CN100522993C - 无指盘臭蛙抗菌肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种无指盘臭蛙抗菌肽，属于生物医学领域。无指盘臭蛙抗菌肽是从两栖类无指盘臭蛙分泌液中分离得到的一种环状多肽，分子量为1705.3道尔顿，等电点为9.39，多肽全序列一级结构为：Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser IlePro Pro Lys Pro Cys Phe(LKGCWTKSIPPKPCF)，第四位和第十四位的的半胱氨酸形成分子内二硫键。其制备方法是：乙醚刺激无指盘臭蛙收集的分泌液离心去除沉淀，冷冻干燥后经凝胶过滤柱层析和反相高压液相色谱后分离纯化后得到。本发明的无指盘臭蛙抗菌肽具有对细菌、真菌、病毒有强烈活性抑制作用，及无溶血活性的优点，可作为制备治疗病原微生物感染疾病药物的应用。

Description

无指盘臭蛙抗菌肽
技术领域：
本发明涉及一种无指盘臭蛙(Rana grahami)抗菌肽，属于生物医学领域。
背景技术：
青霉素的发现使人们对由病原微生物感染而引发的各类疾病不再束手无策，并由此发展了大量的β-内酰胺类抗生素，对保护人类健康作出了巨大贡献。但随着上述“传统抗生素”的广泛使用，不断产生出诸多新问题。如β-内酰胺类抗生素的过敏反应以及长期使用导致抗药菌株的产生。于是人们开始寻找新一代抗菌剂。近期的研究发现，多肽抗生素具有广谱的抗菌活性，同时具有“传统抗生素”无法比拟的优越性：如在最小作用浓度时，快速而广谱地杀灭微生物(包括目前临床抗药菌)；对真菌也有抑制作用；不会诱导抗药菌株的产生；对于局部感染和全身感染都有效，有希望成为新一代抗菌剂，其研制目前受到广泛重视。
很多两栖类动物在中国属于传统中药和民族药物而广泛应用，如中华蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼铃蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylarana guentheri)和泽蛙(Euphlyctislimnocharis)等。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效。已报道药理活性有广谱抗微生物作用、抗肿瘤、镇痛、局部麻醉、免疫调节、心血管系统作用等。在国外，两栖类皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已是新药发明的热点。据国内外文献报道，已从各种生物来源分离得到不同的活性多肽，而且有些已进入临床治疗。如从爪蟾(Xenopus laevis)皮肤分泌液获得的活性多肽Magainin具广谱抗微生物作用，同时具有抗肿瘤活性，在美国已获准作为广谱抗菌药物，其基因工程产品已进入三期临床；Intrabiotics公司生产的活性多肽IB-367已获准用于治疗癌症病人因多种细菌感染而引起的口腔溃疡一期临床试验；Applied Microbiology公司与Astra公司合作用活性多肽nisin治疗胃溃疡的临床试验也取得良好的疗效。
我国对两栖类药物的应用有悠久的历史，但对其活性成分和药理性质的研究主要集中于生物碱等有机小分子，对其皮肤活性肽类物质研究不多。无指盘臭蛙(Rana grahami)在国内主要分布于广西、四川、贵州和云南等地。
发明人将本发明的无指盘臭蛙抗菌肽编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同基因。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种新的具有广谱抗微生物(包括革兰氏阴、阳性细菌、真菌)的无指盘臭蛙抗菌肽。
本发明的无指盘臭蛙抗菌肽采用常规方法制备，即：乙醚刺激无指盘臭蛙，收集的皮肤分泌液离心去除沉淀，冷冻干燥后经一系列的生物化学手段分离纯化得到该多肽，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构，根据所得到的氨基酸序列合成该多肽。采用飞行时间质谱法测定分子量，等电聚焦测定等电点，自动氨基酸测序仪确认氨基酸序列结构。
本发明的无指盘臭蛙抗菌肽是从两栖类无指盘臭蛙分泌液中分离得到的一种环状多肽，分子量为1705.3道尔顿，等电点为9.39，多肽全序列一级结构为：Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe(LKGCWTKSIPPKPCF)，第四位和第十四位的的半胱氨酸形成分子内二硫键。
本发明的无指盘臭蛙抗菌肽作为制备治疗病原微生物感染疾病药物的应用。
本发明的无指盘臭蛙抗菌肽是从天然生物资源得到的产物，具有对细菌、真菌、病毒有强烈活性抑制作用，及无溶血活性的优点，可作为制备治疗病原微生物感染疾病药物的应用。
附图说明：
图1为本发明无指盘臭蛙抗菌肽的Sephadex G-50凝胶过滤柱层析图。
图2为本发明无指盘臭蛙抗菌肽反相高压液相色谱图。
图3为本发明无指盘臭蛙抗菌肽的飞行时间质谱图。
具体实施方式：
下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
无指盘臭蛙抗菌肽的制备：
将活体无指盘臭蛙用水清洗干净，置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚(1升体积容积加1毫升无水乙醚)，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从无指盘臭蛙皮肤分泌出来，收集分泌物，离心(10000rpm，20分钟)、冷冻干燥后保存。
第一步，Sephadex G-50凝胶过滤柱层析，按上述方法获得的原材料无指盘臭蛙皮肤分泌液冻干粉300mg溶解于5ml纯净水，10000rpm 4℃离心10min去除沉淀。Sephadex G-50凝胶过滤柱(长1000mm，直径26mm)用0.1M Na2HPO4-NaH2PO4 pH 6.0缓冲液平衡，充分后将样品上于该柱。用同样缓冲液洗脱，收集活性峰。
第二步，反相高压液相色谱为：Sephadex G-50凝胶过滤得到的活性成分的峰上样于经含1‰三氟乙酸的超纯水充分平衡的C18反相柱(长300mm，直径5mm)用含1‰三氟乙酸的乙晴缓冲液从0％至80％的梯度洗脱。收集具有抑菌作用的活性峰。
第三步，纯化的无指盘臭蛙抗菌肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用飞行时间质谱法(Time of flight mass spectrometry，TOF-MS)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
通过上述方法制备的无指盘臭蛙抗菌肽是中国两栖类无指盘臭蛙抗菌肽基因编码的一种环状多肽，分子量为1705.3道尔顿，等电点为9.39，多肽全序列一级结构为：Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe(LKGCWTKSIPPKPCF)，第四位和第十四位的的半胱氨酸形成分子内二硫键。
无指盘臭蛙抗菌肽的药理实验：
1.无指盘臭蛙抗菌肽抑制细菌生长的作用
抗菌活性检测采用杯碟法，培养基为普通琼脂培养基。分别注入加热溶化的培养基20ml于平皿中作为底层，使其在皿底均匀摊布，凝固后另取培养基适量加热溶化，分别向每皿中加入5ml菌悬液，摇匀使其在底层上均匀摊布，作为菌层。冷却后，在平皿中等距离放入已消毒的不锈钢杯6个。第一个钢杯加入0.3mg/ml浓度的待测化合物溶液0.1ml，其余钢杯采用二倍稀释法加入样品液，37℃培养，24h后测量抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上作为最小抑菌浓度(minimalinhibitory concentration，MIC)。细菌菌株来源于昆明医学院第一附属医院，此实验做四个平行，取几何平均值，结果如表1。
表1.无指盘臭蛙抗菌肽抑制细菌生长的作用
Figure C200610010928D00051
由表1可见，无指盘臭蛙抗菌肽有显著的抑制细菌生长作用。
2.无指盘臭蛙抗菌肽抑制真菌生长的作用
抗真菌活性检测采用杯碟法，培养基为改良沙保氏(Sabousand)培养基。分别注入加热溶化的培养基20ml于平皿中作为底层，使其在皿底均匀摊布，凝固后另取培养基适量加热溶化，分别向每皿中加入5ml菌悬液，摇匀，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。冷却后，在平皿中等距离放入已消毒的不锈钢杯5个。第一个钢杯加入0.3mg/ml浓度的待测化合物溶液0.1ml，其余钢杯采用二倍稀释法加入样品液，37℃培养，24h-48h后测量抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上作为最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)。细菌菌株来源于云南大学微生物研究所，此实验做三个平行，取几何平均值，结果如表2。
表2.无指盘臭蛙抗菌肽抑制真菌生长的作用

Claims (1)

1.一种无指盘臭蛙抗菌肽，其特征在于该无指盘臭蛙抗菌肽是从两栖类无指盘臭蛙分泌液中分离得到的一种环状多肽，分子量为1705.3道尔顿，等电点为9.39，多肽全序列一级结构为：Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro LysPro Cys Phe(LKGCWTKSIPPKPCF)，第四位和第十四位的的半胱氨酸形成分子内二硫键。
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