CN1455673A - 分离自至少部分通过其皮肤进行呼吸的生物体的细菌分离物和衍生自其中的生物活性提取物 - Google Patents

分离自至少部分通过其皮肤进行呼吸的生物体的细菌分离物和衍生自其中的生物活性提取物 Download PDF

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约翰·范赫梅尔
贝内迪克特·萨斯
简·范德克霍夫
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Pleito Dayton Research Co
Kemin Industries Inc
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Abstract

来自微生物的包含生物活性化合物或化合物组合的提取物，所述微生物分离自至少部分通过皮肤呼吸的产生粘液的生物体。发现分离自蝾螈和蛙皮肤的杆状细菌产生具有抗病毒，抗肿瘤，抗菌或抗真菌性质的一或多种化合物。这些化合物具有抑制人类机会病原体以及HIV毒株和肿瘤细胞系的作用，所述机会病原体包括Candida sp.，Microsporum sp.，Staphylococcus sp.，Pseudomonas sp.，Escherichia sp.和Enterococcus sp.。

Description

分离自至少部分通过其皮肤进行呼吸的生物体的 细菌分离物和衍生自其中的生物活性提取物
在先申请
本申请要求2001年1月5日提请的临时申请系列号60/260022的优先权。
发明背景
所有两栖动物均不同程度地进行皮肤呼吸。这样，它们的被覆结构必须作为与其外部环境进行气体通透的屏障(Lilleywhite，H.B.，和P.F.A.Maderson，1988，被覆物的结构和通透性，American Zoologist28：945-962)。皮肤用作呼吸器官，湿度是必不可少的(Fox，H.1994，被覆物的结构，第1章，两栖动物生物学，第1卷，被覆结构，H.Heatwole和G.T.Barthalmus，Surrey Beatty and Sons，ChippingNorton)。这种必需的湿度是通过与被覆结构相关的产生粘液的腺体产生粘液而达到的(Duellman，W.E.，和L.Trueb，1986，两栖动物生物学，McGraw Hill，美国纽约；Fox1994)。两栖动物中粘液的主要成分是粘多糖(糖蛋白)(Duellman和Trueb 1986)。糖蛋白含有与多肽骨架共价连接的一或多个糖链(Schaechter，M.，和I.Brockhausen.1989，支链O-多糖的生物合成， 粘液及相关论题，E.Chantler和N.A.Ratcliffe编辑，实验生物学学会研讨会，No.XLIII，Cambridge大学，Cambridge)。粘液中有丰富的碳，这是一种支持微生物生长和大多数(如果不是全部)细胞化合物合成所必需的因子(Guirard，B.M.，和E.E.Snell，1962，微生物的营养需求，pp33-93，I.C.Gunsalis和R.Y.Staneir编辑，关于细菌结构和功能的论文，第IV卷：生长生理学，学术出版社，美国纽约)。因此，由两栖动物产生以完成皮肤呼吸所需的粘液层是微生物营养素的富集之处(Austin，Jr.，R.M.2000，在Plethodon ventralis中的皮肤微生物菌群和抗生性：关于在Plethodontidae中亲代抚育的推论，pp451-461，R.C.Jaeger和L.D.Houck编辑，Plethodontid Salamanders，Kluwer Academic/PlenumPub.，美国纽约)。
大多数生态系中多数微生物附着于表面(Wimpeny，J.W.T.，S.L.Kinniment和M.A.Scourfield，1993，生物膜的生理和生物化学，pp274-318，S.Denyer，P.Goman和M.Sussman编辑，生物膜形成和控制，Blackwell科学出版社，英国伦敦)，动物的被覆结构通常是微生物群落发育的适当部位(Alexander，M.1971，微生物生态学，JohnWiley and Sons，美国纽约)。这些微生物群落通常呈现与较大的生物体群落(大群落)相同类型的群落水平相互作用。小群落的成员竞争有限的原料并形成密切关系，有时形成偏害共生关系(Atlas，R.M.和R.Bartha，1993，微生物生态学基础与应用，第3版，BenjaminCumming，美国纽约；Bull，A.T.和J.H.Slater，1982，微生物相互作用和群落，第1卷，学术出版社，美国纽约；Frederickson，A.G.和G.Stephanopoulos，1981，微生物竞争，科学213：972-979)。这种偏害共生策略包括但非限于产生抗生素。
抗生素是由微生物产生的物质，其能杀死或抑制其他微生物的生长(Williams，S.T，1982，抗生素是在土壤中产生的吗？土壤生物学23：85-87，Williams，S.T.和J.C.Vickers，1986，抗生素产生的生态学，微生物生态学12：43-52；Brock，T.D.，1994，微生物生物学，第7版，Prentice Hall，Englewood Cliffs，新泽西)。已经观察到这种物质的产生是适应降低或抑制天然环境中的竞争的结果(Weiner1996)。在固体和液体培养基中进行的产生抗生素的细菌和抗生素敏感菌之间的竞争研究，提供了支持这种理论的论据(例如Rasool，K.和J.W.T.Wimpenny，1983，用产生抗生素的链霉菌和大肠杆菌进行混合持续培养实验，微生物生态学8：267-277；Turpin，P.E.，V.K.Dihr，K.A.Maycroft，C.Rowlands，和E.M.H.Wellington，1992，链霉菌属对土壤中沙门氏菌存活力的作用，FEMS微生物生态学101：271-280)。在实验室进行的实验表明抗生素的产生阻止竞争剂的侵入，但不增进侵入或与抗生素敏感微生物建立的群落竞争的能力(Wiener，P.1996，关于细菌中产生抗生素的生态学作用的实验研究，进化生态学10：405-421)。尽管有在实验室中进行抗生素产生的实验证据，但是抗生素的自然作用和产生它们的条件还不清楚(Wiener1996)。
无肺螈科(Plethodontidae)的蝾螈是现存蝾螈的最大科。其成员大多数是许多森林和激流群落生态系中的各种脊椎动物。它们的特征是没有肺。该科的生活史多种多样(例如Tilley，S.G.和J.Bemardo，1993，无肺螈科蝾螈的生活史进化，两栖爬行类学49：154-163；Wake，D.B.和S.M.Marks，1993，无肺螈科蝾螈的发育和进化：先前研究回顾和进一步研究简介，两栖爬行类学49：194-203)。尽管有这些变化，但是它们的生殖生物学中的保守性，尤其以卵守护形式进行的亲代抚育的普遍性(Salthe，S.N.，和J.S.Mecham，1974，生殖和求偶方式，B.Lofts编辑，两栖动物生理学，第2卷，学术出版社，美国纽约)已充分论证(例如Forester，D.C.1978，守护雌性Desmognathus ochrophaeus(两栖纲，有尾类，无肺螈科)和潜在捕食者之间的实验相遇，两栖爬行类学杂志12：537-541，1979；Highton，R.和T.Savage，1961，雌性红背蝾螈Plethodon cinereus孵化行为的功能，佛罗里达州博物馆公报6：235-237；Piersol，W.H.1909，Plethodonerythronotus的习性和幼体状况，Transactions of the CanadianInstitute8：649-493；Ritter，W.E.1903，Autodax lugubris的习性的进一步报告，美国博物学家37：883-886；Tilley，S.G.1972。西北卡罗来纳州中Desmognathus ochrophaeus(两栖类，无肺螈科)的亲代抚育和胚发育的概况，美国中部博物学家89：394-407)。
亲代抚育可以解释为在合子后亲代对子代进行照顾(Trivers，R.L.1985，社会进化，本杰明学会，美国纽约)。在无肺螈科中，这种照顾是卵守护形式，最通常是由雌性照顾(Crump，M.I.1995，亲代抚育pp518-567，H.Heatwole，B.K.Sullivan编辑，两栖动物生物学，第2卷：社会行为，Surrey Beatty and Sons，Chipping Norton，澳大利亚新南威尔士)。在大多数情况下，雌性保持孵育直至发生孵化。无肺螈科中这种行为的适应性益处清晰可见，包括对抗捕食者，抗非病原性普通土壤真菌所致的真菌感染的保护作用，脱水，和预防畸形发生(见Crump，1995，综述)。亲代孵育由所有行为组分组成(例如与窝进行身体接触，移动卵，喉动)，这明显在子代发育的同时授予这些多重益处。
尽管亲代抚育在无肺螈科中的益处已经清晰论证，但是其中一些方面是怎样达到的的机制目前还不清楚(例如Austin 2000)。在上个世纪进行的关于当存在雌性亲代时，在孵化中降低真菌感染的许多观察研究，已经部分清楚这种情况。这种观察产生这样的设想：雌性动物(例如Noble，G.K.1931，两栖动物生物学，MoGrow Hill，美国纽约；Piersol，1909)或其产生的胚(Highton和Savage，1961)，产生一种抗真菌代谢物，能降低或抑制在孵化卵上生长的真菌。随后的研究表明在蝾螈中没有抗微生物分泌物存在的迹象(Daniel，J.C.，Jr.和R.W.Simpson，1954，关于抗生素的阴性记录，两栖爬行类学10：16；Forester，D.C.1979，亲代抚育在Desmognathus ochrophaeus(两栖类，无肺螈科)中的适应性，Copeia 1979：332-341；Tilley，1972；Vial，J.L.，和F.B.Prieb，1966，蝾螈Plethodon cinereus(绿色)的皮肤分泌物的抗生素分析，两栖爬行类学22：284-287；Vial，J.L.和F.B.Prieb，1967，在蝾螈Plethodon cinereus中具有孵育行为功能的抗生素的研究，Missouris科学学会学报1：37-40)。未见公开报道利用两栖动物的皮肤环境作为具有医用价值细菌的潜在原料。许多关于两栖动物或其他生物体的具有医用价值化合物的研究均针对于在两栖动物或其它大生物体的皮肤分泌物中产生这种化合物，而不是栖居于这种生物体皮肤的细菌菌群(例如Glausiusz，J.1998，蛙溶液，发现19：(11)88-92；Carte，B.K.1996，海洋天然产物的生物医学潜力，生物科学46(4)：271-287；Port，O.2001，从蛙中研制药物的飞跃，Business Week3752：99；Tyler，M.J.1995，蛙与药物，澳大利亚自然史24(12)：46-52；Coghlan，A.2000，Bug busters，新科学家166(2233)：15；Stienborner，S.T.，G.J.Currie，J.H.Bowie，J.C.Wallace，和M.J.Tyler，1998，来自澳大利亚树蛙Litoria chloris皮肤的新抗生素caerin肽1。来自Litoria属的caerinl肽的活性对比，肽研究杂志51：(2)，121-127；Rennie，J.1993，这里无蛇油，科学美国人266(3)136-137；McNamee，D.1994，蝾螈的眼睛，蛙的趾，Lancet.344(8938)：1696-1698；Erspamer 1994).
由于产生的营养丰富的粘液促进皮肤呼吸的性质，关于无肺螈科蝾螈成就的其它方面可归因于其栖居的微生物群落。由于无肺螈科蝾螈必须唯一依赖于其皮肤进行气体交换，在皮肤表面栖居过量需氧土壤细菌会对呼吸气体产生不通透的屏障，最后导致蝾螈死亡。
两栖动物的富集营养的皮肤环境已经示出支持与周围环境中的那些微生物截然不同的微生物群落(Austin，Jr.，R.M.1997，东方锯齿蝾螈Plethodon dorsalis Cope(两栖类，无肺螈科)的皮肤细菌菌群，博士论文，Mississippi大学，MS)。微生物已经示出在富集营养的环境中利用偏害共生策略，包括产生抗生素(Frederickson和Stephanopoulos，1981)，所以可以推定两栖动物的皮肤环境支持能产生降低或抑制微生物生长的化合物的微生物，因此对两栖动物的生态学和生活史具有竞争性益处。令人惊奇地，近来确定了由分离自生物体皮肤环境的一些微生物产生的代谢物具有抗人类重要致病菌和真菌的抗微生物活性，以及具有抗病毒和抗肿瘤活性，所述生物体是至少部分通过其皮肤进行呼吸。
发明概要
本发明由包含化合物和化合物组合的提取物组成，所述化合物由分离自产生粘液的生物体的微生物产生，所述生物体至少部分通过其皮肤进行呼吸，所述提取物在人类内具有抗肿瘤，抗病毒，抗真菌和/或抗菌活性。更特别地，本发明由细菌产生的抗生素组成，所述细菌生长于通过其皮肤进行呼吸的动物的粘液中。本发明尤其由细菌产生的化合物和/或化合物组合组成，所述细菌分离自两栖动物的皮肤，所述化合物具有抗病毒，抗肿瘤，抗菌和/或抗真菌活性，包括对抗人类致病细菌和/或真菌的活性。特异性实例包括包含一或多种化合物的提取物，所述化合物是由分离自蝾螈和蛙皮肤的细菌产生的，其具有抗Candida sp.，Microsporum sp.，Streptococcus sp.(包括青霉素抗性Streptococcus)，Staphylococcus sp.(包括二甲氧基苯青霉素抗性Staphylococcus)，Enterococcus sp.(包括万古霉素抗性Enterococcus)，Pseudomonas sp.，Escherichia sp.，人类免疫缺陷病毒(HIV)毒株的活性，包括降低HIV毒株在人类淋巴细胞CEM和MT-4，及f-鼠白血病肿瘤细胞，鼠乳腺癌细胞和人类T淋巴细胞中的致细胞病变性。
本发明的一方面是从细菌中提取一种化合物或化合物组合，所述细菌分离自至少部分通过其皮肤进行呼吸的生物体的皮肤，所述化合物具有抗菌，抗真菌，抗病毒或抗肿瘤作用。
本发明的另一方面是鉴别分离自至少部分通过其皮肤进行呼吸的生物体皮肤的细菌分离物，从该分离物中提取产生的化合物具有抗菌，抗真菌，抗病毒或抗肿瘤作用。
附图简述
图1是用作抑制试验对照的培养皿的照片，其中垂直划线(AC204)包括分离自Acris crepitans皮肤的细菌，水平划线是人类致病菌Enterococcus faecalis(ATCC29212)，大肠杆菌(ATCC25922)，Pseudomonas aeruginosa(ATCC27853)，和Staphylococcus aureus(ATCC29213)，基于水平人类致病菌划线生长至垂直两栖动物细菌划线邻近，示出存在或不存在抑制作用。
图2是参考图1所述用作抑制试验对照的培养皿的照片，其中垂直划线(EC024)包括分离自Eurycea cirrigera的皮肤的细菌。
图3是参考图1所述用作抑制试验对照的培养皿的照片，其中垂直划线(RC003)包括分离自Rana clamitans的皮肤的细菌。
优选实施方案详述
本发明包括鉴别取自至少部分通过其皮肤进行呼吸的动物皮肤微生物菌群的细菌分离物，及从分离物中提取化合物或化合物组合(提取物)，所述化合物具有抗菌，抗真菌，抗病毒或抗肿瘤作用。本发明阐述了鉴别分离物的方法和产生提取物的方法。所述提取物可以包含一个单一的化合物，化合物组合，或一或多种化合物，当其与提取物中的其它化合物组合时发现具有协同作用。
在其天然环境中收集源生物体，并进行分离。在分离后，基于形态特点生长并分离生物体皮肤微生物菌群样品。测试细菌分离物和来自分离物的提取物对抗在培养基上的择定细菌的抗菌作用。使用液体提取技术从细菌分离物中制备提取物，然后使用光度测定法，测试其抑制选定细菌和真菌菌株生长的能力。对提取物的成分测试其抑制癌细胞增殖的能力。实施例1：Desmognathus guadramaculatus中皮肤微生物菌群和对致 病菌的抗菌作用
在Piedmont天然公园中收集物种Desmognathus quadramaculatus的雌性孵育者，并置于一个3.79升的塑料袋中，塑料袋中充填了取自收集地的枯枝落叶和土壤，其置于旅行冷却器中，并运回实验室。在衬有湿润滤纸的玻璃培养皿中隔离蝾螈，并在6-7℃保持1周。
在分离阶段之后，从蝾螈取细菌样品，其通过用细菌学接种环在胸带和腰带之间的背部划线进行。将细菌样品在胰胨豆胨酵母膏(TSYE)琼脂(2g Difco Bacto胰胨豆胨培养液，1g Difco Bacto酵母膏，12g Difco Bacto纯化的琼脂，1升水)上培养，并使其在室温生长72小时。将形态学独立的细菌菌落再在TSYE琼脂上分离，并使其生长72小时以获得纯化的培养物。一旦获得纯化的培养物，将分离物在TSYE琼脂上斜面培养，使其在室温生长2周，并在5℃贮存直至需要。
将培养平板在黑暗中在环境温度下温育。第二天，在平板上观测到不多的生长。制备每套20个TSYE平板，共三套。第二天，对来自D.quadramaculatus雌性孵育者的4个平板进行观测，其令人惊奇地很少生长，在这4个平板仅观测到7个菌落。将分离物在新的TSYE平板上划线以进行分离，并在环境温度在黑暗中温育。
在第2天进行观测，见到6个菌落并鉴别为DQ001A，DQ001B，DQ001C，DQ001D，DQ001E，和DQ001F。令人注目地，DQ001D是不透明边缘白色中心的菌落。
制备具有5个已知人类机会病原体Staphylococcus epidermidis，Enterobacter aerogenes，Enterococcus faecalis，Corynebacterium xerosis和Serratia marcesens的平行条纹的6个平板。将平板在37℃温育72小时。然后将这6个平板的每一个均用6种分离物DQ001A-F的每一种划线。然后将这6个平板在37℃温育72小时。
对这6个平板进行观测，以确定这6种分离物是否呈现对5种人类机会病原体的任意一种具有抑制作用。观测到分离物DQ001D表现为抑制Staphylococcus epidermidis(抑制带＝37mm)，Enterococcus faecalis(抑制带＝32mm)和Corynebacterium xerosis(抑制带＝60mm)，但是对其它两种病原体无抑制作用。其它分离物无一表现为任何抑制作用。实施例2：蝾螈中的皮肤微生物菌群和对致病细菌和真菌的抗菌作 用
                      材料和方法 收集源生物体
从其天然的特有的栖居地中收集16种两栖动物物种，每个物种由至少5个个体组成(n＝5)。物种和收集地概括于表1。
    家族  物种     生物体     栖居类型
    无肺螈科  Desmognathusfolkertsi     蝾螈     溪流边缘
    无肺螈科  Desmognathusfuscus     蝾螈     溪流边缘
    无肺螈科  Desmognathusquadramaculatus     蝾螈     溪流边缘
    无肺螈科  Eurycea cirrigera     蝾螈     沼泽
    无肺螈科  Euryceaguttolineata     蝾螈     溪流边缘
    无肺螈科  Eurycea lucifuga     蝾螈     穴居
    无肺螈科  Plethodon aureolus     蝾螈     疏林森林
    无肺螈科  Plethodonchattahoochee     蝾螈     疏林森林
    无肺螈科  Plethodonchlorobryonis     蝾螈     疏林森林
    无肺螈科  Plethodon dorsalis     蝾螈     疏林森林
    无肺螈科  Plethodonocmulgee     蝾螈     疏林森林
    无肺螈科  Plethodonoconaluftee     蝾螈     疏林森林
    美西螈  Ambystomaopacum     蝾螈     沼泽
    Ranidae  Rana clamitans     蛙     沼泽
    Hylidae  Acris crepitans     蛙     溪流边缘
    Hylidae  Pseudacris crucifer     蛙     溪流边缘
收集后，将两栖动物置于3.79升的塑料袋中，塑料袋中充填了取自收集地的枯枝落叶和土壤，置于旅行冷却器中，并运回实验室。将两栖动物分别在0.0946L的衬有湿润滤纸的塑料容器中隔离，置于Coron6010型环境舱中，并在16℃保持一周。
在分离后，从每个两栖动物中取样细菌，分离自两栖动物的表型独特的细菌指定为相当于从中获得分离物的个体的代码。对每个细菌分离物均通过标准菌落形态学方法进行表型定性(Salle和Meachem，1974)。这种定性是通过注意每个不同的细菌菌落的整个菌落形式，边缘形式，隆起，颜色和表面情况而达到的。通过革兰氏染色方法确定细菌分离物的革兰氏染色情况，以有助于鉴别和对细菌分离物分类，革兰氏染色方法见于Salle，A.J.1973，细菌学基本原理实验手册，McGraw Hill，美国纽约。也要注意细菌分离物的细胞形态。在进行菌落和细胞定性之后，将分离自源生物体的形态独特的细菌在TSYE琼脂上斜面培养，使其在室温生长2周，并在5℃贮存直至需要。琼脂平板抑制实验方法学
对分离自源生物体的形态独特的细菌分离物，测试其产生抗微生物化合物的能力，所述化合物有效对抗革兰氏阳性和革兰氏阴性人类致病菌。用于抑制实验的人类致病菌是Enterococcus faecalis(ATCC#29212)，大肠杆菌(ATCC#25922)，Pseudomonas aeruginosa(ATCC#27853)，和Staphylococcus aureus(ATCC#29213)。
琼脂平板抑制实验包括测试分离自源生物体的每个形态独特的细菌抑制人类致病菌生长的能力，根据Alcamo，I.E.1994，微生物学实验原理，Benjiamin Cumming，美国纽约，所述方法和方案进行。将分离自源生物体的各个细菌分离物用细菌学接种环独立在TSYE平板上划一中线。然后将此平板在室温温育最少72小时，以使细菌生长。然后将人类致病菌菌种以直角单个划线至最初存在的细菌培养物。注意要保证病原性分离物不接触到最初的细菌划线。然后将此平板再温育48小时以使人类致病菌生长。在温育后，检测此平板中与源生物体细菌邻近的人类致病菌分离物的生长。
在原始存在的细菌划线邻近有一条未观测到生长的条带，其被认为是具有抑制作用。当观测到这种情况时，通过测定从最初存在的细菌至最近0.5mm的零生长带的距离，对抑制作用加以定量。抗细菌/抗真菌代谢物抑制实验方法
将在琼脂平板抑制实验中表现为抑制人类致病菌生长的分离自源生物体的细菌，在环境温度下在0.5L液体TSYE培养基中生长7天。每种分离物均以双份在培养瓶中生长，以进行两个不同的提取步骤。在生长阶段后，将由分离自源生物体的细菌分离物产生的复杂分子(代谢物)，利用标准液体提取方法从液体培养基中提取出。
提取方法包括两个独立的提取步骤，设计为定向提取水溶性和非水溶性化合物，以进行进一步测试。
水溶性提取步骤包括将含有细菌分离物细胞培养物的液体培养基样品在-80℃速冻。在速冻后，将冷冻的样品冻干。在冻干后，将样品加入0.5L的100％甲醇中并机械性搅拌1小时。将样品过滤灭菌以保证除去所有细菌细胞/细胞片段。然后利用旋转蒸发器将甲醇从所得甲醇/化合物混合物中蒸发，只剩下含有一或多种具有潜在生物学活性的化合物的多重化合物粗提物。
非水溶性提取步骤包括在含有细菌分离物细胞培养物的培养基样品中加入150ml乙酸乙酯。然后将此所得混合物机械性搅拌15分钟。通过分离漏斗将乙酸乙酯从混合物中分离并除去。将整个步骤重复3次，产生450ml的乙酸乙酯/化合物混合物。然后将乙酸乙酯使用旋转蒸发器从所得混合物中蒸发，只剩下含有一或多种具有潜在生物学活性的化合物的多重化合物粗提物。
对通过水溶性或非水溶性提取步骤得自每个抑制性细菌分离物的每种所得代谢物提取物，测试其抑制一或多种人类致病菌，抗生素抗性人类致病菌，人类真菌病原体，和人类致病病毒的能力。所用的人类致病菌是Enterococcus faecalis ATCC29212，万古霉素抗性Enterococcus faecalis(VRE)ATCC700221，Staphylococcus aureusATCC29213，二甲氧基苯青霉素抗性Staphylococcus aureus(MRSA)ATCC33591，Streptococcus pyogenes ATCC12358，青霉素抗性Streptococcus pneumonia ATCC700674，Pseudomonas aeruginosaATCC27853，和Salmonella typhimurium ATCC700408。所用的人类致病真菌是Candida albicans ATCC24433，Microsporum gypseumATCC14683，Trichophyton mentagrophytes ATCC9533，和Aspergillusfumigatus IHEM2895。
在Mueller-Hinton培养液中进行抗细菌测试。通过产生选自18-24小时琼脂平板中分离菌落的直接盐水悬浮液，制备接种物。之后将接种物标准化为500000CFU/ml。温育温度为35℃，温育时间为16小时。酵母筛选在补加0.3g/l谷氨酰胺和3.46g/l吗啉代丙烷磺酸(MOPS-缓冲液)的PRMI1640培养液中进行。温育温度为35℃，温育时间为24小时。
接种物是通过产生选择自18-24小时Sabouraud琼脂平板的分离的菌落的直接盐水悬浮液而制备的。之后将接种物标准化(1000-5000CFU/ml)。作为测定工具，生长曲线下的面积通过Biolink软件自动测定。将只含有培养液和测试化合物(如25ppm提取物)的样品面积从也含有接种物的样品面积中减去。对每个样品重复5次实验，获得可以与参考抗生素例如两性霉素B，青霉素和万古霉素相对比的一个数值。结果以与无测试化合物的样品相对的生长百分率表示。
抗霉菌筛选是在补加0.3g/l谷氨酰胺和3.46g/l吗啉代丙烷磺酸(MOPS-缓冲液)的PRMI1640培养液中进行。对Aspergillus sp.而言，温育温度/时间为35℃/48小时。对皮肤真菌而言，温育温度为25℃，温育时间为5天。
接种物是通过用大约1ml无菌盐水覆盖培养7天的培养物而制备的。悬浮液通过用Pasteur移液管尖轻轻探查菌落而产生。之后，将接种物标准化(4000-50000CFU/ml)。针对霉菌，不用动力学测定，只进行开始和结束点测定。作为测定工具，我们使用通过Biolink软件自动测定的OD(开始和结束)。将开始OD从结束OD中减去。对每个样品进行5次重复实验。这些数据获得一个数值，其可以与参考抗生素例如两性霉素B相对比。结果也以相对于无测试化合物的样品的生长百分率表示。
将人类致病细菌和真菌暴露于100和25ug/ml(ppm)标准化浓度的代谢物，所述代谢物是从分离自源生物体的每种细菌中提取的。利用Bioscreen C分析仪进行代谢物抑制实验，这种分析仪是一种能通过垂直光度测定(光密度)监测细菌和真菌浊度发育(及生长)的自动读数温育器。将结果用于产生与得自细菌分离物的代谢物提取物相关的生长曲线。每个实验均包括一个阳性对照或具有已知抗测试生物体的MIC的参考抗生素。抗病毒抑制实验方法
从粗提物中提取各种代谢物，所述粗提物是通过前述的两个提取步骤，使用HPLC层析柱，尤其Beckman Ultrasphere(4.6mm×150mm)，PartNo.235330，RP-18，5m粒径，从源生物体的皮肤环境中分离的细菌中获得的。洗脱剂是75∶25的乙腈和水的混合物，流速1ml/分钟。UV检测仪设定为210nm。对从源生物体的皮肤环境中分离的细菌中提取的代谢物，测试其在人类淋巴细胞CEM和MT-4细胞培养物中抑制HIV诱导的细胞病变的能力。将CEM细胞悬浮在大约250000个细胞/ml的培养基中，并用野生型HIV-1(IIIB)感染，以100倍的50％细胞培养感染剂量(CCID50)/ml感染。然后，将100微升感染细胞悬浮液加入200微升微滴定平板孔中，所述孔中含有100微升适当稀释的测试混合物。在37℃温育4天后，将细胞培养物经显微镜检测合胞体形成情况。EC50(半数有效浓度)定义为半数抑制合胞体形成所需的化合物浓度。抗肿瘤实验方法
对从源生物体的皮肤环境中分离的细菌中提取的代谢物，测试其抑制f-鼠白血病细胞(L1210/0)，小鼠乳腺癌细胞(FM3A)和人类T淋巴细胞(Molt4/C8和CEM/0细胞)增殖的能力。所有分析均在96孔微滴定平板中进行。在每个孔中加入5-7.5×104个细胞和给定数量的测试化合物。使细胞在37℃，在控制CO2的湿润环境中增殖48小时(小鼠白血病L1210，小鼠乳腺癌FM3A)或72小时(人类淋巴细胞CEM和Molt)。在温育结束时，在Coulter计数仪中计数。IC50(半数有效抑制浓度)定义为半数降低存活细胞数的化合物浓度。结果
从16种两栖动物(源生物体)中取样皮肤微生物菌群，所述动物包括13种蝾螈和3种蛙(表1)。从这些样品中，共分离417种形态学独特的细菌分离物。这些包括来自蝾螈的356种独特分离物，包含306种革兰氏阴性杆菌，20种革兰氏阳性杆菌，25种革兰氏阴性球菌和5种革兰氏阳性球菌，及来自蛙的61种独特分离物，包含37种革兰氏阴性杆菌，10种革兰氏阳性杆菌，7种革兰氏阴性球菌和7种革兰氏阳性球菌(表2)。
表2分离自两栖动物皮肤环境的细菌分离物概括
革兰氏阴性杆菌分离物数 革兰氏阳性杆菌分离物数 革兰氏阴性球菌分离物数 革兰氏阳性球菌分离物数
蝾螈细菌分离物     306     20     25     5
蛙细菌分离物     37     10     7     7
琼脂平板抑制实验
对417种独特的细菌分离物的每一种对抗4种人类细菌病原体Enterococcus faecalis(ATCC29212)，大肠杆菌(ATCC25922)，Pseudomonas aeruginosa(ATCC27853)，和Staphylococcus aureus(ATCC29213)进行的琼脂平板抑制实验，表明有13种独特的细菌分离物能抑制一或多种所述人类病原体生长。这13种分离物中，9种分离自无肺螈科蝾螈，4种分离自Hylidae和Ranidae科的蛙。Desmognathus quadramaculatus的分离物，与实验1的妊娠雌性孵育者不同，基本未呈现抑制。已知蝾螈的皮肤微生物菌群受激素，环境变化和其它因素影响，因此在实验1和实验2的个体之间观测到微生物菌群不同是不吃惊的。因此，实验1的细菌分离物DQ001D包括在实验2进行的测试中。能抑制致病菌生长的这13种独特的细菌分离物概括于表3。表3分离自两栖动物的呈现抑制活性的细菌的菌落和细胞形态特征概括
分离号 菌落形式 边缘形式 隆起形式 颜色 外表 革兰氏反应 源生物体
DQ001D 环形 完整 中央凸 不透明的白色边缘，白色中心 光滑 革兰氏阴性杆菌 蝾螈
PO014 环形 完整 凸起 桃红色中心，白色边缘 光滑 革兰氏阴性杆菌 蝾螈
PO019 环形 完整 凸起 黄色 光滑 革兰氏阴性杆菌 蝾螈
PO026 环形 完整 凸起 不透明白色 光滑 革兰氏阴性杆菌 蝾螈
PO027 环形 波浪形 凸起 白色 光滑 革兰氏阴性杆菌 蝾螈
AC021 环形 波浪形 凸起 不透明白色 光滑 革兰氏阴性杆菌 蛙
AC024 不规则形 波浪形 凸起 白色 光滑 革兰氏阴性杆菌 蛙
PC017 环形 完整 凸起 白色 光滑 革兰氏阴性杆菌 蛙
PD026 环形 完整 凸起 不透明桃红色 光滑 革兰氏阴性杆菌 蝾螈
EG006 不规则形 叶状 凸起 桔黄色 光滑 革兰氏阴性杆菌 蝾螈
EC009 点状 完整 凸起 黄色 光滑 革兰氏阴性杆菌 蝾螈
EC024 不规则形 叶状 中央凸起 不透明白色边缘，白色中心 光滑 革兰氏阴性杆菌 蝾螈
RC003 环形 锯齿状 凸起 紫色 光滑 革兰氏阳性球菌 蛙
在分离自源生物体的13种独特的细菌分离物中，有8种表现为能抑制一种以上测试的人类致病菌。5种分离自源生物体的独特细菌分离物只有效抑制一种测试的人类病原体。从表4的数据中可以看出，细菌分离物DQ001D，AC021，EG006，EC009，PO026，PO027，和RC003表现为能产生抑制Enterococcus faecalis(ATCC29219)的生长的化合物。细菌分离物EG006，EC009，PO014，EC024，和AC024表现为能产生抑制大肠杆菌(ATCC25922)生长的化合物。细菌分离物AC021，PO019，PO014，PO027，RC003，PD026和PC017表现为能产生抑制Staphylococcus aureus(ATCC29213)生长的化合物。细菌分离物EC024和AC024表现为能产生抑制Pseudomonasaeruginosa(ATCC27853)生长的化合物。
表4：细菌分离物对人类致病菌的抑制带
                           抑制带(mm)
分离物 Enterococcusfaecalis 大肠杆菌 Staphylococcusaureus Pseudomonasaeruginosa
DQ001D 37.0
PO014 17.5 ＞50
PO019 45.0
PO026 25.0
PO027 23.0 22.0
AC021 27.0 30.5
AC024 29.5 32.0
PC017 22.0
PD026 ＞50
EG006 ＞50 ＞50
EC024 35.5 32.0
EC009 ＞50 ＞50
RC003 44.0 45.5
抗细菌/抗真菌代谢物抑制实验
对从所述13种细菌分离物中提取的代谢物，进行测试其抑制致病细菌或真菌生长的效力，所述细菌分离物是从源生物体中分离的，其在琼脂平板抑制实验中抑制致病细菌生长。在这些代谢物中，来自细菌分离物DQ001D，PO026，PO027，和PC017的提取物在抑制致病细菌，致病真菌或这二者中，表现为强生物活性。
来自分离物DQ001D的代谢物，在100ppm(ug/ml)和25ppm有效抑制多重革兰氏阳性致病菌。特别地，来自DQ001D的代谢物提取物完全抑制致病性Enterococcus faecalis，万古霉素抗性Enterococcus faecium，Staphylococcus aureus，二甲氧基青霉素抗性Staphylococcus aureus，Streptococcus pyogenes，和青霉素抗性Streptococcus pneumonia的生长。另外，来自DQ001D的代谢物提取物在100ppm还有效地完全抑制人类致病真菌Candida albicans的生长，并示出在100ppm部分抑制人类致病真菌Microsporum gypseum的生长。
来自分离物PO026的代谢物提取物示出在100ppm完全抑制致病真菌Candida albicans的生长。
来自分离物PO027的代谢物提取物在25ppm有效地完全抑制人类致病菌Staphylococcus aureus生长。另外，来自分离物PO027的代谢物提取物在250ppm也抑制致病真菌Candida albicans的生长。
来自分离物PO017的代谢物提取物示出在100ppm抑制人类致病真菌Candida albicans的生长。最近从两栖动物中分离的其它细菌的提取物的抗菌和抗真菌活性获得相似结果，进一步表明应用本发明可以在将来发现其它这种活性。抗病毒抑制实验
对从所述13种细菌分离物中提取的代谢物，进行测试其抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)的多个毒株生长的效力，所述细菌分离物是从源生物体的皮肤环境中分离的，其在琼脂平板抑制实验中抑制致病细菌生长。在这些代谢物中，来自DQ001D的代谢物提取物(存留时间7.27分钟)表现为明显的抑制HIV在人类淋巴细胞CEM和MT-4细胞培养物中的致细胞病变性。特别地，抑制HIV-1和HIV-2在CEM细胞中的HIV致细胞病变作业所需要的DQ001D的有效代谢物浓度，分别是7ppm和17ppm。抑制HIV-1在MT-4细胞中的HIV诱导的致细胞病变作用所需要的DQ001D的有效代谢物浓度为9ppm。从DQ001D提取的代谢物对MT-4细胞的毒性经测定为40ppm。基于测试所述分离物的数据，预期可以提示其它分离物的抗病毒活性。抗肿瘤实验
从细菌分离物DQ001D中提取的代谢物，示出分别在17ppm，16ppm，17ppm，和17ppm抑制f-小鼠白血病细胞(L1210/0)，小鼠乳腺癌细胞(FM3A)和人类T淋巴细胞(Molt4/C8，CEM/0)的增殖。基于测试的所述分离物，预期可以提示其它分离物的抗肿瘤活性。
细菌和真菌对已知抗生素和抗真菌药物的抗性，导致世界范围内对能对抗这种疾病的新药源的研究。由于先前发现这种具有医用价值的化合物的新细菌原料的成功率非常低，研究人员将注意力集中于将大的生物体作为具有新医用价值的药物的潜在新原料(例如Beattie1992)。本发明数据提供了清晰的和重要的迹象，即两栖动物是能产生抗菌，抗真菌，抗病毒和抗肿瘤代谢物的具有医用价值的细菌的原料。
另外，细菌对已知药物的抗生素抗性代表严重的世界范围的健康问题。这个研究提供了清晰的指示，即两栖动物的皮肤环境含有能抑制多重人类致病细菌和真菌生长的细菌菌群，所述致病细菌和真菌包括那些高抗生素抗性菌，如万古霉素抗性Enterococcus faecalis和二甲氧基苯青霉素抗性Staphylococcus aureus。另外，从细菌分离物DQ001D中提取的代谢物的抗病毒和抗肿瘤活性，提供了分离自两栖动物皮肤环境的具有医用价值的化合物的应用指征。根据提供的这种及其它分离物的生物活性，可以认为并期望其它分离物也具有相似的抗病毒活性。
上述内容包含了本发明例证的实施方案。上述实施方案和方法可以基于本领域技术人员能力，经验，和选择而变化。方法中以一定顺序列举的步骤，只是举例说明而无限制所述方法的步骤之意。上述内容和图表只是举例说明了本发明，而无限制之意，除了权利要求限制范围内本领域技术人员在不偏离本发明范围内，可以对本发明加以修改和变化。

Claims (19)

1.一种分离自至少部分通过其皮肤进行呼吸的生物体皮肤的细菌的提取物，所述提取物抑制细菌，真菌，病毒或肿瘤的生长。
2.权利要求1的提取物，其中生物体是两栖动物。
3.权利要求1的提取物，其中生物体选自蝾螈组成的组。
4.权利要求1的提取物，其中生物体选自蛙组成的组。
5.权利要求1的提取物，其中提取物抑制人类致病细菌或人类致病真菌的生长。
6.权利要求1的提取物，其中提取物抑制人HIV的生长。
7.权利要求6的提取物，其中人类致病细菌选自由Enterococcus sp.，Staphylococcus sp.，Esherichia sp.和Pseudomonas sp.组成的组。
8.权利要求1的提取物，其中提取物在大约5ppm至大约250ppm之间是有效的。
9.为人类施用治疗量的权利要求1所述的提取物的方法。
10.一种选自DQ001D，PO014，PO019，PO026，PO027，AC021，AC024，PC017，PD026，EG006，EC009，EC024，和RC003的一种细菌分离物。
11.一种鉴别生物活性细菌代谢物的方法，包括在一种包含一或多种致病生物体的分析系统中，培养权利要求10所述的一种细菌分离物，并确定由该细菌分离物产生的代谢物对致病生物体相对于对照物生长的作用。
12.一种鉴别生物活性提取物，组分或化合物的方法，包括：
(a)培养权利要求10的细菌分离物；
(b)从培养物中提取代谢物；
(c)任意地分级分离提取的代谢物；并
(d)确定提取的或分级分离的代谢物在适当的分析系统中抑制致病生物体，肿瘤细胞，或病毒生长的能力。
13.一种根据权利要求12的方法鉴别的生物活性提取物，级分或化合物。
14.一种药物组合物，其包含一或多种权利要求13的生物活性提取物，级分或化合物，和一种适当的药物载体。
15.权利要求14的药物组合物，其中组合物适于局部，肠道，非肠道，或静脉内施用给对象。
16.一种抑制个体中致病生物体生长的方法，包括为该个体施用有效量的权利要求14的药物组合物。
17.一种抑制个体中肿瘤细胞生长的方法，包括为该个体施用有效量的权利要求14的药物组合物。
18.一种抑制个体中病毒生长的方法，包括为个体施用有效量的权利要求14的药物组合物。
19.权利要求18的方法，其中病毒是人类免疫缺陷病毒。
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