CN115957349B - 激活猪的pja1基因表达的制剂在制备猪抗猪流行性腹泻病毒感染药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程及生物医药领域，公开了激活猪的PJA1基因表达的制剂在制备猪抗猪流行性腹泻病毒感染药物中的应用，所述的PJA1基因包括猪中的NCBI登录号为NC_010461.5的PJA1基因。本发明发现该基因在IPEC‑J2细胞（猪小肠上皮细胞）中被激活之后能够抑制PEDV的增殖，故本基因可作为抑制PEDV复制的疫苗药物的开发与抗病育种研究的新型靶点。
Description
技术领域
本发明属于基因工程及生物医药领域，具体涉及激活猪的PJA1基因表达的制剂在制备猪抗猪流行性腹泻病毒感染药物中的应用。
背景技术
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染引起的一种急性、高度接触性肠道传染病。该病毒可感染所有年龄段的猪，并表现出不同程度的症状，其中哺乳期仔猪受影响最大，感染将出现严重的水样腹泻、呕吐、脱水和死亡(死亡率接近100％)。尽管疫苗接种是预防和对抗病毒性疾病最有效的方法，但是由于PEDV突变毒株的持续出现，导致难以预防该病的流行和爆发。自1971年在英国首次报道以来，PED慢慢传播到世界各地，并给包括我国在内的全球养猪业造成重大的经济损失，预防和控制其流行是一项持续的全球性挑战。因此，亟需开展PEDV感染相关的宿主基因鉴定及其互作研究，为抗PED猪品种培育和疫苗药物研发等提供理论基础及靶基因。
发明内容
本发明的目的在于提供了激活猪的PJA1基因表达的制剂在制备猪抗猪流行性腹泻病毒感染药物中的应用，所述的PJA1基因包括猪中的NCBI登录号为NC_010461.5的PJA1基因，或是编码SEQ ID NO.2所示蛋白的基因。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
激活猪PJA1基因表达的制剂在制备抗PEDV感染药物中的应用；所述的PJA1基因为猪中的NCBI登录号为NC_010461.5的PJA1基因，或是编码SEQ ID NO.2所示蛋白的基因；
以上所述的应用中，所述的PJA1基因为SEQ ID NO.1所示；
以上所述的应用中，优选的，所述的激活方法包括但不限于针对猪PJA1基因的CRISPR/SAM激活技术、或基因过表达技术。
当使用CRISPR/SAM激活技术时，激活猪中NCBI登录号为NC_010461.5的PJA1基因表达的制剂为gRNA：GACCCGCCCCCTTGATGTGG。
本发明的保护内容还包括：一种抗PEDV感染的细胞模型，其特征在于包含有激活猪PJA1基因的表达制剂。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
申请人通过CRISPR/SAM激活技术在IPEC-J2细胞中靶向激活PJA1的表达，首次发现激活PJA1的表达的细胞可以通过影响PEDV的复制从而抑制PEDV的感染，该基因可作为PEDV的新型抗病靶点。本发明为研制有效安全防治猪流行性腹泻病的新型疫苗药物提供了新的靶标，也为抗猪流行性腹泻病育种研究提供了新型候选基因，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1：IPEC-J2-SAM单克隆细胞系的激活基因表达效果验证：
IPEC-J2-SAM中转入靶向B4GALNT2基因的4条gRNA，qPCR检测B4GALNT2基因的激活效果，β-actin为内参基因(*P<0.05，t-test)。
图2：IPEC-J2-SAM-PJA1细胞的构建及验证：
qPCR检测PJA1基因在IPEC-J2-SAM-NTC细胞(图中标记为NTC)和IPEC-J2-SAM-PJA1细胞(图中标记为PJA1)中的表达，β-actin为内参基因(**P<0.01，t-test)。
图3：PJA1基因激活细胞对PEDV增殖的作用检测：
A：IPEC-J2细胞激活PJA1后，相对定量检测感染24h后PEDVM mRNA的表达水平(**P<0.01，t-test)；
B：IPEC-J2细胞激活PJA1后，绝对定量检测感染24h后PEDV M基因的拷贝数(**P<0.01，t-test)。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
IPEC-J2-SAM细胞的构建和验证
1.1IPEC-J2-SAM细胞的构建
(1)按NEOFECT公司的DNA转染试剂(TF201201)的操作说明书利用辅助质粒psPax2(Addgene，12260)、pMD2.G(Addgene，12259)，以及两种核心质粒lenti dCAS9-VP64_Blast(Addgene，61425)、lentiMPH v2(Addgene，89308)分别包装慢病毒。
(2)将IPEC-J2细胞(猪小肠上皮细胞)接种到6孔细胞培养板的2个孔，一孔作为实验组，另一孔作为对照组，用含有10％FBS的DMEM高糖培养基培养。
(3)待细胞汇合度达到60％～70％时，进行感染(MOI～1)。用含有10％FBS的DMEM高糖培养基稀释步骤1制备的慢病毒，并加入终浓度为8μg/mL的polybrene。
(4)感染1d后，细胞传代至10cm细胞培养皿，继续培养。
(5)培养2d后，加含有杀稻瘟菌素和潮霉素的培养基(10％FBS的DMEM高糖培养基)，杀稻瘟菌素和在潮霉素该培养基中的终浓度分别为6μg/mL和300μg/mL(以下简称培养基)。
(6)每天更换新鲜的培养基，待对照组细胞全部死完，实验组有细胞存活时，将实验组细胞接种到10cm细胞培养皿，使其形成单个细胞，加入培养基。
(7)继续培养14d左右，待单个细胞长成单克隆细胞团，用玻璃针刮下来放置24孔培养板中，加入培养基获得IPEC-J2-SAM单克隆细胞系。
1.2IPEC-J2-SAM单克隆细胞系的验证
1.2.1利用qPCR检测激活元件dCas9-VP64和MS2-HSF1-P65在单克隆细胞IPEC-J2-SAM中的表达
(1)按Omega公司总RNA提取试剂盒(R6834-01)的操作说明书提取野生型细胞IPEC-J2和单克隆细胞IPEC-J2-SAM的总RNA。
(2)测得RNA浓度后，按艾科瑞生物公司反转录试剂盒(AG11705)的操作说明书将RNA反转录成cDNA。
(3)cDNA经RNase Free H2O 5倍稀释后，qPCR检测两种激活元件的表达水平。
cDNA样本通过Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪进行扩增，检测不同样本中特定基因表达的差异，同时设置内参基因β-actin作为对照，每个样本设置3个复孔。三步法的扩增反应条件为：预变性95℃4min，循环反应为变性95℃5sec，退火60℃20sec，延伸72℃20sec，并收集荧光信号，共进行40个循环，最后延伸72℃2min。65℃-95℃升温，升温速度0.5℃/5sec以检测融解曲线。所使用的体系(Takara，RR820Q)和引物分别见表1和2。
表1qPCR扩增体系
表2qPCR引物
qPCR分别检测单克隆细胞IPEC-J2-SAM和野生型细胞IPEC-J2中激活元件dCas9-VP64和MS2-HSF1-P65的表达。两种激活元件dCas9-VP64和MS2-HSF1-P65在单克隆细胞系IPEC-J2-SAM中均可高效表达(如下表)，说明单克隆细胞IPEC-J2-SAM已构建成功。
SAM系统元件在IPEC-J2-SAM细胞系中的表达
1.2.2单克隆细胞IPEC-J2-SAM可激活内源基因表达的验证
随机选取一个猪基因B4GALNT2(Gene ID:100621328)，根据其序列设计4条gRNA，分别转入单克隆细胞IPEC-J2-SAM后确认该基因的激活效果，以验证构建的单克隆细胞IPEC-J2-SAM能否有效激活猪内源基因的表达。
(1)gRNA的设计：选择需要gRNA靶向基因位置的部分序列，使用http://crispr.mit.edu/，http://crispr.cos.uni-heidelberg.de/index.html和http://www.rgenome.net/cas-database/网站进行设计。激活B4GALNT2基因的gRNA序列见表3。
(2)将公司合成的gRNA稀释为100nM后，互补序列各取5μL混合。
(3)将混合液上PCR仪器，退火得到双链gRNA。程序如下：95℃，10min，65℃，40min，10℃，10min。
(4)将lentigRNA(MS2)_puro backbone载体(Addgene，73795)使用BbsI或BsmbI酶切回收后，使用T4连接酶将gRNA与载体连接。
(5)转化载体到DH5α，涂平板，挑单克隆菌落送往测序验证。
(6)阳性菌落测序鉴定正确后，扩繁菌液，按TIANGEN公司的质粒小提试剂盒(DP103)的操作说明书提取质粒。
(7)按NEOFECT公司的DNA转染试剂(TF201201)的操作说明书利用辅助质粒psPax2(Addgene，12260)、pMD2.G(Addgene，12259)，以及上一步中得到的质粒进行慢病毒包装。
(8)将相同数量及适量的实验组细胞(IPEC-J2-SAM)和对照组细胞(IPEC-J2)接种到6孔板中，5％CO2、37℃培养箱培养。24h后，使用适量上一步中得到的慢病毒感染实验组细胞，空载(lentigRNA(MS2)_puro backbone)包装得到的慢病毒感染对照组细胞。48h后，使用嘌呤霉素(3μg/mL)持续筛选7天。
(9)收集细胞提取RNA并利用qPCR检测B4GALNT2基因在实验组细胞和对照组细胞中的表达，具体操作见实施例1中2.1部分，所使用的引物见表3(内参基因为猪的β-actin，序列见表2)。
表3 B4GALNT2基因的gRNA序列和qPCR引物
qPCR结果如图1所示，与对照组相比，实验组细胞中B4GALNT2基因均被显著激活，故IPEC-J2-SAM单克隆细胞系可有效激活内源基因表达，能够用于后续的PJA1基因激活细胞的制备。
实施例2：
PJA1基因激活细胞的构建及验证：
目的基因PJA1基因序列的NCBI号为NC_010461.5，具体为SEQ ID NO.1所示，编码SEQ ID NO.2所示蛋白。PJA1基因激活细胞的构建和验证的具体操作，可参见实施例1中B4GALNT2基因的构建和基因激活效果检测，所使用的gRNA序列及qPCR引物见表4。
表4 PJA1基因的gRNA序列和qPCR引物
PJA1基因激活的qPCR结果如图2所示，与对照组相比，实验组细胞中PJA1基因被显著激活，故PJA1基因激活细胞构建成功。
实施例3：
PJA1基因激活细胞对PEDV增殖的作用检测
3.1利用相对定量检测PJA1基因激活细胞对PEDVM mRNA的抑制效果。
将相同数量及适量的实验组PJA1激活细胞(图中PJA1)和对照组细胞(图中NTC)接种到6孔板中，5％CO2、37℃培养箱培养。24h后弃培养基并用DMEM洗2遍，加入PEDV(MOI＝0.1，YN144毒株，GenBank accession:KT02123)混匀，37℃孵育1h后，再加入1mL DMEM+10％FBS完全培养基，继续培养24h。随后的收样及qPCR操作步骤与实施例1相同，所使用的PEDVM基因的qPCR引物见表5(内参基因为猪的β-actin，序列见表2)。
表5PEDVM基因的qPCR引物
结果发现，在24h时，PEDVM基因的表达量在实验组中显著降低(图3中A)，说明在IPEC-J2细胞中激活PJA1基因后显著抑制了PEDV的增殖。
3.2利用绝对定量检测PJA1基因激活细胞对PEDV M基因拷贝数的抑制效果
将相同数量及适量的实验组PJA1激活细胞(图中PJA1)和对照组细胞(图中NTC)接种到6孔板中，5％CO2、37℃培养箱培养。24h后弃培养基并用DMEM洗2遍，加入PEDV(MOI＝0.1，YN144毒株，GenBank accession:KT02123)混匀，37℃孵育1h后，再加入1mL DMEM+10％FBS完全培养基，继续培养。在感染后24h后收获上清，将样品在4℃下以1000g离心10分钟以去除细胞碎片。按照Omega公司病毒RNA提取试剂盒(R6874)的操作说明书提取总RNA，进行绝对定量分析PEDV M基因的拷贝数。所使用的绝对定量体系(Bio-Rad，1725132)见表6、引物序列见表5、探针序列为FAM-TTCGTCACAGTCGCCAAGG-TAMRA。
表6绝对定量扩增体系
结果发现，在24h时，实验组PJA1激活细胞上清液中PEDV M基因的拷贝数显著降低(图3中B)，说明在IPEC-J2细胞中激活PJA1基因后显著抑制了PEDV的增殖。
Claims (3)
1. 激活猪PJA1基因表达的制剂在制备抗PEDV感染药物中的应用，所述的PJA1基因为编码SEQ ID NO.2所示蛋白的基因；所述的激活的方法为CRISPR/SAM，所述的激活猪PJA1基因表达的制剂为gRNA：GACCCGCCCCCTTGATGTGG。
2. 根据权利要求1所述的应用，所述的PJA1基因为SEQ ID NO.1所示。
3. 一种抗 PEDV感染的细胞模型，其特征在于包含有激活猪PJA1基因的表达制剂，所述的PJA1基因为编码SEQ ID NO.2所示蛋白的基因，所述的表达制剂为包含以下序列的gRNA质粒载体：GACCCGCCCCCTTGATGTGG，所述模型的构建方法为CRISPR/SAM。
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