CN102766645A - 一种促进黄鳝生长的口服重组蛋白tat-gh及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进黄鳝生长的口服重组蛋白TAT-GH及制备方法和应用。一种促进黄鳝生长的口服重组蛋白的制备方法，其步骤是：A、根据已知序列人工合成黄鳝GH基因；B、通过PCR的方法扩增蛋白转导结构域多肽TAT，并将其与GH基因融合；C、双酶切TAT-GH融合基因和质粒，胶回收含TAT-GH基因的片段和开环片段，得到TAT-GH质粒；D、将质粒转化到感受态BL21（DE3）中，所得阳性克隆即为目的菌株。E、分离纯化目的菌株表达的蛋白。纯化后的TAT-GH重组蛋白经口服方式能有效促进黄鳝生长，为制备TAT介导的口服重组蛋白制剂提供了依据。

Description

一种促进黄鳝生长的口服重组蛋白TAT-GH及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因生物工程技术领域，具体涉及一种促进黄鳝生长的口服重组蛋白，还涉及一种促进黄鳝生长的口服重组蛋白的制备方法，还涉及一种表达口服重组蛋白的大肠杆菌基因工程菌株，同时还涉及一种口服重组蛋白在促进黄鳝生长中的应用。 

技术背景

黄鳝（Monopterus albus），俗称鳝鱼、田鳗和长鱼等，它是一种淡水硬骨鱼类，广泛分布于中国、印度、马来西亚和印度尼西亚，已在中国中南部开展大面积的养殖。中国目前的养殖总产量已经达到18万吨，由于其生长快，成活率高以及对网箱养殖条件的适应性好，它被当作中国水产养殖的首选品种之一。鳝肉质细嫩，鲜美可口，营养价值高，具有滋补强身和药用功能，是人们喜爱的滋补水产品，深受中国消费者的青睐。 

为了繁荣市场，丰富人民生活，发展池塘养殖已变得日益迫切，对黄鳝的生物学特性、生长变化规律等方面的研究已成为重要的课题。近年来其水产养殖发展很快。在水产养殖中高效饵料的研制是增产增收的基本途径。如何提高饵料转化率，缩短养殖周期，降低生产成本，提高水产养殖品的产量和质量被越来越多的科研工作者和养殖户所关注。 

鱼类生长激素是由鱼的脑垂体前叶细胞合成分泌的一种单链多肽，具有提高饵料转化率、促进鱼类生长发育、调节蛋白质合成和脂肪代谢等多种生理功能。GH的作用途径有两种，一种是诱导肝细胞、肌细胞产生IGFs等生长介导素(somatomedins)，再经IGF间接起作用，另一种是GH激活JAK2(Janus Kinase)，JAK2及GHR(生长激素受体)磷酸化，并同磷酸化的受体一起将GH信号向下游传递。无论哪一种方式GH都需要首先同细胞表面的特异性受体即GHR结合，再由受体介导，激发一系列生化反应并最终产生生物效应。鱼类GH的作用的发生，主要是通过IGFs的间接方式。IGFs属于胰岛素家族成员，包括IGF-I和IGF-II两个亚型，合成部位主要在肝脏，其合成和分泌主要由GH控制，生长激素能诱导肝脏中IGF-I和IGF-II的合成。反过来，IGF对GH的合成和分泌有抑制作用。鱼类的生长和其它脊椎动物一样，是通过脑神经内分泌-GH-IGF轴来实现的。但正常鱼体内的生长激素含量甚微，每升鱼血仅含20μg。生长激素直接投喂给鱼苗，可以促进鱼体的生长，表明生长激素多肽可以活性成分的形式进入鱼体。研究发现，鱼类小肠上皮细胞可以通过胞饮作用吸收大分子并转移进入血液循环。同时许多研究已经证实，用基因工程方法获得的生长激素具有代 偿内源生长激素的功能，肌肉注射外源生长激素，可促进鱼体生长;饵料中添加的重组生长激素可通过鱼体消化道后肠上皮细胞的胞饮作用吸收，提高鱼体的生长速度，并且在鱼体内半衰期一般在6h以内，在12~24h之后，基本检测不到。Atia等(1999)将外源表达的金头鳃生长激素蛋白经口投喂鱼苗38天，生长率比对照组提高55~65%。而经注射重组GH 90天后，生长率也比对照鱼提高了29~33%。同样，白俊杰等（1998）将鲑鱼生长激素通过PCR技术改造后，克隆到大肠杆菌中获得表达，重组蛋白为可溶性，占细胞总蛋白的10%。鲑鱼重组蛋白经纯化、复性后，同饲料一起投喂罗非鱼，产生了明显的促生长作用。2001年王伟等人工合成了草鱼GH基因，在大肠杆菌中的表达量占到细胞总蛋白量的40%。2003年Li等在毕赤酵母中用AOX基因启动子表达鲤鱼生长激素，其表达量为300-400mg/L。罗非鱼经注射重组鲤鱼GH 5周后，实验鱼的增长率比对照提高53.1%。1998年陈丹等也在毕赤酵母中用AOX基因启动子构建了鲈鱼生长激素表达载体，经甲醇诱导后，成功表达了鲈鱼生长激素。2003年陈荣忠等则将表达鲈鱼GH基因的重组酵母菌制成干粉，掺入到饲料中进行促生长试验，发现重组酵母能明显促进大黄鱼、卵形鳃、花尾胡椒鳃等鱼种的生长。因此，用基因工程方法获得廉价的重组鱼生长激素具有产量高、成本低的优点，适宜大量制备，将其应用于水产养殖业是增收节支的有效途径。 

TAT是近年来发现的一种新型的高效运输载体-蛋白质转导结构(protein transduction domains,pTDs)或称细胞穿膜肽(cell penetrating peptides，CPP)。TAT能穿透细胞膜、细胞核膜，携带肽、蛋白质和DNA分子等进入胞质和胞核发挥生物效应，具有高效性、无须耗能或通过受体转运的特点，为提高靶细胞在体内外的基因转移效率和蛋白质表达提供了一个高效、简便的方法。Tat蛋白是一个小型蛋白,其分子大小依HIV-1病毒的品系不同而有所差异，从86到130个氨基酸残基不等，由两个外显子编码。一般以86个氨基酸的Tat蛋白作为研究对象，分析其结构与功能。根据氨基酸的组成,Tat序列可被分为几个不同的区:N末端激活区(1～19位氨基酸)、半胱氨酸富集区(20～31位氨基酸)、中心区(32～47位氨基酸)、碱性氨基酸富集区(48～57位氨基酸)及谷胺酰胺富集区(60～76位氨基酸)。半胱氨酸富集区对维持Tat的功能是必需的,可介导体外金属连接的二聚物的形成。碱性氨基酸富集区含有核定位序列,且在病毒Tat蛋白序列中具有高度保守性。中心区、碱性氨基酸富集区及谷胺酰胺富集区均与RNA结合相关。TAT分子中的富含碱性氨基酸、具有较多正电荷的多肽片段与跨膜转导有关。Schwarze等确定具有蛋白转导功能的最小肽段是47-57,由11个氨基酸组成，其序列为YGRKKRRQRRR，该段等电点12.7，为碱性多肽，转导速度快，效率高。该结构域已被证明能以一种快速高效的方式将外源融合蛋白转导到真核细胞内,这 种方式不依赖细胞膜,转运子,但其详细机制目前还不是很清楚。自Nagahara等报道构建了一个可通用的原核表达载体(pTAT-HA)之后,有关TAT介导的蛋白质功能的研究报道急剧增加，如丁劲等利用该载体在大肠杆菌中成功地表达了TAT2乙肝病毒靶向核糖核酸酶融合蛋白。并且，其研究的方法学也趋于成熟。目前的体内及体外试验显示HIV-TAT，可以穿过包括神经元细胞在内的所有组织细胞，且未观察到明显毒副作用。TAT可以将与之相连的多肽或全长蛋白质在数分钟内转导进入细胞，而且在体内可以通过血液循环运输至脑组织，跨越血脑屏障进入神经元或胶质细胞内。自PTD被识别并鉴定以来，数百种化合物和蛋白质被成功转导进入不同的细胞或者跨越血脑屏障入脑，并表现出了相应的生物活性，而且已将多种变性的蛋白质如半乳糖苷酶转导进入小鼠体内并恢复了生物活性，被带入细胞的分子基本上保留了它们各自原有的性质，在细胞内会各显其能，各尽其责，这些特性使得这种技术特别具有吸引力。 

本发明将一种蛋白转导结构域多肽(TAT)和黄鳝生长激素成熟肽（简称GH）构建成融合蛋白，通过黄鳝口服之后能有效发挥其生物学活性，促进黄鳝生长，为制备TAT介导的口服蛋白制剂提供了理论依据。 

发明内容

本发明的主要目的是提供了一种促进黄鳝生长的口服重组蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示。本发明将TAT穿膜肽与GH蛋白融合表达，得到具有生物活性的TAT-GH蛋白，利用TAT的穿膜功能将GH蛋白穿过肠壁细胞进入血液发挥其生物学功能。 

本发明的另一个目的是在于提供了一种促进黄鳝生长的口服重组蛋白的制备方法，该方法可应用于大规模的养殖业中，表达量大，操作简单，成本低。 

本发明的目的另一个目的是在于提供了一种大肠杆菌基因工程菌株大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）pET-32a-TAT-maGH，F^-ompThsdS_B(r_B ^-m_B ^-)gal dcm(DE3)；CCTCCNO：M2012147。该菌株可以表达蛋白转导结构域多肽(TAT)和黄鳝生长激素成熟肽（GH）基因工程融合蛋白TAT-GH。其优点是表达量大，部分可溶，表达的包涵体蛋白复性容易，易于工业化生产，成本低，安全性好。 

本发明的再一个目的是在于提供了一种黄鳝生长激素基因工程融合蛋白在促进黄鳝生长中的应用。通过口服方式，TAT-GH蛋白穿过肠壁细胞进入血液发挥其生物学功能，产生了明显的促进黄鳝生长的效应。 

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施： 

一种促进黄鳝生长的口服重组蛋白的制备方法，其步骤为： 

1.黄鳝GH基因的制备： 

根据GeneBank中已经发表的GH（GeneBank：AY265351.1）的序列人工合成黄鳝GH基因（由上海Generay公司合成），并设计PCR引物进行基因扩增。 

2.融合基因TAT-GH的制备： 

通过PCR重叠延伸技术分3次PCR合成TAT-GH。即以人工合成的黄鳝GH基因为模板，通过搭桥的方法在GH序列的前端加上TAT序列，得到TAT-GH片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。 

3.融合基因的制备及表达载体的构建： 

用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切TAT-GHPCR片段和质粒pET-32a（+）（购自Novagen公司），目的片段TAT-GH和开环pET-32a（+）胶回收后4℃连接过夜，转化大肠杆菌JM109（购自Novagen公司）感受态细胞，挑取单菌落进行PCR鉴定，用碱裂解法小量提取质粒，参照《分子克隆实验指南》进行，DNA产量在100ng和5μg之间，依质粒的拷贝数而定。对提取的质粒进行酶切鉴定，得到的阳性克隆命名为pET-32a（+）-TAT-GH。 

4.大肠杆菌基因工程菌的制备： 

将质粒pET-32a（+）-TAT-GH转化大肠杆菌BL21(DE3)（购自Novagen公司）感受态细胞。PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为本发明涉及的能够融合表达TAT-GH的重组基因工程菌株Escherichia coli BL21（DE3）pET-32a-TAT–GH，申请人已于2012年4月26日将该菌送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCCNO:M 2012147，分类命名：大肠杆菌BL21（DE3）pET-32a-TAT-maGH，F^-ompThsdS_B(r_B ^-m_B ^-)gal dcm(DE3)，Escherichia coli BL21（DE3）pET-32a-TAT-maGH，F^-ompThsdS_B(r_B ^-m_B ^-)gal dcm(DE3)。 

通过上述方法获得了一种大肠杆菌基因工程菌株Escherichia coli BL21（DE₃）pET-32a-TAT-GH，它属于革兰氏阴性杆菌，无芽胞。最适生长温度为37℃，菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、呈灰色。该菌合成代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好，能发酵多种糖类产酸、产气。 

所述的大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）pET-32a-TAT-GH能够表达TAT-GH融合蛋白，该蛋白的基因为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。 

5.基因工程融合蛋白TAT-GH的诱导表达： 

重组基因工程菌株Escherichia coli BL21（DE₃）pET-32a-TAT-GH的单菌落接种于含氨 苄青霉素（终浓度为100μg/ml）的20ml LB液体培养基中，于37℃摇床中，300rpm振摇过夜培养10～12h。按1：100的比例接种到20ml新鲜的LB（Amp⁺）液体培养基中，37℃恒温、300rpm培养3h左右，至OD₆₀₀约0.6~0.8，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.6mM，于37℃恒温、300rpm诱导表达5h。离心12000g，4℃，10min收集菌体，用20ml的Lysis Buffer重悬菌体进行超声波破碎，离心收集上清和沉淀并用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。进一步扩大培养，超声波破碎后，12000g，4℃离心，20min收集沉淀。 

6.基因工程融合蛋白TAT-GH的纯化： 

收集湿菌体后，加入20ml细胞lysis buffer重悬菌体沉淀，于-20℃反复冻融3次，再进行超声波破碎（400W，工作3s，间歇3s），菌液破碎至清亮。将破碎后的菌液于4℃离心，12000rmp、20min，分别收集上清和菌体沉淀。用2M尿素洗涤菌体沉淀，重复2次，再用水洗涤1次。加入适量20ml包涵体lysis buffer，4℃裂解过夜，4℃离心，12000rpm、10min，弃去沉淀，将上清液稀释于100ml蛋白复性液中，4℃、复性24h。将复性液用0.45μm滤膜过滤，装入处理过的透析袋中（在10mM NaHCO₃、1mM EDTA的溶液中煮沸10min），透析袋两端用夹子夹好，将其放入透析液中，4℃、透析12~24h。期间需更换一次或两次透析液，以便完全除去尿素。经PEG20000浓缩后，4℃离心，12000rpm、10min，上清即为复性好的重组蛋白。用SDS-PAGE检测蛋白纯化结果。即得到纯化的TAT-GH蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。 

Ni-NTA Superflow柱亲和层析法进一步纯化重组蛋白，其步骤如下： 

（1）用移液器吸取1ml Ni-NTA Agarose装入层析柱底部，用10倍柱体积的双蒸水洗涤柱子。 

（2）用10倍柱体积的Lysis Buffer平衡镍柱。 

（3）将复性好的蛋白溶液经0.45μm的滤膜过滤后，用蠕动泵以1ml/min的速率，加入到平衡好的镍柱子中，使蛋白前端的6-His与Ni²⁺充分结合。 

（4）依次用适量的含20mM Imidazole、40mM Imidazole、60mM Imidazole、80mMImidazole的Wash Buffer以1ml/min的速率洗脱柱子，以洗脱下Ni²⁺柱上结合不牢固的或少量未与Ni²⁺结合的非目的蛋白。用核酸蛋白检测仪检测每次洗脱后的流出液的OD₂₈₀，待OD₂₈₀持续为0时停止洗涤。 

（5）用含250mM Imidazole的Elution Buffer以200μl/min的速率洗脱柱子，用Eppendorf管收集目的蛋白。取收集的蛋白进行12%SDS-PAGE检测纯化效果。 

（6）进行SDS-PAGE电泳，检测所收集的蛋白的纯化效果。 

一种黄鳝生长激素基因工程融合蛋白在促进黄鳝生长中的应用，其应用过程是： 

A.ELISA-RA法检测基因工程融合蛋白TAT-GH的生物活性 

取新鲜处死的黄鳝肝脏剪碎，加5倍于肝重的膜受体缓冲液，4℃反复匀浆。4℃高速离心，15000rpm、30min，取上清。4℃超速离心，100000rpm、60min，弃上清，收集沉淀，以10mg/ml重悬于0.05M Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液。用该缓冲液以1:50稀释受体膜，使终浓度为200μg/ml，添加到酶标板中，每孔100μl，4℃包被过夜。用5%BSA封闭96孔酶标板，每孔添加100μl，37℃封闭2h。甩干封闭液，每孔用300μL PBST缓冲液振荡洗涤5min，重复三次。每孔加入100μl梯度稀释的蛋白溶液，每个浓度3个平行，37℃孵育2h。甩干封闭液，每孔用300μL PBST缓冲液振荡洗涤5min，重复三次。每孔加入100μl稀释400倍的GH抗体溶液，37℃孵育2h。甩干封闭液，每孔用300μL PBST缓冲液振荡洗涤5min，重复三次。每孔加入100μl稀释10000倍的HRP标记的羊抗兔IgG，37℃孵育2h。甩干封闭液，每孔用300μL PBST缓冲液振荡洗涤5min，重复三次。每孔加入100μl OPD显色液，37℃避光反应10-20min。每孔加入50μl终止液，终止显色。用Bio-Rad450全自动酶标仪检测每孔在490nm波长下的吸光值。 

B.基因工程融合蛋白TAT-GH的促生长实验 

挑选健康鲜活且大小相近的黄鳝分成3组，每组20尾，平均20g/尾。饲养在同一室内同样规格的塑料箱中，水温控制在22~25℃，24h通氧，饲喂时间为20天。实验组1口头灌喂100μg的GH纯化蛋白，实验组2口头灌喂100μg的TAT-GH纯化蛋白，对照组口头灌喂等量的生理盐水。每天下午5∶00投喂饵料，投喂量以喂饱为度，而后清走残留饵料。每天观察黄鳝生长状况并换水。称重前一天停止喂食，比较实验前和实验结束时黄鳝体重及体长的变化，分析是否有显著的差别。 

与现有技术相比，本发明具有以下特点： 

（1）本发明所涉及的融合蛋白TAT-GH表达量大，为部分可溶蛋白，包涵体蛋白也容易复性，便于大规模生产，成本低廉，操作工艺简单； 

（2）本发明利用大肠杆菌表达TAT蛋白转导结构域和黄鳝GH的融合蛋白，意在采用口服方式到达促进黄鳝生长的目的。蛋白转导结构域多肽TAT目前还没有直接应用于养殖业，但其独特的穿膜效率十分具有吸引力。本发明公开的基因工程菌株制备的TAT-GH重组蛋白，TAT可以携带GH蛋白不经口服而直接进入血液中，可以应用于大规模的养殖业，使其具有 实际操作的可行性。 

附图说明

图1为一种重组表达质粒pET-32a（+）-TAT-GH的构建过程示意图。 

图2A为一种重组表达质粒pET-32a（+）-TAT-GH的PCR示意图。 

通过PCR重叠延伸技术分3次PCR合成TAT-GH。即以人工合成的黄鳝GH基因为模板，通过搭桥的方法在GH序列的前端加上TAT序列。 

图2B为一种重组表达质粒pET-32a（+）-TAT-GH的酶切鉴定示意图。 

从LB（Amp⁺）平板上挑取白色的单菌落进行扩大培养，对菌液进行小量提取质粒进行BamH I/EcoR I双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测鉴定阳性重组子。 

M：DL2000 

泳道1：PET32a-TAT-GH BamH I/EcoR I双酶切 

泳道2：PET32a-TAT-GH质粒 

图3为一种重组蛋白TAT-GH经IPTG诱导表达示意图。 

M：蛋白Maker 

泳道1：IPTG诱导前BL21/PET-32a空载 

泳道2：IPTG诱导前BL21/PET-32a-GH 

泳道3：IPTG诱导前BL21/PET-32a-TGH 

泳道4：IPTG诱导后破碎上清BL21/PET-32a空载 

泳道5：IPTG诱导后破碎上清BL21/PET-32a-GH 

泳道6：IPTG诱导后破碎上清BL21/PET-32a-TGH 

泳道7：IPTG诱导后破碎沉淀BL21/PET-32a空载 

泳道8：IPTG诱导后破碎沉淀BL21/PET-32a-GH 

泳道9：IPTG诱导后破碎沉淀BL21/PET-32a-TGH 

泳道10：IPTG诱导后破碎全菌体BL21/PET-32a空载 

泳道11：IPTG诱导后破碎全菌体BL21/PET-32a-GH 

泳道12：IPTG诱导后破碎全菌体BL21/PET-32a-TGH 

M：蛋白Maker 

图4为一种鱼肝膜受体与TAT-GH结合曲线示意图。 

ELISA-RA检测表明，黄鳝肝膜受体和TAT-GH重组蛋白能够发生特异性结合。当肝膜受体浓度一定时，随着黄鳝生长激素浓度的提高，光密度值会相应升高；当以加热失活的黄鳝生长激素和肝膜受体结合时，光密度值有显著下降；当黄鳝生长激素和肝膜受体同时失活时，光密度值进一步降低。当黄鳝生长激素浓度一定时，随着肝膜受体浓度的降低，光密度值会相应下降。 

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例子对本发明作进一步说明。在实施例中涉及的所有培养基和分子生物学操作方法为本领域技术人员所熟知。本实验所涉及的分子生物学方法为常规方法，为本领域人员所熟悉。本发明中未详细阐述的请参见《分子克隆实验指南》J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔等主编。 

实施例1：黄鳝GH基因的制备 

人工合成黄鳝GH基因：根据GeneBank中已经发表的GH（GeneBank：AY265351.1）的序列人工合成黄鳝GH基因，并设计PCR引物。GH的上游引物P1：5’-GGCGGATCCATGGACAAAGTCGTCCTCCTG-3’(划线处为BamHⅠ位点)，即为SEQ ID NO.3,GH的下游引物P2：5’-GCCGAATTCCTACAGAGTGCAGTTAGCTTCTGG-3’(划线处为EcoRⅠ位点),即为SEQ ID NO.4。以人工合成的黄鳝GH基因为模板，PCR扩增目的基因GH。GH基因的PCR反应条件为：①94℃2分钟，②（94℃30秒→56℃40秒→68℃40秒）共32个循环，③68℃5分钟。将反应后的产物贮于-20℃备用。 

PCR反应体系： 

实施例2：融合基因TAT-GH的制备 

PCR扩增TAT-GH基因：通过PCR重叠延伸技术分3次PCR合成TAT-GH。即通过搭桥的方法在GH序列的前端加上TAT序列。以人工合成的黄鳝GH基因为模板，上游引物P3:5’-CAGCGTCGTCGTGGATCCATGGACAAAGTCGTCC-3；即为SEQ ID NO.5，下游引物P4:5’-GCCGAATTCCTACAGAGTGCAGTTAGCTTCTGG-3’(划线处为EcoRⅠ位点)，即为SEQ ID NO.6，退火温度为55℃，PCR扩增目的片段，电泳并作回收；以上一步回收产物为模板，以上游引物P5:5’-CGTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTGGATCC-3’即为SEQ ID NO.7，下游引物P4:5’-GCCGAATTCCTACAGAGTGCAGTTAGCTTCTGG-3；即 为SEQ ID NO.8，退火温度55℃做PCR,电泳并作回收；以上一步回收产物为模板，以上游引物P6:5’-GGCGGATCCGGCTATGGCCGTAAAAAACGTCGT-3’(划线处为BamHⅠ位点)，即为SEQ ID NO.9，下游引物P4:5’-GCCGAATTCCTACAGAGTGCAGTTAGCTTCTGG-3’(划线处为EcoRⅠ位点)，即为SEQ ID NO.10，退火温度55℃，PCR扩增目的基因TAT-GH，其PCR反应条件为：①94℃2分钟，②（94℃30秒→56℃40秒→68℃40秒）共32个循环，③68℃5分钟。将反应后的产物贮于-20℃备用。PCR反应体系同实施例1。 

实施例3：PCR产物的回收、纯化。 

1）将上述PCR产物和6×Loading Buffer混匀，在1%（W/V）琼脂糖凝胶上电泳。 

2）当目标DNA带与其它完全分离后，在紫外灯下迅速切下含有目的DNA条带的琼脂糖凝胶（尽量切小），并转移到1.5ml EP管中，称其重量。用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收目的条带。 

3）向胶块中加入3倍体积的溶胶液（凝胶重为0.1g，其体积可视为100μL，以此类推），盖好管盖，于55℃水浴10分钟，期间不断颠倒混匀，直至凝胶完全融解。 

4）放置2-3分钟，待室温（20-25℃,以下相同）后，加入吸附柱中，12000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液。 

5）向吸附柱中加入600μLWash Buffer，12000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液。重复两次。 

6）空柱子12000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液。室温放置5-10分钟，彻底晾干，防止残留的Wash Buffer影响下游实验。 

7）将吸附柱放入一个干净的Eppendorf管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μL~100μLEluton Buffer，室温放置2分钟，12000rpm离心60s，-20℃保存。 

实施例4：重组质粒pET-32a（+）-TAT-GH的构建。 

用限制性内切酶EcoR I、BamH Ⅰ双酶切载体pET-32a（+）质粒和纯化的GH和TAT-GHPCR产物。酶切体系如下： 

酶切反应条件为37℃，反应时间2~3个小时。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒回收开环pET-32a（+）和GH、TAT-GH PCR酶切片段。 

将GH、TAT-GH PCR酶切片段与开环pET-32a（+）连接，得到重组质粒pET-32a（+）-TAT-GH。连接体系如下： 

连接反应液混匀，于22℃连接反应2小时，贮于4℃备用。 

氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞，其步骤是： 

1）在新鲜固体LB平板上挑取DH5α（或JM109）的单菌落，接种于20ml LB液体培养基中，37℃摇床300rpm培养过夜。 

2）接种过夜活化的200μl菌液于新鲜的20ml LB液体培养基中，37℃、300rpm培养约2~3h，至OD₆₀₀约0.4~0.6即可。 

3）无菌环境下，吸取菌液到预冷的1.5ml EP管中，4℃离心，4000rpm、10min。弃上清培养液，收集菌体。 

4）每管用200μl预冷的0.1M CaCl₂溶液重悬，冰浴30分钟。 

5）4℃离心，4000rpm、10min，弃上清培养液、收集菌体，置于冰上。 

6）每管用100μl预冷的0.1M CaCl₂溶液重悬，感受态细胞即制备完毕。 

连接产物转化大肠杆菌感受态细胞：其步骤是： 

1）无菌条件下取连接产物10μl加入100μl感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。 

2）42℃水浴热激90s，迅速移至冰上，冷却1~2min。 

3）加入600μl LB液体培养基，于37℃摇床中150rpm轻摇，温育45min， 

4）4000rpm离心10分钟，留下100μl上清，弃去剩余菌液，用移液器重悬菌体。 

5）用无菌的三角涂布棒将上述菌液均匀涂布于含有Amp⁺(终浓度为100μg/ml)的LB平 板上，正向放置，待液体被充分吸收以后，倒置平板，37℃培养过夜。 

由此法可以制备得到E.coli JM109 pET-32a（+）-TAT-GH菌落。 

阳性正向重组子pET-32a（+）-TAT-GH的酶切鉴定： 

用碱裂解法小量（15-20ug）提取E.coli JM109pET-32a（+）-TAT-GH质粒，对所提质粒进行单酶切和双酶切，酶切体系如下： 

酶切反应条件均为37℃，反应时间2-3个小时，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳分析结果。重组表达质粒pET-32a（+）-TAT-GH的构建过程见附图1，酶切及PCR鉴定见图2。 

实施例5：大肠杆菌基因工程菌的制备 

将质粒pET-32a（+）-TAT-GH（1ul）转化大肠杆菌BL21(DE₃)感受态细胞。PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为本发明涉及的能够融合表达TAT-GH的重组基因工程菌株Escherichia coli BL21（DE3）pET-32a-TAT-GH。 

实施例6：基因工程融合蛋白TAT-GH的表达 

1）从固体LB（Amp⁺）平板上挑取携带有质粒pET-32a、pET-32a-GH和pET-32a-TAT-GH的E.coli BL21(DE3)单菌落，接种于含氨苄青霉素（终浓度为100μg/ml）的20ml LB液体培养基中，于37℃摇床中，300rpm振摇过夜培养10～12h。 

2）第二天，按1：100的比例接种到20ml新鲜的LB（Amp⁺）液体培养基中，37℃恒温、300rpm培养3h左右，至OD₆₀₀约0.6~0.8，无菌条件下，取1ml菌液作为诱导前的对照。 

3）加入诱导剂IPTG至终浓度为0.6mM，于37℃恒温、300rpm诱导表达3-5h。同时 设定对照组，即未加入IPTG诱导的样品组。 

4）4℃离心，12000rpm、5min，弃上清，收集菌体。 

5）向收集的菌体沉淀中加入20ml的Lysis Buffer进行重悬。 

6）将菌悬液置于-20℃反复冻融几次后进行超声破碎，400W，工作时间3s，间隔时间3s。 

7）待菌悬液由浑浊变清亮时，表明菌体已基本破碎完全，停止超声破碎。 

8）将菌体破碎液于4℃、12000rpm离心20min。 

9）分别收集离心所得的上清液和菌体沉淀，用5ml无菌水重悬菌体沉淀，取出20μL与等体积的2×SDS-PAGE样品缓冲液混匀，样品置于沸水中煮10min，制得菌体样品，进行SDS-PAGE。 

10）电泳结束后，卸下凝胶，用考马斯亮蓝染液染色2-4h后，再用脱色液将背景色脱尽为止，以确定GH和TAT-GH蛋白是否得到表达。 

融合蛋白TAT-GH的SDS-PAGE鉴定见附图3。 

实施例7：基因工程融合蛋白TAT-GH的纯化 

1）取发酵液于4℃离心，8000rpm、10min，收集湿菌体。 

2）加入30ml细胞lysis buffer重悬菌体沉淀，于-20℃反复冻融3次，再进行超声波破碎（400W，工作3s，间歇3s），菌液破碎至清亮。将破碎后的菌液于4℃离心，12000rmp、20min，分别收集上清和菌体沉淀。 

3）用2M尿素洗涤菌体沉淀，重复2次，再用水洗涤1次。 

4）加入30ml包涵体lysis buffer，4℃裂解过夜。 

5）裂解液4℃离心，12000rpm、10min，弃去沉淀，将上清液稀释于100ml蛋白复性液中，4℃、复性24h。 

6）将复性液用0.45μm滤膜过滤，装入处理过的透析袋中（在10mM NaHCO₃、1mMEDTA的溶液中煮沸10min），透析袋两端用夹子夹好，将其放入透析液中，4℃、透析12~24h。期间需更换一次或两次透析液，以便完全除去尿素。 

7）经PEG20000浓缩后，4℃离心，12000rpm、10min，上清即为复性好的重组蛋白。用SDS-PAGE检测蛋白纯化结果。 

Ni-NTA Superflow柱亲和层析法进一步纯化重组蛋白，其步骤如下： 

（1）用移液器吸取1ml Ni-NTA Agarose装入层析柱底部，用10倍柱体积的双蒸水洗涤柱 子。 

（2）用10倍柱体积的Lysis Buffer平衡镍柱。 

（3）将复性好的蛋白溶液经0.45μm的滤膜过滤后，用蠕动泵以1ml/min的速率，加入到平衡好的镍柱子中，使蛋白前端的6-His与Ni²⁺充分结合。 

（4）依次用适量的含20mM Imidazole、40mM Imidazole、60mM Imidazole、80mM Imidazole的Wash Buffer以1ml/min的速率洗脱柱子，以洗脱下Ni²⁺柱上结合不牢固的或少量未与Ni²⁺结合的非目的蛋白。用核酸蛋白检测仪检测每次洗脱后的流出液的OD₂₈₀，待OD₂₈₀持续为0时停止洗涤。 

（5）用含250mM Imidazole的Elution Buffer以200μl/min的速率洗脱柱子，用Eppendorf管收集目的蛋白。取收集的蛋白进行12%SDS-PAGE检测纯化效果。 

（6）进行SDS-PAGE电泳，检测所收集的蛋白的纯化效果，蛋白浓度约为250μg/ml。 

实施例8：黄鳝GH多克隆抗体的制备和纯化 

1.黄鳝GH多克隆抗体的制备 

（1）新西兰大白兔1只，体重约2.5kg，免疫前于耳缘静脉采血1mL，分离血清-20℃保存备用，作为阴性对照。 

（2）将400μg～600μg GH纯化蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合，皮下多点注射，每点注射0.lmL左右。免疫间隔周期为2周，一共免疫3次。 

（3）第二次免疫时可取血清测定其效价。 

（4）第三次免疫后第11天取血，全血37℃静置2h，然后在4℃静置过夜，4℃低速离心，4000rpm、20min，吸取上清-20℃保存备用。 

2.黄鳝GH多克隆抗体的纯化 

（1）用移液器吸取2.5ml Protein A Sepharose装入Protein A Sepharose^TM CL-4B柱子中。 

（2）用10倍柱体积的binding buffer平衡柱子。 

（3）将2ml抗血清用binding buffer稀释到30ml，4℃离心12000rpm、10min，收集上清并用0.45μm滤膜过滤。 

（4）将上述样品用蠕动泵以200μl/min的速率，加入到平衡好的柱子中。 

（5）用binding buffer以500μl/min的速率洗脱柱子，直到基线稳定。 

（6）用elution buffer以250μl/min的速率洗脱IgGs，用Eppendorf管收集洗脱液，同时在每1ml洗脱液中加入200μl neutralizing buffer，立即混匀，以便保持抗体IgGs的活性。 

（7）进行SDS-PAGE电泳，检测所收集的抗体IgGs的纯化效果。 

实施例9：ELISA-RA法检测黄鳝TAT-GH的生物活性 

1）将购买的鲜活黄鳝杀死，取肝脏剪碎，加5倍于肝重的膜受体缓冲液，4℃反复匀浆。 

2）4℃高速离心，15000rpm、30min，取上清。 

3）4℃超速离心，100000rpm、60min，弃上清，收集沉淀，以10mg/ml重悬于0.05MNa₂CO₃-NaHCO₃缓冲液。 

4）用0.05mol/mlNa₂CO₃-NaHCO₃缓冲液以1:50稀释受体膜，使终浓度为200μg/ml，添加到酶标板中，每孔100μl，4℃包被过夜。 

5）用5%BSA封闭96孔酶标板，每孔添加100μl，37℃封闭2h。 

6）甩干封闭液，每孔用300μL PBST缓冲液振荡洗涤5min，重复三次。 

7）每孔加入100μl梯度稀释的蛋白溶液，每个浓度3个平行，37℃孵育2h。 

8）重复步骤6），每孔加入100μl稀释400倍的黄鳝GH抗体溶液，37℃孵育2h。 

9）重复步骤6），每孔加入100μl稀释10000倍的HRP标记的羊抗兔IgG（购自Proteintech Group公司），37℃孵育2h。 

10）重复步骤6），每孔加入100μl OPD显色液（购自Amresco公司），37℃避光反应10-20min。 

11)每孔加入50μl终止液，终止显色。 

12）用Bio-Rad450全自动酶标仪检测每孔在490nm波长下的吸光值。 

实施例10：生长激素促生长实验 

挑选健康鲜活且大小相近的黄鳝分成3组，每组20尾，平均20g/尾。饲养在同一室内同样规格的塑料箱中，水温控制在22~25℃，24h通氧，饲喂时间为20天。实验组1口头灌喂100μg的GH纯化蛋白，实验组2口头灌喂100μg的TAT-GH纯化蛋白，对照组口头灌喂等量的生理盐水。每天下午5∶00投喂饵料，投喂量以喂饱为度，而后清走残留饵料。每天观察黄鳝生长状况并换水。称重前一天停止喂食，比较实验前和实验结束时黄鳝体重及体长的变化，分析是否有显著的差别。 

实验鱼在实验期间的成活率为100℅，测量的实验数据以平均数X±标准差S表示。在20天的投喂期间，实验组1、2的体重和体长均得到较明显的提高。 

实验组1的体重增长率比对照组快27.94℅，体长增长率比对照组快5.0℅。实验组2的体重增长率比对照组快45.59℅，体长增长率比对照组快8.3℅（结果见表1）。而比较两实验组发现，在体长方面二者并没有明显差异，而在体重方面，组2比组1的变化差异更为明显。T 检验表明，与对照组相比，两实验组在体长方面也没有明显差异，而在体重方面，组1有明显的变化差异，组2的差异性更显著。这表明构建的工程菌所表达的黄鳝TAT-GH蛋白具有生物活性。黄鳝TAT-GH重组蛋白可通过口服被黄鳝肠道吸收，并产生了明显的促生长效应。 

表1黄鳝GH、TAT-GH蛋白促生长效应 

*P<0.05    P<0.01 。

   SEQUENCE LISTING

 

<110>  武汉凯肽来生物科技有限公司

 

<120>  一种促进黄鳝生长的口服重组蛋白TAT-GH及制备方法和应用

 

<130>  一种促进黄鳝生长的口服重组蛋白TAT-GH及制备方法和应用

 

<160>  10   

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  675

<212>  DNA

<213>  黄鳝

 

<400>  1

atggctgata tcggatccga attcggctat ggccgcaaaa aacgccgtca gcgccgccgt     60

 

atggacaaag tcgtcctcct gctatcagtc ctatctctgg gcatctcctc tcagccaatc    120

 

acagacagcc agcgtctgtt ctccatcgct gtgagcagag ttcagcacct ccacctgctc    180

 

gcccagagac tcttctctga ctttgagagc tctctgcaga cagaggagca gcgtcaactc    240

 

aacaaaatct tcctgcagga cttctgcaac tctgattata tcatcagccc cattgacaaa    300

 

catgagacac aacgtagctc tgttctgaag ctgctgtcca tctcctatca attggttgat    360

 

tcctggaagt tccccagtca ttctctgtct ggaggttctg ctctgaggaa tcagatttca    420

 

cccaaactgt ctgagctgaa gacaggaatc cttctgctga tcagggccaa tcaggatggg    480

 

gcagagatct tttctgacaa ctcagccctg cagcttgctc cctatgtgag ctatgatcaa    540

 

agtctgggag ctgatgagcc actgagacga acctatgacc tgctggcttg cttcaagaaa    600

 

gacatgcaca aggtggagac gtacttgaca gtggctaaat gtcgactctc tccagaagct    660

 

aactgcactc tgtag                                                     675

 

 

<210>  2

<211>  224

<212>  PRT

<213>  黄鳝

 

<400>  2

 

Met Ala Asp Ile Gly Ser Glu Phe Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg

1               5                   10                  15     

 

 

Gln Arg Arg Arg Met Asp Lys Val Val Leu Leu Leu Ser Val Leu Ser

            20                  25                  30         

 

 

Leu Gly Ile Ser Ser Gln Pro Ile Thr Asp Ser Gln Arg Leu Phe Ser

        35                  40                  45             

 

 

Ile Ala Val Ser Arg Val Gln His Leu His Leu Leu Ala Gln Arg Leu

    50                  55                  60                 

 

 

Phe Ser Asp Phe Glu Ser Ser Leu Gln Thr Glu Glu Gln Arg Gln Leu

65                  70                  75                  80 

 

 

Asn Lys Ile Phe Leu Gln Asp Phe Cys Asn Ser Asp Tyr Ile Ile Ser

                85                  90                  95     

 

 

Pro Ile Asp Lys His Glu Thr Gln Arg Ser Ser Val Leu Lys Leu Leu

            100                 105                 110        

 

 

Ser Ile Ser Tyr Gln Leu Val Asp Ser Trp Lys Phe Pro Ser His Ser

        115                 120                 125            

 

 

Leu Ser Gly Gly Ser Ala Leu Arg Asn Gln Ile Ser Pro Lys Leu Ser

    130                 135                 140                

 

 

Glu Leu Lys Thr Gly Ile Leu Leu Leu Ile Arg Ala Asn Gln Asp Gly

145                 150                 155                 160

 

 

Ala Glu Ile Phe Ser Asp Asn Ser Ala Leu Gln Leu Ala Pro Tyr Val

                165                 170                 175    

 

 

Ser Tyr Asp Gln Ser Leu Gly Ala Asp Glu Pro Leu Arg Arg Thr Tyr

            180                 185                 190        

 

 

Asp Leu Leu Ala Cys Phe Lys Lys Asp Met His Lys Val Glu Thr Tyr

        195                 200                 205            

 

 

Leu Thr Val Ala Lys Cys Arg Leu Ser Pro Glu Ala Asn Cys Thr Leu

    210                 215                 220                

 

 

<210>  3

<211>  30

<212>  DNA

<213>  黄鳝

 

<400>  3

ggcggatcca tggacaaagt cgtcctcctg                                      30

 

 

<210>  4

<211>  33

<212>  DNA

<213>  黄鳝

 

<400>  4

gccgaattcc tacagagtgc agttagcttc tgg                                  33

 

 

<210>  5

<211>  34

<212>  DNA

<213>  黄鳝

 

<400>  5

cagcgtcgtc gtggatccat ggacaaagtc gtcc                                 34

 

 

<210>  6

<211>  33

<212>  DNA

<213>  黄鳝

 

<400>  6

gccgaattcc tacagagtgc agttagcttc tgg                                  33

 

 

<210>  7

<211>  33

<212>  DNA

<213>  黄鳝

 

<400>  7

cgtaaaaaac gtcgtcagcg tcgtcgtgga tcc                                  33

 

 

<210>  8

<211>  33

<212>  DNA

<213>  黄鳝

 

<400>  8

gccgaattcc tacagagtgc agttagcttc tgg                                  33

 

 

<210>  9

<211>  33

<212>  DNA

<213>  黄鳝

 

<400>  9

ggcggatccg gctatggccg taaaaaacgt cgt                                  33

 

 

<210>  10

<211>  33

<212>  DNA

<213>  黄鳝

 

<400>  10

gccgaattcc tacagagtgc agttagcttc tgg                                  33

 

 

Claims (5)

1.一种分离重组的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.一种分离重组的融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2 所示。

3.一种表达权利要求2所述融合蛋白的基因工程菌株，其特征在于：大肠杆菌（ Escherichia coli ）BL21（DE3）pET-32a-TAT-maGH，F^- ompT hsdS _B (r _B ^- m _B ^- )gal dcm(DE3)；CCTCC NO：M2012147。

4.一种权利要求2所述融合蛋白的制备方法，其步骤为：

黄鳝GH基因的制备：根据GeneBank中已经发表的GH的序列：GeneBank：AY265351.1人工合成黄鳝GH基因，并设计PCR引物，以人工合成的黄鳝GH基因为模板， PCR扩增目的基因GH；

GH的上游引物P1：5’-GGCGGATCCATGGACAAAGTCGTCCTCCTG-3’；

GH的下游引物P2：5’- GCCGAATTCCTACAGAGTGCAGTTAGCTTCTGG -3’；

TAT-GH融合基因的制备：通过PCR的方法扩增蛋白转导结构域多肽TAT，并将其与GH基因融合，其具体步骤是：

以人工合成的黄鳝GH基因为模板，

上游引物P3: 5’-CAGCGTCGTCGTGGATCCATGGACAAAGTCGTCC-3’；

下游引物P4: 5’-GCCGAATTCCTACAGAGTGCAGTTAGCTTCTGG-3’,划线处为EcoRⅠ位点，退火温度为55℃，PCR扩增目的片段，电泳并作回收；

以上一步回收产物为模板，

上游引物P5: 5’-CGTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTGGATCC-3’；

下游引物P4: 5’-GCCGAATTCCTACAGAGTGCAGTTAGCTTCTGG-3’；

退火温度55℃做PCR, 电泳并作回收；

以上一步回收产物为模板，

上游引物P6: 5’-GGCGGATCCGGCTATGGCCGTAAAAAACGTCGT-3’,划线处为BamHⅠ位点，

下游引物P4: 5’-GCCGAATTCCTACAGAGTGCAGTTAGCTTCTGG-3’,划线处为EcoRⅠ位点，退火温度55℃，PCR扩增目的基因TAT-GH；

PCR反应条件为：                                                

94℃ 2分钟，94℃ 30秒→56℃ 40秒→68℃ 40秒，共32个循环，

68℃ 5分钟，将反应后的产物贮于-20℃备用；

融合基因表达载体的构建：首先双酶切TAT-GH融合基因和质粒pET-32a（+）， 胶回收含TAT-GH基因的片段和开环pET-32a（+）片段，22℃连接两小时后转化到感受态E.coli中，所得到的阳性克隆子是TAT-GH融合基因的大肠杆菌，该质粒命名为pET-32a（+）-TAT-GH；

D. 大肠杆菌基因工程菌的制备：将质粒pET-32a（+）-TAT-GH转化到感受态BL21（DE3）中，PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为本发明涉及的能够表达TAT-GH的大肠杆菌基因工程菌株；

E. 基因工程融合蛋白的制备：将步骤D中获得的基因工程菌转接到LB液体培养基中，经IPTG诱导，融合蛋白TAT-GH以包涵体的形式高效表达。

5.权利要求2所述的融合蛋白在促进黄鳝生长中的应用。

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