CN102899342B

CN102899342B - 鲇生长激素与穿肠膜肽tat融合蛋白及制备方法和应用

Info

Publication number: CN102899342B
Application number: CN201210188435.4A
Authority: CN
Inventors: 孟小林; 徐进平; 王健; 于京佑
Original assignee: WUHAN KAITAILAI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: HUBEI TAIYANGHONG BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2012-06-08
Filing date: 2012-06-08
Publication date: 2014-01-01
Anticipated expiration: 2032-06-08
Also published as: CN102899342A

Abstract

本发明公开了一种鲇生长激素与穿肠膜肽TAT融合蛋白及制备方法和应用，特别是对于促进硬骨鱼类的生长和耐渗透压上的应用。融合蛋白的制备方法是从活鲇的脑垂体中提取RNA，然后经过RT-PCR获得包含编码GH基因成熟肽的cDNA片段，将GH与TAT连接后连入表达载体pET22b(+)，在大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中进行表达，获得的纯化融合蛋白通过投喂，注射或是浸泡等方式都能不同程度的提高鱼体生长速率，增强盐水的耐受能力。本发明相比于单纯的使用GH表达蛋白应用于鱼体，效果更佳。

Description

鲇生长激素与穿肠膜肽TAT融合蛋白及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因生物工程技术领域，具体涉及一种saGH-TAT重组融合蛋白，还涉及一种saGH-TAT重组融合蛋白的制备方法，还涉及一种表达saGH-TAT重组融合蛋白的基因工程菌，还涉及一种saGH-TAT重组融合蛋白在促进鱼类生长中的应用。

背景技术

生长激素（Growth Hormone,GH）是一类由中腺垂体细胞分泌的单链肽类素，本质是蛋白质。GH广泛存在于脊椎动物（哺乳纲，鸟纲，爬行纲，鱼纲等）中,在多种重要的内分泌调控活动中起着重要的作用，尤其表现在促进鱼体快速生长上，由于在鱼类养殖业上的广泛前景，因而从其被发现开始一直成为研究的热点。

大量生长激素可以通过重组生长激素基因工程菌发酵而获得。鱼类生长激素基因在大肠杆菌中的表达，最早是由Sakine在1985年完成的，诱导表达的生长激素蛋白产物占细胞总蛋白的15%。随后，虹鳟、鲑、罗非鱼等的生长激素也在大肠杆菌中相继获得表达。

有两类方法推动着鱼类生长激素基因体外表达向应用发展：其一是表达效率的提高，根据大肠杆菌偏爱密码子和已知的草鱼生长激素氨基酸序列，人工合成草鱼生长激素cDNA，并构建表达载体pET-GH，转化BL21(DE3)，在T7启动子的驱动下，通过诱导，获得的草鱼生长激素表达量占细胞总蛋白量的40%其二是采用可作为饵料的表达系统Kawata等构建另一类表达载体pQSG1,在藻类（Agmenellum quadruplicatum）中表达重组的鲑鱼生长激素，表达量占细胞蛋白含量的0.1%。Tsai构建了重组金枪鱼生长激素cDNA的杆状病毒载体pHM，在多聚角蛋白启动子的调控下，在昆虫细胞内表达，表达量占细胞总蛋白的2%-8%新型表达载体的研制和应用，可以获得更高表达量的外源蛋白。

酵母是单细胞低等真核生物，它不仅具备原核细胞增殖快、易培养、便于基因工程操作等特性，同时又具有真核生物的蛋白质翻译后加工的功能和重组蛋白正确折叠的细胞内环境，加之酵母粉本身就是非常好的单细胞蛋白饵料添加剂，富含各种必需的氨基酸、维生素。因此，以酵母作为生长激素的表达宿主菌，在生产中更具有价值!啤酒酵母首先被用来作为外源基因的表达宿主菌，但在大量表达外源蛋白时，性状不够稳定，质粒易于丢失，不适合高密度培养。甲醇营养性酵母（Pichia pastoris），又称毕赤酵母，可利用烷烃类化合物来生产单细胞蛋白，成熟的大规模发酵技术已经建立。

生长激素直接投喂给鱼苗，可以促进鱼体的生长，表明生长激素多肽可以活性成分的形式进入鱼体。研究发现，鱼类小肠上皮细胞可以通过胞饮作用吸收大分子并转移进入血液循环。给虹鳟投喂重组鲑鱼生长激素，虹鳟的体重和体长明显高于对照。通过荧光标记生长激素进一步确证，虹鳟的后肠是吸收生长激素的部位。在生长激素通过胃和肠道前部时，其中大部分被降解，余下的小部分到达后肠并进入血液循环。当生长激素以抗酸多聚物包被后投喂鱼，鱼体血液中的生长激素水平以及鱼的生长速度都明显提高。鲤科鱼类与鲑科鱼类不同的是没有胃，灌喂不同鱼同样浓度的辣根过氧化物酶，发现鲤鱼血浆中的辣根过氧化物酶是虹鳟血浆的1000倍。所以生长激素在投喂给鲤科鱼类时，可以有更多的生长激素蛋白分子到达后肠而被吸收。

近年来发现有一些小分子的多肽可以介导外源物质穿过细胞膜，这种小分子多肽被称之为细胞穿膜肽（cell penetrating peptides,CPP）。许多CPP都是来源于某些直接与宿主细胞相互作用的病毒结构蛋白的蛋白转导结构域（protein transduction domains,PTD）。现在研究最多、应用范围最广的细胞穿膜肽来源于人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的转录激活因子（Trans-activating transcriptional activator,Tat）。Tat蛋白中存在3个功能结构域，分别是：位于N-端的酸性区，主要起反式激活的功能；位于第22-37位氨基酸之间的DNA结合区，该区域富含半胱氨酸；位于第47-60位氨基酸之间的碱性区，是主要的蛋白转导结构域，参与Tat蛋白的细胞内化作用。Tat蛋白共有86个氨基酸，是HIV复制所必需的调节因子。Schwarze发现位于Tat蛋白中第47-57位之间的11个氨基酸YGRKKRRQRRR不仅能够独立穿过细胞膜，而且其穿膜效率比全长的Tat蛋白还要高。这段多肽即是TAT穿膜肽。

不管是单独的TAT穿膜肽，或者是携带其他大分子物质如蛋白质、寡聚核苷酸或脂质体等，在穿膜时都可以表现出较高的穿膜活性。在携带外源物质穿膜时，TAT介导的穿膜似乎与其要携带的分子大小无关，100KD的蛋白质、40nm大小的纳米颗粒、甚至200nm大小的脂质体都可以经TAT运载入细胞内。而且，以这种方式运输到细胞内的脂质体甚至可以在进入细胞内1h后仍然可保持结构的完整性。相反的，没有与TAT穿膜肽连接的物质在与细胞共同孵育时均不能够进入细胞内。

TAT穿膜肽的序列中由于有6个精氨酸和2个赖氨酸残基，因此是带有高度正电荷的多肽。以不带电荷的丙氨酸替代其中的任何一个碱性氨基酸残基都会使穿膜活性降低，而替代序列中的其他氨基酸残基时穿膜活性则不会发生改变。这说明TAT穿膜肽所带的正电荷是其穿膜功能所必需的，因此推测这些正电荷很可能是能够与真核细胞的细胞膜发生强的静电作用，从而介导了穿膜过程。对TAT穿膜肽的亲和性分析发现，它能够与许多细胞膜表面的阴离子通过静电作用强烈地结合，与之结合的细胞表面分子可以是核仁素、蛋白聚糖等。精氨酸丰富的多肽可以穿过细胞膜，而其他氨基酸如赖氨酸、组氨酸等丰富的多肽却不具有此功能。然而，由精氨酸组成的支链聚合物与直链聚合物具有同样的穿膜效率。此外，研究发现TAT穿膜肽不会因为手性结构的改变而影响其穿膜活性，其手性分子与自然结构具有相同的穿膜活性。这说明这种细胞穿膜肽很可能不依赖于特定的结合位点。然而，多肽的长度是影响穿膜效率的重要因素。穿膜效率与精氨酸的个数有关，含有6个或者更多精氨酸的多肽要比含有少于5个精氨酸多肽的穿膜效率高一些，在多肽小于15个氨基酸时，穿膜效率会随着多肽大小的增加而增强。大于15个氨基酸的多肽虽然也可具有穿膜活性，但其效率却会明显减小。

尽管对于TAT穿膜肽的穿膜功能研究的比较多，但是到目前为止，关于TAT穿膜肽进入细胞的分子机制还没有完全研究清楚。早期研究认为是通过直接转运机制穿过细胞膜，且是不依赖于能量的，但最近的研究也有与这一观点不同的结果。尽管其进入细胞的机制还没有完全研究透彻。尽管TAT穿膜肽的应用已经十分广泛，但利用TAT携带鱼的生长素跨肠膜并显著提高鱼的产量国内外还没有报道。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种saGH-TAT融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。该融合蛋白能够增强盐水的耐受能力，比表达的saGH蛋白在耐渗透压的能力上更强，可以穿过肠细胞膜而进入血液中，使GH可以不经注射而直接进入血液中，通过血液在鱼体内的循环，使其融合蛋白到达不同的组织，增加了GH的利用效率，同时也提高了药效。

本发明的目的是在于提供了一种大肠杆菌基因工程菌株，大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）pET-22b(+)-saGH-TAT，F^-ompT hsdS_B(r_B ^-m_B ^-)gal dcm(DE3)，保藏编号：CCTCC NO：M 2012126，该菌株能表达saGH-TAT的融合蛋白，其能显著促进鱼体生长，效率高，安全性好。

本发明的另一个目的是在于提供了一种融合蛋白saGH-TAT的制备方法，该方法可应用于大规模的养殖业中，表达量大，操作简单，成本低。

本发明的再一个目的是在于提供了一种大肠杆菌基因工程菌株在促进硬骨鱼体（鲇鱼、黄颡鱼、罗非鱼、鲤鱼、草鱼）生长中的应用，能够高效利用生长激素添加剂并且快速提高鱼体增重。

本发明还有一个目的是在于提供了一种分离重组的鲇生长激素与穿肠膜肽融合蛋白在增强罗非鱼耐高渗透压海水的研究中的应用。为了达到上述的目的，本发明采用以下技术措施：

本发明的创新之处在于，本发明利用大肠杆菌表达TAT跨膜域和saGH的融合蛋白，意在促进鲇科鱼类的生长。通过基因工程生产的saGH-TAT融合蛋白可以作为鱼类养殖中的促生长剂，能够显著提高对鱼体的生长速率。本发明另一个创新之处在于，将TAT穿膜肽和saGH融合表达，由于TAT穿膜肽可以携带外源蛋白穿过细胞膜，因此将saGH-TAT经口投喂鱼后该融合蛋白可以穿过肠细胞膜而进入血液中，使GH（Growth Hormone,GH）可以不经注射而直接进入血液中，通过血液在鱼体内的循环，使其融合蛋白到达不同的组织，增加了GH的利用效率，同时也提高了药效。

TAT穿膜肽目前还没有直接应用于养殖业，但其独特的穿膜效率十分具有吸引力。而且本发明公开的基因工程菌株的构建方法可以应用于大规模的养殖业中，表达量大，操作简单，成本低。

一种融合蛋白saGH-TAT的制备方法，其步骤是：

A、鲇生长激素基因的制备：首先切取已处死的鲇（人工养殖南方大口鲇）头部洗净备用，用刀从口劈开头部，使上颌部和下颌部分开，在上颌部的腹面有一长管状的骨骼为鲇副蝶骨，将刀横搁在副蝶骨的一端，用锤轻敲刀背两至三下，刀口深度约为2-3mm,副蝶骨的另一端同法敲击，然后将刀口轻轻扭动，就可以将副蝶骨扭下，便可获得完整的脑垂体。根据GeneBank中已经发表的鲇科鱼类GH的序列（GenBank:AY157496.1）设计PCR引物，以上述脑垂体提取的RNA作为模板反转出cDNA，PCR扩增目的基因silurus asotus growth hormone gene(saGH)，PCR产物通过DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物并将其克隆到pMD18-T（购自Takara公司）载体中，转化大肠杆菌JM109，挑取单菌落用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序。得到的阳性克隆子即为包含saGH基因的大肠杆菌，用于基因的扩增和保藏。

B.通过重叠延伸PCR的方法将TAT 33bp碱基连入saGH的3'端构成saGH-TAT，将PCR产物组装入pMD18-T载体，得到重组载体pMD18-T-saGH-TAT，然后转化大肠杆菌JM109（recA1,endA1,gyrA96,thi-1,hsdR17,supE44,relA1,Δ(lac-proAB)/F'[traD36,proAB+,lac Iq,lacZ ΔM15]，购自novagen公司），挑取单菌落用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序。得到的阳性克隆子即为包含saGH-TAT的大肠杆菌，用于基因的扩增和保藏。

C.融合基因的制备及表达载体的构建：首先双酶切重组质粒pMD18-T-saGH-TAT和质粒pET-22b（+）（购自novagen公司，amp^r）,胶回收含saGH-TAT基因的片段和开环pET-22a（+）片段，16℃连接后转化到感受态E.coli BL21（F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3））中，所得到的阳性克隆子是本发明涉及的saGH-TAT融合基因的大肠杆菌，命名为BL21（DE3）pET-22b(+)-saGH-TAT。

D.基因工程菌的制备：将质粒pET-22a（+）-saGH-TAT转化到感受态BL21（DE3）（F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3））中，PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为本发明涉及的能够表达saGH-TAT的大肠杆菌基因工程菌株BL21（DE3）pET-22b(+)-saGH-TAT，申请人已于2012年4月20将该菌送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2012126，分类命名：大肠杆菌BL21（DE3）pET-22b(+)-saGH-TAT，F^-ompT hsdS_B(r_B ^-m_B ^-)gal dcm(DE3)，Escherichia coli BL21（DE3）pET-22b(+)-saGH-TAT，F^-ompT hsdS_B(r_B ^-m_B ^-)gal dcm(DE3)。

一种大肠杆菌基因工程菌株BL21（DE3）pET-22b(+)-saGH-TAT，能够在常规的大肠杆菌培养基中生长，并具有氨苄抗性，代谢正常，经过IPTG诱导后能大量分泌saGH-TAT蛋白。

E.基因工程融合蛋白的制备：将上述基因工程菌转接到2×YT培养基中，融合蛋白saGH-TAT以包涵体的形式高效表达。

获得了基因工程融合蛋白saGH-TAT的大肠杆菌基因工程菌株后经过破碎纯化后能够简单的与各种饲料混合，直接口服投喂，促进鱼体生长。

一种大肠杆菌基因工程菌株在促进硬骨鱼体（鲇鱼、黄颡鱼、罗非鱼、鲤鱼、草鱼）生长中的应用，其应用过程是：

1.促生长实验

选取形体相似的罗非鱼苗（Oreochromis Niloticus），随机分成11组，每组20尾，放入80cm×60cm×20cm的饲养盆中，水温恒定25℃．每天换一次水。在实验处理之前让其在饲养盆中适应1周时间。

11组处理如下：

1)非处理组；

2)0.7%（w/v）生理盐水腹腔注射组；

3)5μg/g体重saGH-TAT腹腔注射组；

4)1μg/g体重GH-TAT腹腔注射组；

5)0.1μg/g体重GH-TAT腹腔注射组；

6)5μg/g体重saGH腹腔注射组；

7)1μg/g体重GH腹腔注射组；

8)0.1μg/g体重GH腹腔注射组；

9)1μg/g体重saGH口服组；

10)1μg/g体重saGH-TAT口服组；

11)0.7%生理盐水口服组。

每周测体长、体重，处理六周。

另外，设定三组口服实验分别按照体重的10%比例投喂饲料，重组蛋白包封量为5μg/g体重。

2.耐渗透压实验

罗非鱼先在淡水中喂养，转入海水之前3天停止给鱼喂食。大小相似的鱼随机分组（2–3g），保证所有实验组中鱼体生长状况相似。纯化的saGH和saGH-TAT溶于自来水中。

1）正常鱼体对海水海水渗透压耐受力：

将罗非鱼随机分成10组，每组5条，将鱼放入不同浓度的海水（0,10,20,30,40,50,60,75,85,100%）中，统计不同大小的罗非鱼开始死亡时间和完全死亡时间。

2）鲇生长激素（saGH和saGH-TAT）对海水存活力的影响：

将罗非鱼随机分成4组，每组20条，分别用浓度为2mg/L的saGH,saGH-TAT,BSA水溶液浸泡罗非鱼苗2小时和24小时后，直接将罗非鱼转到60%的海水中。统计2小时和24小时浸泡罗非鱼苗后在海水中鱼苗的存活率。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1.本发明制备saGH-TAT融合蛋白能够增强盐水的耐受能力，比表达的saGH蛋白在耐渗透压的能力上更强，可以穿过肠细胞膜而进入血液中，使GH可以不经注射而直接进入血液中，通过血液在鱼体内的循环，使其融合蛋白到达不同的组织，增加了GH的利用效率，同时也提高了药效。

2.口服添加生长激素（saGH-TAT）饲料，能够显著提升鱼体增长速率，相比于现有的单纯添加生长激素(saGH)，能够减少至少80%的蛋白用量，节约生产成本。

3.本发明提供的融合蛋白saGH-TAT的制备方法，该方法可应用于大规模的养殖业中，表达量大，操作简单，成本低。

附图说明：

图1为鲇脑垂体RNA琼脂糖凝胶电泳图

提取的RNA为3条带，自上而下分别为28S,18S和5S。

图2-1为一种RT-PCR产物电泳结果示意图

泳道1：DL2000Marker;泳道2-3:RT-PCR产物；泳道4：阴性对照。获得了大小570bp左右的条带。

图2-2为一种质粒pET22b(+)-saGH-TAT构建图谱

将获得的saGH基因片段连入pMD18T载体中后用PCR将TAT序列连入saGH 3'端，然后连入表达载体pET22b(+)中。

图3为一种pET22b(+)-saGH/saGH-TAT PCR及酶切鉴定示意图

单酶切或双酶切以及PCR鉴定都能看到目的条带。

M1:D10,000；泳道1:pET22b(+)-saGH质粒泳道；2:pET22b(+)-saGH质粒NdeI单酶切；

泳道3:pET22b(+)-saGH质粒NdeI/XhoI双酶切；泳道4:pET22b(+)-saGH质粒NdeI/PstI双酶切；泳道5:saGH PCR扩增产物泳道6:pET22b(+)-saGH-TAT质粒；泳道7:pET22b(+)-saGH-TAT质粒NdeI单酶切；泳道8:pET22b(+)-saGH-TAT质粒NdeI/XhoI双酶；泳道9:pET22b(+)-saGH-TAT质粒NdeI/PstI双酶切泳道10:saGH-TAT PCR扩增产物M2：D2000图4为一种BL21(DE3)/pET22b(+)-saGH-TAT在大肠杆菌中的表达SDS-PAGE图

在22kd处和20KD处分别由目的蛋白saGH-TAT和saGH表达。

泳道l:蛋白分子量标准(116.0,66.2,45.0,35.0,25.0,18.4,14.4)；泳道2:BL21(DE3)/pET22b(+)未诱导；泳道3:1mM IPTG诱导BL21(DE3)/pET22b(+)4小时菌体；泳道4:1mM IPTG诱导BL21(DE3)/pET22b(+)4小时上清；泳道5:1mM IPTG诱导BL21(DE3)/pET22b(+)4小时沉淀；泳道6:BL21(DE3)/pET22b(+)-saGH未诱导；泳道7:1mM IPTG诱导BL21(DE3)/pET22b(+)-saGH 4小时菌体；泳道8:1mM IPTG诱导BL21(DE3)/pET22b(+)-saGH 4小时上清；泳道9:1mM IPTG诱导BL21(DE3)/pET22b(+)-saGH 4小时沉淀；泳道10:纯化saGH蛋白；泳道11:BL21(DE3)/pET22b(+)-saGH-TAT未诱导；泳道12:1mM IPTG诱导BL21(DE3)/pET22b(+)-saGH-TAT 4小时菌体；泳道13:1mM IPTG诱导BL21(DE3)/pET22b(+)-saGH-TAT 4小时上清；泳道14：1mM IPTG诱导BL21(DE3)/pET22b(+)-saGH-TAT 4小时沉淀；泳道15:纯化saGH-TAT蛋白。

图5为一种兔抗saGH IgG纯化SDS-PAGE示意图

获得了大小为55kd的蛋白条带。

泳道1:蛋白分子量标准泳道2:纯化IgG泳道3:兔抗血清

图6为一种蛋白质印迹分析图

获得了单一免疫印迹条带。泳道1：saGH泳道2:saGH-TAT泳道3:空菌体

图7为一种鲇鳃膜受体与GH结合曲线示意图

图8为一种鲇鳃膜受体与GH-TAT结合曲线示意图

图9为一种鲇肠膜受体与saGH/saGH-TAT结合曲线示意图

图10为一种鲇肝膜受体与saGH/saGH-TAT结合曲线示意图

图11为一种GH与活性或非活性受体结合实验示意图

图12为一种鱼体重增长柱形图示意图

图13为一种4周后鱼体重增长柱形示意图

图14为8种常见淡水鱼GH亲缘关系图

具体实施方式:

本实验所涉及的分子生物学方法为常规方法，为本领域人员所熟悉。本发明中未详细阐述的请参见《分子克隆实验指南》J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔等主编。

实施例1：制备鲇生长激素基因，其步骤是：

1.1鲇脑垂体RNA的提取

按照TIANGEN RNA提取试剂盒操作，稍作改动，具体步骤如下：

取样：剪开鱼头骨，用镊子取出脑垂体，重约100mg；

将脑垂体放入加有1ml的TRNzol的Eppendorf管中，用匀浆棒捣碎；

将匀浆样品在20℃放置5min,使得核酸蛋白复合物完全分离；

4℃12000rpm离心10min,取上清；

加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15秒，室温（20-25℃，以下相同）放置3分钟；

4℃12000rpm离心15min,样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（约600μl）转移到新的离心管中。

在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20min；

4℃12000rpm离心10min,去上清。离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀；

加入1ml 75%（V/V）乙醇（DEPC处理过的水配制）洗涤、沉淀。每使用1ml TRNzol至少1ml 75%乙醇对沉淀进行洗涤；

4℃5000rpm离心3min,倒出液体，注意不要倒出沉淀，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出；

室温放置晾干（2-3min），加入30μlRNase-free ddH2O,反复吹打、混匀，充分溶解RNA。

1.2RNA检测

将提取的RNA与Loading Buffer混匀后在1.5%（M/V）的琼脂糖凝胶，1×TAE电泳缓冲液，5V/cm的条件下电泳30min,紫外灯下观察RNA提取情况。RNA提取结果如图1。

saGH克隆结果：

用鲇垂体提取总RNA作为模板，经反转后，获得了预期为570bp的DNA片段，如图2所示。

鲇生长激素（saGH）cDNA合成；

根据Toyobo公司RT-PCR试剂盒方法进行：

RNA热变性

65℃，5min,立即置于冰上。

反应液配置

逆转录反应

30℃/10min，42℃/20min，99℃/5min，4℃/5min，5000rpm离心1min；

1.3PCR

兼并引物设计：使用codehop软件设计：

正向：5'-GCTTCCCTGTTCTTCAACcarggngcnac-3'degen=32temp=60.2

反向：5'-CTACAGTGTGCAGTTGGArtcnarnga-3'

引物由Invitrogen公司合成

利用反转录的saGH cDNA为模板，50μl体系采用如下条件进行PCR反应：

向无菌PCR管中加上述组分的操作在冰上进行，用移液枪抽吸混匀，4000rpm瞬时离心后，将PCR管置于PCR仪中。

琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，PCR产物估计大小为570bp.

saGH cDNA片段测序结果：

首先用T-A法将扩增得到的cDNA片段克隆到载体pMD18T中，转化大肠杆菌JM109,得到转化子，首先用菌落PCR方法筛选转化子，电泳检测：570bp处出现DNA条带者为可能的重组子，提取质粒送至桑尼（上海）公司进行测序，测得的核苷酸序列为SEQ IDNO：1所示。

鲇生长激素cDNA及氨基酸序列生物信息学分析

氨基酸序列翻译	DNAMAN
		氨基酸及核苷酸序列比对	NCBI BLAST
信号肽分析	SignalP 4.0Server
		进化树建立	ClawX,Treeview
结构预测和同源模建	Swiss-model

分析：ORF含570个核苷酸，编码189个氨基酸残基，第1-11氨基酸为信号肽部分序列；12-189为成熟肽，分子量20292道尔顿，预测等电点（pI）6.02，根据翻译的多肽序列经过BLAST比对后生成物种亲缘关系树如图14所示。

1.4加A反应：

取KOD Polymerase扩增获得的PCR片段为模板，用Mastermix Taq DNA polymerase 72℃延伸20min按如下体系：

1.5PCR扩增片段的回收：

使用Biomiga公司的回收试剂盒进行，步骤如下：

1.从凝胶上割下带有目的片段的凝胶块到一个1.5ml的离心管中，加入1倍体积的Buffer GC，置于55℃-60℃水浴中8-10分钟，期间颠倒混匀几次，直至凝胶块完全溶化。冷却离心管至室温。

2.转移以上混合液（每次不超过700μl）至一个带有收集管的吸附柱中，室温下，13000g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回到收集管中。

3.加入650μlDNA Wash Buffer至吸附柱中，室温下，13000g离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回到收集管中。

4.室温下，13000g，将吸附柱打开盖子离心2min，去除残留的乙醇。

5.转移吸附柱至1.5ml收集管中，加入30-50μl60℃预热的Elution Buffer到吸附柱膜中央，室温放置一分钟，13000g离心一分钟，将洗脱液放回到吸附柱中重新洗脱一次。

6.回收产物-20℃冰箱保存。

1.6冷氯化钙法制备大肠杆菌JM109感受态细胞：

1)以无菌牙签挑取平板上的大肠杆菌JM109单菌落，接种到20ml LB培养基中，37℃，220rpm活化过夜。

2)取10～20μl上述活化大肠杆菌，接种到20ml新鲜的LB培养基中，37℃，220rpm培养2～3h，至OD600值为0.4～0.6。

3)取1.5ml步骤2）的菌液加入无菌的Eppendorf离心管中，4℃，4,000rpm离心10min，弃上清。

4)加入200μl冰预冷的0.1M氯化钙轻轻振荡重悬菌体沉淀，冰浴30min。4℃，4,000rpm离心10min，弃上清。

5)加入100μl冰预冷的0.1M氯化钙重悬沉淀，得到制备好的感受态细胞。4℃保存，7天内使用。

1.7PCR产物与pMD-18T载体连接

所有反应体系在冰上进行，按如下体积进行：

以上反应产物于22℃水浴连接1小时。

连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞

1）取10μl连接反应液，加入到100μl上述制备的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。

2）42℃水浴中热激90s，迅速移至冰中冰浴2min。

3）加入900μl新鲜LB液体培养基，37℃，150rpm轻摇，复苏45min。

4）4,000rpm离心5min，吸弃900μl上清，将剩余的菌液用移液枪轻轻混匀。

5）取100μl细菌悬液，用无菌三角玻璃涂棒涂布于含氨卞青霉素的LB平板上，正向放置1-2小时，直至液体被充分吸收，倒置平版，与37℃培养箱中培养过夜，挑选阳性克隆，得到菌株pMD18T-saGH/JM109。

菌落PCR鉴定

从LB转化平板上挑取单菌落，接种于20ml LB培养液，37℃培养过夜，取1μl菌液作为模板进行菌液PCR鉴定。

PCR反应体系如下：

引物：

正向5'GGACTG CATATGTTCGAGAACCAGCGTCTCT 3'

反向5'CAT CTCGAGCAGGGTGCAGTTGGAATCC 3'

PCR反应条件如下：

琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。

碱裂解法提取质粒pMD18T-saGH

1)用接种环接种少量保种菌液pMD18T-saGH/JM109，于氨苄青霉素平板上划线，37℃静置培养过夜；

2）用无菌牙签挑取生长在氨苄青霉素平板上的白色单菌落，接种到20ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养过夜；

3)次日取培养的菌液1.5ml于1.5ml Eppendorf管中，12,000rpm离心30s，吸弃上清，收集菌体沉淀，加入100μl冰预冷的溶液I，剧烈振荡使沉淀完全悬浮；

4)再加入200μl溶液Ⅱ（天根质粒提取试剂盒溶液），颠倒数次混匀，待整个溶液澄清，冰浴静置5min；

5)加入150μl冰预冷的溶液Ⅲ（天根质粒提取试剂盒溶液），轻微振荡均匀，冰浴10min，澄清的溶液会出现絮状沉淀；

6)4℃,12,000rpm离心10-15min，转移上清至一个新的无菌Eppendorf管中；

7)加入等体积的酚/氯仿，充分混匀，4℃，12,000rpm，离心5min，取上清液转入另一支无菌的Eppendorf管中；

8)离心后取上清，加入900μl预冷的无水乙醇，-20℃沉淀10min；

9)12,000rpm离心15min，去上清，吸弃液体，倒置于无菌滤纸上待其干燥；

10)加入70％乙醇1ml，稍微震荡后放置2min，4℃，12,000rpm离心10min，吸弃液体，干燥；

11)DNA沉淀溶于40μl含RNase A(10mg/ml)的ddH2O中，-20℃存放。

实施例2：saGH/saGH-TAT基因片段的PCR扩增和表达载体的构建

根据saGH的序列(GenBank:AY157496.1)设计引物：

上游引物：5'GGACTGCATATGTTCGAGAACCAGCGTCTCT 3'（划线处为Nde I酶切位点，）

下游引物：5′CAT CTCGAGCAGGGTGCAGTTGGAATCC 3'（划线处为Xho I酶切位点）

另外根据TAT PTD中11个氨基酸的碱基序列通过PCR延伸法将其连在saGH片段后，引物设计如下：

上游引物：5'-GGACTGCATATGTTCGAGAACCAGCGTCTCT-3'

下游引物1：5'-TTTCTTACGGCCATACAGGGTGCAG-3'

下游引物2：5'-ACGACGCTGACGACGTTTCTTACGG-3'

下游引物3：5'-CATCTCGAGACGACGACGCTGACGACGT-3'

以上引物由Sunny公司合成。

利用提取的pMD18T-saGH为模板，50μl体系采用PCR反应.

酶切回收片断

saGH/saGH-TAT PCR产物回收片断双酶切：

表达载体pET22b(+)（购自novagen公司）质粒双酶切：

将上述反应体系组分在冰上混合并混匀，5000rpm瞬时离心，置于37℃水浴锅中保温反应3h，加反应量0.1倍体积的10×loading buffer终止反应，全部用于1%的琼脂糖凝胶电泳。回收saGH/saGH-TAT和pET22b(+)片段。在冰上混合上述液体，将10μl混合液放在无菌PCR管中，用移液枪轻轻抽吸几下混匀，5000rpm瞬时离心，将混合液集中在管底，然后16℃连接过夜，得到重组菌株pET-22b（+）-saGH-TAT/JM109。

挑取单克隆pET-22b（+）-saGH-TAT/JM109于500ul新鲜液体LB培养基（含终浓度为30ug/ml的氨苄青霉素）中，37℃，300rpm摇床培养3小时，以此菌液为模板，上游引物与下游引物3为引物进行PCR初步鉴定，其产物为saGH-TAT全长融合基因，大小约为570bp。将PCR鉴定所得阳性克隆的菌液转接50ul于20ml新鲜液体LB培养基（含终浓度为30ugml的氨苄青霉素）中，37℃，300rpm摇床培养过夜，碱裂解法小量提取质粒，用NdeⅠ和NcoI双酶切鉴定阳性重组子，并送上海生工有限公司测序，DNA序列完全一致，符合翻译阅读框。重组表达质粒pET-22b（+）-saGH-TAT的构建过程见图2-2，酶切及PCR鉴定见图3。将PCR初步鉴定为阳性的菌液小量提取质粒，再进行酶切鉴定。

单酶切：

双酶切：

将上述反应体系组分在冰上混合并混匀，5000rpm瞬时离心，置于37℃水浴锅中保温反应3h，加反应量0.1倍体积的10×loading buffer终止反应，取8μl酶切产物，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。根据单,双酶切后是否有大小正确的带来判断该质粒是否为阳性重组子。

具体构建过程如图2-2所示，首先将连入载体pMD18T的片段saGH进行PCR扩增，获得saGH片段，然后用NdeI和XhoI进行双酶切插入表达载体pET22b(+)中，获得充足表达载体pET22b(+)-saGH。另外用两轮延伸PCR进行3'添加TAT序列至saGH,获得saGH-TAT片段，然后用NdeI和XhoI进行双酶切插入表达载体pET22b(+)中，获得充足表达载体pET22b(+)-saGH-TAT。

实施例3：基因工程菌的构建及融合蛋白的诱导表达和纯化

转化方法同JM109转化法。

1)挑取转化有质粒的单菌落，接种于5ml选择性LB液体培养基中，37℃，250rpm/min振摇培养过夜。

2)次日将培养过夜的菌液200μl再接种于20ml（1:100）选择性2×YT液体培养基（17g蛋白胨，10g酵母提取物,5g NaCl，加水至1000ml）中，37℃，250rpm/min振摇培养至光密度（OD ₆₀₀=0.6）时，取1ml样本作为诱导前样本，10000g离心1min收集菌体沉淀，-20℃冻存备用。

3)加入1mol/L IPTG于菌液中，使IPTG终浓度为1mM，37℃，250rpm/min

4)振摇培养4小时。取1ml样本作为诱导后标本，同上法收集菌体沉淀，

5)-20℃冻存备用。

6)将诱导前后菌体沉淀用20~40μl ddH₂O（pH=8.0）重悬，加入等体积的2×SDS

7)上样缓冲液，煮沸加热5min，SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离，考马斯亮蓝染色3小时后，脱色观察结果。

8)选取诱导成功的细菌克隆，扩大诱导规模，收集菌体沉淀，于-20℃保存，准备做下一步分析及纯化。

经1mM IPTG 4小时诱导BL21(DE3)/pET22b(+)-saGH,BL21(DE3)/pET22b(+)-saGH-TAT及BL21(DE3)/pET22b(+)和未被诱导细菌总蛋白进行电泳分析。诱导的BL21(DE3)/pET22b(+)-saGH的蛋白大小理论值为21.5KD。BL21(DE3)/pET22b(+)-saGH-TAT理论值大小为23.1KD。SDS-PAGE都发现了目标蛋白条带，如图4所示。而未经IPTG诱导的BL21(DE3)/pET22b(+)-saGH和BL21(DE3)/pET22b(+)-saGH-TAT和BL21(DE3)/pET22b(+)均没有出现条带;经正常IPTG诱导的BL21(DE3)/pET22b(+)-saGH-TAT及BL21(DE3)/pET22b(+)-saGH表达蛋白量占总蛋白量的21%和18%。

实施例4：重组蛋白质的复性、定量和贮存

纯化后的蛋白用梯度降低的尿素溶液缓慢透析，最终用0.01×PBS透析，透析后的蛋白质溶液加入甘油（V/V 20%）-20℃贮存。

以牛血清白蛋白(BSA)为标准，采用Tiangen公司蛋白质定量试剂(protein assay)比色测定蛋白质的含量，其步骤是：

1)将Bradford试剂工作液平衡至室温并颠倒混匀，将酶标仪预热。

2)将0、1、2、4、8、12、16、20μl牛血清蛋白（BSA）标准溶液（1mg/ml）依次加入酶标微孔板中，用10mM PBS补足至20μl。

3)向每孔中加入200μl Bradford试剂工作液（0.1%考马斯亮蓝G250，5%（v/v）乙醇，8.5%（v/v）磷酸）振荡混匀后室温放置2分钟。

4)用酶标仪测BSA蛋白各浓度的OD₅₇₀值。以BSA蛋白浓度为横坐标，BSA蛋白各浓度的OD₅₇₀值为纵坐标制作标准曲线。

5)用同样的方法测定样品的OD₅₇₀值，从标准曲线中确定样品的浓度。

纯化蛋白saGH和saGH-TAT含量测定结果：

首先用Bradford做出标准曲线，Bradford法测定saGH蛋白的浓度得到加入甘油前的蛋白浓度为0.745mg/ml.总共浓缩纯化了6ml的蛋白液，所以总活性蛋白为4.5mg。

同样方法测定saGH-TAT甘油溶液浓度为：0.564mg/ml。

实施例5：兔抗saGH抗血清制备

选择体重在2.0Kg左右的健康日本大耳白兔进行免疫。第一次免疫前耳缘静脉采血1ml，取得血清，与待注射抗原进行反应，确定其为阴性反应。免疫程序按表5-1进行，第一次免疫用抗原用弗氏完全佐剂包裹，第二次和第三次免疫用抗原用弗氏不完全佐剂包裹。从第三次免疫后一周采血测定抗血清效价，当效价达到要求后从心脏采全血，37℃放置2h，4℃静置过夜，待血清析出后4000rpm离心10min，收集抗血清分为两份，其中一份加入0.05%的NaN3，分装后-20℃冻存备用。另一份直接保存于-20℃备用。

表1用纯化的saGH蛋白作为抗原的免疫程序

注射次数	间隔时间	抗原量(ml)	注射部位
				第一次	2周	1	背部和腿部
第二次	2周	1	背部和腿部
				第三次	15天	1	背部和腿部

注：抗原浓度为500mg/ml.

5.1血清中抗体的测定(间接ELISA法)，其步骤是：

1)用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。

2)加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(羊抗兔)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用ddH2O洗涤。

3)加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的OPD底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

4)终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

5)结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、”“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

(样品OD₄₅₀—空白对照OD₄₅₀)/(阴性对照OD₄₅₀—空白对照OD₄₅₀)≥2.1即为阳性。

取前述制备得到的重组saGH用CBS(碳酸盐缓冲液)稀释为10μg/ml作为ELISA测定抗血清效价的抗原，以免疫前血清为阴性对照，测得免疫兔后得到的血清抗体滴度(结果见表2)，以大于阴性对照平均OD值2.1倍为阳性，可知此血清抗体滴度至少为1:12800。

表2兔抗重组saGH抗血清的效价测定

5.2Protein A法纯化抗体：

1)将血清于4℃，12000r/min离心15min，去除杂质，收集上清。

2)将2ml抗血清用Binding Buffer稀释到30ml，以10000g，4℃离心15min，收集上清并用0.45μm滤膜过滤。

3)将处理好的样品连续上样三次，以1ml/5min的速度流过预先用Binding Buffer平衡好的ProteinA Sepharose^TM CL-4B柱（1×10cm玻璃柱，内装2.5ml ProteinA Sepharose填料）。

4)用Binding Buffer以0.5ml/min的流速洗脱柱子直到基线稳定。

5)用Elution Buffer以0.25ml/min的流速洗脱IgGs，分步收集洗脱液，为保持抗体IgGs的活性，收集的同时在每1ml洗脱液中加入200μl Neutralizing Buffer并立即混匀。

6)装入透析袋（截流分子量12kDa）透析过夜；

7)用聚乙二醇20000透析袋浓缩IgGs溶液，从透析袋中分装成小份后保存于-20℃。

8)用SDS-PAG分析抗体IgGs的纯化效果。

备注：透析袋使用前用10mmol/L NaHCO₃、1mmol/L EDTA溶液煮沸透析袋30min，煮沸之后，用双蒸水充分洗涤透析袋。

5.3抗体含量测定：

用Bradford法检测抗体含量。

首先建立标准曲线图：

根据公式Y=0.0011x+0.7520已知测得的saGH-IgG的OD570=1.654，代入公式计算得到纯化后的saGH-IgG含量为820μg/ml。

5.4抗体纯度分析

同SDS-PAGE电泳分析。

抗体纯化及含量纯度以及效价分析结果：

兔抗saGH抗血清经Protein A亲和层析纯化后用SDS-PAGE法检测抗体纯化的纯度（结果图5所示），电泳结果显示：未纯化的兔抗血清含有许多血清蛋白成分，而经过ProteinA纯化的IgG则为一条较深的主带，大小为55kD,为IgG重链的大小。另外在22kD处还有一条较浅的带，为IgG轻链大小。纯化结果比较理想。

纯化后抗体效价测定：

结果见表3，可知当纯化的saGH IgG滴度至少是1：12800。

表3兔抗重组saGH蛋白的效价测定

实施例6：蛋白质印迹实验(Western Blot)

用表达的融合蛋白作为样品进行SDS-PAGE。

在SDS-PAGE电泳结束后，将凝胶、6张滤纸和一张硝酸纤维素膜(NC膜)共浸于转移缓冲液中，注意硝酸纤维素膜要均匀地浸透。将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，准备转移体系:阴极夹板一海绵一三层滤纸一凝胶一硝酸纤维膜一滤纸一海绵一阳极夹板。将述转移体系垂直置于电转移槽中，硝酸纤维膜对阳极，凝胶对阴极。4℃，90V，电转移4-6h，然后对硝酸纤维膜上的样品进行免疫测定。电转移完毕后，取出膜，用TBS洗涤1次。将膜放入封闭液中，于室温封闭1h或4℃封闭过夜。用封闭液稀释的一抗(分别用本发明纯化后的抗体和抗血清)至10μl/ml，与膜在室温下作用1小时。TBST洗膜4次，每次15min，按试剂盒说明书稀释酶标记的二抗，二抗与膜于室温下作用30min。TBST洗膜4次，每次15min，按试剂盒说明书加入显色液，于室温轻轻摇动温育之。仔细观察蛋白带的生色反应，一旦蛋白带的颜色深度达到要求，约2-3min，即用水略为漂洗，然后把滤膜转移到内装PBS溶液的培养皿中，终止反应。拍照保留结果。

蛋白质印迹实验结果：

兔抗血清可与转有融合蛋白的saGH和saGH-TAT的NC膜发生反应，相对分子质量约为21KDa和23KDa部位显示特异性条带（图6）。而将正常兔血清作为对照，发现正常兔血清不发生反应。以纯化后的抗体实验得到和抗血清相同的结果。说明制得的抗血清能和saGH发生特异性结合，纯化的过程不会破坏抗体的活性。

实施例7：用酶联免疫吸附受体法检测鲇生长激素的生物活性

7.1鱼肝受体制剂的制备

将从渔场购来的鲜活鲇杀死后，用剪刀剪碎取出的肝脏后加5倍于肝重的缓冲液[0.02MTris-HCl(pH7.5)，6mM MgCl₂，0.3M蔗糖];匀浆后置1500g离心30min，收集上清再用100000g离心60min，倾去上清收集沉淀重悬于上述缓冲液中。用Bradford方法测定受体膜制剂中的蛋白质含量，然后稀释成4mg/ml，分装后置-30℃保存备用。

7.2ELISA-RA程序

1)包被：用0.05mol/L Na2CO₃-NaHCO₃包被缓冲液以1:25稀释受体膜，终浓度200μg/ml，添加到酶标板中，每孔100μl 4℃包被过夜。

2)封闭：每孔添加100μl 0.5%BSA，37℃封闭1h。

3)添加蛋白：用含0.05%Tween-20的PBS洗板3次后，在每孔中加入100μl梯度稀释的蛋白溶液，37℃孵育2h。

4)添加一抗：洗板3次后，每孔加入100μl按照1:500倍稀释的鲇GH抗体溶液，37℃孵育1h。

5)添加HRP标记的二抗：洗板3次后，每孔加入100μl按照1:20000倍稀释的HRP标记的二抗，孵育1-2h。

6)洗板4次后，每孔加入100μl反应显色液（OPD），37℃避光反应10-20min。加入50μl反应终止液（2M硫酸）。

7)检测：用Bio-Rad450全自动酶标仪检测每孔在490nm处的吸光值。

实施例8：促生长实验

11组处理如下：

12)非处理组；

13)0.7%（w/v）生理盐水腹腔注射组；

14)5μg/g体重saGH-TAT腹腔注射组；

15)1μg/g体重GH-TAT腹腔注射组；

16)0.1μg/g体重GH-TAT腹腔注射组；

17)5μg/g体重saGH腹腔注射组；

18)1μg/g体重GH腹腔注射组；

19)0.1μg/g体重GH腹腔注射组；

20)1μg/g体重saGH口服组；

21)1μg/g体重saGH-TAT口服组；

22)0.7%生理盐水口服组。

每周测体长、体重，处理六周。

另外，设定三组口服实验分别按照体重的10%比例投喂饲料，重组蛋白包封量为5μg/g体重。促生长作用统计结果：

表4为尼罗罗非鱼体重和体长随时间增长的统计数据。

表4鱼体重体长增长统计表

根据体重增长趋势做出柱形增长图（图12，图13）。

实施例9：耐渗透压实验

罗非鱼先在淡水中喂养，转入海水之前3天停止给鱼喂食。大小相似的鱼随机分组（2-3g），保证所有实验组中鱼体生长状况相似。纯化的saGH和saGH-TAT溶于自来水中。9.1正常鱼体对海水海水渗透压耐受力：

以海水盐度（3.5%）为参照标准，见表5.

表5罗非鱼耐渗透压试验统计表

注：温度为（25土1）℃

9.2鲇生长激素（saGH和saGH-TAT）对海水存活力的影响：

鲇生长激素（saGH和saGH-TAT）对海水存活力的影响：

在各种溶液处理罗非鱼苗为2个小时的情况下，罗非鱼的存活率很相似，只发现当其它所有的鱼体死亡的时候，saGH-TAT组处理的罗非鱼苗还有20%的存活。

表6为将浸泡时间增加到24小时后的结果：

表6罗非鱼苗渗透压实验存活率统计结果

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉凯肽来生物科技有限公司

<120> 鲇生长激素与穿肠膜肽TAT融合蛋白及制备方法和应用

<130> 鲇生长激素与穿肠膜肽TAT融合蛋白及制备方法和应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 567

<212> DNA

<213> 鲇

<400> 1

ttcgagaacc agcgtctctt caacaacgca gtcatccgtg tgcaacacct tcatcagctg 60

gctgccaaaa tgatggatga ctttgaggaa gctttgctac ctgaagaacg caaacagctg 120

agcaagatct tcccattgtc cttctgcaac tcagactcca tcgaagctcc atcaggcaaa 180

gacgaaaccc agaagagttc tgtgttgaag ctgctgcaca cctcctaccg tctgatcgag 240

tcatgggagt tccccagtaa gaacctgggc aaccctaatc acatctcaga gaagctggct 300

gacctgaaaa tgggcatcgg tgtgcttatc gagggatgta tggatggaca aaccagcctg 360

gatgagaacg actctctggc tccacccttt gaggatttct accagaccct aaccgaggga 420

aacctgagga aaagcttccg tctgctctcc tgcttcaaga aggacatgca caaagtggag 480

acctatctga gcgtggccaa gtgccgtcgt tccctggatt ccaactgcac cctgtatggc 540

cgtaagaaac gtcgtcagcg tcgtcgt 567

<210> 2

<211> 189

<212> PRT

<213> 鲇

<400> 2

Phe Glu Asn Gln Arg Leu Phe Asn Asn Ala Val Ile Arg Val Gln His

1 5 10 15

Leu His Gln Leu Ala Ala Lys Met Met Asp Asp Phe Glu Glu Ala Leu

20 25 30

Leu Pro Glu Glu Arg Lys Gln Leu Ser Lys Ile Phe Pro Leu Ser Phe

35 40 45

Cys Asn Ser Asp Ser Ile Glu Ala Pro Ser Gly Lys Asp Glu Thr Gln

50 55 60

Lys Ser Ser Val Leu Lys Leu Leu His Thr Ser Tyr Arg Leu Ile Glu

65 70 75 80

Ser Trp Glu Phe Pro Ser Lys Asn Leu Gly Asn Pro Asn His Ile Ser

85 90 95

Glu Lys Leu Ala Asp Leu Lys Met Gly Ile Gly Val Leu Ile Glu Gly

100 105 110

Cys Met Asp Gly Gln Thr Ser Leu Asp Glu Asn Asp Ser Leu Ala Pro

115 120 125

Pro Phe Glu Asp Phe Tyr Gln Thr Leu Thr Glu Gly Asn Leu Arg Lys

130 135 140

Ser Phe Arg Leu Leu Ser Cys Phe Lys Lys Asp Met His Lys Val Glu

145 150 155 160

Thr Tyr Leu Ser Val Ala Lys Cys Arg Arg Ser Leu Asp Ser Asn Cys

165 170 175

Thr Leu Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

180 185

Claims

1.一种分离重组的基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.一种分离重组的融合蛋白，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

3.一种表达权利要求2所述蛋白的大肠杆菌基因工程菌株，其特征在于：大肠杆菌（Esch erichia coli）BL21（DE3）pET-22b(+)-saGH-TAT，F-ompT hsdS_B(r_B ^-m_B ^-)gal dcm(DE3)；C CTCC NO：M2012126。

4.权利要求2所述融合蛋白的制备方法，其步骤是：

A.鲇生长激素基因的制备：获取鲇头部脑垂体，根据GeneBank中已经发表的鲇科鱼类GH的序列设计PCR兼并引物，以上述脑垂体提取的RNA作为模板反转出cDNA，PCR扩增目的基因saGH，PCR产物通过DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物并将其克隆到pM D18-T载体中，挑取单菌落用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，得到的阳性克隆子即为包含saGH基因的大肠杆菌，用于基因的扩增和保藏；

B.通过重叠延伸PCR的方法将TAT33bp碱基连入saGH的3'端构成saGH-TAT，将P CR产物组装入pMD18-T载体，转化大肠杆菌JM109，挑取单菌落用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序。得到的阳性克隆子即为包含saGH-TAT的大肠杆菌，用于基因的扩增和保藏；

C.融合基因的制备及表达载体的构建：首先双酶切重组质粒pMD18-T-saGH-TAT和质粒pET-22b（+）,胶回收含saGH-TAT基因的片段和开环pET-22a（+）片段，16℃连接后转化到感受态E.coli中，所得到的阳性克隆子是包含saGH-TAT融合基因的大肠杆菌；

D.基因工程菌的制备：将步骤C中制得的质粒pET-22a（+）-saGH-TAT转化到感受态BL21（DE3）中，PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为本发明涉及的能够表达s aGH-TAT的大肠杆菌基因工程菌株。

E.基因工程融合蛋白的制备：将步骤D制得的大肠杆菌基因工程菌株转接到2×YT培养基中，融合蛋白saGH-TAT以包涵体的形式高效表达。

5.权利要求2所述融合蛋白在促进罗非鱼体重增长中的应用。

6.权利要求2所述的融合蛋白在增强罗非鱼耐高渗透压海水中的应用。

7.权利要求2所述融合蛋白在促进罗非鱼体长增长中的应用。