CN1157405C - 霍乱毒素b亚基的制法 - Google Patents
霍乱毒素b亚基的制法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1157405C CN1157405C CNB011445025A CN01144502A CN1157405C CN 1157405 C CN1157405 C CN 1157405C CN B011445025 A CNB011445025 A CN B011445025A CN 01144502 A CN01144502 A CN 01144502A CN 1157405 C CN1157405 C CN 1157405C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ctb
- silkworm
- pupa
- subunit
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 title claims abstract description 13
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 title claims abstract description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 7
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 claims abstract description 83
- 241000382353 Pupa Species 0.000 claims abstract description 42
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 28
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 18
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 4
- 101150005152 ctb gene Proteins 0.000 claims description 21
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 claims description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 230000029305 taxis Effects 0.000 claims description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 2
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 claims 3
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 claims 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 claims 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 claims 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims 1
- 239000005723 virus inoculator Substances 0.000 claims 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 25
- 230000036039 immunity Effects 0.000 abstract description 20
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 abstract description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 9
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 abstract description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 8
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 abstract description 5
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 abstract description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 abstract description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 4
- 241000409811 Bombyx mori nucleopolyhedrovirus Species 0.000 abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract 3
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 abstract 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 abstract 1
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 29
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 16
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 10
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 8
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 7
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 7
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 101500001532 Avian infectious bursal disease virus Capsid protein VP2 Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 102220369445 c.668T>C Human genes 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Chemical class 0.000 description 4
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 4
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 4
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 3
- 238000013320 baculovirus expression vector system Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 3
- 238000011330 nucleic acid test Methods 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 241001367049 Autographa Species 0.000 description 2
- 208000027312 Bursal disease Diseases 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 210000004460 N cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000032976 Neuroendocrine carcinoma of pancreas Diseases 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 2
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229940125395 oral insulin Drugs 0.000 description 2
- 229940126701 oral medication Drugs 0.000 description 2
- 201000002530 pancreatic endocrine carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102220004457 rs11567847 Human genes 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 241000709715 Hepatovirus Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M ampicillin sodium Chemical compound [Na+].C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C([O-])=O)(C)C)=CC=CC=C1 KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229960005004 cholera vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000011194 food seasoning agent Nutrition 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- QPJBWNIQKHGLAU-IQZHVAEDSA-N ganglioside GM1 Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)[C@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](CO)O1 QPJBWNIQKHGLAU-IQZHVAEDSA-N 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000006186 oral dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种霍乱毒素B亚基的制法,属于生物技术制药工程中的基因工程生产多肽类药物技术领域。该方法通过家蚕杆状病毒表达系统(Bombyx mori Nuclear polyhedrosis Virus)重组带有CTB基因,获得重组病毒,该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存,地址在北京中关村,保藏日期为2001年7月2日,保藏编号为CGMCC NO:0594,将该重组病毒接种家蚕幼虫、蛹进行表达,经分离纯化,冷冻干燥,制成口服药物,经动物试验,在小鼠体内产生较强的抗体;以家蚕幼虫、蛹中表达CTB作为佐剂能显著增强rHBsAg、丙肝抗原、IBDV VP2抗原的口服免疫效果,显著增强胰岛素、rhGM-SCF口服治疗效果,成为一种制备抗霍乱菌药物和佐剂的新型方法。与现有技术相比,原料易得,生产成本低,治疗效果良好,具有十分重大的市场开发应用前景。
Description
技术领域:
本发明涉及通过家蚕杆状病毒表达系统用蚕幼虫和蛹制备霍乱毒素B亚基(CTB)蛋白的方法,本发明还涉及用蚕幼虫和蛹生产CTB制备药物的方法。
背景技术:
由霍乱弧菌引起的霍乱,是一种烈性肠道传染病,致病性主要是由于其产生的霍乱毒素。全世界共有200多万例,导致近20多万人死亡,严重危害人类的身体健康,研制价廉而有效的霍乱疫苗是防治霍乱的有效措施,多年来,关于霍乱毒素的理化性质、生物活性、毒素分子的结构和作用机理的研究,取得了重要进展。霍乱毒素由一个A亚单位与五个B亚单位组成,二者以非共价键形式结合,分子量分别为28000和11600(Nature,1983,306:551-557)。A亚单位是霍乱毒素的活性部分,B亚单位的主要功能是通过与哺乳动物小肠上皮细胞上的单唾液酸神经节苷脂GM1结合而使得A亚单位穿过细胞膜(Nature,1981,292:413-417)。CTB本身不具有毒性,具有很强的免疫原性,通过口服能使机体产生很高的抗体效价,CTB不仅用于制备抗霍乱菌的疫苗,还用于强化蛋白质等半抗原,提高免疫效果(PNAS,1989,86:481-485;PNAS,1997,94:4610-4614)。
用大肠杆菌系统可以表达CTB蛋白,且表达量较高,但不含糖基化,并形成包涵体,涉及到蛋白质变性和复性问题,给后处理工艺带来繁琐的多步操作;用哺乳动物细胞可以生产CTB蛋白,但需要培养基和牛血清来培养,生产成本高,另外表达低也是一个问题。家蚕杆状病毒表达系统(Bombyx mori Nuclear polyhedrosis Virus)是真核表达系统,该技术自1983年Smith等首创以来,已有百种外源基因在该系统表达(《昆虫病毒分子生物学》,1998,547-578),由于家蚕淋巴血本身的大量蛋白的保护作用和一些未知机理的作用,家蚕表达的蛋白可以生产口服药物。
发明内容:
为此,本发明从霍乱菌(Vibrio cholerae)DNA中克隆到霍乱毒素B亚基(CTB)基因,采用家蚕杆状病毒表达系统(Bombyx moriNuclear polyhedrosis Virus),并在家蚕幼虫和蛹中表达CTB,经分离纯化,冷冻干燥,制成注射和口服药物,经动物试验,在小鼠体内产生较强的抗体,成为一种制备抗霍乱菌药物的新方法。
本发明提供了含有霍乱毒素B亚基(CTB)的大肠杆菌质粒pUC-CTB,以霍乱菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增,在5’端引物引进BamHI酶切位点,在3’端引入靶向序列和EcoR I位点,PCR产物经Klenow酶补平克隆进入pUC19的SmaI位点(宝灵曼公司),构建质粒pUC-CTB。
本发明还提供了含CTB基因的杆状病毒转移质粒pBac-CTB。从pUC-CTB质粒用BamHI和EcoRI酶切,将目的片段连在同样被BamHI和EcoRI酶切的pBacPAK8上(CLONTECH公司),构建含CTB基因的杆状病毒转移质粒pBac-CTB(图1)。
本发明还提供了含CTB基因的重组家蚕杆状病毒BmBacCTB。将转移质粒pBac-CTB与家蚕核型多角体病毒DNA进行共转染家蚕(Bombyx mori)细胞BmN,进行10轮空斑和Southern点杂交筛选筛选出含CTB基因的重组昆虫杆状病毒BmBacCTB,该病毒分类命名为:杆状病毒属家蚕核型多角体病毒(含CTB),该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存,地址在北京市中关村,保藏日期为2001年7月2日,保藏编号为CGMCCNO:0594。
本发明还提供了CTB基因在家蚕五龄幼虫和蛹中的表达产物。将重组杆状病毒BmBac CTB注射到五龄家蚕幼虫和蛹(Bombyx mori)(申请人自行饲养)中,每头注射2ul左右(滴度为1×107/ml),分别取24、48、72、96和120小时表达的家蚕淋巴血,经SDS-PAGE电泳和Western杂交结果表明,条带分子量为50KD左右。ELASA检测表明感染后第120小时每条蚕平均表达量为0.52mg,感染后第120小时每个蛹平均表达量为0.53mg(图2)。
本发明还提供了对家蚕幼虫表达的CTB进行纯化。发病5天后收集蚕血清先经离心和硫酸铵沉淀后上Sephadex G150柱和MonoQ柱分离,每次收集样品均经测活,确定其活性存在,进一步用HPLC阳离子交换柱和阴离子交换柱纯化,获得纯度为95%的重组蛋白。
本发明还将家蚕幼虫和蛹体表达CTB制成口服药物。在家蚕幼虫、蛹中表达CTB能显著增强IBDV VP2口服免疫效果。
本发明还进行了家蚕幼虫、蛹中表达CTB作为佐剂的抗丙肝病毒的动物免疫实验。实验动物为BalB/C小鼠,共60只,随机分成3组,每组20只,I组每只经口喂丙肝抗原口服药物(申请者表达,参考)加上15ug CTB(实例6),II组每只经口喂丙肝抗原口服药物,对照组为0.9%生理盐水,共免疫3次,间隔7天。4周后每隔1周采血。结果表明I组小鼠个体80%以上5周后均产生了较强的抗体水平,I组到第8周血清抗体OD水平已达到1.2,相当于丙肝感染者的抗体水平,比II组血清抗体水平增加1倍以上,表明家蚕幼虫、蛹中表达CTB能增强丙肝抗原口服免疫效果。
本发明还进行了家蚕幼虫、蛹中表达CTB作为佐剂的NOD小鼠模型抗I型糖尿病的动物实验。实验动物为NOD小鼠,共20只,随机分成2组,每组10只,I组每只经口喂100ug胰岛素(购自Novo公司)加上15ug CTB(实例6),II组每只经口喂100ug胰岛素。共免疫7次,间隔7天。结果表明20周后I组小鼠胰腺炎指数为2.0+0.3,II组小鼠胰腺炎为4.0+0.5,30周后II组有75%小鼠发生糖尿病,而I组小鼠只有35%发生糖尿病,说明以家蚕幼虫、蛹中表达CTB作为佐剂的胰岛素口服免疫能显著抑制NOD小鼠模型糖尿病的发生。
本发明还进行了家蚕幼虫、蛹中表达CTB作为佐剂的小鼠升白细胞的动物实验。实验动物为BalB/C小鼠,共100只,随机分成2组,每组50只,I组每只经口喂10ug rhGM-SCF(先灵保雅公司产品)加上10ug CTB(实例6),II组每只经口喂10ug rhGM-SCF(先灵保雅公司产品)。结果表明I组喂小鼠喂药3天后白细胞开始增加,1周后白细胞增加13%,II组小鼠白细胞变化不明显,表明家蚕幼虫、蛹中表达的CTB能增强rhGM-SCF口服生白细胞效果。
附图说明:
图1:含CTB基因的昆虫杆状病毒转移质粒pBac-CTB
(图注说明:3’FS/5’FS:苜蓿银纹夜蛾多角体病毒多角体启动子3’端/5’端旁侧序列;P:苜蓿银纹夜蛾多角体病毒多角体启动子;A(Polyhedin Poly Asignal):多角体蛋白基因聚腺苷酸化信号;M13 ori:M13噬菌体复制起始点;Amp:氨苄青霉素基因;ori:pUC复制起始点)
图2:CTB蛋白在家蚕中的表达
本发明专利申请保藏生物材料情况如下:该病毒分类命名为:杆状病毒属家蚕核型多角体病毒(含CTB),该病毒提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存,地址在北京市中关村,保藏日期为2001年7月2日,保藏编号为GMCC NO:0594。虫和蛹体表达CTB,经过过滤(100KD超滤),30000rmP离心后经冷冻干燥后,以家蚕幼虫和家蚕蛹为填充料配制成口服药物。
本发明还对用家蚕幼虫、蚕蛹表达的CTB进行抗霍乱菌的动物实验。实验动物为BaIB/C小鼠30只,随机分成3组,每组10只。I组每只经口喂50ugCTB药物,II组每只经口喂10ugCTB药物,对照组为0.9%生理盐水,共免疫3次,间隔7天。4周后采血,用CTB抗体检测试剂盒(Sigma公司)检测结果,结果表明I组小鼠均产生了较强的抗体水平,到第8周血清抗体OD水平已达到1.0以上,相当于患者感染者的抗体水平,说明家蚕幼虫、蛹中表达CTB口服后能在体内产生较强的抗体。
综上所述,本发明的优点如下:用蚕高效表达CTB,可以避免直接从动物体内纯化存在的操作烦琐、产率底、生产成本高等缺点,不会造成公害;家蚕是可以无菌大规模饲养经济昆虫,可以低成本地大规模饲养;蚕体中有多种天然蛋白质保护剂,对表达产物有保护作用,使基因表达产物十分稳定;家蚕生产的蛋白可以口服药物,为患者解除了注射的痛苦和被感染的威胁。
用家蚕幼虫和蚕蛹表达的CTB药物作为佐剂也具有较好的效果。本发明还进行了用家蚕幼虫和蚕蛹表达的CTB药物作为佐剂的抗乙肝病毒的动物免疫实验。实验动物为BaIB/C小鼠,购自浙江医学科学院动物中心,共60只,平均体重16-18g,随机分成3组,每组20只,I组每只经口喂100ugrHBsAg(购自中国药品生物制品鉴定所)加上15ugCTB(实例6)。II组每只经口喂100ugrHBsAg,对照组为0.9%生理盐水,共免疫3次,间隔7天。4周后每隔1周采血检测结果。结果表明I组小鼠个体80%以上4周后均产生了较强的抗体水平,到第8周血清抗体水平已达到205mIU/ml,说明基于在家蚕幼虫、蛹中表达CTB作为佐剂的rHBSAg口服免疫能在体内产生较强的抗体,产生了免疫应答。
本发明还进行了家蚕幼虫、蛹中表达CTB作为佐剂的抗传染性法氏囊病病毒(IBDV)的动物免疫实验。实验动物为非免疫鸡,共40只,随机分成2组,每组20只,I组每只经口喂10mgIBDVP2冻干粉(申请者表达,参考《生物化学和生物物理学报》,2000年第3期,281-284页)加上10ugCTB(实例6),II组每只经口喂15mgIBDV VP2冻干粉(来源同上),共免疫5次,间隔3天。3周后每隔1周采血检测中和抗体。经病毒血清中和试验结果表明I组小鼠4周后均产生了较强的中和抗体水平,到第6周血清中和抗体滴度达到1∶3300,比II组血清中和抗体滴度增加1倍以上,表明家蚕幼虫、蛹中表达CTB能显著增强IBDVP2口服免疫效果。
具体实施方式:
本发明通过以下实例作进一步阐述,但并不限制本发明的范围。
实施例1、CTB基因大肠杆菌表达质粒的构建
根据已发表的CTB基因序列设计引物((Nature,1983,306:551-557),在5’端引物引进BamHI酶切位点,在3’端引入靶向序列和EcoR I位点。上游引物为:5’GGGGATCCATGATTAAATTAAAATTTGGT3’,下游引物为:5’GGGGAATTCTTATAGCTCATCTTTCTCAGAATTTGCCATACTAATTGCGGCAA3’,取霍乱菌(Vibrio cholerae)1ml,12000rpm离心5分钟,取沉淀,加入5μl 20g/L蛋白酶K(GIBCOBRL公司)和10%SDS50μl,37℃,1小时,加入500μl酚,12000rpm离心10分钟,取上清,加入500μl氯仿(浙江迪耳药业有限公司),12000rpm离心10分钟,取上清,加入2倍体积的乙醇,混匀后,12000rpm离心10分钟,弃上清,加入50μl水溶解。PCR扩增CTB基因,反应条件为预变性94℃10分钟,变性温度94℃45秒,延伸温度为72℃90秒,复性温度45℃60秒,循环30次,最后72℃延伸10分钟。将PCR产物经过低融点胶分离回收,加1ml饱和苯酚(pH8.0),65℃作用10分钟,12000rpm离心10分钟,取上清,用苯酚再抽提一次。取上清加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1),混合5分钟,12000rpm离心10分钟,取上清,加入2倍无水乙醇,混合均匀置-20℃,2小时后再用12000rpm离心10分钟,弃上清,用70%乙醇洗沉淀,12000rpm离心1分,弃上清,自然干燥,沉淀用20μl TE缓冲液溶解置于-20℃冰箱。PCR产物经Klenow酶(GIBCOBRL公司)补平克隆进入经SmaI酶切(GIBCOBRL公司)的pUC19(宝灵曼公司)位点,构建质粒pUC-CTB,经测序证明其核苷酸序列正确。
实施例2、CTB基因的昆虫杆状病毒转移质粒的构建
从pUC-CTB质粒用BamHI和EcoRI酶切,将酶切片段连在同样被BamHI和EcoRI酶切的pBacPAK8(CLONTECH公司)上,构建含CTB基因的杆状病毒转移质粒pBac-CTB(图1),经酶切分析鉴定基因正确。
实施例3、CTB基因的重组杆状病毒的获得
取5ul含CTB基因的昆虫杆状病毒转移质粒pBac-CTB和和6ul野生家蚕核型多角体病毒DNA进行共转染。取6ul Lipofectin(GIBCOBRL公司)加入100ul无血清的TC-100培养基混均。将事先培养在35mm Dish中的BmN细胞用无血清的TC-100(GIBCOBRL公司)培养基洗涤两次,并逐滴加入转移质粒和Lipofectin混合物,27℃培养4-5天,收取上清进行第一轮空斑筛选。取5ul上清感染35mmDish中的BmN细胞,1小时后弃去上清加入等量混合的TC-100培养基和低熔点琼脂糖。4-5天后挑取空斑,感染Bm N细胞3-4天,保存上清,细胞用NaOH裂解用于Southern杂交,取阳性克隆的上清进行第10轮空斑筛选。取阳性克隆的上清感染Bm N细胞扩增。即可得到大量的含CTB基因的重组杆状病毒,该病毒分类命名为:杆状病毒属家蚕核型多角体病毒(含CTB),该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存,地址在北京中关村,保藏日期为2001年7月2日,保藏编号为CGMCC NO:0594。
实施例4、CTB基因在家蚕幼虫和蛹中的表达和活性测定
将重组杆状病毒BmBac CTB注射到五龄家蚕幼虫和蛹(Bombyxmori)(申请人自行饲养)中,每头注射2ul左右(滴度为1×107/ml),分别取24、48、72、96和120小时表达的家蚕淋巴血,5000rpm 5min离心后取上清,用PBS pH7.4稀释10倍后,加入等体积的2×蛋白质上样缓冲液(100Mm Tris.HCl,4%SDS,0.1%溴酚蓝,10%甘油),取20ul进行SDS-PAGE电泳,与PVDF膜(宝灵曼公司)一起电转过夜,通过与一抗(兔抗CTB,Sigma公司),二抗(羊抗兔IgG,Sigma公司)杂交,结果表明,Western杂交条带分子量为50KD左右。ELASA检测表明感染后第120小时每条蚕平均表达量为0.52mg,感染后第120小时每个蛹平均表达量为0.53mg(图2)。
实施例5、在家蚕幼虫和蛹中表达的CTB的纯化
用1万头五龄起蚕,每头人工接种重组病毒使之发病,在感染的第六天收集蚕血清共8000ml。蚕血清先经5000rpm离心1小时,取上清在25000rpm离心30分钟,经硫酸铵沉淀后上Sephadex G150柱分离,每次收集样品均经细胞测活,确定其活性存在,筛选活性峰。将过Sephadex G150柱的活性部分混合后,上MonoQ柱,进一步用HPLC阳离子交换柱和阴离子交换柱纯化,获得纯度为95%的重组蛋白。
实施例6、在家蚕幼虫和蛹中表达的CTB口服疫苗的制备
在家蚕幼虫和蛹体(申请人自行饲养)表达CTB,经过过滤(100KD超滤),30000rmp离心后经冷冻干燥后,以家蚕蛹为填充料配制成药物和佐剂。
实施例7、在家蚕幼虫、蛹中表达CTB的抗霍乱菌的动物实验
实验动物为BalB/C小鼠,购自浙江医学科学院动物中心,共30只,平均体重16~18g,随机分成3组,每组10只。I组每只经口喂50ug CTB(实施例6的口服药物),II组每只经口喂10ug CTB(实施例6的口服药物),对照组为0.9%生理盐水,共免疫3次,间隔7天。4周后采血,用CTB抗体检测试剂盒(Sigma公司)检测结果,结果表明雌雄个体均产生了较强的抗体水平,I组到第8周血清抗体OD水平已达到1.0以上,相当于患者感染者的抗体水平,,说明家蚕幼虫、蛹中表达CTB口服剂型的CTB可以通过肠道被老鼠吸收,并具有抗原活性,能在体内产生较强的抗体。
实例8、在家蚕幼虫、蛹中表达CTB作为佐剂的抗乙肝病毒的动物免疫实验
实验动物为BalB/C小鼠,购自浙江医学科学院动物中心,共60只,平均体重16~18g,随机分成3组,每组20只,I组每只经口喂100ug rHBsAg(购自中国药品生物制品鉴定所)加上15ug CTB(实施例6的口服药物),II组每只经口喂100ug rHBsAg(购自中国药品生物制品鉴定所),对照组为0.9%生理盐水,共免疫3次,间隔7天。4周后每隔1周采血,用抗-HBs ELISA试剂盒检测试剂盒(华美生物工程公司)检测结果。结果表明I组小鼠个体80%以上4周后均产生了较强的抗体水平,到第8周血清抗体水平已大到205mIU/ml,相当于乙肝感染者的抗体水平,说明基于在家蚕幼虫、蛹中表达CTB作为佐剂的rHBsAg口服免疫可以通过肠道被老鼠吸收,并具有抗原活性,能在体内产生较强的抗体,产生了免疫应答。
实例9、在家蚕幼虫、蛹中表达CTB作为佐剂的抗传染性法氏囊病病毒(IBDV)的动物免疫实验
实验动物为非免疫鸡,购自浙江省农业科学院,共40只,随机分成2组,每组20只,I组每只经口喂10mg IBDV VP2冻干粉(申请者表达,参考《生物化学和生物物理学报》,2000年第3期,281-284页)加上10ug CTB(实施例6的口服药物),II组每只经口喂15mg IBDV VP2冻干粉(来源同上),共免疫5次,间隔3天。3周后每隔1周采血检测中和抗体。检测中和抗体检测采用鸡胚纤维细胞培养法测定(参考《浙江大学学报》,农业与生命科学版,2000年,第一期,9-16页)。经病毒血清中和试验结果表明I组小鼠4周后均产生了较强的中和抗体水平,到第6周血清中和抗体滴度达到1∶3300,比II组血清中和抗体滴度增加1倍以上,表明家蚕幼虫、蛹中表达CTB能显著增强IBDV VP2口服免疫效果,能在体内产生更强的中和抗体。
实例10、在家蚕幼虫、蛹中表达CTB作为佐剂的抗丙肝病毒的动物免疫实验
实验动物为BalB/C小鼠,购自浙江医学科学院动物中心,共60只,平均体重16~18g,随机分成3组,每组20只,I组每只经口喂丙肝抗原口服药物(申请者表达,参考)加上15ug CTB(实施例6的口服药物),II组每只经口喂丙肝抗原口服药物,对照组为0.9%生理盐水,共免疫3次,间隔7天。4周后每隔1周采血,采血后用HCV抗体检测试剂盒测抗体(检测方法按上海复华公司试剂盒操作说明书进行)。结果表明I组小鼠个体80%以上5周后均产生了较强的抗体水平,I组到第8周血清抗体OD水平已达到1.2,相当于丙肝感染者的抗体水平,比II组血清抗体水平增加1倍以上,表明家蚕幼虫、蛹中表达CTB能增强丙肝抗原口服免疫效果。
实例11、家蚕幼虫、蛹中表达的CTB作为佐剂的NOD小鼠模型抗I型糖尿病的动物实验
实验动物为NOD小鼠,购自浙江医学科学院,共20只,随机分成2组,每组10只,I组每只经口喂100ug胰岛素(购自Novo公司)加上15ug CTB(实施例6的口服药物),II组每只经口喂100ug胰岛素(购自Novo公司)。共免疫7次,间隔7天。10周后检测对胰腺炎的抑制效果。结果表明20周后I组小鼠胰腺炎指数为2.0+0.3,II组小鼠胰腺炎为4.0+0.5,30周后II组有75%小鼠发生糖尿病,而I组小鼠只有35%发生糖尿病,说明基于在家蚕幼虫、蛹中表达CTB作为佐剂的胰岛素口服免疫可以通过肠道被老鼠吸收,能显著抑制NOD小鼠模型糖尿病的发生。
实例12、在家蚕幼虫、蛹中表达的CTB作为佐剂的小鼠升白细胞的动物实验
实验动物为BalB/C小鼠,购自浙江医学科学院动物中心,共100只,平均体重16~18g,随机分成2组,每组50只,I组每只经口喂10ug rhGM-SCF(先灵保雅公司产品)加上10ugCTB(实施例6的口服药物),II组每只经口喂10ug rhGM-SCF(先灵保雅公司产品),每天喂1次,共喂7天。隔2天采血,采血后用血球自动计数仪进行检测白细胞数目。结果表明I组喂小鼠喂药3天后白细胞开始增加,1周后白细胞增加13%,II组小鼠白细胞变化不明显,表明家蚕幼虫、蛹中表达的CTB能增强rhGM-SCF口服生白细胞效果。
附件1:核苷酸和/或氨基酸序列表
<110>浙江大学
<120>霍乱毒素B亚基的新制法和用途
<160>2
<210>1
<211>402
<212>DNA
<213>霍乱弧菌(Vibrio cholerae)
<220>
<221>CDS
<222>(1)…(390)
<400>1
atg att aaa tta aaa ttt ggt gtt ttt ttt aca gtt tta cta tct 45
MET Ile Lys Leu Lys Phe Gly Val Phe Phe Thr Val Leu Leu Ser
5 10 15
tca gca tat gca cat gga aca cct caa aat att act gat ttg tgt 90
Ser Ala Tyr Ala His Gly Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys
20 25 30
gca gaa tac cac aac aca caa ata cat acg cta aat gat aag ata 135
Ala Glu Tyr His Asn Thr Gln Ile His Thr Leu Asn Asp Lys Ile
35 40 45
ttt tcg tat aca gaa tct cta gct gga aaa aga gag atg gct atc 180
Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu MET Ala Ile
50 55 60
att acc ttt aag aat ggt gca att ttt caa gta gaa gta cca ggt 225
Ile Thr Phe Lys Asn Gly Ala Ile Phe Gln Val Glu Val Pro Gly
65 70 75
agt caa cat ata gat tca caa aaa aaa gcg att gaa agg atg aag 270
Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg MET Lys
80 85 90
gat acc ctg agg att gca tat ctt act gaa gct aaa gtc gaa aag 315
Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys
95 100 105
tta tgt gta tgg aat aat aaa acg cct cat gcg att gcc gca att 360
Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala Ile Ala Ala Ile
110 115 120
agt atg gca aat tct gag aaa gat gag cta taa gaattcccc402
Ser MET Ala Asn Ser Glu Lys Asp Glu Leu ---
125 130
<210>2
<211>130
<212>PRT
<213>霍乱弧菌(Vibrio cholerae)
<400>2
Met Ile Lys Leu Lys Phe Gly Val Phe Phe Thr Val Leu Leu Ser
1 5 10 15
Ser Ala Tyr Ala His Gly Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys
20 25 30
Ala Glu Tyr His Asn Thr Gln Ile His Thr Leu Asn Asp Lys Ile
35 40 45
Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile
50 55 60
Ile Thr Phe Lys Asn Gly Ala Ile Phe Gln Val Glu Val Pro Gly
65 70 75
Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys
80 85 90
Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys
95 100 105
Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala Ile Ala Ala Ile
110 115 120
Ser Met Ala Asn Ser Glu Lys Asp Glu Leu
125 130
Claims (7)
1、一种霍乱毒素B亚基的制法,其特征在于:通过基因工程方法获得重组的带CTB基因的家蚕重组杆状病毒,该病毒分类命名为:杆状病毒属家蚕核型多角体病毒(含CTB),该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存,地址在北京中关村,保藏日期为2001年7月2日,保藏编号为CGMCCNO:0594,并用该病毒接种家蚕幼虫和蛹进行表达CTB。
2、根据权利要求1所述的霍乱毒素B亚基的制法,其特征在于所述获得带CTB基因的家蚕重组杆状病毒的基因工程方法是:通过RT-PCR方法合成CTB基因片段,克隆进入经SmaI酶切的pUC19位点,将CTB基因片段克隆进入转移载体pBacPAK-8,获得重组转移载体质粒pBac-CTB。
3、根据权利要求1、2所述的霍乱毒素B亚基的制法,其特征在于所述获得带CTB基因的家蚕重组杆状病毒的基因工程方法是:通过重组转移载体pBac-CTB DNA与家蚕核型多角体病毒DNA进行共转染家蚕细胞,经10轮空斑筛选和Southern杂交斑筛选获得重组病毒BmBacCTB。
4、根据权利要求1所述的霍乱毒B亚基的制法,其特征在于所述的CTB基因在家蚕幼虫和蛹中的表达产物是通过重组杆状病毒BmBacCTB注射至五龄家蚕幼虫和蛹体内表达产生。
5、根据权利要求1所述的霍乱毒素B亚基的制法:其中还包括分离,纯化家蚕表达的CTB的步骤。
6.根据权利要求5所述的霍乱毒素B亚基的制法:其中还包括以家蚕和蛹为填充剂制备口服药物的步骤。
7.根据权利要求6所述的霍乱毒素B亚基的制法,其特征在于所述的口服药物是通过表达CTB的家蚕五龄幼虫和蛹经冷冻干燥后制成的。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNB011445025A CN1157405C (zh) | 2001-12-18 | 2001-12-18 | 霍乱毒素b亚基的制法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNB011445025A CN1157405C (zh) | 2001-12-18 | 2001-12-18 | 霍乱毒素b亚基的制法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1427010A CN1427010A (zh) | 2003-07-02 |
CN1157405C true CN1157405C (zh) | 2004-07-14 |
Family
ID=4677626
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNB011445025A Expired - Fee Related CN1157405C (zh) | 2001-12-18 | 2001-12-18 | 霍乱毒素b亚基的制法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1157405C (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101892189B (zh) * | 2010-07-05 | 2012-07-04 | 浙江大学 | 一种口服免疫阻断猪生长抑素作用的转化子及其应用 |
-
2001
- 2001-12-18 CN CNB011445025A patent/CN1157405C/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1427010A (zh) | 2003-07-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN113521265B (zh) | 一种鲈鱼弹状病毒亚单位疫苗及其制备方法 | |
CN1665528A (zh) | 佐剂病毒颗粒 | |
CN104059927B (zh) | 鸡新城疫糖蛋白病毒抗原的制备方法及其产品 | |
CN112439056B (zh) | 基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒及由其制备的o型口蹄疫疫苗和应用 | |
CN1974775A (zh) | 含有草鱼干扰素基因的重组质粒、工程菌及其应用 | |
CN114524862B (zh) | 禽流感(h5+h7)三价dna疫苗的构建及其应用 | |
CN102304529B (zh) | 一种兔出血热病毒空衣壳抗原的制备方法 | |
CN112500458B (zh) | 鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株亚单位疫苗、其制备方法及应用 | |
CN1157405C (zh) | 霍乱毒素b亚基的制法 | |
CN108329394A (zh) | 一种鸭短喙矮小综合征疫苗及其制备方法 | |
CN102406929A (zh) | 一种共表达分子佐剂加强型二价口蹄疫蛋白工程疫苗 | |
CN102311957A (zh) | 羊包虫可溶性抗原的制备方法及其产品 | |
CN1277925C (zh) | 表达ctb和人胰岛素融合蛋白的重组家蚕杆状病毒及其应用 | |
CN1583792A (zh) | 一种防治对虾病毒病的卵黄免疫球蛋白及其制备方法和应用 | |
CN1324661A (zh) | 一种人乙型肝炎核酸疫苗 | |
CN107814833A (zh) | 刺激隐核虫重组蛋白质疫苗及制备方法和应用 | |
CN100335633C (zh) | 用重组大肠杆菌制备N-末端乙酰化修饰的胸腺素α的方法 | |
CN112426523A (zh) | 一种含抗病毒组合物的猪用疫苗和应用 | |
CN1053642A (zh) | 传染性支气管炎病毒疫苗 | |
CN1690212A (zh) | 抗肿瘤重组活载体疫苗 | |
CN1375500A (zh) | 新的干扰素-胸腺肽融合蛋白及其制法和用途 | |
CN1740325A (zh) | 一种融合基因、其表达的蛋白及其制备方法 | |
CN1227026C (zh) | 一种用蚕表达人白细胞介素11生产口服药物的方法 | |
CN1170845C (zh) | 大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白及其制备方法和其基因 | |
CN110684768B (zh) | 一种基于模式识别受体配体的鸭天然免疫增强剂 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C17 | Cessation of patent right | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20040714 Termination date: 20101218 |