CN112426523A - 一种含抗病毒组合物的猪用疫苗和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于兽用生物新药技术领域，具体涉及一种含抗病毒组合物的猪用疫苗和应用。抗病毒组合物主要以猪α、λ3干扰素和CD40L为活性单位，以精氨酸、甘油等为保护剂的液体组合物，所述猪干扰素α、λ3和CD40L均是利用基因工程重组技术获得的表达蛋白，经亲和层析纯化后，按以下终浓度比例与保护剂混合：猪α干扰素50～500万单位/ml，猪λ3干扰素0.5～5万单位/ml，CD40L 10～40ug/ml，精氨酸0.02～0.1mol/L，甘油1%～5%，甘露醇0.05～0.2mol/L，海藻糖1%～3%。本发明组合物具有非常好的抗病毒活性，能够显著抑制猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒等的增殖，同时该组合物也可用作免疫调节剂，能显著提高免疫后的体液和细胞免疫水平，且该组合物保存期长，使用方便。

Description

一种含抗病毒组合物的猪用疫苗和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种含抗病毒组合物的猪用疫苗和应用。
背景技术
随着规模化养殖的发展，病毒性疾病已经成为危害养殖业的最大因素，而目前的动物疫苗并不能完全防控此类疾病，尚缺少有效的治疗手段。近年来，爆发的各种传染性疾病对我国养猪业造成巨大的危害，一些对猪造成严重威胁的疾病还没有得到全面控制，如猪瘟、口蹄疫、繁殖与呼吸综合症等。特别是2018年我国非洲猪瘟的爆发使养猪业损失惨重。
目前市场上预防和治疗动物疫病的药物主要有预防类的疫苗和治疗类的抗病毒化学类药。其中，安全、有效的疫苗在预防重大动物疫病发生方面一直发挥着重大作用，如猪瘟、口蹄疫、禽流感等疫病防控，效果确实、可靠，但疫苗本身也存在一些弊端，如动物机体只产生针对特定抗原的应答，对于多种疫病，需要连续免疫多种疫苗；某些疫苗安全性和有效性存在不足，如高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗，学术界对其防控高致病性猪繁殖与呼吸综合征效果仍有争论，同时对于许多疫病的致病机理难以摸清，导致疫苗研发困难重重，如非洲猪瘟病毒，虽然对全球多个国家的养猪业造成了致命打击，但对该疫病疫苗的研究，时至今日全世界范围内都未攻克。对于治疗类的抗病毒类药物，其可直接抑杀病毒，使用方法较多，可注射、混饲、混饮， 但缺点是在抑杀病毒的同时也破坏了细胞正常代谢，有严重的药物残留，可直接危害到人类健康，且病毒也可能对药物会产生耐药性变异株，使药效降低或失去。综上可见，面对突发的动物疫病，目前的预防手段和治疗措施并不能真正经济、有效地控制我国畜禽等疫病的发展，因此我们迫切需要找到一种有效的防治措施或治疗方法。
干扰素（Interferon,IFN）是人和动物细胞受到病毒感染，或者核酸、细菌内毒素、促细胞分裂素等干扰素诱生剂刺激后，由巨噬细胞、淋巴细胞及体细胞产生的一种具有高活性、多功能的糖蛋白。在正常机体的脾脏、肝脏、外周血淋巴细胞中都可以检出。该蛋白具有广谱抗病毒、抗肿瘤和调节免疫等多重生物学活性，为现今一种最理想的抗病毒生物制剂。干扰素根据其来源、结构和功能，可分为三大类：Ⅰ型、Ⅱ型和III型。Ⅰ型干扰素主要由白细胞、成纤维细胞产生，抗病毒作用为主，免疫增强为辅。主要包括IFN-α、IFN-β、IFN-ω，其主要是干扰病毒DNA或RNA的合成。Ⅱ型干扰素由活化的T细胞和NK细胞产生，免疫增强为主，抗病毒作用为辅，主要有IFN-γ。III型干扰素是由上皮细胞和黏膜细胞产生，功能作用与I型干扰素类似，抗病毒为主，主要是IFN-λ，人分为λ1、λ2和λ3三个亚型，猪目前只分离到λ1和λ3两个亚型。
目前对INF-α、β、γ生物学功能和作用机理研究报道较多，对III型报道较少。干扰素的主要生物学功能可概括为：1、广谱抗病毒功能：I型和II型干扰素基因均可经诱导剂激活而表达，表达产物通过特定信号转导通路，激活干扰素诱导基因的转录，机体合成多种具阻断病毒复制功能的抗病毒酶和蛋白质，抵抗病毒对机体细胞的感染；2、免疫调节功能：I型干扰素可增强MHC-I类分子表达，而抑制MHC-II类分子表达；II型干扰素可促进MHC-II类分子表达，两类干扰素的协同调节作用，使机体处于最佳免疫应答状态。3、免疫增强功能：I和II型干扰素均可刺激NK细胞并增强其杀伤功能，有利于机体清除病毒感染。III型干扰素(也称为IFN-λs或IL-28/29)是2003年发现的新类型，在结构和遗传上同IL-10家族成员相似，但显示I型IFN样活性，主要通过JAK-STAT信号通路，发挥抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用。IFN-λs受体表达主要在上皮细胞，包括表皮、呼吸道和胃肠道上皮细胞。相对于I型干扰素，III型干扰素由于其受体(IFN-λs)的靶向优势，其引起的副作用相对较小。另外，IFN-λs是粘膜、上皮组织中抗病毒反应的重要介质，并且对GI上皮的保护至关重要，可能是靶向黏膜感染的潜在抗病毒治疗剂，同时也在黏膜免疫中发挥重要作用。总的来说，III型干扰素诱导ISGs表达的能力低于I型干扰素。很多体内实验表明，I型和III型干扰素在机体抗病毒应答的过程中几乎是缺一不可的。由于病毒感染的某些细胞无法对III型干扰素产生应答，IFN-人抗病毒系统不能单独对全身性的病毒感染提供完全的保护作用，在对全身性病毒感染作出应答时，I型干扰素是必不可少的。III型干扰素在肠胃上皮细胞抗病毒应答中具有独特作用，且这种作用不与I型干扰素重叠。
CD40L分子是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白,为肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员, CD40L主要表达于活化的CD4+T淋巴细胞，部分活化的CD8+T细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、NK细胞也有表达。CD3单抗可以刺激T细胞表达CD40L。研究表明CD40L与CD40分子之间相互作用能促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的活化、增殖及抗体产生。同时CD40L对多种免疫细胞具有特异性免疫调节作用，因而被广泛应用于疫苗开发。大量研究表明，CD40-CD40L介导的信号能够诱导抗原递呈细胞（APC）的活化。APC活化能提供抗原刺激信号和第二信号，两者协同作用启动免疫级联反应，促进体液和细胞免疫功能。在胸腺里，CD40在皮质、髓质的上皮以及胸腺间质细胞上表达。这些细胞在非疾病状态持续低水平表达CD40，与CD40相反，在非疾病状态下，CD40L并不表达。通过肌肉注射本专利的抗病毒组合物，能够快速启动CD40-CD40L反应，引发一系列特异性免疫应答，包括：（1）促进B细胞的分化、发育、增殖、成熟，参与免疫球蛋白的分泌及类型转换；（2）促进T细胞的激发和定向分化，发挥细胞特异性杀伤功能；（3）参与DC的分化及功能调节。CD40L分子可以与APC表面CD40相互作用激活APC，促进APC共刺激分子表达和细胞因子分泌。
在特异性免疫反应中，特异性CTL的激发和扩增必须首先由Th细胞与APC细胞（DC）的相互作用，被Th激发的DC再将信号传递给CTL，其中DC在Th细胞和CTL间起了桥梁的作用。然而，最近的研究发现，CTL的激发可通过激发DC的CD40分子而绕过Th细胞。国外有文献报道，缺乏CD4+T细胞辅助不影响CD40依赖性的CD8+T细胞反应，这表明有其他细胞提供表达CD40L以激活抗原呈递细胞。因为CD8+T细胞能够表达CD40L，它们能够直接与APCs相互作用，为自身激活提供帮助。
综上所述，I型和III型干扰素的抗病毒作用是非特异性的，能对动物机体提供广泛的抗病毒作用。同时，辅助于CD40L共激进分子，既能诱导产生各种细胞因子，又能活化APC，特异性地促进其对各种病毒抗原的递呈，提高细胞免疫和体液免疫的级别。
发明内容
本发明旨在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。提高免疫动物的免疫应答，包括体液和细胞免疫应答，提高抗体水平，从而提高疫苗的免疫效果，同时能够缩短免疫窗口期，延长保护期。
本发明的目的在于提供一种含抗病毒组合物的猪用疫苗，含有抗病毒组合物和病毒疫苗，病毒疫苗可以为全病毒灭活疫苗或亚单位疫苗，抗病毒组合物是由猪α干扰素、猪λ3干扰素和猪CD40L蛋白及保护剂组合而成。
所述猪α干扰素为猪α干扰素编码基因克隆连接到重组表达载体上进行表达获得；
所述猪λ3干扰素为猪λ3干扰素编码基因克隆连接到重组表达载体上进行表达获得；
所述猪CD40L为猪CD40L编码基因克隆连接到重组表达载体上进行表达获得；
任选地，所述重组表达载体包括原核表达载体、酵母表达载体和真核表达载体；
任选地，原核表达载体包括但不限于pET系列载体、pQE系列载体、pGEX系列载体、pMAL系列载体和pBV系列载体等，优选地pET系列载体和pBV系列载体，更优选地使用pET28、pET32及pBV220。
任选地，真核表达载体包括但不限于pcDNA系列载体、pCMV系列载体和pEF系列载体，优选地使用pcDNA系列载体，更优选地使用pcDNA3.1载体。
所述猪α干扰素编码基因为Seq ID No：1所示序列；
所述猪λ3干扰素编码基因为Seq ID No：2所示序列；
所述猪CD40L编码基因为Seq ID No：3所示序列；
任选地，所述猪α干扰素的终浓度为50～500万单位/ml，所述猪λ3干扰素的终浓度为0.5～5万单位/ml，所述猪CD40L 的终浓度为10～40ug/ml；更优选地，所述猪α干扰素的终浓度为100万单位/ml，所述猪λ3干扰素的终浓度为1万单位/ml，所述猪CD40L 的终浓度为20ug/ml。
任选地，所述猪α干扰素、猪λ3干扰素和猪CD40L原核重组蛋白，均通过两相萃取法或亲和层析法或离子交换法或超滤法去除内毒素；更优选地，内毒素的去除方法为超滤法。
所述保护剂是由精氨酸、甘油、海藻糖、甘露醇组成。
所述全病毒灭活疫苗包括但不限于猪伪狂犬灭活疫苗、猪流行性腹泻灭活疫苗，猪圆环病毒灭活疫苗、猪细小病毒灭活疫苗、口蹄疫灭活疫苗等；优选地为猪伪狂犬病毒灭活疫苗；
所述亚单位疫苗包括但不限于非洲猪瘟、猪流行性腹泻、猪圆环等病毒通过基因工程技术重组制备的亚单位疫苗。
根据本发明的具体实施例，提供了一种含有该抗病毒组合物的疫苗，其特征在于，所述疫苗为全病毒灭活疫苗或亚单位疫苗，抗病毒组合物作为免疫佐剂或免疫增强剂。
优选地，所述全病毒灭活疫苗包括但不限于猪伪狂犬灭活疫苗、猪流行性腹泻灭活疫苗，猪圆环病毒灭活疫苗、猪细小病毒灭活疫苗、口蹄疫灭活疫苗等；更优选地为猪伪狂犬病毒灭活疫苗。
优选地，所述亚单位疫苗包括但不限于非洲猪瘟、猪流行性腹泻、猪圆环等病毒通过基因工程技术重组制备的亚单位疫苗。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：猪α干扰素和猪λ3干扰素均为基因工程重组蛋白产品，生物活性比天然干扰素高1～3个数量级，且两者均具有显著的抗病毒活性，猪λ3干扰素的加入能够弥补猪α干扰素在上皮细胞及黏膜组织中抗病毒作用不足的特点。而CD40L为辅助刺激因子CD40的受体，两者的结合不仅能够促进T细胞的分化，更能发挥细胞特异性杀伤功能，间接进一步的提高抗病毒作用；也能够促进B细胞的活化和体液免疫应答。
附图说明
图1 重组蛋白纯化效果图
M：为蛋白Marker；1为重组猪IFN-α；2为重组猪IFN-λ3；3为重组猪CD40L。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1 原核表达载体的构建
用Trizol法提取猪肝脏总RNA，并以此为模板，用反转录试剂盒合成cDNA。根据Genebank公布的猪IFN-α、IFN-λ3和CD40L序列，设计带有BamH I和Xho I酶切位点扩增引物，进行PCR扩增，所得产物即为相应目的基因序列，见Seq ID No.1、Seq ID No.2和Seq IDNo.3，琼脂糖凝胶电泳鉴定后，连接T载体（pUC-19），鉴定，并送测序公司测序。
将测序正确的含目的基因的T载体与pET32a分别利用BamH I和Xho I酶双酶切，酶切产物琼脂糖凝胶电泳鉴定，将鉴定正确的目的基因与pET32a载体连接，转化DH5a菌。挑取单克隆，接入5ml含有终浓度100ug/ml的氨苄西林钠的LB液体培养基中，37℃、180rpm，震荡培养12h后，用全式金Plasmid mini kit I试剂盒分别提取pET32-IFN-α、pET32-IFN-λ3和pET32-CD40L质粒，送测序公司进行测序，将测序正确的质粒转化Transetta(DE3) ，涂LB固体琼脂平板，37℃过夜培养。
挑取LB固体平板上的单菌落，接入5ml含有终浓度100μg/ml的氨苄西林钠的LB液体培养基中，37℃、180rpm，震荡培养10h后，加入终浓度30%的甘油，-80℃保存，分别即为猪IFN-α、IFN-λ3和CD40L重组原核表达载体菌种。
实施例2 重组蛋白的发酵培养与纯化
1. 一级种子繁殖及鉴定（复壮） 用接种环钩取适量甘油菌种接种于含100μg/ml氨苄西林钠的LB琼脂平板上，37℃培养12小时，挑取至少5个单克隆菌落，进行PCR检测验证。合格的菌落平板置2～8℃保存，应不超过14日，继代不得超过5代。
2. 二级种子繁殖 将一级种子接种于含100μg/ml氨苄西林钠的LB液体培养基（50mL/250mL）中，在37℃培养10小时，作为二级种子（生产用种子）。
3. 三级种子培养 将二级种子接种于含100μg/ml氨苄西林钠的LB液体培养基（250mL/1000mL，两瓶）中，在37℃培养10小时，作为三级种子（生产用种子）。
4. 发酵前准备 将配置好的发酵培养液加入到发酵罐中，同时矫正pH电极，溶氧电极，然后整罐放入灭菌锅进行灭菌，灭菌条件： 121℃，20min。灭菌完毕趁热取出。
5. 菌体培养 按发酵液总体积的10%接种三级种子，同时加入1%的无菌葡萄糖，接种后调节pH6.8，温度37℃，转速与溶氧联动保持溶氧在30%以上，。
6. 诱导表达 菌液培养6-10小时，菌体OD值在可达2.5以上时，加入IPTG0.5mmol/L，调节温度为28℃，诱导12h后停止培养。
7. 菌体处理 将收集的菌体合并放入已清洗干净的离心管中，称重配平，用高速冷冻离心机10000r/min、4℃离心20分钟，倒掉上清，沉淀用1/5原体积的Tris-HCl（0.02mol/L Tris，0.5mol/L NaCl，10%甘油，用浓盐酸调节pH值至7.9，0.45μm过滤）缓冲液重悬溶解，称重配平，再次离心，用该方法连续洗涤两次。最后一次倒掉上清后，称重沉淀，按100mg菌体沉淀加入1.0～5.0ml Tris-HCl缓冲液，重悬溶解。按1:100的比例，向重悬溶解后的菌体中加入蛋白酶抑制剂，冰浴条件下用超声波裂解，工作5秒、休息6秒，连续超声40分钟， 10000r/min、4℃离心20分钟，收集上清液，0.45μm滤膜过滤。
8. 纯化 用亲和层析法和APPS 50D蛋白纯化系统纯化重组蛋白：将琼脂糖凝胶预装柱（保持4℃放置）连接到检测器连接管中，打开纯化软件，进行连接检测；将进液A管放入到去离子水中，流速设定为2.0ml/min，运行25分钟，将预装柱中的乙醇冲洗干净；再将进液A从去离子水中取出，放入到平衡结合液中，流速设定为2.0ml/min，运行25分钟，进行柱平衡。将进液A管从平衡结合液中取出，放入到待纯化样品液中，流速设定为0.5ml/min，运行。待样品进液结束后，将进液A管放入到杂蛋白洗涤液中，流速为2.0ml/min，运行100分钟（如基线未趋于稳定，可延长时间）。杂蛋白洗涤结束后，将进液A管放入到目的蛋白洗脱液中，流速为1.0ml/min，洗脱目的蛋白，待蛋白峰出现后，开始收集目的蛋白，待蛋白峰落下后停止收集，做好标记。
9. 内毒素去除
利用南京金斯瑞公司的Toxin EraserTM Endotoxin Removal Resin去除内毒素：首先利用0.1M的盐酸调节样品pH值为7.5，然后将样品加入到已用平衡液平衡后的胶柱中，控制流速为0.2ml/min，收集流穿液。
实施例3 重组纯化蛋白质量检测
1. 纯度测定
重组蛋白用SDS-PAGE电泳结合Bio-Rad Image Lab软件确定蛋白纯度。样品上样量不低于1ug，经SDS-PAGE电泳、染色和脱色之后，电泳胶上均只有与目的蛋白分子量相符的条带，看不到明显的杂蛋白条带，且Image Lab软件分析的纯度均在90.0%以上，测定结果见图1。
2. 生物学活性的测定
参考《中国药典（2010版）》附录“干扰素生物学活性测定法（细胞病变抑制法）”，以MDBK细胞和VSV病毒为评价体系，测定纯化重组蛋白IFN-α和IFN-λ3的生物学活性。猪α和λ3干扰素的生物学活性分别为2.3×109.0U/ml和1.8×105.0U/ml。
3. 蛋白含量测定
利用康为世纪公司的BCA法蛋白定量检测试剂盒，检测三个重组纯化蛋白的蛋白含量，IFN-α、IFN-λ3、CD40L分别为0.6mg/ml、0.4mg/ml、0.4mg/ml。
实施例4 保护剂及抗病毒组合物的制备
（1）用Tris缓冲液配制含精氨酸终浓度0.2mol/L、甘油20%、甘露醇0.4mol/L、海藻糖6%的溶液，彻底溶解后，用浓盐酸调节pH值7.2。
（2） 将猪α干扰素和猪λ干扰素用Tris缓冲液分别稀释至400万单位/ml和4万单位/ml，然后与保护剂等体积混合；
（3）将CD40L重组蛋白用Tris缓冲液稀释至40ug/ml，再与干扰素和保护剂的混合液等体积混合；
（4）再次用浓盐酸调节pH值7.2，无菌过滤即为抗病毒组合物混合液。
实施例5 抗病毒组合物安全性测定
1. 小鼠法
采用小鼠试验法，每批样品用5只小鼠，注射前每只小鼠称体重，应为18～22g。每只小鼠腹腔注射供试品0.5ml，观察7天。观察期内，小鼠全部健存，且无异常反应，到期时每只小鼠体重均增加。
2. 内毒素测定
采用南京金斯瑞生物公司的ToxinSensor™凝胶法内毒素检测试剂盒检测抗病毒组合物样品中的内毒素含量，检测结果显示，组合物中内毒素含量不超过20EU/ml。
实施例6 靶动物抗猪流行性腹泻病毒效果的验证
挑选4日龄猪流行性腹泻病毒抗原（荧光定量PCR法）和抗体（细胞中和抗体滴度不高于1:4）均为阴性的仔猪（长白猪）15头，分成3组，每组5头，其中第1、2组为试验组，第4组为对照组。试验第1-6日，第1组5头仔猪早晚各肌肉注射0.5ml/头的猪重组IFN-α（100万单位），第2组5头仔猪早晚各肌肉注射0.5ml/头的抗病毒组合物；试验第3日，试验组和对照组均各口服1000TCID50的猪流行性腹泻病毒攻击毒；攻毒后临床观察7日，每日观察记录各组猪的腹泻、呕吐等临床症状，并用荧光定量PCR法测定粪便中猪流行性腹泻病毒。试验结果见表1。
表1 试验组与对照组攻毒后临床表现及检测结果统计表
Figure 201855DEST_PATH_IMAGE001
注：荧光定量法为试验组自建方法，CT值低于37即为阳性。
实验结果表明，与攻毒对照组相比，攻毒前单独使用IFN-α和抗病毒组合物均能使攻毒猪发病率和死亡率降低，其中单独使用IFN-α能使发病率和死亡率分别降低20%和25%，使用抗病毒组合物能使发病率和死亡率分别降低40%（一过性腹泻较多）和50%；同时实验结果还显示，感染前使用抗病毒组合物还能延迟发病时间，显著降低排毒量。由于在发病潜伏期内，使用干扰素后能启动机体的抗病毒因子的产生，形成一种网络的保护机制，释放抗病毒蛋白因子，能有效地提高猪体的免疫水平。所以，本专利中的抗病毒组合物对猪流行性腹泻有较好的防治效果。
实施例7 作为免疫增强剂在猪伪狂犬病灭活疫苗中的应用（小鼠）
将在vero细胞中培养的病毒滴度为107.8TCID50/ml的猪伪狂犬病毒gI/gE缺失株病毒液，灭活后先与抗病毒培养物以2:1的比例混合，再与常规油佐剂按比例混合后接种18～22g的昆明小鼠8只，设为试验A组，同时设只接种猪伪狂犬病毒与常规油佐剂的疫苗试验B组和空白对照C组。接种后14和28日，采血分离血清，分别用细胞中和试验法和ELISA法测定血清中的中和抗体滴度和IFN-γ含量。具体结果见表2。从结果可知，抗病毒组合物作为免疫增强剂使用之后，能明显增强猪伪狂犬病灭活疫苗的中和抗体滴度和细胞免疫水平。
表2 血清中和抗体滴度和IFN-γ含量测定结果统计表
Figure 118995DEST_PATH_IMAGE002
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
序列表
<110> 北京大伟嘉生物技术股份有限公司
<120> 一种含抗病毒组合物的猪用疫苗和应用
<130> 1
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 423
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgcgacctgc ctcagaccca cagcctggct cacaccaggg ccctgaggct cctggcacaa 60
atgaggagaa tctctccctt ctcctgcctg gaccacagaa gggactttgg atttccccaa 120
gaggccttgg ggggcaacca ggtccagaag gctcaagcca tggctctggt gcatgagatg 180
ctccagcaga ccttccagct cttcagcaca gagggctcgg ctgctgcctg ggatgagagc 240
ctcctgcacc agttctacac tggactggat cagcagctca gggacctgga agcctgtgtc 300
atgcaggagg cggggctgga agggaccccc ctgctggagg aggactccat cctggctgtg 360
aggaaatact tccacagact caccctctat ctgcaagaga agagctacag cccctgtgcc 420
tgg 423
<210> 2
<211> 519
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgcctgtcc ctgaagccct cagggccctc ccaggagcaa ggggctgcca cttggcccag 60
ttcaagtctc tgtccccaca agcgctgcag gccttcaaga gggccaagga tgcctttgaa 120
gagtccctct tggaggactg gaactgcagc tcccgcatct tccccaggag cagggacctg 180
aagcagctgc aggtgtggga gcgccccgtg gccttggagg ccgaggtggc cctgaccctc 240
agcgtcctgg gctccttggc gaactcatcc ctgcacagca gcctggacca gccccttcac 300
acgctgcgcc acatccacgc ccagctccag gcctgtgtcc cagctcagcc catggcaggc 360
ccccggcccc ggggccgcct ccaccactgg ctgcaccggc tccaggaggc ccagaagaag 420
gagccccaga gctgcctgga agcctctgtc atgttcaacc tcttccgcct cctcacccgg 480
gacctgaaat gtgtcgccag tggagacctg tgtgtctga 519
<210> 3
<211> 756
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgatcgaaa cgtacagcca accttcgccc cgctctgtgg ccgctggacc acccgtcagt 60
atgaaaatct ttatgtattt acttactgtt tttcttatca cccagatgat tgggtcagca 120
ctttttgcag cgtaccttca cagaagattg gacaagatag aagatgaaag gaatcttcat 180
gaagattttg tgttcataaa aacgatacag agatgcaagc aaggagaggg gtccttatcc 240
ttattgaact gtgaggaaat cagaagccag tttgaagacc tggtcaaggg tataatgcaa 300
agcaaagaag tgaagaagaa agaaaaaagc tttgaaatgc acaaaggcga tcaggatcct 360
caaattgcgg cacatgtcat aagcgaggcc agtagtaaaa cagcatctgt cctgcagtgg 420
gcccccaaag ggtactacac cctcagcacc aacttggtga ccctggaaaa cgggagacag 480
ctggccgtca aaagacaagg aatctattac atctacgccc aagtcacctt ctgctccaac 540
cgggacgccg cgggtcaagc tcccttcata gccagcctct gcctgaggtc cccaagcggg 600
tcggagagaa tcttactccg cgcggccaac acccacagtt cctccaagcc ctgcgggcag 660
caatccattc acttgggcgg agtcttcgag ttgcaacccg gcgcttcggt gttcgtcaac 720
gtgactgatc caagccaagt gagccacggg acctga 756

Claims (4)

1.一种含抗病毒组合物的猪用疫苗，含有抗病毒组合物和病毒疫苗，病毒疫苗可以为全病毒灭活疫苗或亚单位疫苗，其特征在于，抗病毒组合物是由猪α干扰素、猪λ3干扰素和猪CD40L蛋白及保护剂组合而成。
2.根据权利要求1所述的含抗病毒组合物的猪用疫苗，其特征在于，
所述猪α干扰素为猪α干扰素编码基因克隆连接到重组表达载体上进行表达获得；
所述猪λ3干扰素为猪λ3干扰素编码基因克隆连接到重组表达载体上进行表达获得；
所述猪CD40L为猪CD40L编码基因克隆连接到重组表达载体上进行表达获得；
任选地，所述重组表达载体包括原核表达载体、酵母表达载体和真核表达载体；
任选地，原核表达载体包括但不限于pET系列载体、pQE系列载体、pGEX系列载体、pMAL系列载体和pBV系列载体等，优选地pET系列载体和pBV系列载体，更优选地使用pET28、pET32及pBV220；
任选地，真核表达载体包括但不限于pcDNA系列载体、pCMV系列载体和pEF系列载体，优选地使用pcDNA系列载体，更优选地使用pcDNA3.1载体；
所述猪α干扰素编码基因为Seq ID No：1所示序列；
所述猪λ3干扰素编码基因为Seq ID No：2所示序列；
所述猪CD40L编码基因为Seq ID No：3所示序列；
任选地，所述猪α干扰素的终浓度为50～500万单位/ml，所述猪λ3干扰素的终浓度为0.5～5万单位/ml，所述猪CD40L 的终浓度为10～40ug/ml；更优选地，所述猪α干扰素的终浓度为100万单位/ml，所述猪λ3干扰素的终浓度为1万单位/ml，所述猪CD40L 的终浓度为20ug/ml；
任选地，所述猪α干扰素、猪λ3干扰素和猪CD40L原核重组蛋白，均通过两相萃取法或亲和层析法或离子交换法或超滤法去除内毒素；更优选地，内毒素的去除方法为超滤法。
3.根据权利要求1所述的含抗病毒组合物的猪用疫苗，其特征在于，所述保护剂是由精氨酸、甘油、海藻糖、甘露醇组成。
4.根据权利要求1所述的含抗病毒组合物的猪用疫苗，其特征在于，所述全病毒灭活疫苗包括但不限于猪伪狂犬灭活疫苗、猪流行性腹泻灭活疫苗，猪圆环病毒灭活疫苗、猪细小病毒灭活疫苗、口蹄疫灭活疫苗等；优选地为猪伪狂犬病毒灭活疫苗；
所述亚单位疫苗包括但不限于非洲猪瘟、猪流行性腹泻、猪圆环等病毒通过基因工程技术重组制备的亚单位疫苗。
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