
실시예 4 무기염화되고 비-무기염화된 세포제거되고 탈수된 유미목 양서류 결합조직 기질의 멸균 참여 또는 분말 형태의 준비
무기염화된 콜라겐 유미목 양서류 결합조직 절편의 세포제거 후에, 유리스트(Urist)에 의해 사용한 것과 유사하게 탈무기염화 방법, 용매 또는 동결건조 탈수, 절편화된 무세포 탈무기염, 무기염 또는 비-무기염화된 유미목 양서류 결합조직 세포외 기질의 극저온 밀링을 수행함으로써 보존된 조직구조 및 기능을 지니는 ECM의 미립자 또는 분말 형태를 얻을 수 있다. 최종 입자 크기 분포는 지속기간 및 체질(sieving)에 따라서, 극저온밀링 후 125 내지 850마이크론으로 다를 수 있다. 저선량 냉각 감마 조사 또는 e-빔 조사(<25 Kgy)를 사용하여 무세포 ECM 시트, 미립자 또는 분말 및 관습적 유전자 조작 작제물을 멸균할 수 있다.
실시예 5. 무세포 무기염화된 및 비-무기염화된 유미목 양서류의 건강한 또는 치유한 결합조직 기질의 시험관내 특성규명
일련의 시험관내 분석을 통해, 양면 기저막 시트 기질 또는 단리된 천연 균질 개방 다공성 기질과 같은 다층 작제물 또는 용해, 동결건조 및 장입된 ECM-유래 콜라겐 스펀지를 포함하는 세포제거된 세포외 기질 작제물 및/또는 미립자의 천연 또는 관습적 유전자 조작 기능 및 구조 특성의 세포제거 및 보존을 확인할 수 있다. 세포 파편에 대한 마커로서 DNA 함량을 96-웰 플레이트에서 170 작업 용액 대 30 샘플/표준의 비로 형광 염료인 퀀트-아이티 피코그린(Quant-iT PicoGreen)(미국에 소재한 몰레큘러 프로브(Molecular Probes))을 이용하는 단일, 에탄올-기반 추출 기법을 이용하여 정량적으로 세포제거를 평가하기 위해 사용할 수 있다. 짝지어진 천연 및 가공 후 분석 및 상업적으로 입수가능한 조직 ECM에 대한 비교를 수행하여 용인성을 확인할 수 있다. 도 6 참조.
생활성 구성성분 및 천연 및 가공 후 단백질 분해 재흡수 프로파일의 정량화를 위한 ELISA 분석을 수행할 수 있다. 콜라게나제(232 내지 262㎎/단위 활성)를 이용하는 분해시, 37℃에서 24시간 동안 pH 7.6 완충제(50mM 트리스-HCl, 200mM CaCl2, 50mM NaCl) 중의 세포제거되고 탈수된 유미목 양서류 ECM 조직 또는 작제물(미국에 소재한 시그마(Sigma))의 정규화된-중량-대-표면적 절편을 다양한 시점에 분석하여 가공 전 및 가공 후 조직의 상대적 재흡수를 구성하여 조직구조의 보존을 확인할 수 있다. 산/염-세척 분해물의 100㎕ 알리쿼트 중에서 시르콜(Sircol) 키트(영국 바이오컬러 엘티디(Biocolor Ltd.)를 이용하여 분해 후 가용화된 콜라겐을 평가할 수 있다. 구체적으로, BMP 2/4 및 TGF-1 성장 인자 또는 황화 점다당질의 수준을 상업적으로 입수가능한 ELISA 키트(미네소타주 미니애폴리스에 소재한 알앤디 시스템즈(R&D Systems))에 의한 분해 후에 평가할 수 있다. 1:10 희석에서 단백질 함량을 표준 브래드포드 흡광도 분석을 통해 측정할 수 있다.
샘플의 현미경 평가를 4% 파라폼알데하이드 및 파라핀 포매에서 고정, 5㎛에서 절편화 및 일상적 조직학적 염색(미국에 소재한 히스토서브 인코포레이티드(Histoserv, Inc.))을 이용하여 수행할 수 있다. 헤마톡실린 및 에오신으로 횡단면을 염색할 수 있다. 올림푸스(Olympus) IM 도립현미경에 대해 표준 브라이트필드 기법을 이용하여 영상을 획득하고 분석할 수 있다. 등급화된 에탄올 시리즈(15%, 30%, 50%, 70%, 95% 및 100%) 중에서 탈수, CO2에서 임계점 건조 및 금으로 증착 코팅 후에 주사 전자 현미경을 이용하여 샘플을 분석할 수 있다. FEI 퀀타(Quanta) 600 FEG 주사 전자 현미경에서 샘플을 시각화할 수 있고, 스캐폴드 초미세구조의 대표적인 이미지를 획득할 수 있다.
24시간에 정량적 세포 생존능력 평가를 위해 직접적 세포 접촉 방법(ISO 10993, 파트 5)을 세포독성 시험을 위해 연장된 시점(48 및 72시간)에 수행하여 세포 증식 및 부착 효능을 측정할 수 있다. 배양 웰의 전달 및 트립신처리 후에 혈구계산판 중의 비부착 세포의 수동 계수화를 수행할 수 있다. 셀타이터(CellTiter) 96 분석을 수행하여 4일 후에 살아있는 세포를 정량화할 수 있다. 살아있는/사멸된 세포 염색 키트를 마찬가지로 사용하여 24시간에 형광 현미경을 통해 스캐폴드를 시각화하고, 이에 의해 제4일에 생체적합성을 확인할 수 있다.

Claims (33)

  1. 세포제거된(decellularized) 생체재료로서, (A) 유미목 양서류(urodele)로부터 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)을 포함하는 조직 샘플을 얻는 단계, 및 (B) 상기 샘플을 구조적 및 기능적 완전성을 유지하도록 세포제거하는 한편 상기 샘플의 충분한 세포 구성성분을 제거하여 이종이식편(xenograft)으로서 상기 생체재료의 항원성을 감소 또는 제거하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 세포제거된 생체재료.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포제거 단계는 상기 조직 샘플에 알칼리 처리를 실시하는 단계를 포함하는, 세포제거된 생체재료.
  3. 제1항에 있어서, 상기 방법은 상기 샘플에 멸균화를 실시하는 단계를 더 포함하는, 세포제거된 생체재료.
  4. 제1항에 있어서, 탈활력화된(devitalized) 세포를 더 포함하는, 세포제거된 생체재료.
  5. 제1항에 따른 유미목 양서류로부터 유래된 세포외 기질 구성성분을 포함하는 조직 이식편.
  6. 제1항에 따른 단리되고, 세포제거된 유미목 양서류 ECM.
  7. 제6항에 있어서, 상기 ECM은 아홀로틀 조직(axolotl tissue)으로부터 유래된, 유미목 양서류 ECM.
  8. 제6항에 있어서, 상기 ECM은 기저막을 포함하는, 유미목 양서류 ECM.
  9. 제6항에 있어서, 상기 ECM은 성장인자, 사이토카인, 케모카인, 단백질, 탄수화물, 당, 스테로이드, 항균제, 합성 중합체, 접착제, 약물 또는 단리되거나 합성또는 재조합적으로 생산된, 인간에서 발견되는 제제인, 유미목 양서류에 대해 이종성인 제제에 주입, 코팅 또는 부착되는, 유미목 양서류 ECM.
  10. 제9항에 있어서, 상기 제제는 인간 세포인, 유미목 양서류 ECM.
  11. 제6항에 있어서, 상기 ECM은 시트인, 유미목 양서류 ECM.
  12. 제11항에 있어서, 상기 시트는 천공을 포함하는, 유미목 양서류 ECM.
  13. 제6항에 있어서, 상기 ECM은 건조 분말인, 유미목 양서류 ECM.
  14. 제6항에 있어서, 상기 ECM은 재구성된 겔인, 유미목 양서류 ECM.
  15. 제6항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ECM은 멸균인, 유미목 양서류 ECM.
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  28. (A) 유미목 양서류로부터 ECM을 포함하는 조직 샘플을 얻는 단계, 및 (B) 상기 샘플의 충분한 세포 구성성분을 제거하도록 상기 샘플의 세포를 제거하여 이종이식편으로서 생체재료의 항원성을 감소 또는 제거하는 단계를 포함하는, 생체재료를 제조하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 방법은 ECM이 세포가 그 위에서 또는 그 안에서 성장할 수 있는 기질로서 유용하게 되는데 충분하게 ECM의 구조적 및 기능적 완전성을 유지하는 방식으로 상기 세포제거를 수행하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 세포제거된 ECM을 균질화하여 분말을 형성하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 겔로서 상기 분말을 재구성하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  32. 제29항에 있어서, 상기 세포제거된 ECM을 멸균화하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  33. 제29항에 있어서, 유미목 양서류에 대해 이종성인 제제에 상기 세포제거된 ECM을 부착하는 단계를 더 포함하는, 방법.
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