JP2016504932A - 非哺乳動物組織からの脱細胞化生体材料 - Google Patents

Abstract

有尾類の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）および付随する皮膚組織の成長因子プロファイル、結合組織マトリックス成分、および免疫特権状態は、その中に存在する抗菌ペプチドの存在と共に、有尾類由来の組織を、異種移植のための生物学的足場の理想的なソースにする。具体的には、生物学的足場生体材料は、以下を含む方法により得ることができる：（Ａ）有尾類からの組織試料を得ること、ここで該組織は、基底膜を含むＥＣＭを含み、および（Ｂ）試料に対して、線維性および非線維性タンパク質、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）およびプロテオグリカンの保持により細胞外マトリックスの構造的および機能的完全性を保持し、同時に異種移植用に抗原性および免疫原性を低減または排除するために試料の十分な細胞成分を除去する、脱細胞化プロセスを施すこと。得られた有尾類由来の生体材料は、皮膚のホメオスタシスの回復を向上させるため、手術後の炎症によって引き起こされる関連損傷の重症度、持続時間を低減するため、および自然治癒および再生プロセスの進行を促進するために、使用することができる。さらに、生体材料は、損傷していないヒト組織の品質、機能、およびコンプライアンスに匹敵する、リモデル組織の形成を促進する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、３５ＵＳＣ§１１９（ｅ）の下で、２０１３年１月９日に出願された米国仮出願第61/750,555号の利益を主張する；この出願の全内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

発明の背景
組織工学の試みは、生物学的機能を置換するため、特に組織全体またはその一部を修復または置換するための方法および材料を作り出すために継続されている。この点において、創傷療法および皮膚の修復は、病気やけがによる皮膚の完全性の喪失が生命を脅かす慢性的な合併症を引き起こし得るために、優勢な重点分野である。

創傷治癒には、損傷後の組織を再構成するための、細胞、成長因子、および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分の間の複雑な相互作用が関与する。成人の哺乳動物組織における創傷治癒プロセスは十分に特徴づけられており、炎症、増殖、およびリモデリング（再構築）の３つの段階に分けることができる。

典型的には、切開または外傷に反応して、身体は、傷に形成された空隙（空洞または負の空間とも呼ばれる）に血液、血液生成物、およびタンパク質を運搬する。初期の炎症の間、炎症性メディエーターの影響下および血管拡張の結果として、創傷滲出物が形成され始める。凝固血液中に存在するフィブリンおよびフィブロネクチンは足場(scaffold)を提供し、その上を通って、ケラチノサイト、血小板および白血球などの細胞が創傷部位に移動する。細菌およびデブリ（破片）は貪食されて除去され、線維芽細胞の移動および分裂を刺激する成長因子が放出される。

創傷治癒の次の段階は、新たな組織の形成が、肉芽組織と呼ばれる線維性結合組織（線維芽細胞、マクロファージ、および新生血管から構成される）がフィブリン塊に置き換わるにつれて生じることを含む。この段階の間に新しい血管が形成され、線維芽細胞が増殖して、コラーゲンおよびフィブロネクチンを分泌することにより、仮のＥＣＭを生成する。ほぼ全ての哺乳動物細胞は、正常に増殖し機能するために、表面への付着を必要とする。ＥＣＭはこの機能を果たす。当初、仮のＥＣＭは、ＩＩＩ型コラーゲンのネットワーク、すなわち急速に生成されるコラーゲンの弱い形式を含んでいる。これは後に、より強いＩ型コラーゲンで置き換えられる（これが瘢痕形成に寄与する）。同時に、表皮の再上皮化が起きる。このプロセスの間、移動する細胞の先端でメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）などのプロテアーゼおよびコラゲナーゼが凝血塊に侵入するのを助けるにつれて、上皮細胞が増殖して新たに形成される組織の上に移動する。これらの酵素は、成長因子シグナル伝達（細胞−細胞相互作用）および細胞−ＥＣＭ相互作用（細胞、インテグリン（細胞表面受容体）、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン、およびその他のＥＣＭタンパク質の間の相互作用からのシグナル伝達）に加えて、細胞の移動を、創傷中およびＥＣＭ分解へと刺激する。

最後に、リモデリング段階において、コラーゲンが再構築され、テンションラインに沿って再整列されて、不要になった細胞がアポトーシスにより除去される。線維芽細胞がＥＣＭタンパク質および成長因子との相互作用を介して筋線維芽細胞へ変換されるにつれて、創傷収縮が発生する。筋線維芽細胞は次に、コラーゲン、ビトロネクチン、および他のＥＣＭタンパク質と相互作用して、創傷を縮小する。リモデリング段階が進むにつれて、フィブロネクチンおよびヒアルロン酸は、組織に力を付与するコラーゲン束で置き換えられる。

組織修復および再生に生物学、化学、および工学の原理を適用することで、組織のエンジニアは、組織の修復および再生プロセスを促進するために用いられる移植可能な生成物を開発した。損傷を受けた組織の生体力学的機能を回復する能力は、真の課題を提示する。これに応答して、組織修復を促進するために組織構造および機械的挙動を（ある程度）模倣する、合成的および生物学的両方の足場生成物が開発されている。かかる生成物は、損傷した、患部の、または存在しない組織のための、機械的および機能的両方の一時的な代替品として機能する。

理想的には、移植可能な足場生成物は、細胞の接着、増殖、および分化を支持し、新組織を形成する前の細胞のための中間合成細胞外マトリックス（ＥＣＭ）として作用する。足場材料は、生体適合性かつ生分解性で、低い抗原性を示さねばならない。インプラントは、新たな組織の形成とほぼ同じ速度で分解する必要がある。移植されると、足場は、新たな組織が形成されるまで、構造的支持を一時的に提供するために必要な機械的特性を有することが必要である。
さらに、足場生成物は多孔質であり、栄養の送達および組織の内部成長のための適切な経路を提供しなければならない。組織足場はまた、迅速な治癒を促進し、外観と機能の両方において正常な宿主組織に似ている新たな組織の発達または再生を促進する必要がある。この目的のために、移植された足場生成物は、（ｉ）細胞移動、増殖および分化を奨励するための、生物活性的刺激、例えばタンパク質および分子のシグナル伝達、および（ｉｉ）これらのプロセスのための機械的または構造的な支持を、提供しなければならない。

今日、合成足場の開発は活発な研究領域である。合成足場は、繊維状ポリマー、ゼラチン、アパタイト、およびポリマー／セラミック複合材、ポリ乳酸、コラーゲンなどの化学化合物から製造されている。これらの足場は、天然に存在するＥＣＭの構造を模倣するように設計されており、骨組織工学においてある程度の成功を示している。

合成足場生成物に加えて、哺乳動物の組織から得られた生物学的足場が、同種移植片（同種のドナーからの移植細胞または組織）または異種移植片（異なる種のドナーからの移植細胞または組織）として使用するために市販されている。生物学的足場は、例えば、ヒト（生きているドナーまたは死体のいずれか）、ブタ、ウシおよびウマなどを含む種々の哺乳動物の、真皮、膀胱、小腸、中皮、心膜、骨または羊膜から採取した、哺乳動物ＥＣＭから構成されている。これらの市販の生成物は、軟組織、腱、心臓組織、神経組織、慢性創傷、硬膜、骨および角膜などの、損傷を受けた、または失われた組織および臓器の修復と再建のために、一般的に使用されている。

生物学的足場生成物は、組織によって生成され脱細胞化処理を施した細胞外マトリックスに加えて、皮膚細胞を含み得る。これらは創傷部位と接触させられると、創傷治癒過程の一部として、細胞の移動および増殖のための機械的支持を与える。さらに、成長因子または他のタンパク質などの因子も提供されてよく、創傷治癒プロセスを促進する。生物学的足場の機械的および材料特性、およびこれらの生体材料に対する宿主組織の応答は、材料の三次元構造および製造加工方法により影響されると考えられている。さらに、成長因子、表面トポロジーおよび表面配位子の分布、および宿主自然免疫応答の調節はすべて、組織修復または再構築のための生物学的足場の最終的な機能的性能に寄与するものと考えられている。Tottey et ah, Biomaterials 32: 128-36 (2011)。

移植において、ヒト羊膜（ＡＭ）の使用は、比較的厚い基底膜の構造、関連する失活羊膜上皮細胞と間質、および対応する成長因子プロファイルと構造タンパク質組成のために、特定の利点を有する。Meller et ah, Dtsch Arztebl Infl 108: 243-8 (2011）。例えばＡＭは、上皮成長因子（ＥＧＦ）およびケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）を含み、これらは創傷治癒を促進するための重要な成長因子である。また、ＡＭに存在するラミニンおよびＶＩＩ型コラーゲンは、上皮親和性効果を示す。ＡＭはまた、種々の成長因子および炎症性サイトカインの発現を低下させ、一方で、ＩＬ−１０、ＩＬ−１受容体アンタゴニストなどの抗炎症性サイトカインを放出し、こうして、炎症応答を創傷治癒のために有利に調節すると考えられている。ＡＭは、おそらくは低いＭＨＣ Ｉ発現のおかげで免疫特権があり、したがってＡＭ組織の拒絶反応はまれである。これらの特徴は、他の創傷治癒用途のなかで、例えば眼の表面再構成に関して、骨盤再建、および潰瘍の処置において、ＡＭを理想的な基質とする。

従来の組織足場生成物の使用はしかし、欠点がないわけではない。ヒトドナーからの組織の収穫は、寄付のための皮膚の分離に関連するドナー部位の罹患率や感染症などの、望ましくない結果をもたらし得る。疾患の伝播リスクと試料間の変動は、生物学的足場生成物に関連する追加の欠点である。また、損傷組織の広い領域をカバーするのに必要な十分な組織成分を得ることは、困難となり得る。さらに、従来の生物学的および合成材料は高価であり、多くの場合には有効でなく、使用可能性が限定されている。

したがって、機能を回復しつつ組織の再生を促進するための、移植に使用するのに適した組織基質の生体材料に対する必要性が常に存在する。研究業界および医療移植コミュニティ両方が、容易に入手でき、ドナーまたはレシピエントに追加の複雑さを課すことがなく（基質を収穫するために追加の手術を必要とするなど）、天然の組織の物理化学的、電気化学的、および生化学的特性を反映する固有の材料機能性の全てまたは一部を示すような生成物から、利益を得るであろう。

本発明の生体材料は、有尾類の組織から得る。「有尾類」は、ここで、両生網の有尾目(Urodela)、また有尾目(Caudata)としても知られている、サンショウウオを意味する。系統発生の面では、関連する科としてはAmbystomatidae、Cryptobranchidae、Amphiumidae、Proteidae、およびSirenidaeを含む。Wiens et al, Syst. Biol. 54: 91-110 (2005) を参照；この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。したがって、有尾類(urodele)のカテゴリは、例えば、太平洋オオサンショウウオ(Andrias davidianus)、タイガーサラマンダー(Ambystoma tigrinum)、およびメキシコアホロートル(Ambystoma mexicanum)を含む。本発明者は、有尾類の皮膚およびＥＣＭが、ＡＭのそれらに類似した望ましい特性を有し、異種移植のための理想的な生体材料のソースとなることを認識している。

有尾類ＥＣＭおよび組織再生
両生類として、ほとんどの有尾類は幼生の状態で水生動物として生活を開始し、えらのある幼形から、肺を有し空気呼吸の陸生の成体形へと変態する。変態中、有尾類の物理的な特徴は、地上での生活の準備のために変化する。これらの変化は、尾びれの再吸収、皮膚の肥厚、皮膚腺の発達と鰓の吸収を含む。性的成熟も、ほとんどの有尾類でこの期間の間に生じる。有尾類のいくつかの科は「幼態保持」であり、すなわちかかる科のそれらの個体は、性的成熟後も、えらおよびひれなどの幼生時代の特徴を示し得ることを意味する。実際に、幼態保持の有尾類は多くの場合、一生を通してその水生（幼生）形態を保持している。したがって、メキシコアホロートルは通常、その成体期を通して幼態保持状態であるが、ただし特定の状況下では変態を受け、陸生形態に変形する。

アホロートルはまた、切断された身体部分を再生する能力で知られており、これは典型的には、損傷した手足または器官の、構造および機能両方の完全な回復をもたらす。水生アホロートルは、創傷治癒と四肢再生の際に迅速な再上皮化を受け、これらはどちらも、瘢痕のないプロセスである。同様に、変態陸生アホロートルは、いくつかの幼生皮膚機能を保持し、これも瘢痕のない創傷治癒を示すが、ただし、それらの水生の変態前のものよりも遅い速度である。

アホロートルでの治癒のプロセスは、成人哺乳動物で観察されるものとは異なる。アホロートルのプロセスは、胎児および胚における瘢痕のない治癒プロセスにより似ている。このように、かかる創傷もまた、出生後の哺乳動物における対応する事象と比較して、より速い速度で生じる再上皮化および基底膜の再形成（「強化」されている）を示す。

また、アホロートルの皮膚構造および皮下構造は、アホロートル皮膚が融合外胚葉および中胚葉から構成されているという意味で、羊膜／絨毛膜界面のそれと似ている。アホロートルの皮膚はまた、ＡＭと同様に、成長因子および抗菌性ペプチドが豊富である。さらに、アホロートルのＥＣＭは免疫特権を有し、特にコラーゲンＩＩＩおよびメタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）を含み、これもＡＭに類似する。

移植目的のために特に重要なのは、より一般的に、免疫原性がほとんど示されないという、ヒト新生児（例えば、胎性真皮）とＡＭの免疫学的な特権状態、すなわちアホロートルＥＣＭに映し出されている状態である。一般成人と比較して、低下した免疫応答および一般に低下した炎症反応のおかげで、新生児およびアホロートルの皮膚の治癒は共に、成人の創傷治癒において観察されるような、加速された組織吸収を特徴としない。むしろ、有尾類および新生児の組織両方の成長因子プロファイル、酵素活性、構造組成、および免疫調節効果は、創傷治癒の間に、再上皮化の強化に加えて、構造足場を適切な段階で除去し、得られた負の空隙空間の中に組織を成長させることを特徴とする。これにより、最適な創傷治癒環境およびプロセスがもたらされる。また、ＡＭおよび有尾類組織中に存在する高濃度の抗菌ペプチドは、好ましい環境および、創傷治癒の間に観察される再上皮化の促進にさらに貢献する。

本発明の重要な側面は、有尾類ＥＣＭおよび付随する皮膚組織の成長因子プロファイル、結合組織マトリックス成分、および免疫特権状態と、その中に存在する抗菌ペプチドの存在が、有尾類由来の組織を、異種移植のための生物学的足場の理想的なソースとするという、本発明者の認識である。

したがって本発明によれば、以下を含む方法の生成物である、生物学的足場生体材料が提供される：（Ａ）有尾類からの組織試料を得ること、ここで該組織は、基底膜を含むＥＣＭを含み、および（Ｂ）試料に対し脱細胞化プロセスを施して、線維性および非線維性タンパク質、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）およびプロテオグリカンの保持により細胞外マトリックスの構造的および機能的完全性を保持し、同時に異種移植用に抗原性および免疫原性を低減または排除するために、試料の十分な細胞成分を除去すること。さらに提供されるのは、皮膚のホメオスタシスの回復を向上させるため、手術後の炎症によって引き起こされる関連損傷の重症度、持続時間を低減するため、および自然治癒および再生プロセスの進行を促進するために、有尾類由来の生体材料を用いる方法である。さらに、本発明の生体材料は、損傷していないヒト組織の品質、機能、およびコンプライアンスに匹敵するリモデル組織の形成を促進する。

脱細胞化
本発明の生体材料は、有尾類から得た組織試料を脱細胞化することにより生産される。得られた有尾類生体材料の主成分は、ＥＣＭと、おそらくは失活上皮細胞であり、これは水分を保持し、また創傷治癒環境を保護することができる。

有尾類の皮膚は、本発明のための適切な出発物質の一例である。したがって、脱細胞化が施される出発物質は、表皮ありまたはなしの、有尾類真皮および基底膜を含むことができる。さらに脱細胞化の際に、本発明の生体材料は、ＥＣＭと共に、方法によって非生存可能にすることができる隣接した上皮細胞を含むことができる。代替的に、皮膚でない有尾類組織は、本発明の出発物質として、特に様々な体腔の内層を形成する基底膜または上皮組織を、すなわち、例えば胸腔内、腹腔内、および囲心腔内に見出される体壁中皮組織を含むものとして、機能することができる。軟骨、腱、骨、硬膜および筋膜などの線維性結合組織の相当量を含有する組織もまた、本発明の適切な出発物質の例である。

任意の従来の脱細胞化の方法論を介して達成される、有尾類組織の脱細胞化は、関連するＥＣＭの構造的完全性および組成を維持しつつ、炎症反応または免疫介在の組織拒絶反応を誘導可能な免疫原性細胞抗原を除去するために行われる。一般にＥＣＭ構造成分は、すべてではなくともその多くが脱細胞化の後に無傷のまま残り、これらは異種のレシピエントによって十分に耐容される。本発明の最終的な生体材料中に存在することができるＥＣＭ成分としては、以下が挙げられる：コラーゲン（例えば、繊維状コラーゲンＩおよびコラーゲンＩＩＩ、ならびに非繊維状コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶおよびコラーゲンＶＩＩ）、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、トロンボスポンジン、オステオポンチンおよびテネイシンなどのタンパク質、加えてＧＡＧ（例えば、プロテオグリカン、デコランおよびバーシカンおよび硫酸化ＧＡＧ、例えば、ヘパリン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸およびコンドロイチン硫酸）、および成長因子、例えばＶＥＧＦ、ＢＭＰ、ＴＧＦおよびＦＧＦ。いくつかの適応について、脱細胞化後の材料は、少なくともコラーゲンＩＶ、ラミニン、硫酸化ＧＡＧおよび１または２以上の成長因子を、組織学的および免疫組織染色を介して見た場合に、適切な脱細胞化前のレベルを近似する量で含む。

本発明に従って組織を脱細胞化するための適切な技術は、凍結、直接加圧、超音波処理、および撹拌などの物理的方法を含む。これに加えて、または代替的に、化学的方法も使用することができ、例えば、アルカリおよび酸処理、界面活性剤（両性、カチオン性、アニオン性および非イオン性界面活性剤を含む）、有機溶剤、低張溶液または高張溶液およびキレート化剤の適用である。
プロテアーゼ消化および１または２以上のヌクレアーゼによる処置を含む酵素的アプローチも、有尾類組織を脱細胞化するために使用することができる。これに加えて、または代替的に、有尾類組織は、洗浄、滅菌、消毒、抗生物質処置および／またはウイルスの不活化に供される。

本発明の一側面によれば、生体材料が提供される。材料は、（Ａ）有尾類からの、細胞外マトリックスを含む組織試料を得ること、および（Ｂ）試料を脱細胞化して、構造的および機能的完全性を保持しつつ、異種移植片としての生体材料の抗原性を低減または排除するために試料の十分な細胞成分を除去すること、を含む方法により生産される。いくつかの態様において、脱細胞化は、組織試料にアルカリ処理を施すことを含む。態様において、方法はさらに、前記試料を滅菌することを含むことができる。態様において、方法はさらに、細胞を失活化することを含むことができる。

本発明の一側面によれば、組織移植片が提供される。移植片は、有尾類由来の細胞外マトリックス成分を含む。態様において、細胞外マトリックス成分は、異種移植片として移植した場合に、免疫応答を誘発する成分を実質的に含まない。態様において、細胞外マトリックス成分は、非毒性である。

本発明の一側面によれば、脱細胞化有尾類ＥＣＭが提供される。いずれの態様においても、脱細胞化ＥＣＭは、アホロートル組織に由来することができる。いずれの態様においても、脱細胞化ＥＣＭは、基底膜を含むことができる。いずれの態様においても、脱細胞化ＥＣＭは、有尾類に異種の薬剤を注入し、これを被覆し、組み合わせ、または共有結合もしくは非共有結合により結合させることができる。いずれの態様においても、薬剤は、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、タンパク質、炭水化物、糖、ステロイド、抗菌剤、合成ポリマー、接着剤、薬物および／またはヒトの剤（すなわち、ヒトにおいて見出され、分離され、合成または組換え的に産生された薬剤）の任意の１つ、または任意の組み合わせであることができる。本発明の一部を形成するさらなるかかる薬剤は、以下でより詳細に記載される。いくつかの態様において、薬剤は、細胞、任意にヒト細胞である。いくつかの態様において、薬剤は、前駆細胞、任意にヒト前駆細胞である。本発明の一部を形成するさらなるかかる細胞は、以下により詳細に記載される。いずれの態様においても、脱細胞化ＥＣＭは任意の種々の形状をとることができ、なぜならば材料は、形成し、積層し、均質化し、ゲル化する等が可能だからである。いくつかの態様において、ＥＣＭはシートである。シートは任意に、穿孔を含むことができる。シートは任意に、バッキングおよび／または接着剤を含むことができる。バッキングは、生分解性であってもよく、または非生分解性であってもよい。いくつかの態様において、脱細胞化ＥＣＭは、乾燥粉末である。いくつかの態様において、脱細胞化ＥＣＭは、再構成ゲルである。いずれの態様においても、ＥＣＭは、滅菌であることができる。

本発明の一側面によれば、パッケージが提供される。パッケージは、滅菌脱細胞化有尾類ＥＣＭ、または滅菌脱細胞化有尾類ＥＣＭ由来の有尾類画分を含む。パッケージは、上述のＥＣＭのいずれかを含むことができる。例えば、パッケージは、脱細胞化有尾類ＥＣＭのシート、乾燥粉末または再構成ゲルを含むことができる。パッケージは任意の生成物を、例えば、滅菌脱細胞化有尾類ＥＣＭ、または滅菌脱細胞化有尾類ＥＣＭ由来の有尾類画分を含む、任意のインプラントを含むことができる。かかるインプラントは、全体が、または小部分が、本発明のＥＣＭで作られてよい。

本発明はまた、脱細胞化有尾類ＥＣＭまたは脱細胞化有尾類ＥＣＭ由来の有尾類画分を含む、滅菌医療用インプラントを提供する。かかる医療用インプラントの例としては、生体適合性のシート、メッシュ、ゲル、移植片、プラグ、組織またはデバイスを含む。デバイスとしては、例えば、被覆されたステント、骨置換物、関節置換物、移植可能なハードウェアなどが挙げられる。インプラントは、完全にまたは部分的に、ＥＣＭから製造することができる。インプラントはまた、本発明のＥＣＭをカプセル封入し、注入し、これで被覆し、これに含浸させ、これを積層し、またはこれに共有結合もしくは非共有結合的に結合することができる。

本発明はまた、分離された脱細胞化有尾類ＥＣＭまたは分離された脱細胞化有尾類ＥＣＭ由来の有尾類画分で、被覆された、これに含浸された、これをカプセル封入した、またはこれに結合された、材料を提供する。材料は、天然または合成であり得る。例としては、金属、プラスチック、セラミックおよび繊維である。

本発明の一側面によれば、組織培養系が提供される。系は、（ａ）分離された脱細胞化有尾類ＥＣＭ、（ｂ）組織培養培地、および（ｃ）有尾類に異種の細胞、を含む。細胞は動物からのものであってもよく、いくつかの態様において、細胞は哺乳動物細胞である。細胞は、培養可能な任意の種類の細胞とすることができる。態様において、細胞はヒト細胞、任意に前駆細胞である。

本発明の一側面によれば、調整組織培養培地が提供される。液体組織培養において一般的に使用される任意の培地を、分離脱細胞化有尾類ＥＣＭまたは分離脱細胞化有尾類ＥＣＭ由来の有尾類画分で調整する。多くの液体組織培養培地が市販されており、当業者に知られている。

本発明の一側面によれば、デバイスが提供される。デバイスは、互いに積層された、少なくとも２枚の分離脱細胞化有尾類ＥＣＭのシートである。シートは、同一または異なる組織に由来し得る。シートは配向させることができ、同じ方向に配向させるか、または互いに角度を持って配向させることができる。シートはさらに、有尾類に異種の任意の薬剤を含むことができ、この薬剤は、１または２以上の積層シートを被覆し、これに注入し、またはこれに含浸させ、またはそれ以外で結合させてよい。

シートが関与する、上記のいずれの態様においても、シートはさらに、バッキングおよび／または接着剤を含むことができる。

本発明の一側面によれば、生成物が提供される。生成物は、有尾類から有尾類ＥＣＭを分離し、ＥＣＭを脱細胞化し、および脱細胞化ＥＣＭを滅菌することにより、調製される。デバイスの調製は、次のステップの任意の１または２以上をさらに含むことができる（順不同で提示）：ＥＣＭをある形状に成形すること、ＥＣＭを均質化すること、ＥＣＭを材料に積層すること、薬剤を被覆、含浸などによりＥＣＭと組み合わせること、またはその他により薬剤をＥＣＭに結合すること。

本発明の一側面によれば、生物学的材料を調製する方法が提供される。この方法は、Ａ）有尾類からの、細胞外マトリックスを含む組織試料を得ること、および（Ｂ）試料を脱細胞化して、異種移植片としての生体材料の抗原性を低減または排除するために生体材料の十分な細胞成分を除去すること、を含む。態様において、方法はさらに、脱細胞化を、ＥＣＭが、その上または内側で細胞が成長できるマトリックスとして有用であることを可能にするのに十分な、ＥＣＭの構造的および機能的完全性を保持するような様式で実施することを含む。いずれの態様においても、本方法はさらに、ＥＣＭを均質化して、微粒子または粉末を形成することを含むことができる。いくつかの態様において、方法はさらに、粉末をゲルとして再構成することを含むことができる。いずれの態様においても、本方法はさらに、ＥＣＭを滅菌することを含むことができる。いずれの態様においても、本方法はさらに、ＥＣＭを有尾類に異種の薬剤に結合することを含むことができる。

本発明の別の側面によれば、インプラント、デバイス、シート、ゲルおよび粉末などの材料を、対象を処置する方法において使用することができ、ここで材料は、創傷、外科用ベッド、組織の内部および外部に対して、一般に、接着を防止するため、例えば縫合組織に対する組織の支持を提供するため、ヘルニアを処置するため、または組織プラグとして、火傷および削皮術(derm-abrasion)、ならびに以下に記載の他の状態の処置のために、適用される。

上記のいずれの態様においても、ＥＣＭは、分離されているか、または分離することができる。

図１は、ＥＣ要素の識別のために、組織学的検査用に調製された天然アホロートルの組織試料を示す図である。

図２は、天然アホロートルの真皮組織およびヒト羊膜の、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）およびアルシアンブルー染色を示す図である（倍率４０倍）。

図３は、天然アホロートルの真皮組織およびヒト羊膜組織の、種特異的なコラーゲンＩＶおよびラミニン抗体を介した、４０倍の倍率での免疫組織化学染色を示す図である。

図４は、ＥＣ要素の識別のために、組織学的検査用に調製されたアホロートル皮膚およびヒト羊膜の試料を示す図である。

図５は、Ｈ＆Ｅ染色された、アホロートルの皮膚組織の天然および処理後の対の切片の、組織学的評価を示す図である。

図６は、ヒト羊膜組織からのデータと比較した、処理の前および後のアホロートル組織中のＤＮＡ含有量についてのＥＬＩＳＡデータを示す図である。

好ましい態様の詳細な説明
定義
「抗菌性ポリペプチド」（または「ＡＭＰ」）は、細菌、ウイルス、真菌、原虫、寄生虫、プリオンを含む広範囲の微生物、および腫瘍／癌細胞に対して広いスペクトルの活性を有する、可変の長さ、配列および構造の小ペプチドを意味する。（例えばZaiou, J Mol Med, 2007; 85:317を参照：この全体は参照により本明細書に組み込まれる）。ＡＭＰは、広いスペクトルの迅速な殺傷活性の開始と、潜在的に低いレベルの誘導抵抗性、および付随する広範な抗炎症作用を有する。
抗菌ポリペプチドは、デフェンシン、例えばα−デフェンシン（例えば、好中球デフェンシン１、デフェンシンα１、好中球デフェンシン３、好中球デフェンシン４、デフェンシン５、デフェンシン６）、βデフェンシン（例えば、βデフェンシン１、βデフェンシン２、βデフェンシン１０３、βデフェンシン１０７、βデフェンシン１１０、βデフェンシン１３６）、およびθデフェンシンなどを含む。抗菌ポリペプチドは、ｈＣＡＰ１８などのカテリシジンも含む。

「生体適合性」とは、組成物およびそのin vivoでの正常な分解生成物が、有用で実用的および／または許容可能な耐容性の範囲内の対象において、実質的に非毒性かつ非発癌性であることを意味する。

「細胞適合性」とは、組成物が、細胞の集団の生存度および増殖を維持できることを意味する。

「脱細胞化ＥＣＭ」とは、マトリックスが異種移植片として非毒性であると考えられる程度に、細胞外マトリックスの抗原性を排除または低減するために十分なほど、細胞成分を含まない細胞外マトリックスを意味する。

本発明のＥＣＭに関連して使用される場合、「分離された」とは、他の有尾類組織から分離されていることを意味する。

「非毒性」とは、組成物が、対象に移植された場合に、体内の細胞および組織にほとんど、あるいはまったく有害な反応または実質的な害を引き起こさず、体内の細胞および組織に実質的に有害な反応または実質的な害を引き起こさないことを意味し、例えば、組成物は、壊死、感染、または移植もしくは適用された組成物から組織に対して害をもたらすような、実質的な免疫応答を引き起こさない。

「前駆細胞」とは、一定の条件下でさらに分化した細胞型に分化できる、細胞を意味する。前駆細胞の非限定的な例としては、全能性、多能性、多（分化）能性幹細胞であってよい幹細胞、または前駆細胞と呼ばれるもの、が含まれる。前駆細胞のさらなる非限定的な例は、血管周囲の幹細胞、芽細胞、および多系統(multilineage)前駆細胞を含む。

本発明のＥＣＭに関連して使用される「構造的および機能的完全性を保持する」とは、マトリックスの、in vivoまたはin vitroでの細胞の成長用基質としての使用を可能にし、支持するのに十分な、構造および機能を保持することを意味する。

「対象」とは、動物を意味する。いくつかの態様において、動物は哺乳動物である。哺乳動物は、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、または非ヒト霊長類であることができる。いずれの態様においても、哺乳動物はヒトであることができる。

「処置」または「処置する」とは、対象に対して組成物を、任意の適切な投与手段、計画および経路により、次の目的で投与すること：望ましい臨床／医療エンドポイントを達成する、例えば創傷治癒、組織閉鎖、組織バルキングを補助する、組織接着を防止する、組織に構造的支持を提供する、保護バリアを提供する、欠陥を修正する等、を意味する。

「脱細胞化有尾類ＥＣＭ由来の有尾類画分」とは、脱細胞化有尾類ＥＣＭの抽出物または分離物であって、抽出物を有尾類から得たものとして、電子顕微鏡法、ＨＰＬＣ、免疫組織化学などの任意の１または２以上によって識別するために、抽出物または分離物における２つの（または３つ、または４つ、または５、または６以上の）化学的実体の化学構造および／または化学濃度の点から十分な有尾類の特徴を維持している、前記抽出物または分離物を意味する。

一般的な調製方法論
本発明によれば、脱細胞化のために得た有尾類組織試料は、US 2008/0046095またはUS 2010/0104539に詳述されている方法で処理することができる。したがって、組織試料には、洗浄および化学的汚染除去を行ってもよい。この方法では、組織試料を、約１０〜３０分間、室温またはその近傍の１８％ＮａＣｌ（高張食塩水）溶液を含む滅菌洗面器(basin)で洗浄する。組織の基底膜に隣接した上皮細胞などの目に見える細胞の破片は、滅菌スポンジを使用して静かにこすり落として、基底膜を露出させる。とがっていない器具、細胞スクレーパまたは滅菌ガーゼを使用して、任意の残留破片または汚染も除去する。他の技術、例えば限定はされないが、膜の凍結、細胞スクレーパを使用した物理的な除去、または非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、およびヌクレアーゼへの細胞の暴露なども、細胞除去のために使用することができる。

一態様において、有尾類組織は、アルカリ処理を用いて脱細胞化される。

組織は、次の化学的汚染除去のステップのために、ナルゲン瓶などの滅菌容器内に入れる。したがって各容器には、無菌的に１８％食塩水を充填し、密封する（または上部で閉じる）。容器はその後ロッカープラットホーム上に置き、３０〜９０分間攪拌して、汚染物質の組織をさらに清浄にする。

滅菌環境で滅菌鉗子を使用して、組織を静かに１８％高張食塩水含有の容器から取り出し、空の容器に入れる。組織を入れたこの空の容器を次に、無菌的に予備混合した抗生物質溶液で満たす。好ましくは、予備混合した抗生物質溶液は、硫酸ストレプトマイシンおよび硫酸ゲンタマイシンなどの抗生物質のカクテルで構成されている。他の抗生物質、例えばポリミキシンＢ硫酸塩およびバシトラシン、または現在もしくは将来的に利用可能な類似の抗生物質も、同様に適している。抗生物質溶液は、組織の温度を変化させたり、その他で組織を損傷したりしないように、添加した時に室温であることが好ましい。組織および抗生物質を含有するこの容器を次に密封または閉じて、ロッカープラットホーム上に置き、好ましくは６０〜９０分間攪拌する。抗生物質溶液内の組織のかかる揺動または攪拌は、組織から汚染物質および細菌をさらに洗浄する。

滅菌環境で容器をあけ、滅菌鉗子を使用して組織を静かに取り出し、滅菌水または生理食塩水（０．９％食塩水）を含有する滅菌洗面器に入れる。組織を、滅菌水／生理食塩水中に少なくとも１０〜１５分間浸漬させる。組織をわずかに撹拌して、抗生物質溶液および他の汚染物質の、組織からの除去を促進することができる。

いくつかの場合において、本発明は、Tutaplast（登録商標）およびAllowash（登録商標）手順などの化学的殺菌方法論を用いて、任意に、BioCleanse（登録商標）システムにおけるように化学剤を静かに撹拌する機械的方法と組み合わせて、有尾類組織を処理することを含む。したがって、有尾類の組織には、酸化および／またはアルカリ処理、ならびに浸透圧処理を施して細胞壁を破壊し、病原体を不活性化し、および細菌を除去する。また組織には、脱脂質処理、溶媒脱水（コラーゲン構造を損傷することなく、組織の室温保存を可能にするため）、および／または低用量のガンマ線照射を施して、最終生成物の無菌性を確保してもよい。

脱細胞化の際の効率的な細胞除去の確認は、核および細胞質構造を検出する組織学的分析、指標細胞内タンパク質の免疫組織化学または免疫蛍光アッセイ、およびＤＮＡ検出を含む、種々の知られている手段によって行うことができる。最終の有尾類由来足場生体材料における望ましい成分の性質は、処置される臨床的徴候に依存して変化する。特定の徴候が識別されると、知識の豊富な臨床医は、有尾類組織試料中のどの成分が、最終的な足場生成物中に保持されるべきかを決定することができ、標準的な方法論を用いて、脱細胞化の後に所望の成分が存在することを確認できる。

試料は、脱細胞化の前、間、および／または後に組織学的に観察して、プロセスをモニタリングし、所望の程度の細胞成分の除去に達したことを確認する。例えば、組織を細胞骨格含有量について分析して、十分な脱細胞化について測定することができる。細胞内タンパク質含量をアッセイして、脱細胞化が十分であるかどうかを決定することができる。さらに、組織試料の厚さおよび化学的構成をモニタリングして、十分な脱細胞化がいつ達成されたかを決定することができる。処理中の定期的なモニタリングは、観察された組織特性に対してリアルタイムの応答を可能にする。

いくつかの場合において、十分に脱細胞化された組織は、ＥＣＭ乾燥重量１ｍｇ当たり５０ｎｇ未満のｄｓＤＮＡを含む。代替的に、いくつかの適応に対し、十分に脱細胞化された組織は、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）またはヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した組織切片に見られる核物質を欠いている。

隣接する上皮細胞層の除去を必要とするシナリオにおいて、試料中に残留する上皮細胞の存在または不在は、当技術分野で知られている技術を用いて評価することができる。例えば、上皮細胞層を除去した後、処理ロットからの代表的な組織試料を、標準的な顕微鏡検査スライド上に載せる。組織試料を次にエオシンＹ染色を用いて染色し、下記のように評価する。次に試料を覆い、放置する。染色を可能にする十分な時間が過ぎた後、倍率の下で目視観察を行う。細胞および細胞物質の存在は、脱上皮化された領域よりも暗く表示される。

細胞除去が十分に進行した後、従来の方法を用いて、残留しているＥＣＭ足場の所望の構造的および機能的特性の保持を確認する。実施すべき特定の構造試験は、最終的な足場生成物の意図される臨床用途に依存する。いくつかの場合において、有尾類組織出発物質を、脱細胞化の前、間および後にモニタリングして、所望の構造成分および構成が、最終生成物中に維持されていることを確認する。

所望のＥＣＭ成分が存在するかどうかを決定するための１つの方法は、平行組織切片を染色し、これを組織学的に検査して、有尾類組織の所望の成分および構造的配向が保存されているかどうかを決定することを含む。例えば、有尾類組織を、Ｈ＆Ｅとラミニンに対する免疫ペルオキシダーゼ染色で染色して、ＥＣＭおよびラミニンの保全性を評価することができる。一般に、最終的な生体材料足場生成物中に残存するＥＣＭ成分の三次元形状は、組織染色を介して見た場合に、予備脱細胞化された材料のそれの近似であるべきである。アッセイ可能な別の成分は、本発明のＥＣＭにはＡＭＰが豊富であるため、ＡＭＰである。

したがって、本発明の有尾類由来の生体材料は、強化された再上皮化を指向し、効率的な組織再生または創傷治癒を促進するのに有用な、ＥＣＭ成分を含む。本発明の生体材料はまた、成長因子、接着タンパク質およびＡＭＰなどの生理活性ペプチドのためのマトリックスおよびリザーバとして機能する。したがって、生体材料は、組織再生のための生物学的足場として効果的に機能し、必要な生理活性刺激と構造的支持の両方を提供する。生成物は、それ自体で使用され、小片または形状に切断され、それ自体または他の材料に積層され、付着を固定するための開口部を提供するために事前穿孔され、所望の三次元形状、ならびに他のフォーマットに形成されることができ、これらは以下でより詳細に議論されている。

粉末およびゲル
態様において、足場は、さらに小さな粒子または粉末に加工することができる。微粒子は、水、生理食塩水または適切な緩衝液または培地中で水和して、ペーストまたはゲルを生成することができる。この微細材料およびそれから生成されたペーストまたはゲルは、以下により詳細に記載された多数の目的のために使用することができる。

多くの方法が存在するが、２つの例示的な方法を、足場の微粒子形態を製造するために使用することができる。第１の方法は、消毒した物質を凍結乾燥した後、試料を液体窒素中に浸漬することが関与する。スナップ凍結した材料は、その後ブレンダーで小片に縮小し、粒子が、Wileyミルなどの回転刃ミルに配置できるほど十分に小さくする。＃６０スクリーンを用いて、回収した粉末のサイズを、例えば２５０ｎｍ未満などの所望のサイズに制限することができる。ソニックシフターまたは他の分類装置を用いて、より大きな粒子を除去すること、および／または所望の範囲内の粒度分布を得ることができる。第２の方法は前の方法と同様であるが、ただし、試料は最初に、３０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液に５分間浸漬する。材料を次に、液体窒素中でスナップ凍結して塩の結晶を析出させ、凍結乾燥して残留する水を除去する。この物質は、上記で説明したようにその後粉砕する。試料内のＮａＣｌを沈殿させることによって、埋め込まれた塩結晶が、材料をより均一なサイズの粒子に破砕することが期待される。粒子は次に脱イオン水に懸濁させ、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離してＮａＣｌを除去する。懸濁液をスナップ凍結させ、再び凍結乾燥する。最後に、粉末を回転刃ミルに入れて、個々の粒子を脱凝集させる。

粉末は水和させて、ゲル化を補うための他のゲル化材料有りまたは無しで、ゲルを生成することができる。

粉末、ペーストまたはゲルは、さらに処理することなく、対象の処置に適用することができる。これは、噴霧、塗布、注入または他の方法で、創傷または手術部位に適用することができる。ゲルは、成形することができる。粉末、ペーストまたはゲルはまた、例えばポリマー合成材料、または本明細書に記載のようにＥＣＭシートなどの「バッグ」の中に配置することができて、軟骨修復（例えば、膝またはＴＭＪ軟骨修復）のための整形外科用インプラント、または乳房再建もしくは増強のためのインプラントなどの、より大きな三次元構造を生成することができる。このような場合には、所望のサイズおよび形状のバッグが、ＥＣＭ材料または他の生体適合性ポリマー材料のシートから形成され、その後、バッグまたはカバーには、本明細書に記載の組織由来の粉末またはゲルを充填することができる。デバイスまたはインプラントの形状は、その使用目的に応じて変わり得る。バッグは、本明細書に記載の足場材料を成形されたバッグに充填する前に、任意の有用な成形技術によって、例えば耳、鼻、膝、ＴＭＪ、肋骨等の軟骨の形状など、有用な形状に成形することができる。一例では、生分解性ポリマーマトリックス（例えば、ＰＥＵＵまたはＰＥＥＵＵ）は、型上に噴霧または電着される。得られた成形されたカバーには、次に、材料を充填することができる。例えば熱を、カバーを密封するために使用することができる。

添加剤
別の態様において、有尾類に異種の少なくとも１つの薬剤が、対象に移植されるか、または別の方法で対象に投与されるか、または細胞培養に使用される前のＥＣＭまたはその有尾類画分に添加される。一般に薬剤としては、任意の薬剤であって、細胞培養に有用な、または治療剤もしくは治療用アジュバントとして有用な任意の薬剤を含む。薬剤は、本発明のＥＣＭの上またはこの中に、被覆、注入、またはその他で共有結合もしくは非共有結合的に結合するか、組み込むことができる。薬剤はまた、ＥＣＭを含む生成物と組み合わせることができ、例えば、薬剤とＥＣＭの粉末を混合することなどによる。各薬剤は、単独で本発明のＥＣＭと共に、または他の薬剤と組み合わせて使用してもよい。かかる薬剤の非限定的な例としては、抗菌剤、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、皮膚軟化剤、レチノイド、ステロイド、および細胞を含み、細胞は限定することなく、対象自身の細胞を含む。

特定の非限定的な態様において、薬剤は、成長因子である。成長因子の非限定的な例としては、以下を含む：塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子１および２（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、間質由来因子１α（ＳＤＦ−１α）、神経成長因子（ＮＧＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ニューロトロフィン３、ニューロトロフィン４、ニューロトロフィン５、プレイオトロフィンタンパク質（神経突起成長促進因子１）、ミッドカインタンパク質（神経突起成長促進因子２）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、腫瘍血管形成因子（ＴＡＦ）、副腎皮質刺激ホルモン（コルチコトロピン）放出因子（ＣＲＦ）、形質転換成長因子αおよびβ（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン、およびインターフェロン。神経栄養因子および血管新生因子を含む様々な成長因子の市販の調製物は、R & D Systems, Minneapolis, Minn.；Biovision, Inc, Mountain View, Calif；ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., Rehovot, Israel；およびCell Sciences. RTM., Canton, Massから入手可能である。

特定の非限定的な態様において、治療剤は抗菌剤であり、例としては、限定はされないが以下である：抗微生物ペプチド、イソニアジド、エタンブトール、ピラジナミド、ストレプトマイシン、クロファジミン、リファブチン、フルオロキノロン、オフロキサシン、スパルフロキサシン、リファンピン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ダプソン、テトラサイクリン、エリスロマイシン、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、アンピシリン、アンホテリシンＢ、ケトコナゾール、フルコナゾール、ピリメタミン、スルファジアジン、クリンダマイシン、リンコマイシン、ペンタミジン、アトバコン、パロモマイシン、ジクラザリル(diclazaril)、アシクロビル、トリフルオロウリジン、ホスカルネット、ペニシリン、ゲンタマイシン、ガンシクロビル、イトラコナゾール、ミコナゾール、亜鉛ピリチオン、および塩化物、臭化物、ヨウ化物および過ヨウ素酸塩などの銀塩。

非限定的な特定の態様において、治療剤は抗炎症剤であり、例えば限定はされないが、以下が挙げられる：ＮＳＡＩＤ、例えばサリチル酸、インドメタシン、ナトリウムインドメタシン三水和物、サリチルアミド、ナプロキセン、コルヒチン、フェノプロフェン、スリンダク、ジフルニサル、ジクロフェナク、インドプロフェン、サリチルアミドナトリウム；抗炎症性サイトカイン；抗炎症タンパク質；ステロイド性抗炎症剤；またはヘパリンなどの抗凝固剤。

創傷治癒および／または組織再生を促進することができる他の薬物もまた、含まれてよい。

薬剤は、例えば吸着および／または吸収などの任意の有用な方法により、足場内に分散させることができる。例えば、治療剤は、溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）に溶解して足場に加えることができる。別の態様において、薬剤は、担体ポリマーと混合し（例えば、ポリ乳酸−グリコール酸微小粒子、アガロース、ポリ（エステルウレタン）尿素エラストマー（ＰＥＵＵ）またはポリ（エーテルエステルウレタン）尿素エラストマー（ＰＥＥＵＵ））、これをその後、足場内に分散またはこれに適用する。薬剤を担体ポリマーまたはエラストマーポリマーと配合することにより、治療剤の放出速度を、ポリマーの分解速度によって、および／または、放出その他によるポリマーからの拡散によって、制御することができる。同様に、治療剤は、薬学分野において知られている、糖または多糖マトリックスを含む持続放出のための任意の溶解性マトリックス中で提供されてもよい。薬剤はまた、粉末ＥＣＭに含まれ、また粉末ＥＣＭとゲル化してもよい。薬剤は、本発明のＥＣＭに共有結合で結合させてもよい。上記は、非限定的な例であることを意味する。

抽出物
脱細胞化ＥＣＭの天然の状態、または微粒子状もしくは粉末として粉砕された状態に加えて、本発明はまた、脱細胞化ＥＣＭの抽出物および分離物も提供する。上述のように、有尾類ＥＣＭは抗菌ペプチド、成長促進因子、コラーゲンおよびラミニンに負荷され、ＥＣＭの有尾類画分は、本発明に有用である。

抽出緩衝液は、当技術分野でよく知られている。かかる緩衝液の１つは、それぞれ５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中に調製された、４Ｍのグアニジン、および２Ｍの尿素である。ＥＣＭの粉末形態は、フェニルメチルスルホニルフルオリド、Ｎ−エチルマレイミド、およびベンズアミジン（プロテアーゼ阻害剤）をそれぞれ１ｍＭで含有する、関連する抽出緩衝液中に懸濁させることができ（例えば、２５％ｗ／ｖで）、これを４℃で２４時間激しく攪拌する。抽出混合物を次に遠心分離し、上清を回収することができる。不溶性物質は、抽出緩衝液中で洗浄し、遠心分離し、洗浄液を元の上清と合わせることができる。上清を脱イオン水に対して透析することができる。透析液は、遠心分離して任意の不溶性物質を除去することができ、上清はすぐに使用するか、または長期保存のために凍結乾燥する。このような分離物は、成長因子を有尾類に特定の濃度で含む。

別の側面において、抽出は、調整培地により行われる。有尾類の組織特異的抽出物を作製する方法は、粉末状のＥＣＭを取り、溶液を形成し、これにより上清および微粒子を生成し、ここで上清は抽出物であり、抽出物を微粒子から分離する。細胞をＥＣＭ上で増殖させ、細胞増殖の期間の後、上清を分離することもできる。

合成材料
合成した生体適合性および細胞適合性材料を、ＥＣＭと組み合わせることができ、例えば、（ａ）シートまたはゲル状のＥＣＭのための構造的な支持、（ｂ）ＥＣＭを成形するための構造的な支持、（ｃ）ＥＣＭのコーティング（または微粒子ＥＣＭを含むコーティング）、補助ゲル化剤、または（ｄ）微粒子状ＥＣＭまたはその分離物のための徐放性材料である。かかるポリマーは、他のＥＣＭ材料にバッキングシートとして適用されることが知られており、例えばそれ自体が生分解性の材料である。マトリックスのための適切な合成材料は、移行および免疫学的合併症を防止するために、生体適合性であることができ、細胞増殖および分化した細胞の機能をサポートすることができる。いくつかは再吸収可能であり、完全に自然な組織置換を可能にする。いくつかは、様々な形状に構成可能で、移植の際の崩壊を防止するために十分な強度を有することができる。研究により、ポリグリコール酸からなる生分解性ポリエステルポリマーが、これらの基準のすべてを満たすことが示されている（Vacanti, et al. J. Ped. Surg. 23:3-9 (1988); Cima, et al. Biotechnol. Bioeng. 38: 145 (1991); Vacanti, et al. Plast. Reconstr. Surg. 88:753-9 (1991)）。他の合成生分解性支持体マトリックスとしては、ポリ無水物、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの合成ポリマーが挙げられる。合成ポリマーおよび、これらのマトリックスに細胞を組み込むか、または埋め込むための方法のさらなる例は、当技術分野で知られている。例えば米国特許第4,298,002号および第5,308,7号を参照。

非限定的な例としては、粉末は、トリブロック共重合体を用いて製剤化することができる。国際公開出願WO2012131104およびWO2012131106を参照；これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。他の例としてはポロキサマーがあり、これは、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖が隣接しているポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中央疎水性鎖から構成される、非イオン性トリブロック共重合体である。ポロキサマーはまた、商標名Pluronics（BASF）としても知られている。特定のポロキサマーは、医薬品の持続放出材料として有用である。

本発明の粒子は、ポリマー、ヒドロゲルおよび／または外科用シーラントの中にカプセル封入することができる。非限定的な例として、ポリマー、ヒドロゲルまたは外科用シーラントとしては、ＰＬＧＡ、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡｃ）、ポロキサマー、GELSITE（登録商標）（Nanotherapeutics, Inc. Alachua, Fla.）、HYLENEX（登録商標）（Halozyme Therapeutics, San Diego Calif.）、外科用シーラント例えばフィブリノゲンポリマー（Ethicon Inc. Cornelia, Ga.）、TISSELL（登録商標）（Baxter International, Inc Deerfield, 111.）、ＰＥＧベースのシーラント、およびCOSEAL（登録商標）（Baxter International, Inc Deerfield, 111.）が挙げられる。別の態様において、粒子は、対象に注入されるとゲルを形成することができる、当技術分野で知られている任意のポリマー中にカプセル封入することができる。別の非限定的な例として、粒子は、生分解性であってよいポリマーマトリックス中にカプセル封入することができる。制御放出および／または標的化送達のためのポリマーのさらなる例は、少なくとも１つの制御放出コーティングを含んでもよい。制御放出コーティングとしては、これらに限定はされないが、OPADRY（登録商標）、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニル共重合体、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、EUDRAGIT RL（登録商標）、EUDRAGIT RS（登録商標）および、エチルセルロース水性分散液などのセルロース誘導体（Aquacoat（登録商標）およびSurelease（登録商標））が挙げられる。

使用
本明細書に記載の脱細胞化ＥＣＭは、実質的に任意のin vivo、ex vivo、またはin vitroでの使用において、細胞、組織、器官を成長させるために有用である。ＥＣＭは、細胞の増殖および／または分化を促進するための基質として使用することができる。in vitroにおいて、ＥＣＭは、幹細胞、前駆細胞または分化細胞を含む細胞または細胞株の実質的に任意のタイプを含む細胞の培養において、増殖を支持する細胞増殖用基質として有用である。一態様において、細胞は癌細胞である。一態様において、癌細胞は、ＥＣＭ上で増殖すると結節を形成する。基質上の細胞は、組織、器官または身体部分の前駆体、あるいは成熟組織または構造にも成長し得る。ＥＣＭ上で増殖した細胞は、移植のために、創傷被覆材のために、in vitroでの薬物試験のために、分化等のモデル化のために、使用することができる。細胞は、ＥＣＭの組織細胞型に一致させてもよく、または不一致でもよい。細胞は、異種である。

本発明のＥＣＭは、ヒトまたは動物のいずれかの対象における、組織の修復、置換、または増強を含む任意の有用な目的のために、組織成長用の細胞増殖の足場として、in vivoで有用である。例えば、材料は、例えば腫瘍除去後の組織の損失などの、外傷または手術中に失われたかまたは損傷した組織の修復および／または置換に有用である。材料は構造的な修復に有用であり、例えば、鼠径ヘルニア修復、傍ストーマ強化、軟組織の強化、および例えば肥満手術や肺切除、臍ヘルニア移植片、ペイロニー修復移植、切開移植および瘻孔プラグなどの間の、外科用ステープルラインの強化に有用である。材料は、火傷、移植片および分層植皮の被覆、褥瘡潰瘍を含む潰瘍、および皮膚擦傷法のための、創傷被覆材に有用である。材料は、美容目的、例えば豊胸術、口唇拡大術、豊尻術に有用である。抗接着外科的用途のために特に魅力的な本発明の一側面は、接着を阻害または防止する、基底膜の特性である。ＡＭＰの存在は、本発明のＥＣＭを、上記用途のために特に適するものとしている。

上述したように、本明細書に記載の材料を、成形するかまたは構造内に含めて、材料を例えば軟骨細胞および／または軟骨前駆細胞と共に播種することにより、軟骨の修復または置換のためなどに、所望の形状を形成することができる。材料は、粉末状に粉砕し、（ａ）創傷、（ｂ）インプラント、（ｃ）創傷被覆材などへの適用のために、細胞培養添加剤として、粉末、スプレー、液体、懸濁液またはコーティングとして、ゲルを再構成するおよび／または形成するために使用することができる。

一態様において、例えば、脂肪幹細胞は、本明細書に記載の細胞増殖足場で増殖される。脂肪幹細胞は、中胚葉起源のものである。これらは一般的に多能性であり、次のような中胚葉組織に発達する能力がある：成熟脂肪組織；骨；限定することなく心膜、心外膜、心筋外膜、心筋、心膜、および弁組織を含む、心臓；真皮の結合組織；血管組織(hemangial tissue)；筋肉組織；泌尿生殖器組織；胸膜および腹膜組織；内臓；中胚葉腺組織；および間質組織。細胞は、成熟した（完全に分化した）細胞に分化することができるだけでなく、それらはまた、適切な前駆細胞（例えば限定されないが、前駆脂肪細胞、前駆筋細胞(premyocytes)、前駆骨細胞(preosteocytes)）に分化することができる。さらに、培養条件に応じて、細胞はまた、胚性、胎児性、造血性、神経原性、または神経痛原性(neuralgiagenic)などの発達表現型を示すこともできる。

一態様において、対象自身の細胞を、マトリックス内に分散させる。例えば、軟骨組織の生産において、軟骨細胞および／または軟骨前駆細胞をマトリックス内に分散させ、任意に移植前にex vivoで増殖させることができる。同様に、対象の皮膚細胞を、火傷や擦り傷など対象の損傷を受けた皮膚表面への移植の前に、足場内に分散させることができる。

ゲルとして使用する場合、非限定的な例において、創傷などの対象における望ましい部位に、ゲルを注入する。一例では、ゲルは、骨の切断または骨に穿孔された穴に注入して、置換靭帯などの構造の修復および／または骨への接着を促進することができる。別の用途において、微粉砕粒子を、大きな表面擦過傷または火傷の場合などに、対象の表面に噴霧することができる。足場はまた、皮膚の縫合上に噴霧して、瘢痕を抑制することができる。本発明のＥＣＭは、前述したような手術部位において、体内の所定の位置に配置または縫合することができる。これらの処置はすべて、本発明に包含される。

有尾類脱細胞化ＥＣＭはまた、治療用分子、タンパク質または代謝物の、宿主内の部位への持続的送達のために、使用することもできる。例えば以下を参照：US 2004/0181240は、癒着を防止し、細菌を排除し、または細菌の活性を阻害する、または組織の治癒もしくは成長を促進することができる、組織表面のための羊膜被覆を記載し、米国特許第4,361,552号は、架橋された羊膜調製物および、火傷および創傷を処置する方法におけるそれらの使用に関する。本発明のＥＣＭは、同様に使用することができる。

医薬製剤
本明細書において提供される医薬製剤の説明は、主にヒトへの投与に適した医薬組成物を対象としているが、当業者は、かかる組成物が、他の動物、例えば非ヒト哺乳動物などの非ヒト動物への投与にも、一般に適していることを理解するであろう。ヒトへの投与に適した医薬組成物の、この組成物を様々な動物への投与に適したものとするための改変はよく理解されており、当獣医薬理学者は、もし必要だとしても単に通常の実験によって、かかる改変を設計および／または実施することができる。

本明細書に記載の医薬組成物は、薬理学の分野で知られている任意の方法によって調製することができる。一般に、かかる調製方法は、活性成分を、賦形剤および／または１もしくは２以上の他の補助成分と会合させ、その後、必要な場合および／または望ましい場合には、生成物を、所望の単回または複数回使用用の形態へと、分割し、成形し、および／または包装するステップを含む。

本発明によるＥＣＭは、単一の単位用量としてバルクで、および／または複数の単一単位用量として、調製、包装、および／または販売することができる。例えば、組成物は、ＥＣＭを０．１％（ｗ／ｗ）〜１００％の間で含むことができる。他の活性剤が含まれている場合、本発明のＥＣＭと組み合わせる薬剤の相対量は、従来技術において配合するＥＣＭと組み合わせて使用される量と同様に、当業者には周知であろう。相対量もまた、処置される対象の識別、サイズおよび／または状態によって、およびさらにＥＣＭが投与される経路に応じて、変化し得る。

医薬製剤はさらに、薬学的に許容し得る賦形剤を含んでもよく、これは本明細書中で使用する場合、限定はされないが以下を含む：所望の特定の剤形に適した、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤など。医薬組成物を調製するための様々な賦形剤および、組成物を調製するための技術は、当技術分野で知られている。Remington: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (21 st Ed.), A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins (Baltimore, Md., 2006) を参照；これはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

例１：アホロートル真皮の処理
アホロートル真皮試料の脱細胞化は、健常なまたは治癒したアホロートル真皮組織から切り出した試料を調製し、その後に試料に低／高浸透圧浸漬を施して細胞溶解させ、溶媒脱水、およびオーブン乾燥することにより、実施することができる。これらの移植片の具体的な処理は、１５〜２６％ＮａＣｌ中の保管、複数回の低／高浸透圧浸漬（ＮａＣｌ溶液と水を利用して）、次にエタノールを使用した溶媒脱水、および、空気乾燥または３７℃でのオーブン乾燥のいずれかによる、溶媒の蒸発を含む。
天然のアホロートル真皮組織の組織学的検査を行って、基底膜などの注目すべきＥＣＭ要素の存在を同定した。図１および図４を参照。天然のアホロートル真皮組織とヒト羊膜の比較組織学的および免疫組織化学的分析を行って、ＥＣＭの構造および成分を比較し、臨界成分の相対濃度と分布を評価した。図２、図３、および図４を参照。図３は、天然のアホロートル真皮組織とヒト羊膜組織の、種特異的なコラーゲンＩＶおよびラミニン抗体を介した、免疫組織化学的染色を示す（倍率４０倍）。図２は、天然のアホロートル真皮組織とヒト羊膜のＨ＆Ｅ染色およびアルシアンブルー染色（４０倍）を示し、これは、両方の組織において同等の組織構築(histoarchitecture)および硫酸化グリコサミノグリカンの存在を示す。ヘマトキシリンおよびエオシン染色による、対の天然および処理後のアホロートル真皮組織の切片の、組織学的評価（図５）は、細胞外マトリックス組織構築の処理後の保存と、細胞または任意の顕著な濃度の細胞破片の不在を示した。

例２：無細胞脱水アホロートル真皮の分割および積層
脱細胞化脱水アホロートル真皮を、機械的なスプリッタを介して分割し、不均一なマトリックスを均一な切片に分離することができる。所望の厚さの分離切片を、その後、再水和し凍結乾燥して、表面特徴を有する所望の配向の多層積層構造体を得ることができる。より具体的には、真皮マトリックスの網状真皮の領域から得られた内部開放多孔質マトリックスを有する、両面基底膜構造を構成して、所望の表面特性を得ることができる。代替的に、分離された天然の切片を所望の臨床転帰のために天然の形態で使用することができる。例えば、網状真皮の開放多孔質均一マトリックスは、軟組織構造を強化するために用いることができる。
両表面に硫酸化ＧＡＧおよびコラーゲンＩＶとラミニンを有する、積層されたカスタム構築物を、臨床上の利益のために望ましい両面接着防止および抗菌特性のために、得ることができる。さらに、多層構造体は、移植片のin vivoでの耐久性を延長するために、構成することができる。

例３：可溶化された無細胞脱水アホロートルの真皮、心膜、大腿筋膜、骨膜、腹膜、または硬膜の調製
無細胞有尾類結合組織マトリックスの、脱細胞化脱水アホロートルの天然または分離された切片は、脱細胞化軟組織構造を１ｃｍ^２の切片に区画化し、切片を、水性の１Ｍ氷酢酸中、Warringブレンダー（〜１００ｇの組織）で３０〜６０秒間均質化することにより、調製することができる。スポンジの調製は、様々な体積の水を加え、次に所望の幾何学的形状の型内でのスラリーの中和および凍結乾燥により、得ることができる。得られた多孔率は、マトリックスに添加される水の量に相関する。さらに、選択された範囲の生理活性抽出物を、中和の前にスラリーに添加することができ、これには、消化されたヒトまたは有尾類のミネラル化および脱ミネラル化結合組織から抽出された、粒子状成分または小タンパク質成分、例えば脱灰骨基質、エラスチン、または骨形成タンパク質が含まれ、これらは、構築物中に共有結合で負荷することができる。抽出物は、中和後のコラーゲン繊維と共有結合し、原線維発生が生じる生理学的状態に戻る。その後in vivoでのタンパク質分解中に生理活性成分が放出され、急性炎症の間にin vivoで分子が消費または露出されないことが確実となる。代替的に、ＮａＣｌ水溶液を中和前にスラリーに添加して、室温で安定な、持続性、低粘度の注入用溶液を得ることができる。イオン選択性膜を介するスラリーの注入は、塩イオンを除去し、注入後に原線維発生を生じさせて、三次元マトリックスが形成される。

例４：ミネラル化および脱ミネラル化された脱細胞化脱水有尾類結合組織マトリックスの、滅菌された微粒子または粉末形態の調製
ミネラル化コラーゲン有尾類結合組織の切片の脱細胞化の後に、Uristによって使用されたものと同様の脱ミネラル化プロセスを、および、切片化された、無細胞脱ミネラル化、ミネラル化、またはミネラル化なしの有尾類結合組織細胞外マトリックスの、溶媒または凍結乾燥脱水、凍結粉砕を行うことができ、これにより、保存された組織構築および機能を有するＥＣＭの微粒子または粉末形態を得ることができる。最終的な粒度分布は、凍結粉砕後の持続時間およびふるい分けに依存して変化させることができ、１２５〜８５０ミクロンの間である。低用量冷γ線照射または電子ビーム照射（＜２５ｋＧｙ）を使用して、無細胞ＥＣＭシート、微粒子または粉末およびカスタム設計された構築物を滅菌することができる。

例５：無細胞ミネラル化および脱ミネラル化有尾類の健常または治癒結合組織マトリックスの、in vitroでの特性評価
in vitroでの一連の解析により、脱細胞化ならびに、脱細胞化細胞外マトリックス構築物および／または微粒子の、天然またはカスタム設計された機能的および構造的特性の保存を確認することができ、前記構築物および／または微粒子としては、多層積層構築物、例えば両面基底膜シートマトリックスまたは分離された天然の均質開放多孔質マトリックス、または可溶化凍結乾燥して負荷されたＥＣＭ由来のコラーゲンスポンジを含む。細胞破片のマーカーとしてのＤＮＡ含量を用いて、脱細胞化の定量的評価を、単一の、エタノールに基づく抽出技術と、蛍光染料Quant-iT PicoGreen（Molecular Probes, USA）を、９６ウェルプレート中１７０μＬの作業溶液と３０μＬの試料／標準の比率で用いて、実施することができる。対の天然および処理後の分析および市販の組織ＥＣＭとの比較を行って、受容性を確認することができる。図６を参照。
生理活性成分ならびに、天然および処理後のタンパク質分解再吸収プロファイルの定量化のための、ＥＬＩＳＡ分析を行うことができる。コラゲナーゼでの消化（２３２〜２６２ｍｇ／活性単位）の際に、ｐＨ７．６の緩衝液中（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２００ｍＭのＣａＣｌ_２、５０ｍＭのＮａＣｌ）３７℃で２４時間脱細胞化かつ脱水した有尾類ＥＣＭ組織または構築物の、重量対表面積を正規化した切片（Sigma, USA）を、種々の時点で分析して、組織構築物の保存を確認するための、処理の前後の組織の相対的吸収曲線を構成することができる。消化後の可溶化コラーゲンは、酸／塩洗浄消化物の１００μｌのアリコート中、Sircolキット(Biocolor Ltd., UK）を使用して評価することができる。具体的には、ＢＭＰ２／４およびＴＧＦ−１成長因子または硫酸化ＧＡＧのレベルを、消化後に、市販のＥＬＩＳＡキット（R&D Systems, Minneapolis, MN）を用いて評価することができる。１：１０希釈消化物中のタンパク質含有量を、標準ブラッドフォード吸光度アッセイによって測定することができる。

試料の顕微鏡評価は、４％パラホルムアルデヒドでの固定およびパラフィン包埋、５μｍでの切片化、およびルーチンの組織学的染色（Histoserv, Inc., USA）を使用して、実施することができる。縦方向断面をヘマトキシリンおよびエオシンで染色することができる。画像を取得し、標準明視野技術を用いて、Olympus IM倒立顕微鏡で解析することができる。試料を、段階的エタノール系列（１５％、３０％、５０％、７０％、９５％、および１００％）での脱水、ＣＯ_２での臨界点乾燥、および金でのスパッタコーティング後に、走査型電子顕微鏡を用いて分析することができる。試料は、FEI Quanta 600 FEG走査型電子顕微鏡で視覚化することができ、足場微細構造の代表的な画像が得られる。
２４時間での定性的細胞生存率の評価のため、直接的な細胞接触法（ISO 10993、Part 5）を細胞毒性試験のために拡張時点（４８時間および７２時間）で実施して、細胞の増殖および接着効率を測定することができる。血球計での非接着細胞の手動カウントを、培養ウェルの移動およびトリプシン処理後に、行うことができる。CellTiter 96アッセイを実施して、４日後の生存細胞を定量化することができる。生／死細胞染色キットも使用して、２４時間および４日目において蛍光顕微鏡を介して足場を可視化し、これにより生体適合性を検証することができる。

Claims (33)

1. （Ａ）有尾類からの、細胞外マトリックスを含む組織試料を得ること、および（Ｂ）試料を脱細胞化して、構造的および機能的完全性を保持しつつ、異種移植片としての生体材料の抗原性を低減または排除するために試料の十分な細胞成分を除去すること、を含む方法により生産される、脱細胞化生体材料。
2. 脱細胞化が、組織試料にアルカリ処理を施すことを含む、請求項１に記載の脱細胞化生体材料。
3. 方法がさらに、試料を滅菌することを含む、請求項１に記載の脱細胞化生体材料。
4. 失活細胞をさらに含む、請求項１に記載の脱細胞化生体材料。
5. 有尾類由来の細胞外マトリックス成分を含む、組織移植片。
6. 分離され、脱細胞化された有尾類ＥＣＭ。
7. ＥＣＭがアホロートル組織に由来する、請求項６に記載の分離されたＥＣＭ。
8. ＥＣＭが基底膜を含む、請求項６に記載の分離されたＥＣＭ。
9. ＥＣＭに対して、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、タンパク質、炭水化物、糖、ステロイド、抗菌剤、合成ポリマー、接着剤、薬物またはヒトの剤であるところの有尾類に異種の薬剤が、注入されている、被覆されている、またはＥＣＭがこれに結合されている、請求項６に記載の分離されたＥＣＭ。
10. 薬剤が、細胞、任意にヒト細胞である、請求項６に記載の分離されたＥＣＭ。
11. ＥＣＭがシートである、請求項６に記載の分離されたＥＣＭ。
12. シートが穿孔を含む、請求項１１に記載の分離されたＥＣＭ。
13. ＥＣＭが乾燥粉末である、請求項６に記載の分離されたＥＣＭ。
14. ＥＣＭが、再構成されたゲルである、請求項６に記載の分離されたＥＣＭ。
15. ＥＣＭが滅菌されている、請求項６〜１３のいずれか一項に記載の分離されたＥＣＭ。
16. 滅菌の分離された脱細胞化有尾類ＥＣＭ、または滅菌の分離された脱細胞化有尾類ＥＣＭに由来する有尾類画分を含む、パッケージ。
17. 滅菌の分離された脱細胞化有尾類ＥＣＭ、または滅菌の分離された脱細胞化有尾類ＥＣＭに由来する有尾類画分が、分離された脱細胞化有尾類ＥＣＭのシートである、請求項１６に記載のパッケージ。
18. 滅菌の分離された脱細胞化有尾類ＥＣＭ、または滅菌の分離された脱細胞化有尾類ＥＣＭに由来する有尾類画分が、乾燥粉末である、請求項１６に記載のパッケージ。
19. 滅菌の分離された脱細胞化有尾類ＥＣＭ、または滅菌の分離された脱細胞化有尾類ＥＣＭに由来する有尾類画分が、ゲルである、請求項１６に記載のパッケージ。
20. 滅菌の分離された脱細胞化有尾類ＥＣＭ、または分離された脱細胞化有尾類ＥＣＭに由来する滅菌有尾類画分を含む、滅菌医療用インプラント。
21. インプラントが、生体適合性のシート、メッシュ、ゲル、移植片、組織またはデバイスである、請求項２０に記載の滅菌医療用インプラント。
22. 分離された脱細胞化有尾類ＥＣＭ、または分離された脱細胞化有尾類ＥＣＭに由来する有尾類画分で、被覆された、これに含浸された、これをカプセル封入した、またはこれに結合された、材料。
23. （ａ）分離された脱細胞化有尾類ＥＣＭ、（ｂ）組織培養培地、および（ｃ）有尾類に異種の細胞、を含む、組織培養系。
24. 細胞がヒト細胞である、請求項２３に記載の組織培養系。
25. 分離された脱細胞化有尾類ＥＣＭ、または分離された脱細胞化有尾類ＥＣＭに由来する有尾類画分で調整された、組織培養培地。
26. 互いに積層された少なくとも２枚の分離脱細胞化有尾類ＥＣＭシートを含む、デバイス。
27. 有尾類から有尾類ＥＣＭを分離し、ＥＣＭを脱細胞化し、および脱細胞化ＥＣＭを滅菌することにより調製した、生成物。
28. （Ａ）有尾類からの、細胞外マトリックスを含む組織試料を得ること、および（Ｂ）試料を脱細胞化して、脱細胞化ＥＣＭを形成し、異種移植片としての生体材料の抗原性を低減または排除するために試料の十分な細胞成分を除去すること、を含む、生物学的材料を調製する方法。
29. 方法がさらに、脱細胞化ＥＣＭがその上または内部で細胞が成長できるマトリックスとして有用であることを可能とするのに十分なように、脱細胞化ＥＣＭの構造的および機能的完全性を保持する様式で、脱細胞化を実施することを含む、請求項２８に記載の方法。
30. 脱細胞化ＥＣＭを均質化して粉末を形成することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
31. 粉末をゲルとして再構成することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
32. 脱細胞化ＥＣＭを滅菌することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
33. 脱細胞化ＥＣＭを、有尾類に異種の薬剤に結合させることをさらに含む、請求項２９に記載の方法。