CN117417432B - 红鳍东方鲀生长激素及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及红鳍东方鲀生长激素及其应用。利用酵母真核表达系统表达出红鳍东方鲀GH，外源GH显著提高了红鳍东方鲀稚鱼免疫相关基因的表达，在红鳍东方鲀稚鱼特异性免疫和非特异性免疫两方面均发挥了积极作用。外源GH可以促进红鳍东方鲀稚鱼的生长，肠道菌群的研究表明外源GH对红鳍东方鲀稚鱼肠道菌群组成有一定影响，这种影响对红鳍东方鲀稚鱼的生长及免疫力均有促进作用。

Description

红鳍东方鲀生长激素及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及红鳍东方鲀生长激素及其应用。

背景技术

鱼类生长激素（Growth Hormone，GH）是由鱼类脑垂体合成和分泌的一种分子量在22KDa左右的多肽蛋白，可以促进鱼类的生长、发育并参与多种代谢作用。近年来关于鱼类生长激素的报道越来越多，在水产行业中为鱼类提供外源的GH被认为是促进鱼类生长的很好的选择。大量的实验数据表明利用基因工程获得的外源GH在鱼体内具有代偿内源GH的功能。因此可以大大提高鱼体的生长速度。同时GH所具有的免疫、生殖等调节功能也会给鱼类带来更多的积极作用。

鱼类GH在各种表达系统中均获得成功表达。红鳍东方鲀，俗称河鲀，是一种名贵鱼类。2014年，世界自然保护联（IUCN）将红鳍东方鲀列入濒危物种红色名录，人工养殖成为保护资源和市场需求的必然趋势。

因而，研究外源GH对红鳍东方鲀的影响具有重要意义，并能为其育苗和养殖带来巨大效益。

因此，提供一种生长激素基因工程表达菌株并应用于红鳍东方鲀具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了红鳍东方鲀生长激素及其应用。

本发明提供了红鳍东方鲀生长激素及其应用。利用酵母真核表达系统表达出红鳍东方鲀GH，外源GH显著提高了红鳍东方鲀稚鱼免疫相关基因的表达，在红鳍东方鲀稚鱼特异性免疫和非特异性免疫两方面均发挥了积极作用。外源GH可以促进红鳍东方鲀稚鱼的生长，肠道菌群的研究表明外源GH对红鳍东方鲀稚鱼肠道菌群组成有一定影响，这种影响对红鳍东方鲀稚鱼的生长及免疫力均有促进作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了红鳍东方鲀鱼GH，具有：

（Ⅰ）、如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或

（Ⅱ）、在如（Ⅰ）所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或

（Ⅲ）、与如（Ⅰ）所示的氨基酸序列具有至少80%序列同源性的氨基酸序列。

本发明还提供了编码所述红鳍东方鲀鱼GH的基因。

在上述研究的基础上，本发明还提供了表达载体，包括所述基因。

在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体具有：

（1）、如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或

（2）、与（1）所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与（1）所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

（3）、与（1）或（2）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与（1）或（2）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

（4）、与（1）~（3）任一项所述核苷酸序列具有至少80%序列同源性的核苷酸序列。

本发明还提供了宿主，包括如下任意项：

（Ⅰ）、所述红鳍东方鲀鱼GH；和/或

（Ⅱ）、所述基因；和/或

（Ⅲ）、所述表达载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述宿主包括大肠杆菌、毕赤酵母GS115或卤虫。

本发明还提供了红鳍东方鲀GH基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

步骤1：根据红鳍东方鲀GH核酸序列设计引物；

步骤2：PCR扩增红鳍东方鲀GH基因与载体连接，得到表达载体；

步骤3：将所述表达载体转入宿主中，培养筛选验证；

所述PCR扩增的引物组具有：

（Ⅰ）、上游引物具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；和

（Ⅱ）、下游引物具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；或

（Ⅲ）、与（Ⅰ）或（Ⅱ）所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与（Ⅰ）或（Ⅱ）所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

（Ⅳ）、与（Ⅰ）~（Ⅲ）任一项所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与（Ⅰ）~（Ⅲ）任一项所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

（Ⅴ）、与（Ⅰ）~（Ⅳ）任一项所述核苷酸序列具有至少80%序列同源性的核苷酸序列；

所述宿主包括毕赤酵母GS115。

在本发明的一些具体实施方案中，所述验证采用的引物具有：

（Ⅰ）、上游引物具有如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；和

（Ⅱ）、下游引物具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；或

（Ⅲ）、与（Ⅰ）或（Ⅱ）所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与（Ⅰ）或（Ⅱ）所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

（Ⅳ）、与（Ⅰ）~（Ⅲ）任一项所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与（Ⅰ）~（Ⅲ）任一项所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

（Ⅴ）、与（Ⅰ）~（Ⅳ）任一项所述核苷酸序列具有至少80%序列同源性的核苷酸序列。

本发明还提供了如下任意项在促进红鳍东方鲀生长发育和/或提高红鳍东方鲀免疫力中的应用：

（Ⅰ）、所述红鳍东方鲀鱼GH；和/或

（Ⅱ）、所述基因；和/或

（Ⅲ）、所述表达载体；和/或

（Ⅳ）、所述宿主。

在本发明的一些具体实施方案中，所述提高红鳍东方鲀免疫力包括上调IGF、IGFR、GHR和/或Pbx1基因。

在本发明的一些具体实施方案中，所述提高红鳍东方鲀免疫力包括提高特异性免疫力和非特异性免疫力。

在本发明的一些具体实施方案中，所述提高特异性免疫力包括上调IgM、RAG1、NFATc3、Mall和/或TNF-α基因；

所述提高非特异性免疫力包括上调MR1、Hsp70、BPI、Cathepsins-L、C5、C9和/或Hepcidin基因。

在本发明的一些具体实施方案中，所述提高红鳍东方鲀免疫力包括激活免疫相关信号通路；

所述免疫相关信号通路包括细胞凋亡、抗原加工和递呈、补体途径、Toll-like受体信号通路、B细胞受体信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、T细胞受体信号通路、Jak-STAT信号通路、NOD-like受体信号通路和/或NF-κB信号通路。

本发明还提供了产品，包括如下任意项以及药学上可接受的辅料或助剂：

（Ⅰ）、所述红鳍东方鲀鱼GH；和/或

（Ⅱ）、所述基因；和/或

（Ⅲ）、所述表达载体；和/或

（Ⅳ）、所述宿主。

在本发明的一些具体实施方案中，所述产品包括饲料、生长促进剂或提高免疫功能制剂。

在本发明的一些具体实施方案中，所述饲料为卤虫。

本发明还提供了促进红鳍东方鲀生长发育和/或提高红鳍东方鲀免疫力的方法，包括向红鳍东方鲀施用如下任意项：

（Ⅰ）、所述宿主；和/或

（Ⅱ）、所述产品。

本发明提供了红鳍东方鲀生长激素及其应用。利用酵母真核表达系统表达出红鳍东方鲀GH，外源GH显著提高了红鳍东方鲀稚鱼免疫相关基因的表达，在红鳍东方鲀稚鱼特异性免疫和非特异性免疫两方面均发挥了积极作用。外源GH可以促进红鳍东方鲀稚鱼的生长，肠道菌群的研究表明外源GH对红鳍东方鲀稚鱼肠道菌群组成有一定影响，这种影响对红鳍东方鲀稚鱼的生长及免疫力均有促进作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例1中研究外源GH对红鳍东方鲀免疫和生长的影响采用的技术方案；

图2示实施例1中重组质粒构建示意图；

图3示效果例1中红鳍东方鲀脑垂体RNA；

图4示效果例1中重组质粒pGAPZA-TrGH PCR鉴定；注：M：DNAMarker；1-10：重组质粒；

图5示效果例1中重组质粒pGAPZA-TrGH测序结果；

图6示效果例1中重组质粒电击转入酵母；注：A：导入重组质粒的酵母；B：未导入重组质粒的酵母；

图7示效果例1中酵母重组子的高抗筛选；注：A-D：YPD平板含博来霉素浓度分别为：100μg/mL、300μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL；

图8示效果例1中pGAPZA-TrGH蛋白表达WesternBlot检测结果；其中，对照示空酵母的WesternBlot检测结果；1示菌株 1的WesternBlot检测结果 ；2示菌株2的WesternBlot检测结果；

图9示效果例2中差异基因火山图；其中，A示短期试验中，全鱼组织差异基因火山图；B示长期试验中，全鱼组织差异基因火山图；横轴为基因在不同组样本间的表达差异倍数fold-change(log(B/A))值，纵轴为代表基因表达量变化的统计学显著程度pValue，pValue越小，-log(pValue)越大，差异越显著；图中每个点代表一个基因，其中红色表示上调基因，绿色表示下调基因，黑色表示非差异基因；

图10示效果例2中生长相关基因在不同时段的相对表达量(短期实验)；其中，A为生长激素受体基因GHR、B为胰岛素样生长因子IGF、C为胰岛素样生长因子受体IGFR、D为转录因子PBX1；注：*表示差异显著(p＜0.05)，**表示差异极显著(p＜0.01)；

图11示效果例2中特异性免疫基因在不同时段的相对表达量(短期实验)；其中，A为重组激活基因rag-1、B为免疫球蛋白IgM、C为肿瘤坏死因子IFN-α、D为转录因子NFATc3、E为MALL基因；

图12示效果例2中非特异性免疫基因在不同时段的相对表达量(短期实验)；其中，A为信号转导基因MR1、B为热休克蛋白Hsp70、C为BP1基因、D为组织蛋白酶Cathepsin-L；

图13示效果例2中生长相关基因在不同时段的相对表达量(长期实验)；其中，A为生长激素GH、B为生长激素受体GHR、C为胰岛素样生长因子IGF；

图14示效果例2中特异性免疫基因在不同时段的相对表达量(长期实验)；其中，A为免疫球蛋白IgM、B为肿瘤坏死因子IFN-α、C为重组激活基因rag-1；

图15示效果例2中非特异性免疫基因在不同时段的相对表达量(长期实验)；其中，A为补体因子5、B为补体因子9、C为抗菌肽hepcidin；

图16示效果例3中GH处理对红鳍东方鲀稚鱼消化道门水平菌群相对丰富度的影响；

图17示效果例3中GH处理对红鳍东方鲀稚鱼消化道属水平菌群相对丰富度的影响(平均值±SEM，n=3)；

图18示效果例3中红鳍东方鲀稚鱼不同组织石蜡切片HE染色结果图；注：A：实验组肝；B：对照组肝；C：实验组鳃；D：对照组鳃；E：实验组肠；F：对照组肠。

具体实施方式

本发明公开了红鳍东方鲀生长激素及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明使用的巴斯德毕赤酵母本身无毒无害并且还可以作为水产养殖中的生物饵料。选择胞内表达型的酵母能更好的将胞内蛋白传递到鱼体中，且在传递过程中不易被外界因素所干扰。其次毕赤酵母可以进行大规模高密度发酵，便于在实际生产中应用。

因而，研究外源GH对红鳍东方鲀免疫及生长的影响，可对实际养殖提供可信的材料。此外，研究外源GH对免疫及生长的影响还可以提高在养殖过程中的存活率以及生长速率，能够为红鳍东方鲀育苗的和养殖带来巨大效益。

本发明研究了外源GH对红鳍东方鲀免疫及生长的影响，并提供实际养殖的材料。

本发明所用材料如下：

1、实验材料

1.1 实验原料、菌株和质粒

红鳍东方鲀脑垂体组织存于-80℃超低温冰箱。

大肠杆菌DH5α：海南热带海洋学院崖州湾创新研究院水产南繁种业创新中心实验室保存。毕赤酵母GS115：海南热带海洋学院崖州湾创新研究院水产南繁种业创新中心。

pGAPZ-A载体：购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

红鳍东方鲀鱼GH的氨基酸序列（SEQ ID No.1）：

MQPLTDTPRLFSMAVSRVQHLHLLAQRLFADFESSLQTDEQRQLNKKFLPFCNSDSIISPNDKHETQRSSVLKLLSISYRLIESWDFPSLSLSGGLSPKLSDLKTGILLLIKASQDGADMFSESTTLQLGPYENYYQNLGGEEPLKRTYELLTCFKKDMHKVETYLTVAKCRLSPEANCTLEQKLISEEDLLEMQPLTDTPRLFSMAVSRVQHLHLLAQRLFADFESSLQTDEQRQLNKKFLPFCNSDSIISPNDKHETQRSSVLKLLSISYRLIESWDFPSLSLSGGLSPKLSDLKTGILLLIKASQDGADMFSESTTLQLGPYENYYQNLGGEEPLKRTYELLTCFKKDMHKVETYLTVAKCRLSPEANCTLEQKLISEEDLGTM

本发明构建的双GH表达核苷酸序列（SEQ ID No.2），带有3个MYC标签，可以用于后续纯化和检测

GGGAAGCGACAAGACTTTAATTTAATTTATTTGTCCCTATTTCAATCAATTGAACAACTATTTCGAAACGAGGAATTCATGCAGCCACTTACAGACACTCCACGTTTGTTCTCCATGGCTGTGAGCAGGGTTCAACACCTCCACCTGCTTGCTCAGAGACTTTTCGCAGATTTTGAGAGTTCCCTGCAAACCGATGAGCAGCGACAGCTTAACAAAAAATTCCTCCCTTTCTGCAACTCCGATTCCATCATCAGCCCCAATGATAAACACGAGACCCAGCGTAGTTCGGTCCTCAAGCTATTGTCCATTTCCTATCGACTGATTGAGTCTTGGGATTTTCCCAGTCTTTCTCTCTCTGGTGGGCTTTCACCAAAACTGTCTGACCTGAAGACAGGTATCTTACTTCTCATCAAGGCCAGTCAGGATGGAGCTGATATGTTTTCTGAGAGCACAACTCTTCAGCTAGGTCCCTATGAAAACTATTATCAAAATCTGGGAGGAGAGGAGCCACTGAAAAGAACATATGAACTTTTAACATGTTTTAAGAAGGACATGCACAAGGTGGAGACCTACCTAACTGTTGCCAAATGTAGACTCTCTCCTGAAGCCAACTGCACTCTTGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGCTCGAGATGCAGCCACTTACAGACACTCCACGTTTGTTCTCCATGGCTGTGAGCAGGGTTCAACACCTCCACCTGCTTGCTCAGAGACTTTTCGCAGATTTTGAGAGTTCCCTGCAAACCGATGAGCAGCGACAGCTTAACAAAAAATTCCTCCCTTTCTGCAACTCCGATTCCATCATCAGCCCCAATGATAAACACGAGACCCAGCGTAGTTCGGTCCTCAAGCTATTGTCCATTTCCTATCGACTGATTGAGTCTTGGGATTTTCCCAGTCTTTCTCTCTCTGGTGGGCTTTCACCAAAACTGTCTGACCTGAAGACAGGTATCTTACTTCTCATCAAGGCCAGTCAGGATGGAGCTGATATGTTTTCTGAGAGCACAACTCTTCAGCTAGGTCCCTATGAAAACTATTATCAAAATCTGGGAGGAGAGGAGCCACTGAAAAGAACATATGAACTTTTAACATGTTTTAAGAAGGACATGCACAAGGTGGAGACCTACCTAACTGTTGCCAAATGTAGACTCTCTCCTGAAGCCAACTGCACTCTTGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGGGTACCATGCAGCCACTTACAGACACTCCACGTTTGTTCTCCATGGCTGTGAGCAGGGTTCAACACCTCCACCTGCTTGCTCAGAGACTTTTCGCAGATTTTGAGAGTTCCCTGCAAACCGATGAGCAGCGACAGCTTAACAAAAAATTCCTCCCTTTCTGCAACTCCGATTCCATCATCAGCCCCAATGATAAACACGAGACCCAGCGTAGTTCGGTCCTCAAGCTATTGTCCATTTCCTATCGACTGATTGAGTCTTGGGATTTTCCCAGTCTTTCTCTCTCTGGTGGGCTTTCACCAAAACTGTCTGACCTGAAGACAGGTATCTTACTTCTCATCAAGGCCAGTCAGGATGGAGCTGATATGTTTTCTGAGAGCACAACTCTTCAGCTAGGTCCCTATGAAAACTATTATCAAAATCTGGGAGGAGAGGAGCCACTGAAAAGAACATATGAACTTTTAACATGTTTTAAGAAGGACATGCACAAGGTGGAGACCTACCTAACTGTTGCCAAATGTAGACTCTCTCCTGAAGCCAACTGCACTCTTGGGCCCGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGAGTTTTAGCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTACGAGAAGACCGTCTGCTGATTCGCC

1.2 培养基

表1 本实验所用培养基

1.3 引物

实验所需引物，均由上海生工生物技术服务有限公司进行合成(表2)

表2 本实验所用引物

说明：下划线部分为引入的酶切位点。

GGTACC：KpnⅠ；GGGCCC：ApaⅠ

用Primer Premier 6.0设计荧光定量引物(表3)。

1.4 实验仪器

表4 本实验所用仪器

1.5 实验试剂

表5 本实验所用试剂

1.6 实验用鱼及原材料

红鳍东方鲀12日龄稚鱼300尾购自大连天正公司。

卤虫休眠卵：海南热带海洋学院崖州湾创新研究院水产南繁种业创新中心实验室保存。

本发明提供的红鳍东方鲀生长激素及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：红鳍东方鲀生长激素酵母表达系统的建立

本发明采用的技术方案如图1所示。

1、RNA提取与cDNA获得

参考Trizol使用说明对红鳍东方鲀脑垂体组织样品提取总RNA，操作步骤如下：

(1)在装有脑垂体组织(＜100mg)的离心管中加入300μLTrizol试剂，使用电动匀浆器匀浆(冰上操作)至无明显大颗粒后，加入700μLTrizol试剂，混匀后室温放置5-10min，使得核蛋白与核酸完全分离；

(2)12000rpm 4℃离心 10min，取上清转移至干净的无酶离心管中，加入200μL冰上预冷的氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min后12000 rpm 4℃离心 10min；

(3) 吸取上层水相转移至干净的无酶离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20min；

(4)12000rpm 4℃离心 10min，弃上清；

(5)加入1mL75%乙醇洗涤。12000 rpm 4℃离心3min。弃上清(重复一次)。室温干燥5-10min；

(6)加入30-50μL RNase-free ddH₂O，充分溶解RNA。将所得RNA溶液置于-80℃超低温冰箱中或立刻用于后续实验；

(7)所得RNA溶液用微量分光光度仪测定其纯度和浓度，琼脂糖凝胶检测RNA完整性以及基因组污染情况。

按照FastKing RT Kit 反转录试剂盒说明书进行反转录，操作步骤如表6：

表6

反应条件：42℃，15min，去除基因组及反转录；95℃，3min，酶灭活。并与-20℃保存用于后续实验。

2、TrGH基因表达载体的构建与验证

2.1 TrGH基因表达载体的构建

TrGH基因载体构建如图2所示：

据NCBI网站GeneBank数据库中红鳍东方鲀GH核酸序列设计引物，并在引物中引入KpnI和ApaI两个酶切位点，最终得到设计的引物TrGH-F和TrGH-R。以本实施例1所得的cDNA为模板进行PCR反应扩增得到含有酶切位点的目的基因，并对其进行回收。将回收后的TrGH片段和pGAPZ-A载体质粒用KpnI和ApaI限制性内切酶进行双酶切，反应体系如表7。

表7 双酶切反应体系

将上述反应体系混匀后于置于PCR仪中25℃ 15min，65℃热失活20min完成双酶切并进行回收。按照载体质粒∶插入片段1∶3的比例用T4连接酶12℃温育15min，反应体系如表8。

表8 连接反应体系

热激法将上述10μL反应液转入大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞中，转化成功的大肠杆菌细胞能够在含有博莱霉素的LB培养基上生长。

2.2 TrGH基因表达载体的验证

对转化成功的大肠杆菌进行后续验证：(1)使用通用引物pGAP-F/3´ AOX1(表2)对菌液进行PCR验证；(2)将PCR验证验证正确的阳性菌落送样测序，测序引物为pGAP-F/3´AOX1。将两个检验步骤验证均正确的重组质粒命名为pGAPZA-TrGH。

3、表达载体的转化

3.1 pGAPZA-TrGH 质粒线性化

按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒后用BspHⅠ限制性内切酶将质粒线性化。反应体系如表9：

表9 线性化反应体系

将上述反应体系混合均匀后置于PCR仪器37℃孵育2h，使用PCR＆DNA纯化试剂盒回收线性化质粒。

3.2 重组质粒电击转化毕赤酵母 GS115

用作电转的酵母GS115感受态制作方法如下：

(1)将毕赤酵母GS115在YPD平板上划线，30℃恒温培养箱中培养两天；

(2)挑取单菌落接种于10mLYPD液体培养基中，30℃ 200rpm培养过夜；

(3)以1%接种量转接至500mLYPD液体培养基中，30℃ 200rpm培养至OD₆₀₀=1.3-1.5；

(4) 收集菌液4℃ 5000rpm离心5min，弃上清，500mL预冷的无菌去离子水重悬菌体；

(5)重悬菌体4℃ 5000rpm离心5min，弃上清，250mL预冷的无菌去离子水重悬菌体；

(6)重悬菌体4℃ 5000rpm离心5min，弃上清，20mL预冷的1M山梨醇重悬菌体；

(7)重悬菌体4℃ 5000rpm离心5min，弃上清，加入1mL预冷的1M山梨醇，按80μL/管进行分装。

酵母感受态需要现做现用，如-80℃冻存后，感受态的转化效率可能会大大降低。电转方法如下：

(1)取80μLGS115感受态细胞与5-20μg线性化pGAPZA-TrGH质粒混合，转入预冷的0.2cm电转杯中；

(2)冰上静止5min；

(3)电击参数设置：电压1500V，电容25μF，电阻400Ω，设置完毕后进行电击；

(4)电击结束后立即加入1mL预冷的1M山梨醇，之后转入灭菌管中。

4、酵母重组子的高抗筛选及表达

4.1 酵母重组子的高抗筛选

将上述电击后的菌液置于30℃恒温培养箱中孵育2h，将孵育后的菌液涂布在含100μg/mL盐酸博来霉素的YPD平板上，30℃倒置培养3天。之后分别使用200μg/mL、500μg/mL和1000μg/mL的盐酸博来霉素YPD平板进行高抗筛选，以此筛选出多拷贝菌株。为了对重组酵母里所导入的目的基因是否正确进行进一步的验证，对上述方法所得到的重组酵母pGAPZA-TrGH用YPD液体培养基进行扩大培养，提取重组酵母中的全基因组(参照酵母基因组DNA提取试剂盒说明书进行，天根公司)，使用pGAP-F和3´AOX1引物进行PCR反应。并进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果正确的送至生工生物工程有限公司进行测序。

4.2 酵母重组子的表达

挑取验证正确的单一菌落接种于10mL YPD液体培养基中，30℃ 200rpm培养过夜，以1%接种量转接至100mL YPD液体培养基中，30℃ 200rpm培养72h，每24h向培养基中添加1%葡萄糖10mL以此补充培养基中的碳源。收集培养的菌体分装后离心并存于-80℃冰箱用作后续实验

收集菌体使用一步法酵母活性蛋白提取试剂盒提取蛋白，步骤如下：

(1)5000rpm室温离心2min，收集酵母菌，弃掉上清；

(2)向每50mg湿重的菌体中加入500μL的提取试剂(每毫升的提取试剂加入1μL的蛋白酶抑制剂和20μL DTT，10μL PMSF)，用枪头反复吹打均匀；

(3)盖上离心管盖子，放置在摇床上280rpm室温震荡20min；

(4)13000 rpm (15000 g)离心15min，收集酵母细胞碎片，将上清转移到一个新的离心管中，作为可溶性蛋白质部分，重复步骤2-4，合并两次所取得的上清，用于后续实验。

蛋白质产物通过蛋白质印迹(WB)或质谱进行验证。本实验真核细胞表达的融合蛋白携带Myc标签，可作为检测目的蛋白的抗体标签。因此本研究进行WB以鉴定蛋白质产物，详细操作见《分子生物学技术手册》。

效果例1：红鳍东方鲀生长激素酵母表达系统的建立

1、TrGH 基因表达载体的构建与验证

1.1 TrGH 基因的获得

从红鳍东方鲀脑垂体组织中提取RNA时，若组织存放不当会影响RNA提取效果，因此组织应妥善保存在-80℃中或采用新鲜样品。如图3所示，提取的RNA 28S和18S RNA条带清晰可见，拖尾少完整度好，A260/A280数值为1.991，A260/A230数值为2.183纯度较好，浓度为808.4ng/μL，可用作下一步反转录实验使用。

2.1 重组质粒的验证

将pGAPZ-A载体与TrGH目的基因连接构建重组质粒，挑取10株菌落，用通用引物pGAP-F/3´AOX1进行菌落PCR鉴定获得片段大小均为700bp左右的DNA片段，与预期

扩增片段大小621bp相符(图4)。菌液测序结果均与目的基因序列一致，且无移码突变(图5)。表明pGAPZA-TrGH 重组载体构建成功。

2、毕赤酵母重组子的转化

重组质粒电击导入毕赤酵母GS115

由于pGAPZA载体具有Zeocin(博来霉素)的筛选标记，因此成功导入重组质粒的毕赤酵母GS115可以在含有博来霉素的YPD平板上生长，如图6中的A和图6中的B所示，经电转的毕赤酵母GS115可在含博来霉素的YPD平板上生长，而未经电转的毕赤酵母GS115无法生长。结果表明重组质粒成功导入毕赤酵母GS115中。

3、酵母重组子的高抗筛选及表达

3.1 酵母重组子的高抗筛选

通过100μg/mL、300μg/mL、500μg/mL和1000μg/mL的盐酸博来霉素YPD平板的高抗筛选，可以筛选得到高抗性的菌株，如图7所示，最终在1000μg/mL的盐酸博来霉素YPD平板得到了若干株高抗性菌株。

3.2 酵母重组子的表达

WB鉴定蛋白质产物结果如下(图8)：对照组空酵母未检测出条带，菌株1也未检测出条带，菌株2检测出大小为25KDa的条带与预期蛋白大小相符，成功表达出TrGH蛋白，表明酵母重组子表达成功。因此菌株2用作后续实验。

本效果例运用基因工程及分子生物学手段成功建立了TrGH酵母真核表达系统，获得了若干阳性菌株。通过100μg/mL、300μg/mL、500μg/mL和1000μg/mL的盐酸博来霉素YPD平板的高抗筛选，最终在1000μg/mL的盐酸博来霉素YPD平板筛选到若干高抗性菌株。WB检测出菌株2蛋白产物的大小约为25kDa，与TrGH蛋白大小相符，表明本效果例酵母表达系统成功表达出了TrGH。

实施例2：转录组分析及免疫相关基因表达影响

1、重组酵母菌的大量发酵

将实施例1中筛选得到的重组酵母进行扩大培养,具体操作如下：

(1)将重组酵母在 YPD 平板上划线， 30℃恒温培养箱中培养两天；

(2)挑取单菌落接种于 10mLYPD 液体培养基中， 30℃ 200rpm 培养过夜；

(3)以 1%接种量转接至 500mLYPD 液体培养基中， 30℃ 200rpm 培养 72h，每24h 向培养液中添加 50mL1%葡萄糖；

(4)培养结束后离心收集并分装菌体，存于-80℃冰箱用于后续实验。 以同样的方法对普通的毕赤酵母 GS115 也进行扩大培养并收集菌体。

2、饲养实验

2.1 卤虫的营养强化

称10g卤虫卵，放入10L盐度为15‰的水中，连续光照，水温28℃，并充气孵化24h后去卵壳收集卤虫无节幼体。采用直接强化的方法，将重组酵母菌体准确称重直接溶于卤虫养殖水体中，对照组的卤虫投喂普通的毕赤酵母GS115。强化密度为每毫升水体100个卤虫，酵母用量为100g/m³。强化6h后，将各组卤虫用筛绢网过滤，冲洗后分别投喂给相应的红鳍东方鲀稚鱼。

2.2 红鳍东方鲀稚鱼的投喂

短期饲养实验：试验分为实验组，投喂实施例1筛选到的重组酵母强化后的卤虫；对照组，投喂普通毕赤酵母强化后的卤虫。每组设3个重复。实验挑选活力较好的稚鱼分配于6个20L水体的观赏鱼缸中，每缸50尾，暂养1d后正式开始实验。为研究短期内外源GH对红鳍东方鲀的影响，投喂实验设计如下：(1)实验组每天在7点和16点投喂两次，第一次投喂重组酵母强化后的卤虫，此后均投喂普通酵母强化后的卤虫；(2)对照组同样每天7点和16点投喂两次，投喂均为普通酵母强化后的卤虫；

(3)投喂卤虫的量约为10个/mL。实验期间水温18℃，溶氧9-10mg/L，盐度32‰。

长期饲养实验：饲养方法如下：(1)实验组每天在7点和16点投喂两次重组酵母强化后的卤虫(2)对照组同样每天7点和16点投喂两次普通酵母强化后的卤虫；(3)投喂卤虫的量约为10个/ml。(4)实验进行30d。实验期间水温18℃，溶氧9-10mg/L，盐度32‰。

3、取样

本实验中由于所用稚鱼个体较小难以分类取样，因此采用去除肠、尾部及多余肌肉后的全鱼进行试验。

短期试验取样：实验进行3d，分别在第一次投喂后的6h、12h、24h、48h、72h取样。每缸随机挑选3尾鱼，由于稚鱼太小因此每3尾鱼为一组做混合样处理。使用MS-222进行麻醉，待鱼麻醉后取肠、以及去除尾部后的全鱼。详见表10。实验组对照组相同，每组三个平行。

表10 试验取样(短期试验)

长期试验取样：本实施例中短期试验取样的步骤。

详见表 11。实验组对照组相同，每组三个平行。

表11

4、RNA 提取

短期试验：提取样品详见表10；长期试验：提取样品详见表11 。RNA 提取方法同实施例1中的1。

5、RNA-Seq测序

取纯度和完整性均符合要求的RNA样品各10μg，送至上海生工生物有限公司进行转录组测序，剩余样品进行反转录，以备后续测序结果验证。

5.1文库构建

1.利用Qubit RNA检测试剂盒对Total RNA精确定量，以确定文库构建所加入Total RNA 的量；

2.mRNA纯化和片段化；

3.双链cDNA合成；

4.双链cDNA纯化；

5.末端修复/dA尾添加；

6.街头拼接；

7.连接产物纯化及片段大小分选；

8.文库的扩增。

检测构建文库的质量，利用Qubit DNA 检测试剂盒对回收的 DNA 精确定量，以方便按照1:1的比例等量混合后进行测序。

5.2 cDNA文库上机测序

利用Illumina HiseqTM进行测序，得到的原始图像数据文件经CASAVA碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列(Sequenced Reads)，我们称之为Raw Data或RawReads，结果以FASTQ(简称为fq)文件格式存储，其中包含测序序列(reads)的序列信息以及其对应的测序质量信息。

6、测序结果分析

利用生物信息学工具对文库测序结果进行分析，主要包括数据评估及质控、RNAseq测序评估、基因结构分析、表达水平分析、差异表达分析、基因富集分析。分析方法及文献详见wapRNA。

7、RT-qPCR验证及免疫相关基因表达分析

为了验证转录组数据的可靠性以及相关基因表达的变化情况，我们采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的方法对差异表达基因进行验证分析。所选基因为转录组数据中免疫和生长相关的差异表达基因以及除转录组外若干免疫和生长相关的代表基因(表12，13)。

表12 免疫相关差异表达基因(短期试验)

表13 免疫相关差异表达基因(长期试验)

用 Primer Premier 6.0 设计荧光定量引物(表3)

反应体系如表14。反应程序：95℃ 10 分钟； 95℃ 15 s ，60℃ 1min，40个循环。反应结束后分析溶解曲线保证每个反应得到单一的PCR扩增产物。以β-ACTIN作为内参基因，使用2^－ΔΔCT法计算不同样品中各基因的相对表达量。

表14 荧光定量反应体系

8、计算及数据处理

实时荧光定量数据采用 GraphPad Prism 9 软件中独立样本 t 检验 (t tests)及双因素方 差分析 (2way ANOVA) 进行分析作图，p＜0.05，差异显著；p＜0.01，差异极显著； p＞0.05 差异不显著。

效果例2：

1、RNA-Seq 测序结果

1.1 测序数据统计与参考序列对比分析

通过RNA-Seq测序，各组试验得到的Raw Reads及质量控制后的Clean Reads如下表所示：对照组全鱼(短期试验)、实验组全鱼(短期试验)、对照组全鱼(长期试验)、实验组全鱼(长期试验)分别命名为A、B、C、D组。

表15 原始数据及质控数据

将参考基因组作为参考序列，使用HISAT2将质控后的Clean Reads与红鳍东方鲀参考基因组进行比对，并通过RSeQC统计比对结果如表16所示：

表16 质控数据与红鳍东方鲀基因组比对结果

说明：1.Total Reads:测序序列经过测序数据过滤后的数量统计(Clean reads)；2. Total Mapped：能定位到参考序列上的测序序列的数量的统计；3. Mutiple mapped：在参考序列上有多个比对位置的测序序列的数量统计；4. Unique Mapped：在参考序列上有唯一比对位置的测序序列的数量统计；5.Read1 Mapped, Read2

Mapped：测序序列 Read- 1比对到参考序列上的数量统计(仅计算UniqueMapped序列)；6.Mapped to '+', Mapped to '-'：测序序列比对到参考序列上正链和负链 的数量统计(仅计算 UniqueMapped 序列)；7.Non-splice reads：整段比对到外显子的测序序列的统计；8.Splice reads：分段比对到两个外显子上的测序序列(也 称为 Junctionreads)的统计；9.Reads mapped in proper pairs：双端 reads 同时比对上的测序序列统计

1.2 差异基因的表达分析

采用TMM 对 read count数据进行标准化处理，之后用DEGseq进行差异分析。为了得到显著差异的基因，我们将筛选条件设为：qValue<0.05，且差异倍数|FoldChange|>2。

短期试验中，全鱼组织共得到差异基因638个，其中上调基因506个，下调基因132个。表达差异基因火山图如图9中的A所示。

长期试验中，全鱼组织共得到差异基因396个，其中上调基因320个，下调基因76个。表达差异基因火山图如图9中的B所示。

2、RT-qPCR验证及基因表达分析

短期试验中，生长相关基因包括：生长激素受体(GHR)基因、类胰岛素生长因子(IGF)及其受体IGFR。实验组GHR基因表达量在12h和24h显著高于对照组(P＜0.01)；IGF基因表达量在6h、12h和24h显著高于对照组(p＜0.05)；IGFR基因除72h外，其余各时间段表达量均高于对照组(p＜0.05)。实验组pbx1基因除12h外所有时间段表达量均显著高于对照组(P＜0.05)；实验组四个基因表达量在各时间段中均呈现出现上升后下降的趋势(图10)。

特异性免疫基因包括：重组激活基因1(RAG1)、免疫球蛋白M(IgM)、活化T细胞核转录因子3(NFATc3)、T细胞分化蛋白(Mall)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)。实验结果显示，实验组RAG1基因在所有时间段表达量均显著高于对照组(P＜0.05)；实验组IgM基因在12h、24h和48h表达量显著高与对照组(P＜0.05)；实验组NFATc3基因在6h、24h和72h表达量显著高与对照组(P＜0.05)；实验组Mall基因在12h和24h表达量显著高与对照组(P＜0.05)；实验组TNF-α基因在6h、12h和24h表达量显著高与对照组(P＜0.05)。从上述结果可以看出实验组所有基因在24h表达量都显著高于对照组(P＜0.05)；并且出了RAG1和NFATc3基因外，其余实验组各基因的表达量均呈现出先上升后下降的趋势(图11)。

非特异性免疫基因包括：主要组织相容复合体I类相关蛋白(MajorHistocompatibility Complex Class I–Related Gene Protein)、热休克蛋白 70(Hsp70)、杀菌/通透性增加蛋白(BPI) 和组织蛋白酶 L(cathepsin-L)。实验结果显示，实验组 MHC I 基因和 cathepsin-L 基因除 72h 外所有时间段表达量均显著高于对照组(P＜0.05)；实验组 Hsp70 基因在 6h 、12h 和 24h 表达量显著高与对照组 (P＜0.05)；实验组 BPI 基因 12h 、24h 和 48h 表达量显著高与 对照组 (P＜0.05)。从上述结果可以看出实验组所有基因在 12h 和24h 表达量都显著高于 对照组 (P＜0.05) (图12)。

长期实验中，生长相关基因包括生长激素(GH)、生长激素受体(GHR)和胰岛素样因子(IGF)，结果显示，在实验进行30d后，各实验组基因的表达量均显著高于对照组(P＜0.01)(图13)

特异性免疫基因包括免疫球蛋白M(IgM)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和重组激活基因1(RAG1)，其中实验组IgM和TNF-α基因表达量显著高于对照组(P＜0.01)，而实验组RAG1基因表达量相较于对照组无显著升高(P＞0.05)(图14)。

非特异性免疫基因包括铁调素(Hepcidin)和补体5(C5)和补体9(C9)。结果显示，实验组所有基因的表达量均显著高于对照组(P＜0.01)(图15)

本效果例通过对实验组和对照组红鳍东方鲀稚鱼“全鱼”组织样本进行RNA-Seq分析，得到了外源GH可能影响的免疫信号通路包括细胞凋亡，抗原加工和递呈，补体途径，Toll-like受体信号通路，B细胞受体信号通路，自然杀伤细胞介导的细胞毒性，T细胞受体信号通路，Jak-STAT信号通路，NOD-like受体信号通路以及NF-κB信号通路。分析得到的IGF、IGFR以及GHR基因表达显著上调，表明外源GH在红鳍东方鲀体内发挥了作用。Pbx1的表达上调对鱼类膘和鳃的发育有促进作用，综上GHR、IGF、IGFR以及Pbx1的表达上调，说明外源GH对红鳍东方鲀稚鱼的生长同样具有促进作用。特异性免疫基因包括：IgM、RAG1、NFATc3、Mall、TNF-α相较于对照组均有不同程度的显著上调，但是RAG1基因在长期实验中表达量相较于对照组无显著差异。非特异性基因包括：MR1、Hsp70、BPI、Cathepsins-L、C5、C9以及Hepcidin相较于对照组均有不同程度的显著上调。综上所述，我们可以得出无论是短期实验还是长期实验，外源GH在红鳍东方鲀稚鱼特异性免疫和非特异性免疫两方面均发挥了积极作用。差异转录组数据显示，外源GH显著提高了免疫相关基因的表达，在抗原的递呈、T细胞的分化、抗病毒、抗菌等方面都发挥了重要的作用。同时外源GH激活了多条免疫相关信号通路，这为后续更加深入的研究提供了理论基础。

实施例3：鱼体生长及肠道菌群分析

1、饲养实验

同实施例2中2长期饲养实验，每隔五天随机选取实验组和对照组各30尾测量体长。

2、取样

30天生长实验结束后，对实验组和对照组各三尾鱼肠道进行无菌解剖，保存在无菌离心管中，在液氮中快速冷冻并储存在-80℃用于肠道菌群分析。实验组肠组织分别标记为EG-In1、EG-In2和EG-In3；对照组肠组织分别标记为CG-In1、CG-In2和CG-In3。另取实验组和对照组肝、肠和鳃组织用组织固定液固定24h，用于组织切片观察。

3、细菌16S rDNA扩增和测序

使用OMEGA试剂盒E.Z.N.A™ Mag-Bind Soil DNA Kit提取试剂盒提取各样品DNA。高通量测序文库的构建和MiSeq高通量测序工作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。16SrDNA基因的V3-V4区扩增引物为:341F(5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3')SEQ ID No.37和805R(5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3')SEQ ID No.38。对细菌16S rDNA基因V3-V4可变区进行PCR扩增。

4、测序结果分析

测序结束后的数据处理分析主要包括：质量控制、去除嵌合体及非靶区域序列、多样性和群落结构分析和微生物基因功能预测分析。

5、石蜡切片制作

按照石蜡切片制作的常规程序：固定，脱水和透明，次日石蜡包埋切片(切片厚度7μm)，40℃烤片(干燥越好染色效果越好)，二甲苯脱蜡及苏木素和伊红溶液染色，染色后封片。用Nikon eslipse 50i 显微镜观察拍照。

6、计算及数据处理

鱼体长增长率公式如下：

增长率=(初始体长-末体长) /初始体长

基因拷贝数计算方法如下：

Nc=(6.02×1014×C_p)/(Ln+2692)×660

公式中，N_c目的基因拷贝数，C_p为质粒浓度，Ln为插入载体的基因长度。

实验数据采用 GraphPad Prism 9软件中独立样本t检验(t tests)进行分析，p＜0.05差异显著；p＞0.05差异不显著。

效果例3：

1、外源GH对红鳍东方鲀生长速度的影响

经过30天生长实验，体长增长及增长率如表17所示，鱼体在摄入外源 GH后生长速度明显加快，实验组摄食了外源GH的红鳍东方鲀稚鱼体长增长率显著高于对照组(表17)。

表17 外源 GH 对红鳍东方鲀稚鱼生长的影响 (平均值±SEM ，n=30)

注：同一行内*表明不同处理组之间具有显著差异(P <0.05)。

2、肠道菌群分析

2.1测序序列处理结果

6 个样品经过测序后得到的下机序列总数为373450个，其中有效序列总数为370749；所有样品效序列数均达到40000以上，有效序列百分比都达 80%以上。这说明了本次测序 所得到的有效序列可以达到后续微生物多样性分析的要求(表18)。

表18 样品序列分析

2.2 红鳍东方鲀稚鱼肠道菌群的 Alpha 多样性分析

肠道微生物的丰富度和多样性可以用 Alpha 多样性分析反映。此次研究中样品测序覆盖率均为1，说明实验样本中序列没有被捡测出的概率较低。通过对试验组与对照组Shannon指数、Simpson指数、Ace指数及 Chao 指数的平均值进行显著性分析发现，其中ACE 指数和 Chao 指数实验组与对照组均无显著差异(P＞0.05)，表明实验组与对照组红鳍东方鲀肠道菌群丰富度无显著差异; Shannon 指数和 Simpson 指数实验组与对照组均无 显著差异(P＞0.05)，表明实验组与对照组红鳍东方鲀肠道菌群多样性无显著差异(表19)。

表19 红鳍东方鲀稚鱼肠道菌群样品基于 OTU 指数的 Alpha 多样性分析

2.3 菌群结构与 STAMP 差异分析

为直观看清不同处理条件下红鳍东方鲀稚鱼肠道菌群在不同分类水平下的群类结构，将使用统计学的分析方法，将多个样本的群落结构分析放在一起对比，还可以观测其变化情况。肠道菌群结构分析可以在门、纲、目、科和属水平进行，目前常用的是在门和属水平来分析菌群组成差异。

基于门水平上的菌群结构分析，得到各组样品的优势与次优势菌门。实验组与对照 组红鳍东方鲀稚鱼肠道菌群中，优势菌群均为变形菌门(Proteobacteria)。实验组中次优 势菌为拟杆菌门 (Bacteroidetes)，其余还包括蓝藻菌门 (Cyanobacteria/Chloroplast)、厚 壁菌门 (Firmicutes)。对照组中次优势菌为蓝藻菌门(Cyanobacteria/Chloroplast)，其余 还包括拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、疣微菌门(Verrucomicrobia) 和浮霉菌门(Planctomycetes)等。

STAMP差异分析比较实验组与对照组发现，基于门水平，实验组与对照组各菌丰富无显著差异(图16)。

基于属水平上的菌群结构分析，得到各组样品的优势与次优势菌门。实验组与对照组红鳍东方鲀稚鱼肠道菌群中，优势菌群均为不动杆菌属(Acinetobacter)。实验组中次优势菌为金黄杆菌属(Chryseobacterium)；对照组中次优势菌为弧菌属(Vibrio)和Strept ophyta。

STAMP 差异分析比较实验组与对照组发现，基于属水平，实验组红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)显著高于对照组，其余各菌丰富度无显著差异。(图17)。

3、红鳍东方鲀稚鱼各组织显微结构

实验进行30天后红鳍东方鲀稚鱼肝脏、鳃及肠组织切片显微镜观察显示(图18)，实验组与对照组各组织器官形态正常并且各组织未出现病理变化。

本效果例通过卤虫富集将TrGH重组酵母饲喂红鳍东方鲀稚鱼，经过30天投喂后，通过测量鱼体长度发现，实验组鱼体长增长率显著大于对照组鱼体长整长率。这表明重组红鳍东方鲀GH对红鳍东方鲀稚鱼的生长有明显的促进作用。稚鱼的快速生长有利于其自身免疫力的增强并且可以大大提高其存活率。本效果例通过30天的养殖实验发现，实验组鱼体长增长率显著大于对照组鱼体长整长率。表明外源GH对红鳍东方鲀稚鱼的生长有显著的促进作用。肠道菌群分析发现，长期投喂外源GH的红鳍东方鲀与对照组相比，红假单胞菌属丰度有显著提高，在菌群组成上，拟杆菌/厚壁菌比值增加。这一结果表明外源GH对红鳍东方鲀稚鱼肠道菌群组成有一定的影响并且对红起东方鲀的生长及免疫力均有促进。通过组织切片的方法观察到实验组与对照组红鳍东方鲀稚鱼组织器官无病理变化表明重组红鳍东方鲀GH酵母菌株是安全的。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.红鳍东方鲀生长激素，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.编码如权利要求1所述的红鳍东方鲀生长激素的基因。

3.表达载体，其特征在于，包括如权利要求2所述的基因。

4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

5.宿主，其特征在于，包括如下任意项：

（Ⅰ）、如权利要求1所述的红鳍东方鲀生长激素；和/或

（Ⅱ）、如权利要求2所述的基因；和/或

（Ⅲ）、如权利要求3或4所述的表达载体；

所述宿主包括大肠杆菌、毕赤酵母GS115或卤虫。

6.如下任意项在促进红鳍东方鲀生长发育和/或提高红鳍东方鲀免疫力中的应用：

（Ⅰ）、如权利要求1所述的红鳍东方鲀生长激素；和/或

（Ⅱ）、如权利要求2所述的基因；和/或

（Ⅲ）、如权利要求3或4所述的表达载体；和/或

（Ⅳ）、如权利要求5所述的宿主。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述提高红鳍东方鲀免疫力包括提高特异性免疫力和非特异性免疫力。

8.如下任意项在制备促进红鳍东方鲀生长发育和/或提高红鳍东方鲀免疫力产品中的应用：

（Ⅰ）、如权利要求1所述的红鳍东方鲀生长激素；和/或

（Ⅱ）、如权利要求2所述的基因；和/或

（Ⅲ）、如权利要求3或4所述的表达载体；和/或

（Ⅳ）、如权利要求5所述的宿主。

9.产品，其特征在于，包括如下任意项以及药学上可接受的辅料或助剂：

（Ⅰ）、如权利要求1所述的红鳍东方鲀生长激素；和/或

（Ⅱ）、如权利要求2所述的基因；和/或

（Ⅲ）、如权利要求3或4所述的表达载体；和/或

（Ⅳ）、如权利要求5所述的宿主；

所述产品包括饲料、生长促进剂或提高免疫功能制剂。