CN1157405C - 霍乱毒素b亚基的制法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种霍乱毒素B亚基的制法，属于生物技术制药工程中的基因工程生产多肽类药物技术领域。该方法通过家蚕杆状病毒表达系统(Bombyx mori Nuclear polyhedrosis Virus)重组带有CTB基因，获得重组病毒，该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，地址在北京中关村，保藏日期为2001年7月2日，保藏编号为CGMCC NO：0594，将该重组病毒接种家蚕幼虫、蛹进行表达，经分离纯化，冷冻干燥，制成口服药物，经动物试验，在小鼠体内产生较强的抗体；以家蚕幼虫、蛹中表达CTB作为佐剂能显著增强rHBsAg、丙肝抗原、IBDV VP2抗原的口服免疫效果，显著增强胰岛素、rhGM-SCF口服治疗效果，成为一种制备抗霍乱菌药物和佐剂的新型方法。与现有技术相比，原料易得，生产成本低，治疗效果良好，具有十分重大的市场开发应用前景。

Description

霍乱毒素B亚基的制法

技术领域：

本发明涉及通过家蚕杆状病毒表达系统用蚕幼虫和蛹制备霍乱毒素B亚基(CTB)蛋白的方法，本发明还涉及用蚕幼虫和蛹生产CTB制备药物的方法。

背景技术：

由霍乱弧菌引起的霍乱，是一种烈性肠道传染病，致病性主要是由于其产生的霍乱毒素。全世界共有200多万例，导致近20多万人死亡，严重危害人类的身体健康，研制价廉而有效的霍乱疫苗是防治霍乱的有效措施，多年来，关于霍乱毒素的理化性质、生物活性、毒素分子的结构和作用机理的研究，取得了重要进展。霍乱毒素由一个A亚单位与五个B亚单位组成，二者以非共价键形式结合，分子量分别为28000和11600(Nature，1983，306：551-557)。A亚单位是霍乱毒素的活性部分，B亚单位的主要功能是通过与哺乳动物小肠上皮细胞上的单唾液酸神经节苷脂GM1结合而使得A亚单位穿过细胞膜(Nature，1981，292：413-417)。CTB本身不具有毒性，具有很强的免疫原性，通过口服能使机体产生很高的抗体效价，CTB不仅用于制备抗霍乱菌的疫苗，还用于强化蛋白质等半抗原，提高免疫效果(PNAS，1989，86：481-485；PNAS，1997，94：4610-4614)。

用大肠杆菌系统可以表达CTB蛋白，且表达量较高，但不含糖基化，并形成包涵体，涉及到蛋白质变性和复性问题，给后处理工艺带来繁琐的多步操作；用哺乳动物细胞可以生产CTB蛋白，但需要培养基和牛血清来培养，生产成本高，另外表达低也是一个问题。家蚕杆状病毒表达系统(Bombyx mori Nuclear polyhedrosis Virus)是真核表达系统，该技术自1983年Smith等首创以来，已有百种外源基因在该系统表达(《昆虫病毒分子生物学》，1998，547-578)，由于家蚕淋巴血本身的大量蛋白的保护作用和一些未知机理的作用，家蚕表达的蛋白可以生产口服药物。

发明内容：

为此，本发明从霍乱菌(Vibrio cholerae)DNA中克隆到霍乱毒素B亚基(CTB)基因，采用家蚕杆状病毒表达系统(Bombyx moriNuclear polyhedrosis Virus)，并在家蚕幼虫和蛹中表达CTB，经分离纯化，冷冻干燥，制成注射和口服药物，经动物试验，在小鼠体内产生较强的抗体，成为一种制备抗霍乱菌药物的新方法。

本发明提供了含有霍乱毒素B亚基(CTB)的大肠杆菌质粒pUC-CTB，以霍乱菌基因组DNA为模板，通过PCR扩增，在5’端引物引进BamHI酶切位点，在3’端引入靶向序列和EcoR I位点，PCR产物经Klenow酶补平克隆进入pUC19的SmaI位点(宝灵曼公司)，构建质粒pUC-CTB。

本发明还提供了含CTB基因的杆状病毒转移质粒pBac-CTB。从pUC-CTB质粒用BamHI和EcoRI酶切，将目的片段连在同样被BamHI和EcoRI酶切的pBacPAK8上(CLONTECH公司)，构建含CTB基因的杆状病毒转移质粒pBac-CTB(图1)。

本发明还提供了含CTB基因的重组家蚕杆状病毒BmBacCTB。将转移质粒pBac-CTB与家蚕核型多角体病毒DNA进行共转染家蚕(Bombyx mori)细胞BmN，进行10轮空斑和Southern点杂交筛选筛选出含CTB基因的重组昆虫杆状病毒BmBacCTB，该病毒分类命名为：杆状病毒属家蚕核型多角体病毒(含CTB)，该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，地址在北京市中关村，保藏日期为2001年7月2日，保藏编号为CGMCCNO：0594。

本发明还提供了CTB基因在家蚕五龄幼虫和蛹中的表达产物。将重组杆状病毒BmBac CTB注射到五龄家蚕幼虫和蛹(Bombyx mori)(申请人自行饲养)中，每头注射2ul左右(滴度为1×10⁷/ml)，分别取24、48、72、96和120小时表达的家蚕淋巴血，经SDS-PAGE电泳和Western杂交结果表明，条带分子量为50KD左右。ELASA检测表明感染后第120小时每条蚕平均表达量为0.52mg，感染后第120小时每个蛹平均表达量为0.53mg(图2)。

本发明还提供了对家蚕幼虫表达的CTB进行纯化。发病5天后收集蚕血清先经离心和硫酸铵沉淀后上Sephadex G150柱和MonoQ柱分离，每次收集样品均经测活，确定其活性存在，进一步用HPLC阳离子交换柱和阴离子交换柱纯化，获得纯度为95％的重组蛋白。

本发明还将家蚕幼虫和蛹体表达CTB制成口服药物。在家蚕幼虫、蛹中表达CTB能显著增强IBDV VP2口服免疫效果。

本发明还进行了家蚕幼虫、蛹中表达CTB作为佐剂的抗丙肝病毒的动物免疫实验。实验动物为BalB/C小鼠，共60只，随机分成3组，每组20只，I组每只经口喂丙肝抗原口服药物(申请者表达，参考)加上15ug CTB(实例6)，II组每只经口喂丙肝抗原口服药物，对照组为0.9％生理盐水，共免疫3次，间隔7天。4周后每隔1周采血。结果表明I组小鼠个体80％以上5周后均产生了较强的抗体水平，I组到第8周血清抗体OD水平已达到1.2，相当于丙肝感染者的抗体水平，比II组血清抗体水平增加1倍以上，表明家蚕幼虫、蛹中表达CTB能增强丙肝抗原口服免疫效果。

本发明还进行了家蚕幼虫、蛹中表达CTB作为佐剂的NOD小鼠模型抗I型糖尿病的动物实验。实验动物为NOD小鼠，共20只，随机分成2组，每组10只，I组每只经口喂100ug胰岛素(购自Novo公司)加上15ug CTB(实例6)，II组每只经口喂100ug胰岛素。共免疫7次，间隔7天。结果表明20周后I组小鼠胰腺炎指数为2.0+0.3，II组小鼠胰腺炎为4.0+0.5，30周后II组有75％小鼠发生糖尿病，而I组小鼠只有35％发生糖尿病，说明以家蚕幼虫、蛹中表达CTB作为佐剂的胰岛素口服免疫能显著抑制NOD小鼠模型糖尿病的发生。

本发明还进行了家蚕幼虫、蛹中表达CTB作为佐剂的小鼠升白细胞的动物实验。实验动物为BalB/C小鼠，共100只，随机分成2组，每组50只，I组每只经口喂10ug rhGM-SCF(先灵保雅公司产品)加上10ug CTB(实例6)，II组每只经口喂10ug rhGM-SCF(先灵保雅公司产品)。结果表明I组喂小鼠喂药3天后白细胞开始增加，1周后白细胞增加13％，II组小鼠白细胞变化不明显，表明家蚕幼虫、蛹中表达的CTB能增强rhGM-SCF口服生白细胞效果。

附图说明：

图1：含CTB基因的昆虫杆状病毒转移质粒pBac-CTB

(图注说明：3’FS/5’FS：苜蓿银纹夜蛾多角体病毒多角体启动子3’端/5’端旁侧序列；P：苜蓿银纹夜蛾多角体病毒多角体启动子；A(Polyhedin Poly Asignal)：多角体蛋白基因聚腺苷酸化信号；M13 ori：M13噬菌体复制起始点；Amp：氨苄青霉素基因；ori：pUC复制起始点)

图2：CTB蛋白在家蚕中的表达

本发明专利申请保藏生物材料情况如下：该病毒分类命名为：杆状病毒属家蚕核型多角体病毒(含CTB)，该病毒提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，地址在北京市中关村，保藏日期为2001年7月2日，保藏编号为GMCC NO：0594。虫和蛹体表达CTB，经过过滤(100KD超滤)，30000rmP离心后经冷冻干燥后，以家蚕幼虫和家蚕蛹为填充料配制成口服药物。

本发明还对用家蚕幼虫、蚕蛹表达的CTB进行抗霍乱菌的动物实验。实验动物为BaIB/C小鼠30只，随机分成3组，每组10只。I组每只经口喂50ugCTB药物，II组每只经口喂10ugCTB药物，对照组为0.9％生理盐水，共免疫3次，间隔7天。4周后采血，用CTB抗体检测试剂盒(Sigma公司)检测结果，结果表明I组小鼠均产生了较强的抗体水平，到第8周血清抗体OD水平已达到1.0以上，相当于患者感染者的抗体水平，说明家蚕幼虫、蛹中表达CTB口服后能在体内产生较强的抗体。

综上所述，本发明的优点如下：用蚕高效表达CTB，可以避免直接从动物体内纯化存在的操作烦琐、产率底、生产成本高等缺点，不会造成公害；家蚕是可以无菌大规模饲养经济昆虫，可以低成本地大规模饲养；蚕体中有多种天然蛋白质保护剂，对表达产物有保护作用，使基因表达产物十分稳定；家蚕生产的蛋白可以口服药物，为患者解除了注射的痛苦和被感染的威胁。

用家蚕幼虫和蚕蛹表达的CTB药物作为佐剂也具有较好的效果。本发明还进行了用家蚕幼虫和蚕蛹表达的CTB药物作为佐剂的抗乙肝病毒的动物免疫实验。实验动物为BaIB/C小鼠，购自浙江医学科学院动物中心，共60只，平均体重16-18g，随机分成3组，每组20只，I组每只经口喂100ugrHBsAg(购自中国药品生物制品鉴定所)加上15ugCTB(实例6)。II组每只经口喂100ugrHBsAg，对照组为0.9％生理盐水，共免疫3次，间隔7天。4周后每隔1周采血检测结果。结果表明I组小鼠个体80％以上4周后均产生了较强的抗体水平，到第8周血清抗体水平已达到205mIU/ml，说明基于在家蚕幼虫、蛹中表达CTB作为佐剂的rHBSAg口服免疫能在体内产生较强的抗体，产生了免疫应答。

本发明还进行了家蚕幼虫、蛹中表达CTB作为佐剂的抗传染性法氏囊病病毒(IBDV)的动物免疫实验。实验动物为非免疫鸡，共40只，随机分成2组，每组20只，I组每只经口喂10mgIBDVP2冻干粉(申请者表达，参考《生物化学和生物物理学报》，2000年第3期，281-284页)加上10ugCTB(实例6)，II组每只经口喂15mgIBDV VP2冻干粉(来源同上)，共免疫5次，间隔3天。3周后每隔1周采血检测中和抗体。经病毒血清中和试验结果表明I组小鼠4周后均产生了较强的中和抗体水平，到第6周血清中和抗体滴度达到1∶3300，比II组血清中和抗体滴度增加1倍以上，表明家蚕幼虫、蛹中表达CTB能显著增强IBDVP2口服免疫效果。

具体实施方式：

本发明通过以下实例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。

实施例1、CTB基因大肠杆菌表达质粒的构建

根据已发表的CTB基因序列设计引物((Nature，1983，306：551-557)，在5’端引物引进BamHI酶切位点，在3’端引入靶向序列和EcoR I位点。上游引物为：5’GGGGATCCATGATTAAATTAAAATTTGGT3’，下游引物为：5’GGGGAATTCTTATAGCTCATCTTTCTCAGAATTTGCCATACTAATTGCGGCAA3’，取霍乱菌(Vibrio cholerae)1ml，12000rpm离心5分钟，取沉淀，加入5μl 20g/L蛋白酶K(GIBCOBRL公司)和10％SDS50μl，37℃，1小时，加入500μl酚，12000rpm离心10分钟，取上清，加入500μl氯仿(浙江迪耳药业有限公司)，12000rpm离心10分钟，取上清，加入2倍体积的乙醇，混匀后，12000rpm离心10分钟，弃上清，加入50μl水溶解。PCR扩增CTB基因，反应条件为预变性94℃10分钟，变性温度94℃45秒，延伸温度为72℃90秒，复性温度45℃60秒，循环30次，最后72℃延伸10分钟。将PCR产物经过低融点胶分离回收，加1ml饱和苯酚(pH8.0)，65℃作用10分钟，12000rpm离心10分钟，取上清，用苯酚再抽提一次。取上清加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，混合5分钟，12000rpm离心10分钟，取上清，加入2倍无水乙醇，混合均匀置-20℃，2小时后再用12000rpm离心10分钟，弃上清，用70％乙醇洗沉淀，12000rpm离心1分，弃上清，自然干燥，沉淀用20μl TE缓冲液溶解置于-20℃冰箱。PCR产物经Klenow酶(GIBCOBRL公司)补平克隆进入经SmaI酶切(GIBCOBRL公司)的pUC19(宝灵曼公司)位点，构建质粒pUC-CTB，经测序证明其核苷酸序列正确。

实施例2、CTB基因的昆虫杆状病毒转移质粒的构建

从pUC-CTB质粒用BamHI和EcoRI酶切，将酶切片段连在同样被BamHI和EcoRI酶切的pBacPAK8(CLONTECH公司)上，构建含CTB基因的杆状病毒转移质粒pBac-CTB(图1)，经酶切分析鉴定基因正确。

实施例3、CTB基因的重组杆状病毒的获得

取5ul含CTB基因的昆虫杆状病毒转移质粒pBac-CTB和和6ul野生家蚕核型多角体病毒DNA进行共转染。取6ul Lipofectin(GIBCOBRL公司)加入100ul无血清的TC-100培养基混均。将事先培养在35mm Dish中的BmN细胞用无血清的TC-100(GIBCOBRL公司)培养基洗涤两次，并逐滴加入转移质粒和Lipofectin混合物，27℃培养4-5天，收取上清进行第一轮空斑筛选。取5ul上清感染35mmDish中的BmN细胞，1小时后弃去上清加入等量混合的TC-100培养基和低熔点琼脂糖。4-5天后挑取空斑，感染Bm N细胞3-4天，保存上清，细胞用NaOH裂解用于Southern杂交，取阳性克隆的上清进行第10轮空斑筛选。取阳性克隆的上清感染Bm N细胞扩增。即可得到大量的含CTB基因的重组杆状病毒，该病毒分类命名为：杆状病毒属家蚕核型多角体病毒(含CTB)，该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，地址在北京中关村，保藏日期为2001年7月2日，保藏编号为CGMCC NO：0594。

实施例4、CTB基因在家蚕幼虫和蛹中的表达和活性测定

将重组杆状病毒BmBac CTB注射到五龄家蚕幼虫和蛹(Bombyxmori)(申请人自行饲养)中，每头注射2ul左右(滴度为1×10⁷/ml)，分别取24、48、72、96和120小时表达的家蚕淋巴血，5000rpm 5min离心后取上清，用PBS pH7.4稀释10倍后，加入等体积的2×蛋白质上样缓冲液(100Mm Tris.HCl，4％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油)，取20ul进行SDS-PAGE电泳，与PVDF膜(宝灵曼公司)一起电转过夜，通过与一抗(兔抗CTB，Sigma公司)，二抗(羊抗兔IgG，Sigma公司)杂交，结果表明，Western杂交条带分子量为50KD左右。ELASA检测表明感染后第120小时每条蚕平均表达量为0.52mg，感染后第120小时每个蛹平均表达量为0.53mg(图2)。

实施例5、在家蚕幼虫和蛹中表达的CTB的纯化

用1万头五龄起蚕，每头人工接种重组病毒使之发病，在感染的第六天收集蚕血清共8000ml。蚕血清先经5000rpm离心1小时，取上清在25000rpm离心30分钟，经硫酸铵沉淀后上Sephadex G150柱分离，每次收集样品均经细胞测活，确定其活性存在，筛选活性峰。将过Sephadex G150柱的活性部分混合后，上MonoQ柱，进一步用HPLC阳离子交换柱和阴离子交换柱纯化，获得纯度为95％的重组蛋白。

实施例6、在家蚕幼虫和蛹中表达的CTB口服疫苗的制备

在家蚕幼虫和蛹体(申请人自行饲养)表达CTB，经过过滤(100KD超滤)，30000rmp离心后经冷冻干燥后，以家蚕蛹为填充料配制成药物和佐剂。

实施例7、在家蚕幼虫、蛹中表达CTB的抗霍乱菌的动物实验

实验动物为BalB/C小鼠，购自浙江医学科学院动物中心，共30只，平均体重16～18g，随机分成3组，每组10只。I组每只经口喂50ug CTB(实施例6的口服药物)，II组每只经口喂10ug CTB(实施例6的口服药物)，对照组为0.9％生理盐水，共免疫3次，间隔7天。4周后采血，用CTB抗体检测试剂盒(Sigma公司)检测结果，结果表明雌雄个体均产生了较强的抗体水平，I组到第8周血清抗体OD水平已达到1.0以上，相当于患者感染者的抗体水平，，说明家蚕幼虫、蛹中表达CTB口服剂型的CTB可以通过肠道被老鼠吸收，并具有抗原活性，能在体内产生较强的抗体。

实例8、在家蚕幼虫、蛹中表达CTB作为佐剂的抗乙肝病毒的动物免疫实验

实验动物为BalB/C小鼠，购自浙江医学科学院动物中心，共60只，平均体重16～18g，随机分成3组，每组20只，I组每只经口喂100ug rHBsAg(购自中国药品生物制品鉴定所)加上15ug CTB(实施例6的口服药物)，II组每只经口喂100ug rHBsAg(购自中国药品生物制品鉴定所)，对照组为0.9％生理盐水，共免疫3次，间隔7天。4周后每隔1周采血，用抗-HBs ELISA试剂盒检测试剂盒(华美生物工程公司)检测结果。结果表明I组小鼠个体80％以上4周后均产生了较强的抗体水平，到第8周血清抗体水平已大到205mIU/ml，相当于乙肝感染者的抗体水平，说明基于在家蚕幼虫、蛹中表达CTB作为佐剂的rHBsAg口服免疫可以通过肠道被老鼠吸收，并具有抗原活性，能在体内产生较强的抗体，产生了免疫应答。

实例9、在家蚕幼虫、蛹中表达CTB作为佐剂的抗传染性法氏囊病病毒(IBDV)的动物免疫实验

实验动物为非免疫鸡，购自浙江省农业科学院，共40只，随机分成2组，每组20只，I组每只经口喂10mg IBDV VP2冻干粉(申请者表达，参考《生物化学和生物物理学报》，2000年第3期，281-284页)加上10ug CTB(实施例6的口服药物)，II组每只经口喂15mg IBDV VP2冻干粉(来源同上)，共免疫5次，间隔3天。3周后每隔1周采血检测中和抗体。检测中和抗体检测采用鸡胚纤维细胞培养法测定(参考《浙江大学学报》，农业与生命科学版，2000年，第一期，9-16页)。经病毒血清中和试验结果表明I组小鼠4周后均产生了较强的中和抗体水平，到第6周血清中和抗体滴度达到1∶3300，比II组血清中和抗体滴度增加1倍以上，表明家蚕幼虫、蛹中表达CTB能显著增强IBDV VP2口服免疫效果，能在体内产生更强的中和抗体。

实例10、在家蚕幼虫、蛹中表达CTB作为佐剂的抗丙肝病毒的动物免疫实验

实验动物为BalB/C小鼠，购自浙江医学科学院动物中心，共60只，平均体重16～18g，随机分成3组，每组20只，I组每只经口喂丙肝抗原口服药物(申请者表达，参考)加上15ug CTB(实施例6的口服药物)，II组每只经口喂丙肝抗原口服药物，对照组为0.9％生理盐水，共免疫3次，间隔7天。4周后每隔1周采血，采血后用HCV抗体检测试剂盒测抗体(检测方法按上海复华公司试剂盒操作说明书进行)。结果表明I组小鼠个体80％以上5周后均产生了较强的抗体水平，I组到第8周血清抗体OD水平已达到1.2，相当于丙肝感染者的抗体水平，比II组血清抗体水平增加1倍以上，表明家蚕幼虫、蛹中表达CTB能增强丙肝抗原口服免疫效果。

实例11、家蚕幼虫、蛹中表达的CTB作为佐剂的NOD小鼠模型抗I型糖尿病的动物实验

实验动物为NOD小鼠，购自浙江医学科学院，共20只，随机分成2组，每组10只，I组每只经口喂100ug胰岛素(购自Novo公司)加上15ug CTB(实施例6的口服药物)，II组每只经口喂100ug胰岛素(购自Novo公司)。共免疫7次，间隔7天。10周后检测对胰腺炎的抑制效果。结果表明20周后I组小鼠胰腺炎指数为2.0+0.3，II组小鼠胰腺炎为4.0+0.5，30周后II组有75％小鼠发生糖尿病，而I组小鼠只有35％发生糖尿病，说明基于在家蚕幼虫、蛹中表达CTB作为佐剂的胰岛素口服免疫可以通过肠道被老鼠吸收，能显著抑制NOD小鼠模型糖尿病的发生。

实例12、在家蚕幼虫、蛹中表达的CTB作为佐剂的小鼠升白细胞的动物实验

实验动物为BalB/C小鼠，购自浙江医学科学院动物中心，共100只，平均体重16～18g，随机分成2组，每组50只，I组每只经口喂10ug rhGM-SCF(先灵保雅公司产品)加上10ugCTB(实施例6的口服药物)，II组每只经口喂10ug rhGM-SCF(先灵保雅公司产品)，每天喂1次，共喂7天。隔2天采血，采血后用血球自动计数仪进行检测白细胞数目。结果表明I组喂小鼠喂药3天后白细胞开始增加，1周后白细胞增加13％，II组小鼠白细胞变化不明显，表明家蚕幼虫、蛹中表达的CTB能增强rhGM-SCF口服生白细胞效果。

附件1：核苷酸和/或氨基酸序列表

<110>浙江大学

<120>霍乱毒素B亚基的新制法和用途

<160>2

<210>1

<211>402

<212>DNA

<213>霍乱弧菌(Vibrio cholerae)

<220>

<221>CDS

<222>(1)…(390)

<400>1

atg att aaa tta aaa ttt ggt gtt ttt ttt aca gtt tta cta tct 45

MET Ile Lys Leu Lys Phe Gly Val Phe Phe Thr Val Leu Leu Ser

                 5                   10                  15

tca gca tat gca cat gga aca cct caa aat att act gat ttg tgt 90

Ser Ala Tyr Ala His Gly Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys

                 20                  25                  30

gca gaa tac cac aac aca caa ata cat acg cta aat gat aag ata 135

Ala Glu Tyr His Asn Thr Gln Ile His Thr Leu Asn Asp Lys Ile

                 35                  40                  45

ttt tcg tat aca gaa tct cta gct gga aaa aga gag atg gct atc 180

Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu MET Ala Ile

                 50                 55                   60

att acc ttt aag aat ggt gca att ttt caa gta gaa gta cca ggt 225

Ile Thr Phe Lys Asn Gly Ala Ile Phe Gln Val Glu Val Pro Gly

                 65                  70                  75

agt caa cat ata gat tca caa aaa aaa gcg att gaa agg atg aag 270

Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg MET Lys

                 80                  85                  90

gat acc ctg agg att gca tat ctt act gaa gct aaa gtc gaa aag 315

Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys

                 95                 100                 105

tta tgt gta tgg aat aat aaa acg cct cat gcg att gcc gca att 360

Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala Ile Ala Ala Ile

                110                 115                 120

agt atg gca aat tct gag aaa gat gag cta taa gaattcccc402

Ser MET Ala Asn Ser Glu Lys Asp Glu Leu ---

                125                     130

<210>2

<211>130

<212>PRT

<213>霍乱弧菌(Vibrio cholerae)

<400>2

Met Ile Lys Leu Lys Phe Gly Val Phe Phe Thr Val Leu Leu Ser

1               5                    10                  15

Ser Ala Tyr Ala His Gly Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys

                20                   25                  30

Ala Glu Tyr His Asn Thr Gln Ile His Thr Leu Asn Asp Lys Ile

                35                  40                   45

Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile

                50                   55                  60

Ile Thr Phe Lys Asn Gly Ala Ile Phe Gln Val Glu Val Pro Gly

                65                   70                  75

Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys

                80                  85                   90

Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys

                 95                 100                 105

Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala Ile Ala Ala Ile

                110                 115                 120

Ser Met Ala Asn Ser Glu Lys Asp Glu Leu

                125                 130

Claims (7)

1、一种霍乱毒素B亚基的制法，其特征在于：通过基因工程方法获得重组的带CTB基因的家蚕重组杆状病毒，该病毒分类命名为：杆状病毒属家蚕核型多角体病毒(含CTB)，该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，地址在北京中关村，保藏日期为2001年7月2日，保藏编号为CGMCCNO：0594，并用该病毒接种家蚕幼虫和蛹进行表达CTB。

2、根据权利要求1所述的霍乱毒素B亚基的制法，其特征在于所述获得带CTB基因的家蚕重组杆状病毒的基因工程方法是：通过RT-PCR方法合成CTB基因片段，克隆进入经SmaI酶切的pUC19位点，将CTB基因片段克隆进入转移载体pBacPAK-8，获得重组转移载体质粒pBac-CTB。

3、根据权利要求1、2所述的霍乱毒素B亚基的制法，其特征在于所述获得带CTB基因的家蚕重组杆状病毒的基因工程方法是：通过重组转移载体pBac-CTB DNA与家蚕核型多角体病毒DNA进行共转染家蚕细胞，经10轮空斑筛选和Southern杂交斑筛选获得重组病毒BmBacCTB。

4、根据权利要求1所述的霍乱毒B亚基的制法，其特征在于所述的CTB基因在家蚕幼虫和蛹中的表达产物是通过重组杆状病毒BmBacCTB注射至五龄家蚕幼虫和蛹体内表达产生。

5、根据权利要求1所述的霍乱毒素B亚基的制法：其中还包括分离，纯化家蚕表达的CTB的步骤。

6.根据权利要求5所述的霍乱毒素B亚基的制法：其中还包括以家蚕和蛹为填充剂制备口服药物的步骤。

7.根据权利要求6所述的霍乱毒素B亚基的制法，其特征在于所述的口服药物是通过表达CTB的家蚕五龄幼虫和蛹经冷冻干燥后制成的。

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