CN1170845C - 大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白及其制备方法和其基因 - Google Patents

Abstract

本发明涉及大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白及其制备方法和其基因，属于生物医学领域。抗肿瘤蛋白是从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的一种单链多肽，分子量2697道尔顿，等电点9.83，多肽氨基酸全序列一级结构为：NH₂-GIGGKILSGLKTALKGAAKELASTYLH-NH₂。制备方法是收集大蹼铃蟾皮肤分泌物，离心去除沉淀、冷冻干燥后，经离子交换、高压液相反相柱层析分离纯化后得到。由650、623、625个核苷酸组成的三个不同的基因可编码大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白，编码成熟抗肿瘤蛋白分别为第177-257位、第166-246位、175-255位核苷酸。具有抑制肿瘤细胞生长、抗艾滋病病毒活性和抑制细菌和真菌生长的作用。

Description

大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白及其制备方法和其基因

本发明涉及一种大蹼铃蟾(Bombina maxima)抗肿瘤蛋白及其制备方法和其基因，属于生物医学领域。

肿瘤是危害人类健康的一类主要疾病，而且治疗药物匮乏，目前在化疗中所使用的药物，如阿霉素，环磷酰胺等等均具有较大的人体毒性，副作用非常大，因而肿瘤治疗药物的开发是药物研制的热点。

艾滋病(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的破坏肌体免疫系统的致死疾病。这一被称为“二十世纪瘟疫”的病魔，已蔓延到世界的每个角落，众多的发展中国家正在遭受它的危害。据WHO最新公布的材料，AIDS流行的国家和地区达170多个，全球感染HIV者已达4400多万人，已有1400万人死亡，据专家估计，我国目前实际HIV感染人数超过50万人。由于目前尚无可预防的有效疫苗，抗HIV药物成为防治AIDS的有效手段。另一方面，目前发现HIV病毒易变异及对许多药物会产生耐药性，造成治疗上的巨大困难，从传统药物和天然资源中寻找新的抗AIDS药物和先导化合物的研究，是当前国内外新药研制中的重要研究方面和非常活跃的领域。

自从抗生素发明以来，人类在控制和治疗微生物感染疾病中取得了较大的成就，但随着药物的持续使用，目前微生物抗药性已成为临床微生物感染疾病治疗的重大问题，以至于某些病原细菌已没有临床治疗的一线药物。与目前广泛使用的抗生素相比，多肽抗生素具有很多优点：如在最小作用浓度时，快速而广谱的杀灭微生物(包括目前临床抗药菌)，对真菌也有抑制作用，抗性菌株生成性小，对局部感染和全身感染都有效。由此看来，在目前不少病原菌对已有抗生素逐渐产生耐药性，而新的抗生素发现又极为困难的情况下，多肽类物质正成为新一类抗生素，其研制目前受到广泛重视。

很多两栖类动物在中国属于传统中药和民族药物而广泛应用，如中华蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼铃蟾(Bombina maxima)等。大蹼铃蟾主要分布于我国的云南、四川省，是我国的特色资源动物之一，也是特色的民族民间药物。从这些传统药物中寻找特定药理活性的单体化合物是中药现代化的重要内容之一。在国外，两栖类皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已是新药发明的热点，据文献报道从爪蟾(Xenopus laevis)皮肤分泌液获得的抗菌肽Magainin具广谱抗微生物作用，同时具有抗肿瘤活性。Magainin制药公司宣布，他们生产的爪蟾皮肤抗菌肽Magainin类似物MSI-78用于治疗926例糖尿病患者因多种细菌感染而引起足部溃疡的III期临床结果表明，MSI-78与ofloxacin有同样的效果，但产生更小的副作用。Intrabiotics公司生产的抗菌肽IB-367已获准用于治疗癌症病人因多种细菌感染而引起的口腔溃疡一期临床试验。动物实验研究表明，天蚕抗菌肽和蜂毒抗菌肽的部分序列杂合而成的含12-18氨基酸残基的多肽对绿脓假单胞菌引起的兔眼感染有良好的治疗作用。在国外，抗菌肽已开始用于抗肿瘤和抗带外壳病毒的研究和治疗，但未见详细的报道。

发明人将本发明的大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白全序列结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。与发明人的另一发明“大蹼铃蟾多肽及其制备方法和在制药中的应用”，专利申请号00122417.4相比，本发明大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白与大蹼铃蟾多肽在多肽氨基酸序列结构上有较大差异，同时在抗肿瘤、抗病毒活性、抗菌活性方面也存在差异。发明人将本发明的大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同基因。

本发明的目的是基于上述现有技术基础，提供一种具有抗肿瘤、广谱抗微生物(包括革兰氏阳性细菌，革兰氏阴性细菌、真菌)和抗HIV病毒活性的大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白及其制备方法和其基因。

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：

大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白，是我们首次从两栖类动物大蹼铃蟾(Bombina maxima)皮肤分泌物中分离得到的一种单链多肽，分子量2697道尔顿，等电点9.83，多肽氨基酸全序列一级结构为：甘氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-甘氨酸-赖氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-丝氨酸-甘氨酸-亮氨酸-赖氨酸-苏氨酸-丙氨酸-亮氨酸-赖氨酸-甘氨酸-丙氨酸-丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-亮氨酸-丙氨酸-丝氨酸-苏氨酸-酪氨酸-亮氨酸-酰胺化组氨酸(NH₂-GIGGKILSGLKTALKGAAKELASTYLH-NH₂)，定义为SEQ ID NO：1。

大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白制备的方法，是将活体大蹼铃蟾用水清洗干净，置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚(1升体积容积加1毫升无水乙醚)，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心(10000rpm，20分钟)、冷冻干燥后，经CM-Sephadex C-25离子交换后，收取所得峰III再经高效液相色谱(HPLC)反相C18柱分离纯化，取第二步HPLC反相C18柱层析分离出的峰(箭头所示)即可。然后用HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment mass spectrometry，FAB-MS)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白作为制备抗肿瘤药、抗艾滋病药、广谱抗微生物药中的应用。

大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白基因的克隆包括：大蹼铃蟾皮肤总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，在通过抗肿瘤蛋白N-端序列设计引物基础上，利用PCR方法筛选抗肿瘤蛋白编码基因。根据N-端序列所设计的扩增引物长度为18个核苷酸，其序列为5’GGNATCGGNGGNAAAATC3’，其中N＝A、C、G、T，PCR另一扩增引物为位于克隆插入部分的3’端的载体SP6启动子引物，其序列为5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG3’。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。基因测序结果表明三个不同的基因可编码产生同一成熟大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白；其中，基因一的cDNA由650个核苷酸组成，其自5’端至3’端序列为：

GATATCTGATAACCTATAACACGTTTCCTGAGATCTTGGTAAAGATGAATTTTAAGTACAT

AGTTGCAGTGTCCTTTTTAATAGCATCTGCATATGCAAGAAGTGTACAGAATGATGAACAG

TCTCTGAGTCAGAGGGATGTTTTAGAAGAAGAAGAATCACTGAGGGAAATCAGAGGTATAG

GAGGAAAAATCCTATCTGGTCTTAAAACAGCTTTAAAAGGTGCAGCCAAAGAGTTGGCTTC

TACGTATCTGCATAGGAAGAGAACAGCTGAAGAACACGAAGTAATGAAAAGACTGGAAGCC

GTAATGCGTGATCTAGATTCCTTGGATTATCCAGAGGAAGCTTCTGAAAGGGAAACCAGAG

GCTTCAATCAAGACGAGATTGCAAATCTTTTTACTAAAAAAGAGAAACGCATTTTGGGGCC

AGTACTAGGTTTGGTTAGTAATGCACTTGGAGGTTTAATTAAAAAGATTGGATAATTATAA

CCAAAAAACTTTGCTTTCATGAATGTTTGTAAAATGATGCTAATCAGATAACATATAAAAA

AGCATAAAAAAGCTATTTAAACAAACTGCATGCTCTCTACTCTGCTATTAAATAAAAATAA

TTTGGGCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

定义为SEQ ID NO：2，编码权利要求1所述的成熟抗肿瘤蛋白为第177-257位核苷酸，其编码的氨基酸序列为：SEQ ID NO：1；

基因二的cDNA由623个核苷酸组成，其自5’端至3’端序列为：

ATAACCTGTAACACGTTTCCTGAGATCTTGGTAAAGATGCATTTTAAGTACATAGTTGCAG

TGTCCTTTTTAATAGCATCTGCATATGCAAGAAGTGTACAGAATGATGAACAGTCTCTGAG

TCAGAGGGATGTTTTAGAAGAAGAATCACTGAGGGAAATCAGAGGTATAGGAGGAAAAATC

CTATCTGGTCTTAAAACAGCTTTAAAAGGTGCAGCCAAAGAGTTGGCTTCTACGTATCTGC

ATAGGAAGAGAACAGCTGAAGAACACGAAGTAATGAAAAGACTGGAAGCCATAATGCGTGA

TCTAGATTCCTTGGATTATCCAGAGGAAGCTTCTGAAAGGGAAACCAGAGGCTTCAATCAA

GACAAGATTGCAAATCTTTTTACTAAAAAAGAGAAACGCATTTTGGGGCCAGTACTAGGTT

TGGTTGGTAGTGCACTTGGAGGTTTAATTAAAAAGATTGGATAATTATAACCAAAAAACTT

TGCTTTCATGAATGTTTGTAAAATGATGCTAATCAGATAACATATAAAAAAGCATAAAAAA

GCTATTTAAACAAACTGCATGCTCTCTACTCTGCTATTAAATAAAAATAATTTGAGCACAA

AAAAAAAAAAAAA

定义为SEQ ID NO：3，编码权利要求1所述的成熟抗肿瘤蛋白为第166-246位核苷酸，其编码的氨基酸序列为：SEQ ID NO：1；

基因三的cDNA由625个核苷酸组成，其自5’端至3’端序列为：

AGATATCTGATAACCTATAACACGTTTCTTGAGATCTTGGTAAAGATGAATTTTAAGTACA

TAGTTGCAGTGTCCTTTTTAATAGCATCTGCATATGCAAGAAGTGTACAGAATGATGAACA

GTCTCTGAGTCAGAGGGATGTTTTAGAAGAAGAATCACTGAGGGAAATCAGAGGTATAGGA

GGAAAAATCCTATCTGGTCTTAAAACAGCTTTAAAAGGTGCAGCCAAAGAGTTGGCTTCTA

CGTATCTGCATAGGAGAAGAACAGCTGAAGAACACGAAGTAATGAAAAGACTGGAAGCCGT

AATGCGTGATCTAGATTCCTTGGATTATCCAGAGGAAGCTTCTGAAAGGGAAACCAGAGGC

TTCAATCAAGACGAGATTGCAAATCTTTTTACTAAAAAAGAGAAACGCATTTTGGGGCCAG

TACTAAGTATGGTTGGTAGTGCACTTGGAGGTTTAATTAAAAAGATTGGATAATTATAACC

AAAAACTTTGCTTTCATGAATGTTTGTAAATGATGCTATCAGATACATATAAAAAGCATAA

AAAGCTATTTAACAACTGCATGCTCTCTACTCTGCTATTAATAAAATAATTTGAGCCCAAA

AAAAAAAAAAAAAAA

定义为SEQ ID NO：4，编码权利要求1所述的成熟抗肿瘤蛋白为第175-255位核苷酸。其编码的氨基酸序列为：SEQ ID NO：1。

大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白基因作为基因工程制备大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白的应用。

下面用本发明的大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白的药理实验结果来说明本发明的药效作用和有益效果：

1，大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白抑制肿瘤细胞生长的作用：

在96孔平底细胞培养板上，将待测化合物用完全培养基进行5倍或2倍倍比稀释，共六个稀释度，每个稀释度设3个重复孔，每孔100μl，同时设置正常细胞对照。每孔滴加3×10⁵/ml的C8166细胞、Molt-4或HCT-15细胞100μl。置37℃，5％CO₂培养箱内培养。72小时(C8166)或48小时(Molt-4、HCT-15)用MTT方法测定待测化合物对细胞的毒性作用。EC50是对50％宿主细胞产生细胞毒作用时的药物浓度。

表1 大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白抑制肿瘤细胞生长的作用：

化合物                             EC50(μg/ml)

                       C8166       Molt 4       HCT-15

抗肿瘤蛋白粗品         69          78           95

抗肿瘤蛋白(批号1)      9.8         14.5         42.5

抗肿瘤蛋白(批号2)      14.4        27.3         38.2

抗肿瘤蛋白(批号3)      19.5        10.9         45.4

由表1可见，大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白第一步CM-Sephadex C-25离子交换粗品及纯化抗肿瘤蛋白均具有显著的体外抑制人肿瘤细胞生长的作用。

2，抗肿瘤蛋白对HIV-1诱导C8166细胞形成合胞体的抑制作用

在96孔平底细胞培养板上，将待测化合物用完全培养基进行5倍或2倍倍比稀释，共6个稀释度，每孔100μl，同时设置正常细胞对照，HIV感染细胞对照。每实验孔滴加3×10⁴个C8166细胞和200 TCID₅₀的HIV-1_IIIB，即感染复数为0.007，每孔的总体积为200μl。置37℃，5％CO₂培养箱内培养。感染后第3天观察待测化合物对合胞体形成的影响。在100倍的倒置显微镜下，选取5个不重叠的视野，计数HIV-1_IIIB诱导C8166细胞形成的合胞体数。EC50为抑制合胞体形成达50％时的药物浓度。CC50是对50％宿主细胞产生细胞毒作用时的药物浓度，治疗指数(TI)为CC50/EC50的比值

表2 大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白对HIV-1IIIB诱导C8166细胞形成合胞体的抑制作用：

化合物                    EC50           CC50             TI

                        (μg/ml)        (μg/ml)

抗肿瘤蛋白粗品            12.5            89              7

抗肿瘤蛋白(批号1)         1.2             9.8             8

抗肿瘤蛋白(批号2)         1.4             14.4            10

抗肿瘤蛋白(批号3)         1.6             19.5            12

从表2可见，与文献报道的其他来源两栖类皮肤多肽和目前临床上所用抗生素类药物不同，大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白粗品及不同批号的纯化抗肿瘤蛋白均有显著的体外抑制HIV-1_IIIB诱导C8166细胞形成合胞体的作用。

3，大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白抑制细菌生长的作用：

抗菌活性检测，采用杯碟法，培养基为普通琼脂培养基。分别注入加热融化的培养基20ml于平皿中作为底层，使其在皿底内均匀摊布，凝固后，另取培养基适量加热融化后，分别在每皿中加入5ml菌悬液，摇匀，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。冷却后，在平皿中等距离均匀放入已消毒的不锈钢杯6个。第一个钢杯加入 0.3mg/ml浓度的待测化合物溶液0.1ml，其余钢杯采用二倍稀释法加入样品液，37℃培养，观察抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上的作为最小抑菌浓度(minimalinhibitory concentration，MIC)。细菌菌株来源于昆明医学院第一附属医院，此试验重复四次，取平均值，结果如表1。

表3，大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白抑制细菌生长的作用：

菌株                                   最小抑菌浓度(μg/ml)

                                     粗样品       抗肿瘤蛋白

大肠杆菌ATCC25922                      75             3.6

(Escherichia coli ATCC25922)

金黄色葡萄球菌 ATCC2592                75             14.4

(Staphylococcus auneus ATCC2592)

绿脓杆菌CMCCB10104                     75             14.4

(Pseudomonas aeruginosa CMCCB10104)

巨大芽胞杆菌                           150            3.6

(Bacillus megaterium)

痢疾杆菌                               37             3.6

(Bacillus dysenteriae)

肺炎球菌                               37             3.6

(Klebsiella pneumoniae)

由表3可见，除抑制肿瘤细胞生长，抗HIV病毒外，大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白粗品及纯化抗肿瘤蛋白均具有显著的抑制细菌(包括革兰氏阳性细菌，革兰氏阴性细菌)生长的作用，而且与文献报道的其他来源抗菌多肽相比，大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白的抗菌活性平均高5-10倍。

4，大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白抑制真菌生长的作用：

抗真菌活性检测，采用杯碟法。培养基为改良沙保氏(Sabousand)培养基，分别注入加热融化的培养基20ml于平皿中作为底层，使其在皿底内均匀摊布，凝固后，另取培养基适量加热融化后，分别在每皿中加入5ml菌悬液，摇匀，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。冷却后，在平皿中等距离均匀放入已消毒的不锈钢杯6个。第一个钢杯加入0.3mg/ml浓度的待测化合物溶液0.1ml，其余钢杯采用二倍稀释法加入样品液，37℃培养，观察抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上的作为最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)。真菌株来源于云南大学微生物研究所，此试验重复三次，取平均值，结果如表4。

表4，大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白抑制真菌生长的作用：

菌株                                    最小抑菌浓度(μg/ml)

                                        粗样品    抗肿瘤蛋白

白色念珠菌ATCC2002                        37          1.5

(Candida albicans ATCC2002)

黄曲霉IFFI4015                            75          4.2

(Aspergillus flavus sp IFFI4015)

青霉IFFI2001                              ＞300       25

(Penicillium sp IFFI2001)

微小毛霉                                  37          4.2

(Mucor pusillus)

酵母：

啤酒酵母                                  75          12.4

(Sacharomyces cerervisiae)

由表4可见，除抑制细菌生长外，大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白第一步CM-SephadexC-25离子交换粗品及纯化抗肿瘤蛋白均具有显著的抑制真菌生长的作用，而且与其他来源抗菌多肽相比，抗真菌活性平均高10-50倍。

从上述实验结果可得出本发明大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白的有益效果在于：

大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白粗品及不同批号的纯化抗肿瘤蛋白均具有显著地抑制肿瘤细胞生长的作用，对C8166，Molt-4，HCT-15肿瘤细胞的抑制率EC50平均分别为14.6μg/ml，17.6μg/ml，42.0μg/ml；另一方面，大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白具显著的抗艾滋病病毒活性，多肽浓度达到1.4μg/ml时，抗肿瘤蛋白对病毒复制抑制率达50％。除上述活性外，大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白具有抑制细菌和真菌生长的作用(包括革兰氏阳性细菌，革兰氏阴性细菌，真菌；MIC在4-20μg/ml范围内)。而且与文献报道的其他来源抗菌多肽相比，抗肿瘤蛋白的抗菌活性平均高5-10倍。因此，本发明的大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白是一种从中国特色药用生物资源中自己研制的具有抗肿瘤，抗艾滋病病毒，抗微生物作用的生物活性多肽。

下面结合附图用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。

图1为本发明大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白的CM-Sephadex C-25离子交换层析图。

图2为本发明大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白的HPLC反相C18柱层析图。

图3为本发明大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白三个基因核苷酸序列(SEQ ID NO：2，SEQID NO：3，SEQ ID NO：4)。

图4为本发明成熟大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。

实施例一：

1，制备大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白：

活体大蹼铃蟾用水清洗干净，将大蹼铃蟾置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚(1升体积容积加1毫升无水乙醚)，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心(10000rpm，20分钟)、冷冻干燥、低温保存。

第一步：CM Sephadex C-25离子交换：按上述方法获得原材料大蹼铃蟾分泌物冻干粉溶解于0.1M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH6.0缓冲液，装于3.5KDa透析袋，于同样缓冲液透析12小时；上样品于经0.1M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH6.0缓冲液平衡的CMSephadex C-25(Pharmacia产品)阳离子交换柱(300mm长，26mm直径)，经两个柱体积同样缓冲液冲洗至穿透峰被完全洗脱，再用含NaCl的缓冲液进行梯度洗脱，收集峰III。

第二步，反相高压液相层析(RP-HPLC)：CM Sephadex C-25离子交换得到的活性成分峰III以水(含0.1％三氟乙酸)：乙晴(含0.1％三氟乙酸)构成的洗脱系统进行梯度洗脱，收集HPLC反相C18柱层析峰(箭头标记)即为纯化抗肿瘤蛋白。

2，分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment massspectrometry，FAB-MS)，以甘油：间硝基苄醇：二甲亚砜(1∶1∶1，V∶V∶V，体积比)为底物，Cs⁺作为轰击粒子，电流为1μA，发射电压为25Kv。

3，纯化抗肿瘤蛋白用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

通过上述方法制备的大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白，是我们首次从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的一种单链多肽，分子量2697道尔顿，等电点9.83，多肽氨基酸全序列结构为：甘氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-甘氨酸-赖氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-丝氨酸-甘氨酸-亮氨酸-赖氨酸-苏氨酸-丙氨酸-亮氨酸-赖氨酸-甘氨酸-丙氨酸-丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-亮氨酸-丙氨酸-丝氨酸-苏氨酸-酪氨酸-亮氨酸-酰胺化组氨酸(NH₂-GIGGKILSGLKTALKGAAKELASTYLH-NH₂)，SEQ ID NO：1。作为制备抗肿瘤、抗艾滋病、抗微生物感染药物。

实施例二：

1，大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白基因克隆：

1)，大蹼铃蟾皮肤总RNA提取：活体大蹼铃蟾用水清洗干净，放入液氮中速冻4小时，取皮肤组织，称重，取300mg皮肤组织，加入10ml总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，美国GIBC0BRL公司产品)，于20ml玻璃匀浆器中匀浆30分钟，加入等体积酚/氯仿溶液，，剧烈混匀，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀，上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为大蹼铃蟾皮肤总RNA。

2)，大蹼铃蟾皮肤mRNA的纯化：采用美国PROMEGA公司的mRNA分离纯化试剂盒。取大蹼铃蟾皮肤总RNA500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10分钟，加人3μl的Oligo(dT)探针和13μl 20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。磁珠(SA-PMP)的洗涤：将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5×SSC 0.3ml，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml 0.5×SSC悬浮，称之为B液。将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1×SSC洗涤4次，最后弃上清，加0.1ml DEPC水悬浮，至磁力架上吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入0.15ml DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，则上清中为纯化的大蹼铃蟾皮肤mRNA。加入1/10体积3M乙酸钠，pH5.2，等体积异戊醇，于-70℃放置30分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。

3)，大蹼铃蟾皮肤cDNA文库构建：采用美国GIBC0BRL公司SuperScriptTM质粒cDNA文库构建试剂盒，但方法操作有改进。cDNA第一链合成(mRNA反转录)，于1.5ml试管中加入2μl Not I引物和7μl mRNA，3μl DEPC水，70℃保温10分钟，立即放入冰浴冷却，然后加入4μl 5X第一链合成缓冲液，2μl 0.1M DTT，1μl 10mM dNTP混合物，在加入1μl SuperScript II反转录酶，于37℃保温1小时后放入冰浴。cDNA第二链合成，在第一链合成试管中加入：95μl DEPC水，30μl 5X第二链合成缓冲液，3μl 10mM dNTP混合物，1μl大肠杆菌DNA连接酶，4μl大肠杆菌DNA多聚酶I，1μl大肠杆菌RNA酶，反应总体积150μl，混匀后于16℃保温2小时；加入2μlT4 DNA多聚酶继续保温5分钟。DNA的抽提和乙醇沉淀，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)混合物抽提，12000rpm离心5分钟，取140μl上层溶液转移到干净试管中，加入70μl 7.5M乙酸铵，0.5ml无水乙醇，12000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干。Sal I adapter的连接，上述沉淀溶于25μlDEPC水中，加入10μl 5XT4 DNA连接酶缓冲液，10μlSalI adapter，5μl T4 DNA连接酶，反应总体积50μl，于16 ℃保温16小时。重复上述DNA的抽提和乙醇沉淀过程，沉淀溶解于41μlDEPC水中。Not I酶水解，于cDNA溶液中加入5μl React 3缓冲液，4μl Not I酶，反应体积50μl，于37℃保温2小时。重复上述DNA的抽提和乙醇沉淀过程，沉淀溶解于100μlTEN缓冲液中。将cDNA样品过DNA分级分离柱(试剂盒含有)后，去除小于300bp核苷酸的cDNA。cDNA大于300bp核苷酸的组份合并，体积为200μl，加入5μl酵母tRNA，100μl 7.5M乙酸铵，0.6ml无水乙醇，12000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，沉淀溶于20μlTEN缓冲液中。合成的cDNA连接到pSPORT1质粒，取10μl溶解于TEN缓冲液中的cDNA，加入4μl 5XT4 DNA连接酶缓冲液，1μl pSPORT 1质粒(Not I-Sal酶水解，50ng)，4μlDEPC水，1μl T4 DNA连接酶，反应体积20μl，室温3小时，可准备转化大肠杆菌HB101感受态细胞。感受态细胞的制备，挑取单个HB101菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接种于，50ml LB培养液中，37℃振荡2小时，待菌液540nm OD值为0.4时，4℃，2000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀用0.1M CaCl₂悬浮，再2000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀以适量0.1M CaCl₂重悬，分装后置冰浴内备用。连接产物的转化：取上述连接产物5μl加入100μl感受态细胞冰浴60分钟，42℃热休克60秒，再置冰浴5分钟，加入无氨苄青霉素的SOC培养基0.9ml，37℃培养1小时，取200μl涂布于含氨苄青霉素的LB平皿(15cm直径)，37℃培养16小时，每个LB平皿用5ml LB液体培养基洗涤菌落，加10％甘油冻存。构建的cDNA大约含4×10⁴个单独克隆。

4)，大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白基因克隆筛选：利用PCR筛选法筛选大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白基因，所用正向引物P1，根据大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白N-端6个氨基酸序列的可能的编码核苷酸所设计，长度为18个核苷酸，其序列为5’GGNATCGGNGGNAAAATC 3’，其中N＝A、C、G、T；和位于克隆插入部分的3’端的载体SP6启动子引物，其序列为5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG3’。PCR反应在如下条件下进行：94℃ 1分钟，50℃ 1分钟和72℃ 1分钟，30个循环。首先滴定构建的细菌cDNA文库，然后用含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基稀释至适当的细菌浓度(大约5000个细菌/毫升，和30个细菌/毫升分别用于首轮筛选和第二轮筛选)，在96孔培养板(Costar)上按8×8矩阵铺板(共64孔，每孔100μl)，37 ℃过夜培养。按行、列分别合并细菌培养液，有16个样品进行PCR鉴定，交叉阳性孔细菌样品进入第二轮筛选。

2，大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白基因序列测定和结果：提取质粒DNA用双脱氧法测定核苷酸序列，使用仪器为美国Applied Biosystems373A全自动核昔酸序列测定仪，测序引物为SP6和T7启动子，SP6启动子序列：5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG3’，T7启动子序列：5’TAATACGACTCACTATAGGGA3’。克隆筛选和基因测序结果表明，三个不同的基因可编码同一大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白，其cDNA序列自5’端至3’端(见图3)。图3所示大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白基因核苷酸的序列表为：

基因一(SEQ ID NO：2)，序列长度：650个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cDNA，来源：大蹼铃蟾皮肤，序列特征1：其中编码成熟抗肿瘤蛋白为第177-257位核苷酸，其编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)见图4，序列特征2：序列分析表明第417-476位核苷酸可编码另一功能蛋白(氨基酸序列为：ILGPVLGLVSNALGGLIKKI)。

基因二(SEQ ID NO：3)，序列长度：623个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cDNA，来源：大蹼铃蟾皮肤，序列特征1：其中编码成熟抗肿瘤蛋白为第166-246位核苷酸，其编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)见图4，序列特征2：序列分析表明第406-465位核苷酸可编码另一功能蛋白(氨基酸序列为：ILGPVLGLVGSALGGLIKKI)。

基因三(SEQ ID NO：4)，序列长度：625个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cDNA，来源：大蹼铃蟾皮肤，序列特征1：其中编码成熟抗肿瘤蛋白为第175-255位核苷酸，其编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)见图4，序列特征2：序列分析表明第415-474位核苷酸可编码另一功能蛋白(氨基酸序列为：ILGPVLSMVGSALGGLIKKI)。

大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白基因作为基因工程制备抗肿瘤蛋白的应用。

Claims (4)

1.大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白，其特征是从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的一种单链多肽，分子量2697道尔顿，等电点9.83，多肽氨基酸全序列一级结构为：SEQ ID NO：1。

2.大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白的制备方法，其特征是将活体大蹼铃蟾用水清洗干净，置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心去除沉淀、冷冻干燥后，经离子交换、高压液相反相柱层析分离纯化，即可得到抗肿瘤蛋白；其中：

离子交换为：将大蹼铃蟾分泌物冻干粉溶解于0.1M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH 6.0缓冲液，装于3.5KDa透析袋，于同样缓冲液透析12小时；上样品于经0.1MNa₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH 6.0缓冲液平衡的CM Sephadex C-25阳离子交换柱长300mm、直径为26mm，经两个柱体积同样缓冲液冲洗至穿透峰被完全洗脱，再用含NaCl的缓冲液进行梯度洗脱，收集峰III；

高压液相反相柱层析为：将离子交换得到的活性成分峰III以含0.1％三氟乙酸的水：含0.1％三氟乙酸的乙晴构成的洗脱系统进行梯度洗脱，收集HPLC反相C18柱层析峰，箭头标记的柱层析峰即为纯化抗肿瘤蛋白。

3、大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白基因核苷酸序列，其特征在于三个不同的基因可编码产生同一大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白；其中：基因一的cDNA由650个核苷酸组成，其自5’端至3’端序列为：SEQ ID NO：2；基因二的DNA由623个核苷酸组成，其自5’端至3’端序列为：SEQ ID NO：3；基因三的cDNA由625个核苷酸组成，其自5’端至3’端序列为：SEQ ID NO：4。

4、根据权利要求3所述的大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白基因核苷酸序列，其特征在于编码成熟抗肿瘤蛋白分别为：SEQ ID NO：2中的第177-257位核苷酸，SEQ ID NO：3中的第166-246位核苷酸，SEQ ID NO：4中的第175-255位核苷酸；其编码的氨基酸序列为：SEQ ID NO：1。

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