CN102250255B

CN102250255B - 抗对虾白斑综合症病毒工程蛋白tat-vp28-gh及制备和用途

Info

Publication number: CN102250255B
Application number: CN2011101772458A
Authority: CN
Inventors: 孟小林; 徐进平; 王健; 张毅
Original assignee: GUANGXI NANNING ZHONGDA BIOLOGICAL ENGINEERING CO LTD
Current assignee: GUANGXI NANNING ZHONGDA BIOLOGICAL ENGINEERING CO LTD
Priority date: 2011-06-28
Filing date: 2011-06-28
Publication date: 2013-03-06
Anticipated expiration: 2031-06-28
Also published as: CN102250255A

Abstract

本发明公开了一种抗对虾白斑综合症病毒工程蛋白TAT-VP28-GH及制备和用途，其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸和SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，菌株为重组基因工程菌株Escherichiacoli BL21pET-32a-TAT-VP28-GH。从对虾体中提取WSSV并通过PCR获得VP28基因，通过PCR的方法扩增TAT-VP28序列。取鲤鱼脑垂体，提取总mRNA，通过RT-PCR得到总cDNA，再PCR获得鲤鱼生长激素成熟肽基因，其上游插入了酸水解位点天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro-Asp)；然后构建重组质粒pET-32a-TAT-VP28-GH。将重组质粒pET-32a-TAT-VP28-GH转化大肠杆菌BL21，在IPTG的诱导下，融合蛋白TAT-VP28-GH以可溶的形式得到高效表达,该融合蛋白能有效地预防对虾患对虾白斑综合症及促进对虾生长发育。

Description

抗对虾白斑综合症病毒工程蛋白TAT-VP28-GH及制备和用途

技术领域

本发明涉及基因生物工程技术领域。更具体涉及一种重组融合蛋白TAT-VP28-GH亚单位疫苗，同时还涉及一种大肠杆菌基因工程菌株的制备方法，具体涉及构建和高效表达可溶一种蛋白转导结构域多肽(TAT-PTD)，对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白VP28和鲤鱼生长激素(carp mature growth hormone)成熟肽(简称GH)的融合蛋白的基因工程菌株；还涉及上述菌株表达的融合蛋白抗对虾白斑综合症病毒和促进对虾生长的用途。

背景技术

对虾养殖业是我国沿海地区海水养殖的支柱性产业，1990年代初，全国对虾养殖面积达到16万公顷，最高年产量达到22万吨，约占全球对虾养殖总产量的30％。1988-1992年，以中国对虾为主要养殖品种的我国对虾养殖产量连续5年居世界第一，年产值40多亿人民币。从1992年开始，在沿海对虾养殖地区暴发了大规模对虾病毒性流行病虾白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)，是中国对虾养殖业的主要病原，该病是一种病程短、死亡率高的疾病。对对虾养殖业造成了巨大的经济损失。

WSSV是一种有囊膜的环状双链DNA病毒，其形态学与杆状病毒相似，呈长杆状，具有双层囊膜。完整的病毒粒子主要包括囊膜、核衣壳及病毒核心三部分。自WSSV在全世界范围内爆发以来，ICTV现将WSSV列为新建的线头病毒科(Nimaviridae)、白斑病毒属(Whispovirus)的代表种。WSSV有较广的宿主范围，除了可以感染虾、蟹类等甲壳动物外，桡足类及部分节肢动物也可以成为该病毒的传播者及携带者。目前有三株毒株全基因组序列已经测定。(1)台湾株(WSSV-TW，GenBank accession No.AF440570)，病毒分离自台湾的斑节对虾((Penaeusmonodon)，序列全长307,287bp；(2)泰国株(WS SV-TH，GenBankaccession No.AF369029)病毒分离自泰国的斑节对虾(Penaeus monodon)，以克氏鳌虾(Procafnbarus clarkia)作宿主感染增殖后纯化测序，序列全长292,967bp；(3)中国株(WSSV-CN，GenBank accession No.AF332093)，病毒分离自中国大陆的日本对虾(Penaeus japonicus)，序列全长305,107bp。基因组序列分析表明3株WSSV分离株的核营酸序列有99.32％的同源性。迄今为止，科学家们发现WSSV完整粒子的结构蛋白(Structural proteins)达到39个，其中囊膜蛋白(Envelope)21个，核衣壳蛋白(Nucleocapsid)10个，被膜蛋白(Tegument)5个。囊膜蛋白是结构蛋白最主要的成员之一，一般认为这些蛋白与病毒和宿主细胞的结合、侵入以及子代病毒的包装有关。VP28是WSSV含量最丰富囊膜蛋白，它在N-末端和C-末端都具有穿膜结构，该蛋白还具有许多潜在糖基化位点。研究人员应用VP28蛋白的多克隆抗体进行了病毒的中和实验，结果表明VP28的抗体可以中和WSSV病毒颗粒，在一定程度上阻碍病毒的感染。目前用各种表达载体表达囊膜蛋白VP28，其作为亚单位疫苗，口服、注射VP28免疫各种虾类并显著提高存活率的报道很多。如Witteveldt利用原核表达载体在大肠杆菌中重组表达VP28融合蛋白，将纯化的VP28融合蛋白通过肌肉注射到对虾体内，在肌肉注射后第2天及第25天分别进行病毒攻击实验，结果发现与对照组相比，VP28融合蛋白注射组存在较高的相对存活率(Jeroen Witteveldt，Just M.Vlak，Marielle C.W.，vanHulten.Protection of Penaeus monodon against white spot syndrome virus using aWSSV subunit vaccine[J].Fish & Shellfish Immunology.2004，16：571-579)。Du利用昆虫细胞表达系统来表达重组的VP28蛋白，重组蛋白经肌肉注射进入鳌虾体内。并注射后第10天进行病毒攻击实验，结果发现昆虫细胞表达的重组蛋白与对照组相比，对鳌虾有较好的保护作用(Huahua Du，Zirong Xu，Xiaofeng Wu，WeifenLi，Wei Dai.Increased resistance to white spot syndrome virus in Procambarus clarkiiby injection of envelope protein VP28 expressed using recombinantbaculovirus[J].Aquaculture.2006，260：39-43)。Ning以减毒的沙门氏菌作为转运载体，将带有vp28基因的真核表达载体pcDNA3.1转化入减毒的沙门氏菌中，并将重组菌以口服的方式免疫克氏原鳌虾。在免疫后第7、15、25天分别进行病毒攻击实验，结果得到的相对存活率分别为88.3％、66.7％和56.7％(Jian-FangNing，Wei Zhu，Jin-Ping Xu，Cong-Yi Zheng，Xiao-Lin Meng.Oral delivery of DNAvaccine encoding VP28 against white spot syndrome virus in crayfish by attenuatedSalmonella typhimurium.Vaccine[J].2009，27：1127-1135)。

蛋白质转导结构域(protein transduction domain，PTD)或称细胞穿膜肽(cellpenetrating peptides，CPPs)是一条以肽为载体的有效运输各种物质进入细胞及细胞核的系统。通过PTD携带的物质有全长蛋白质、DNA、化学药物、寡核苷酸、40nm磁珠和200nm脂质体等。现在研究最多、应用范围最广的蛋白转导域来源于人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的转录激活因子(Trans-activating transcriptionalactivator，Tat)。Schwarze等确定该蛋白转导功能的最小肽段是由11个氨基酸组成，其序列为YGRKKRRQRRR，该段等电点12.7，为碱性多肽，转导速度快，效率高。TAT可以将与之相连的多肽或全长蛋白质在数分钟内转导进入细胞，而且在体内可以通过血液循环运输至脑组织，跨越血脑屏障进入神经元或胶质细胞内。TAT蛋白质转导结构域序列中由于有6个精氨酸和2个赖氨酸残基，因此是带有高度正电荷的多肽。以不带电荷的丙氨酸替代其中的任何一个碱性氨基酸残基都会使穿膜活性降低，而替代序列中的其他氨基酸残基时穿膜活性则不会发生改变。这说明TAT穿膜肽所带的正电荷是其穿膜功能所必需的，因此推测这些正电荷很可能是能够与真核细胞的细胞膜发生强的静电作用，从而介导了穿膜过程。

鱼的生长激素是一种由鱼的脑垂体分泌的多肽类激素，具有促进鱼的生长发育和调节体内代谢的作用。现研究证明鱼生长激素对某些贝类幼体及对虾苗也有明显的促进生长发育和提高免疫力的作用。

鱼类的GH基因主要有两种类型，分别以鲑鳟鱼类和鲤科鱼类为代表。GH的作用途径有两种，一种是诱导肝细胞、肌细胞产生IGFs等生长介导素(somatomedins)，再经IGF间接起作用，另一种是GH激活JAK2(Janus Kinase)，JAK2及GHR(生长激素受体)磷酸化，并同磷酸化的受体一起将GH信号向下游传递。无论哪一种方式GH都需要首先同细胞表面的特异性受体即GHR结合，再由受体介导，激发一系列生化反应并最终产生生物效应。

鱼类GH的作用的发生，主要是通过IGFs的间接方式。IGFs属于胰岛素家族成员，包括IGF-I和IGF-II两个亚型，合成部位主要在肝脏，其合成和分泌主要由GH控制，生长激素能诱导肝脏中IGF-I和IGF-II的合成。反过来，IGF对GH的合成和分泌有抑制作用。鱼类的生长和其它脊椎动物一样，是通过脑神经内分泌-GH-IGF轴来实现的。

本发明将一种蛋白转导结构域多肽(TAT-PTD)，对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白VP28和鲤鱼生长激素(carp mature growth hormone)成熟肽(简称GH)的三者构建成融合蛋白，并在VP28和GH之间插入酸水解位点，使可溶性融合蛋白在酸性、高温条件下或在对虾的胃里水解开来，并保持了其各自的天然构像，能更有效地行使各自的功能从而达到防治WSS的目的和促进对虾生长发育。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种大肠杆菌基因工程菌株，该菌株可以表达蛋白转导结构域多肽(TAT-PTD)，对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白VP28和鲤鱼生长激素(carp mature growth hormone)成熟肽基因工程融合蛋白TAT-VP28-GH。其优点是表达量大且可溶，易于工业化生产，成本低，安全性好。

本发明的另一个目的是在于提供了一种重组融合蛋白TAT-VP28-GH亚单位疫苗的制备方法，能够预防对虾白斑综合症(WSS)，促进对虾生长发育。通过注射、口服应用于对虾养殖试验，结果证明TAT-VP28-GH共同作用可以明显提高对虾的抗WSSV感染的能力和促进对虾生长发育。

本发明的再一个目的是在于提供了一种重组融合蛋白TAT-VP28-GH在制备治疗或预防对虾白斑综合症(WSS)药物中的应用。通过基因工程生产的TAT-VP28-GH融合蛋白可以作为抗WSS病原的微生物和促进对虾生长发育的药物应用于对虾养殖业，能够显著提高对虾的免疫力，抗病能力，促进生长发育。

本发明的再一个目的是在于提供了一种重组融合蛋白TAT-VP28-GH在对虾养殖业中的应用。将蛋白转导结构域多肽TAT和VP28融合表达。TAT可以携带VP28蛋白不经肌肉注射而直接进入血淋巴中。蛋白转导结构域多肽TAT目前还没有直接应用于养殖业，但其独特的穿膜效率十分具有吸引力。解决了使亚单位疫苗可以不经肌肉注射而直接进入血淋巴中，使其具有实际操作的可行性。而且本发明公开的基因工程菌株的构建方法可以应用于大规模的养殖业中，表达量大，操作简单，成本低。

本发明的技术方案如下：

本发明的技术要点之一是表达基因工程重组融合蛋白TAT-VP28-GH的大肠杆菌基因工程菌株的构建及诱导表达。

本实验所涉及的分子生物学方法为常规方法，为本领域人员所熟悉。本发明中未详细阐述的请参见《分子克隆实验指南》J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔等主编。

一种重组融合蛋白TAT-VP28-CD亚单位疫苗的制备方法，其步骤如下：

1、WSSV的VP28基因的制备：

(1)WSSV病毒基因组的制备：在冰上取患病对虾的鳃、胃和心脏，冰浴匀浆，然后加入蛋白酶K(100ug/ml)，在沸水中煮15分钟，立即冰浴5分钟，12000rpm离心10分钟，取其上清置4℃保存。

(2)PCR扩增VP28基因：根据GeneBank中已经发表的WSSV(GeneBank：EU414753)的序列设计PCR引物，以上述上清作为模板DNA，PCR扩增目的基因VP28，PCR产物通过DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物并将其克隆到pGEM-T载体(在promega公司购置)中，转化到大肠杆菌JM109(在INVITROGEN公司购置)，挑取单菌落培养，用碱裂解法小量(15-20ug)提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，得到的阳性克隆子即为包含VP28基因的大肠杆菌，命名为pGEM-T-vp28。

2、融合基因tat-vp28的制备及表达载体的构建：

(1)PCR扩增tat-vp28基因：上游引物为3条、下游引物为1条：分三次PCR合成tat-vp28：以pGEM-T-vp28质粒为模板，上游引物P1：CAGCGTCGTCGTGGATCCATGGATCTTTCTTTCA，下游引物1：GGCCTAGGTCTACTCGGTCTCAGTGCCAGAGTA，退火温度56℃，做PCR扩增目的片段，电泳并作回收；以上一步回收产物为模板，上游引物P2：CGTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTGGATCC，下游引物1GGCCTAGGTCTACTCGGTCTCAGTGCCAGAGTA，退火温度56℃做PCR，电泳并作回收；以上一步回收产物为模板，上游引物P3：GCGGAATTCGGCTATGGCCGTAAAAAACGTCGT，下游引物1GGCCTAGGTCTACTCGGTCTCAGTGCCAGAGTA，退火温度56℃做PCR。PCR扩增目的基因TAT-VP28，PCR产物通过DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物并将其克隆到pGEM-T载体(在promega公司购置)中，转化到大肠杆菌JM109(在INVITROGEN公司购置)，挑取单菌落培养，用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，得到的阳性克隆子即为包含TAT-VP28基因的大肠杆菌，命名为pGEM-T-tat-vp28。

3、鲤鱼生长激素(carp mature growth hormone)成熟肽基因的制备：(1)鲤鱼生长激素(carp mature growth hormone)成熟肽基因的制备：取鲤鱼脑垂体，按照RNA提取试剂盒的方法提取其总mRNA后，通过RT-PCR得到总cDNA，根据GenBank鲤鱼生长激素的cDNA序列，设计并合成引物，以上述得到的总cDNA为模板，PCR扩增得到鲤鱼生长激素GH基因，PCR产物通过DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物并将其克隆到pGEM-T载体(在promega公司购置)中，转化到大肠杆菌JM109(在INVITROGEN公司购置)，挑取单菌落培养，用碱裂解法小量(15-20ug)提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，得到的阳性克隆子即为包含GH基因的大肠杆菌，命名为pGEM-T-GH。根据carpmature growth hormone基因的成熟肽序列，即去掉信号部分，并插入酸水解位点Asp-Pro-Asp，重新设计引物(上游引物：CGCGTCGAC

ATGTCAGACAACCAGCG划线处为Sal I位点，方框内为Asp-Pro-Asp酸水解位点。下游引物：_GGCCTCGAGCTACAGGGTGCAGTTGG(划线处为Xho I位点，粗体为终止密码子)。以上述pGEM-T-GH质粒为模板，PCR扩增GH基因。PCR产物通过DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物并将其克隆到pGEM-T载体(在promega公司购置)中，转化到大肠杆菌JM109(在INVITROGEN公司购置)，挑取单菌落培养，用碱裂解法小量(15-20ug)提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，得到的阳性克隆子即为包含酸水解位点的CD基因的大肠杆菌，命名为pGEM-T-GH(Asp-Pro-Asp)。

4、融合基因的制备及表达载体的构建：

(1)同时双酶切pGEMT-GH(Asp-Pro-Asp)和pGEMT-TAT-VP28，胶回收开环质粒pGEMT-TAT-VP28和含GH基因的片段，4℃连接后转化到感受态E.coli中，所得到的阳性克隆子命名为pGEMT-TAT-VP28-GH。

(2)用EcoR I和Xhol I双酶切质粒pGEMT-TAT-VP28-GH和质粒pET-32a(+)(在INVITROGEN公司购置)，目的片段TAT-VP28-GH和开环pET-32a(+)胶回收后16℃连接过夜，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，挑取单菌落培养，用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，得到的阳性克隆子即为包含TAT-VP28-GH基因的大肠杆菌，命名为pET-32a(+)-TAT-VP28-GH。

5、大肠杆菌基因工程菌的制备：

将质粒pET-32a(+)-TAT-VP28-GH(1ul)转化大肠杆菌BL21(DE₃)(本实验室保存)感受态细胞。PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为本发明涉及的能够融合表达TAT-VP28-GH的重组基因工程菌株Escherichia coli BL21(DE3)pET-32a-TAT-VP28-GH。

6、基因工程融合蛋白TAT-VP28-GH的表达：

重组基因工程菌株Escherichia coli BL21(DE3)pET-32a-TAT-VP28-GH的单菌落接种到20ml新鲜液体LB(含终浓度为的100ug/ml氨苄青霉素)培养基中。37℃200rpm摇床培养过夜。将5ml过夜培养物分别同时接种到200ml 2×YT(含终浓度为的100ug/ml氨苄青霉素)培养基。37℃200rpm摇床培养至OD600为0.6时(约3小时)加入终浓度为0.6mmol/L IPTG，37℃诱导4h后，离心12000g，4℃，10min收集菌体，用10mMPBS(pH8.0)重悬超声波破碎，离心收集上清和沉淀并用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。以优化后的条件扩大培养，超声波破碎后，离心(12000g，4℃，20min)收集上清。融合蛋白TAT-VP28-GH的纯化按Ni-NTA说明书进行，用SDS-PAGE检测蛋白纯化结果。得到纯化的TAT-VP28-GH蛋白。

一种大肠杆菌基因工程菌株，其特征在于，该菌株为重组基因工程菌株Escherichia coli BL21(DE3)pET-32a-TAT-VP28-GH，CCTCC NO：M 2011197。

所述的重组基因工程菌株Escherichia coli BL21(DE3)pET-32a-TAT-VP28-GH，重组质粒pET-32a-TAT-VP28-GH为本发明所构建。所述的重组大肠杆菌菌株Escherichia coli BL21(DE3)pET-32a-TAT-VP28-GH是具有质粒pET-32a-TAT-VP28-GH的大肠杆菌菌株，保藏编号：CCTCC NO：M201197，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2011年6月14日，分类命名：Escherichia coli BL21(DE3)pET-32a-TAT-VP28-GH，F-ompT hsdS_B(r_B ^-m_B ^-)gal dcm(DE3)。所述的编码基因BL21(DE₃)pET-32a-TAT-VP28-GH是具有SEQUENCE NO.1的核苷酸序列的蛋白编码基因。所述的蛋白BL21(DE₃)pET-32a-TAT-VP28-GH是具有SEQUENCE NO.2的氨基酸序列的蛋白。一种分离的蛋白质，其序列为SEQUENCE NO.2所示的氨基酸序列。该大肠杆菌菌株有以下特性，最适生长温度为37℃，菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、呈灰色。BL21(DE₃)以T7 RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区域整合于BL21的染色体上。

一种重组融合蛋白TAT-VP28-GH亚单位疫苗在制备治疗或预防对虾白斑综合症(WSS)药物中的应用和一种重组融合蛋白TAT-VP28-GH亚单位疫苗在对虾养殖业中的应用。其过程是：

试验设有阴性对照、阳性对照、基因工程融合蛋白TAT-VP28-GH I(1×10¹⁰个菌/mL)、II(1×10⁹个菌/mL)和III(1×10⁸个菌/mL)共5组处理，每组处理各设二个重复，各处理养殖箱贴上相应标签。各处理样品分别包被对虾饲料的方法：包被剂0.0300克，加淡水25mL，搅拌均匀后；待成胶体状后分别移取2mL至贴有试验处理标签的小塑料盆中；用移液枪分别准确移取2mL的I、II、III和淡水2mL、淡水2mL加入相应小塑料盆中(I、II、III、阴性对照、阳性对照)；各自搅拌均匀后，再分别加入10克的对虾饲料0号(1号)料拌匀，凉干备用。

逐日早晚观察记录并打捞各处理项目养殖箱内的死虾，统计累计死亡头数。7月19日实验结束后，统计各处理养殖箱内剩余活虾及虾总重量，计算最后的存活率和平均体重增加率。

试验结果表明口服基因工程融合蛋白TAT-VP28-GH的养殖箱，经WSSV口服侵染16天后南美白对虾存活率分别是：I为100％；II为98.36～100.00％；III为98.41～100.00％。未经口服基因工程融合蛋白TAT-VP28-GH的阳性对照，经WSSV口服染16天后存活率仅为22.35～48.62％。这表明口服基因工程融合蛋白TAT-VP28-GH的南美白对虾能有效预防WSSV的侵染，而且单位高的效果更好。

从表2可以看出口服基因工程融合蛋白TAT-VP28-GH的养殖箱，经WSSV口服侵染试验结束后较阴性对照平均每头虾增重率分别是：I为3.2％；II为3.0％；III为4.2％。这表明口服基因工程融合蛋白TAT-VP28-GH能促进南美白对虾体重增加。

本发明与现有报道的单一VP28亚单位疫苗相比，其优势在于：(1)本发明所涉及的TAT-VP28-GH重组蛋白，TAT可以携带VP28-GH蛋白不经肌肉注射而直接进入血淋巴中。解决了使亚单位疫苗可以不经肌肉注射而直接进入血淋巴中，使其具有实际操作的可行性。(2)在VP28和CD之间插入酸水解位点脯氨酸-天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro-Asp)，重组蛋白经对虾口服之后能在虾胃酸性条件下水解成单独TAT-VP28和GH天然分子，能更好地发挥其阻断病毒感染和促进虾体生长的双重功能。(4)本发明所涉及的融合蛋白TAT-VP28-GH为可溶蛋白，便于大规模生产，成本低廉，操作工艺简单；

附图说明

图1为一种重组表达质粒pGEM-T-TAT-VP28-GH的构建过程示意图。

图2为一种重组表达质粒pET-32a(+)-TAT-VP28-GH的构建过程示意图。

图3为一种重组表达质粒pET-32a(+)-TAT-VP28-GH的酶切和PCR鉴定图。

1.D2000 2.TAT-VP28-GH PCR产物 3.pET-32a(+)-TAT-VP28-GH质粒 4.pET-32a(+)-TAT-VP28-GH单切/Sal I 5.pET-28a(+)-TAT-VP28-CD双切/EcoR I、Xho I 6.MarkerIV。

图4为一种SDS-PAGE鉴定图。

1：蛋白Marker；2：诱导后的Escherichia coli BL21(DE3)pET-32a样品；3：未诱导的Escherichia coli BL21(DE3)pET-32a-TAT-VP28-GH样品；4：诱导后的Escherichia coli BL21(DE3)pET-32a-TAT-VP28-GH样品。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例子对本发明作进一步说明。在实施例中涉及的所有培养基和分子生物学操作方法为本领域技术人员所熟知。本实验所涉及的分子生物学方法为常规方法，为本领域人员所熟悉。本发明中未详细阐述的请参见《分子克隆实验指南》J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔等主编。

实施例1：tat-vp28基因的制备。

(2)PCR扩增VP28基因：根据GeneBank中已经发表的WSSV(GeneBank：EU414753)的序列设计PCR引物，以上述上清作为模板DNA，PCR扩增目的基因VP28，PCR产物通过DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物并将其克隆到pGEM-T载体(在promega公司购置)中，挑取单菌落用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序得到的阳性克隆子即为包含VP28基因的大肠杆菌，命名为pGEM-T-vp28，用于基因的增殖和保藏。

(3)PCR扩增tat-vp28基因：上游引物为3条、下游引物1：分三次PCR合成tat-vp28：以pGEM-T-vp28质粒为模板，上游引物P1：CAGCGTCGTCGTGGATCCATGGATCTTTCTTTCA，下游引物1：GGCCTAGGTCTACTCGGTCTCAGTGCCAGAGTA，退火温度56℃，做PCR扩增目的片段，电泳并作回收；以上一步回收产物为模板(蘸取少许)，上游引物P2：CGTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTGGATCC，下游引物1GGCCTAGGTCTACTCGGTCTCAGTGCCAGAGTA，退火温度56℃做PCR，电泳并作回收；以上一步回收产物为模板(蘸取少许)，上游引物P3：GCGGAATTCGGCTATGGCCGTAAAAAACGTCGT，下游引物1GGCCTAGGTCTACTCGGTCTCAGTGCCAGAGTA，退火温度56℃做PCR。PCR反应体系：10×Taq Buffer with KCl 2.5uL，MgCl₂(25mM)1.5uL，dNTP Mixture(2.5mM)1uL，上下游引物各1uL(25pmol)，模板1uL，Taq DNA聚合酶(1U/uL)1uL，加无菌水至终体积50uL。PCR反应条件为：；94℃30s，55℃30s，72℃50s(30个循环)；72℃10min。得到TAT-VP28的PCR产物。

实施例2：鲤鱼生长激素成熟肽基因(GH)的制备：

(1)鲤鱼生长激素RNA的提取：

取鲤鱼脑垂体，按照RNeasy^R Kit的操作说明书提取其总RNA，提取得到的总RNA放置-80℃备用。

(2)合成GH cDNA的第一条链：

按照Reverse Transcription System试剂盒说明书，以Oligo(dT)₂₀为引物合成cDNA第一链。反应体系如下，依次将以下试剂加入经DEPC水处理并灭菌过的PCR管中：

反应参数为：

42℃ 1h

95℃ 5min

3℃ 5min

将反应后的产物放置于-20℃以作为目的基因克隆的模板。

(3)鲤鱼生长激素GH的制备：

依据GenBank中已发表的鲤鱼生长激素GH cDNA序列，综合分析后设计PCR引物。上游引物P4：ATGTCAGACAACCAGCGG，下游引物P5：CTACAGGGTGCAGTTGG。引物由上海生物工程有限公司合成。以cDNA第一链为模板，按照以下反应体系和反应参数进行目的基因的扩增：

逆转录反应体系：

应用降落式PCR的形式进行反应，其反应参数为：95℃预变性4min，94℃变性30sec，60-50℃退火30min，72℃延伸1min，20个循环；94℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸1min，10个循环，72℃再延伸10min。将反应后的产物置于-20℃备用。

将上述PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳并回收纯化，方法见实施例3。

将纯化的PCR产物与pGEM-T载体(在promega公司购置)连接。连接体系如下：

连接反应液4℃水浴放置过夜。转化感受态大肠杆菌JM109，方法见实施例4。从LB平板上挑取4个单菌落于500ul新鲜液体LB培养基(含终浓度100ug/ml氨苄青霉素)中，37℃，300rpm摇床培养3小时，以此菌液为模板，primer3、primer4为引物进行PCR初步鉴定，并送上海生工有限公司测序。将阳性克隆的菌液转接5ul于20ml新鲜液体LB培养基(含终浓度为100ug/ml氨苄青霉素)中，37℃，300rpm摇床培养过夜，碱裂解法小量提取质粒，置于-80℃备用。重组质粒命名为pGEM-T-GH。

(4)鲤鱼生长激素成熟肽基因(以下简称GH)

根据GenBank中已经发表的GH成熟肽的序列设计引物。GH的上游引物P6：CGCGTCGAC

ATGTCAGACAACCAGCG(划线处为Sal I位点，方框内为Asp-Pro-Asp酸水解位点)，GH的下游引物P7：GGCCTCGAGCTACAGGGTGCAGTTGG(划线处为Xho I位点，粗体为终止密码子，将C末端甘氨酸突变成天冬酰胺)。以pGEM-T-GH为模板进行PCR，PCR反应体系：10×Taq Buffer with KCl 2.5uL，MgCl₂(25mM)1.5uL，dNTP Mixture 1uL，上下游引物各1uL(25pmol)，模板1uL，Taq DNA聚合酶(1U/uL)1uL，加无菌水至终体积25uL。PCR反应条件为：；94℃30s，54℃30s，72℃50s (30个循环)；72℃10min。得到鲤鱼生长激素成熟肽基因GH的PCR产物。

实施例3：PCR产物的回收、纯化和亚克隆。

将实施例1，2中得到的TAT-VP28，鲤鱼生长激素成熟肽基因GH的PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下迅速切下欲回收的条带，用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化，将单一的目的DNA条带放入干净的Eppendorf管中，称取重量。向胶块中加入三倍体积的溶胶液PN(凝胶重为0.1g，其体积可视为100uL，以此类推)。50℃水浴10分钟，其间每2分钟温和上下翻转Eppendorf管，以确保胶块充分溶解。将所得溶液取750uL加入到一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室温(20-25℃以下相同)放置2分钟，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入600uL漂洗液，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。再向吸附柱中加入600uL漂洗液，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。空柱12000rpm离心2分钟，尽量除尽漂洗液。将吸附柱放入一个干净的Eppendorf管中，室温放置数分钟，彻底晾干，防止残留的漂洗液影响下一步的实验。向吸附膜中间位置悬空滴加30uL洗脱缓冲液，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟。

PCR产物的亚克隆：

将回收、纯化的PCR产物与pGEM-T(在promega公司购置)连接，连接体系如下：

连接反应液4℃水浴放置过夜。

实施例4：质粒pGEM-T-tat-vp28和pGEM-T-gh(Asp-Pro-Asp)的构建。

氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞：其步骤是：

(1)用接种环挑取固体LB平板上新活化的大肠杆菌JM109单菌落，接种到20ml液体LB培养基(将1g蛋白胨、0.5g酵母粉、1g NaCl溶解在75mlddH₂O中，调整pH值至7.0，最后加ddH₂O定容至100ml，分装于五个三角瓶里，115磅灭菌处理20min后备用)中，37℃，250rpm摇床活化过夜。

(2)无菌条件下取60ul上述活化的大肠杆菌于新鲜的20ml液体LB培养基中，37℃，250rpm摇床培养3小时左右至OD₆₀₀值为0.4-0.6。(下述所有步骤均需无菌操作)

(3)无菌条件下取1.5ml上述菌液于无菌Eppendorf管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃。4000rpm，4℃离心10分钟，用移液枪吸干上清。

(4)加入300ul冰预冷的0.1MCaCl₂溶液重悬菌体沉淀，冰浴30分钟，4000rpm，4℃离心10分钟，用移液枪吸干上清。

(5)加入100ul冰预冷的0.1MCaCl₂溶液重悬沉淀，即得感受态细胞，置于4℃保存，24小时内使用为宜。

连接产物转化大肠杆菌感受态细胞：其步骤是：

(1)无菌条件下取连接反应液10ul，加入到100ul大肠杆菌JM109感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟。(下述所有步骤均需无菌操作)

(2)42℃水浴中热激90秒，迅速移至冰中冰浴2-3分钟。

(3)加入800ul液体LB培养基，37℃，150rpm轻摇，温育45分钟使细菌复苏。

(4)4000rpm离心10分钟，吸取700ul上清弃去，将剩余菌液用移液枪轻轻混匀。

(5)将上述菌液用无菌三角玻棒均匀涂布在含10ul 1M IPTG，40ul 20mg/mlX-gal，10ul 200mg/ml Amp的LB平板上，正向放置1-2小时，直至液体被全部吸收，倒置平板于37℃培养箱中培养过夜。

有此法可以制备得到E.coli JM109 pGEMT-TAT-VP28和E.coli JM109 pGEMT-GH(Asp-Pro-Asp)菌落。

实施例4：融合基因的制备及表达载体的构建：

(1)重组扩增质粒pGEM-T-TAT-VP28-GH的构建：其步骤是：

同时用Sal I和XhoI双酶切pGEMT-GH(Asp-Pro-Asp)和pGEMT-TAT-VP28，胶回收开环质粒pGEMT-TAT-VP28和含GH基因的片段，4℃连接后转化大肠杆菌JM109感受态细胞，方法同实施例4。挑取单克隆pGEM-T-TAT-VP28-GH/JM109于500ul新鲜液体LB培养基(含终浓度100ug/ml氨苄青霉素)中，37℃，300rpm摇床培养3-4小时，以此菌液为模板，上游引物P1、下游引物P7为引物进行PCR初步鉴定，其产物为TAT-VP28-GH全长融合基因。所得到的阳性克隆子命名为pGEMT-TAT-VP28-GH。

(2)重组表达质粒pET-32a(+)-TAT-VP28的构建：其步骤是：

用EcoR I和Xhol I双酶切质粒pGEMT-TAT-VP28-GH和质粒pET-32a(+)(在INVITROGEN公司购置)，目的片段TAT-VP28-CD和开环pET-32a(+)胶回收后16℃连接过夜，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，方法如下：

①无菌条件下取连接反应液10ul，加入到100ul大肠杆菌JM109感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟。(下述所有步骤均需无菌操作)下表为连接体系：

②42℃水浴中热激90秒，迅速移至冰中冰浴2分钟。

③将上述菌液用无菌三角玻棒均匀涂布在含终浓度为100ug/ml氨苄青霉素的LB平板上，正向放置1-2小时，直至液体被全部吸收，倒置平板于37℃培养箱中培养过夜。挑取单克隆pET-32a(+)-TAT-VP28-GH/JM109于500ul新鲜液体LB培养基(含终浓度为的100ug/ml氨苄青霉素)中，37℃，300rpm摇床培养3-4小时，以此菌液为模板，上游引物P1、下游引物P7为引物进行PCR初步鉴定，其产物为TAT-VP28-GH全长融合基因。将PCR鉴定所得阳性克隆的菌液转接50ul于20ml新鲜液体LB培养基(含终100ug/ml氨苄青霉素)中，37℃，300rpm摇床培养过夜，碱裂解法小量(15-20ug)提取质粒，用EcoR I和Xhol I双酶切鉴定阳性重组子，重组质粒命名为pET-32a(+)-TAT-VP28-GH，并测序与DNA序列完全一致，符合翻译阅读框。重组表达质粒pET-32a(+)-TAT-VP28-GH的构建过程见附图1，酶切及PCR鉴定见附图2。

阳性正向重组子pET-32a(+)-TAT-VP28-GH的酶切鉴定：

用碱裂解法小量(15-20ug)提取E.coli JM109 pET-32a(+)-TAT-VP28-GH质粒pET-32a(+)-TAT-VP28-GH，对所提质粒进行单酶切和双酶切，酶切体系如下：

重组质粒pGEMT-TAT-VP28-GH的单酶切

质粒pGEMT-TAT-VP28-GH 8ul

10×Buffer 2ul

Sal I 1ul

加无菌水至终体积20ul。

重组质粒pGEMT-TAT-VP28-GH的双酶切

加无菌水至终体积20ul。

酶切反应条件均为37℃，反应时间2-3个小时，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳分析结果。

实施例5：大肠杆菌基因工程菌的制备。

将质粒pET-32a(+)-TAT-VP28-GH(1ul)转化大肠杆菌BL21(DE₃)感受态细胞。PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为本发明涉及的能够融合表达TAT-VP28-GH的重组基因工程菌株Escherichia coli BL21(DE3)pET-32a-TAT-VP28-GH。

实施例6：基因工程融合蛋白TAT-VP28-GH的表达。

重组基因工程菌株Escherichia coli BL21(pET-32a-TAT-VP28-GH)的单菌落接种到20ml新鲜液体LB(含终浓度为的100ug/ml氨苄青霉素)培养基中。37℃200rpm摇床培养过夜。LB培养基配方：称取将1g蛋白胨、0.5g酵母粉、1g NaCl溶解在75ml ddH₂O中，调整pH值至7.0，最后加ddH₂O定容至100ml，分装于5个三角瓶里，15磅灭菌处理20min后备用。

将5ml过夜培养物分别同时接种到200ml 2×YT(含终浓度为的100ug/ml氨苄青霉素)培养基。2×YT培养基配方：称取16g胰蛋白胨、10g酵母提取物，8g氯化钠加入去离子水定容至1000ml，115℃高压灭菌20min备用。37℃，300rpm摇床培养，一瓶作诱导，一瓶作对照。3小时后，取欲诱导的2×YT培养物，在无菌条件下用移液枪吸取1ml于一个干净的Eppendorf管中，再向上述2×YT培养物中加入120ul 1M异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃，300rpm摇床继续培养。4小时后，停止诱导，同时取出经诱导和未经诱导的培养物，用移液枪分别吸取600ul诱导后的培养物和600ul未诱导的培养物于两个干净的Eppendorf管中。以12000rpm离心1分钟，弃去上清，加100ul无菌水重悬菌体沉淀。分别取上述样品各20ul于20ul 2×SDS凝胶加样缓冲液(100mM Tris-C1、200mMβ-巯基乙醇、4％(质量/体积)SDS、0.2％(质量/体积)溴酚蓝、20％(质量/体积)甘油)中，100℃加热10分钟，样品可贮存于-4℃，以备在凝胶上加样。融化样品，于室温以12000rpm离心1分钟。取10ul加样到丙烯酰胺浓度为12％(质量/体积)SDS聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。

电泳结束后，卸下凝胶，在考马斯亮蓝染色液(1g考马斯亮蓝R-250，450ml甲醇，450ml ddH₂O，100ml冰醋酸)中染色2个小时，然后用脱色液(40ml甲醇，10ml乙酸，50ml ddH₂O)脱色，每隔30分钟换液一次，直至背景脱干净为止。融合蛋白TAT-VP28-GH的SDS-PAGE鉴定见附图4。

实施例7：基因工程融合蛋白TAT-VP28-GH抗WSSV感染及促生长作用的实际应用。

1.试验样品及来源：

基因工程融合蛋白TAT-VP28-GH的三种样品分别为I：1×10¹⁰个菌/mL，II：1×10⁹个菌/mL，III：1×10⁸个菌/mL；以下简称“I、II、III”。其制备方法如下：本发明所涉及的基因工程菌株大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)pET-32a-TAT-VP28-GH经30L大罐发酵，发酵液经终浓度为4％的甲醛25℃灭活10分钟，经GQ-75管式离心机离心收集菌体，用万分之一电子天平分别称取1.0000g；0.1000g；0.0100g湿菌体加100mL灭菌的5mM PH7.4的PBS重悬成为1×10¹⁰个菌/mL，1×10⁹个菌/mL，1×10⁸个菌/mL。以上样品经冷藏运输至试验场地并冷藏备用。包被剂由武汉大学生命科学学院病毒学国家重点实验室基因工程药物及昆虫病毒的生物学研究室研制提供并购买。

WSSV悬浮液由武汉大学生命科学学院病毒学国家重点实验室基因工程药物及昆虫病毒的生物学研究室制备提供，冰冻保藏运输至试验场地并冰冻保存备用。

试验用的南美白对虾虾苗：2010年6月14日在广西北海的南美白对虾精养池，通过饲料台观察网，捞取健康南美白对虾(体长2-3cm)，水体充氧运输至试验地。

试验过程中用的海水：取自于南美白对虾精养池；兑淡用的井水系当地的一般机井水。

2.试验地点及其试验条件：

试验地点，通电通水有门窗的房屋，共计100余平方米。500L白色塑料养殖箱10只，经二溴海茵溶液消毒、冲洗干净后，每箱装400升的海水，比重为1.013kg/L，并通电充气。

试验期间水温平均28℃～31℃，塑料养殖箱内养殖水体水质指标：氨氮1.0～1.5mg/L，亚硝酸盐0.20～0.30mg/L，pH值7.5～8.0，溶氧3～4mg/L。定人定时用检测试剂盒来检测养殖水体水质指标，若超标则主要通过更换适量的海水和增氧泵不间断通气来调控。

2010年6月14日，每箱随机投放约100尾，室内暂养，以备试验用。

3.试验设计、调查及统计：

试验设有阴性对照、阳性对照、基因工程融合蛋白TAT-VP28-GH I(1×10¹⁰个菌/mL)、II(1×10⁹个菌/mL)和III(1×10⁸个菌/mL)共5组处理，每组处理各设二个重复，各处理养殖箱贴上相应标签。

各处理样品分别包被对虾饲料的方法：包被剂0.0300克，加淡水25mL，搅拌均匀后；待成胶体状后分别移取2mL至贴有试验处理标签的小塑料盆中；用移液枪分别准确移取2mL的I、II、III和淡水2mL、淡水2mL加入相应小塑料盆中(I、II、III、阴性对照、阳性对照)；各自搅拌均匀后，再分别加入10克的对虾饲料0号(1号)料拌匀，凉干备用。

各处理项目养殖箱分别于6月27日、6月28日、7月3日、7月8日当日对应投喂一次，上过包被样品饲料每箱各5克。

于7月4日、7月5日、7月11日除阴性对照外的其它处理项目的养殖箱投喂已被WSSV的饲料，当日一次，其它时间喂食正常对虾饲料。

逐日早晚观察记录并打捞各处理项目养殖箱内的死虾，自7月8日(WSSV侵染96小时后)统计累计死亡头数。7月19日实验结束后，统计各处理养殖箱内剩余活虾及虾总重量，计算最后的存活率和平均体重增加率。

4.试验结果及分析：

从表1中可以看出口服基因工程融合蛋白TAT-VP28-GH的养殖箱，经WSSV口服侵染16天后南美白对虾存活率分别是：I为100％；II为98.36～100.00％；III为98.41～100.00％。未经口服基因工程融合蛋白TAT-VP28-GH的阳性对照，经WSSV口服染16天后存活率仅为22.35～48.62％。这表明口服基因工程融合蛋白TAT-VP28-GH的南美白对虾能有效预防WSSV的侵染，而且单位高的效果更好。

表1：7月19日各处理项目累计死亡头数及其存活率统计结果表

表2：7月19日各处理项目活虾数及重量统计结果表

SEQUENCE LISTING

<110> 广西南宁众达生物工程有限公司

<120> 抗对虾白斑综合症病毒工程蛋白TAT-VP28-GH及制备和用途

<130> 抗对虾白斑综合症病毒工程蛋白TAT-VP28-GH及制备和用途

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1758

<212> DNA

<213> 重组DNA

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1758)

<223>

<220>

<221> pET32a tag

<222> (1)..(519)

<223>

<220>

<221> TAT

<222> (520)..(552)

<223>

<220>

<221> VP28 gene

<222> (553)..(1173)

<223>

<220>

<221> GH gene

<222> (1174)..(1758)

<223>

<400> 1

atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60

gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120

ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180

atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240

ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300

aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360

catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420

ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg 480

gctgatatcg gatccatggc tgatatcgga tccgaattcg gctatggccg taaaaaacgt 540

cgtcagcgtc gtcgtggatc catggatctt tctttcactc tttcggtcgt gtcggccatc 600

ctcgccatca ctgctgtgat tgctgtattt attgtgattt ttaggtatca caacactgtg 660

accaagacca tcgaaaccca cacagacaat atcgagacaa acatggatga aaacctccgc 720

attcctgtga ctgctgaggt tggatcaggc tacttcaaga tgactgatgt gtcctttgac 780

agcgacacct tgggcaaaat caagatccgc aatggaaagt ctgatgcaca gatgaaggaa 840

gaagatgcgg atcttgtcat cactcccgtg gagggccgag cactcgaagt gactgtgggg 900

cagaatctca cctttgaggg aacattcaag gtgtggaaca acacatcaag aaagatcaac 960

atcactggta tgcagatggt gccaaagatt aacccatcaa aggcctttgt cggtagctcc 1020

aacacctcct ccttcacccc cgtctctatt gatgaggatg aagttggcac ctttgtgtgt 1080

ggtaccacct ttggcgcacc aattgcagct accgccggtg gaaatctttt cgacatgtac 1140

gtgcacgtca cctactctgg cactgagacc gaggtcgacc cagatccaat gtcagacaac 1200

cagcggctct tcaataatgc agtcattcgt gtacaacacc tgcaccagct ggctgcaaaa 1260

atgattaacg actttgagga cagcctgttg cctgaggaac gcagacagct gagtaaaatc 1320

ttccctctgt ctttctgcaa ttctgactac attgaggcgc ctgctggaaa agatgaaaca 1380

cagaagagct ctatgctgaa gcttcttcgc atctcttttc acctcattga gtcctgggag 1440

ttcccaagcc agtccctgag cggaaccgtc tcaaacagcc tgaccgtagg gaaccccaac 1500

cagctcactg agaagctggc cgacttgaaa atgggcatca gtgtgctcat ccaggcatgt 1560

ctcgatggtc aaccaaacat ggatgataac gactccttgc cgctgccttt tgaggacttc 1620

tacttgacca tgggggagaa caacctcaga gagagctttc gtctgctggc ttgcttcaag 1680

aaggacatgc acaaagtcga gacctacttg agggttgcaa attgcaggag atccctggat 1740

tccaactgca ccctgtag 1758

<210> 2

<211> 585

<212> PRT

<213> 多肽

<220>

<221> TAT-VP28-GH PEPTIDE

<222> (1)..(585)

<223>

<220>

<221> pET32a tag

<222> (1)..(173)

<223>

<220>

<221> TAT

<222> (174)..(184)

<223>

<220>

<221> VP28

<222> (185)..(390)

<223>

<220>

<221> GH

<222> (391)..(585)

<223>

<400> 2

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp

1 5 10 15

Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp

20 25 30

Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp

35 40 45

Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn

50 55 60

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu

65 70 75 80

Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser

85 90 95

Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly

100 105 110

Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

115 120 125

Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln

130 135 140

His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met

145 150 155 160

Ala Asp Ile Gly Ser Met Ala Asp Ile Gly Ser Glu Phe Gly Tyr Gly

165 170 175

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Ser Met Asp Leu Ser Phe

180 185 190

Thr Leu Ser Val Val Ser Ala Ile Leu Ala Ile Thr Ala Val Ile Ala

195 200 205

Val Phe Ile Val Ile Phe Arg Tyr His Asn Thr Val Thr Lys Thr Ile

210 215 220

Glu Thr His Thr Asp Asn Ile Glu Thr Asn Met Asp Glu Asn Leu Arg

225 230 235 240

Ile Pro Val Thr Ala Glu Val Gly Ser Gly Tyr Phe Lys Met Thr Asp

245 250 255

Val Ser Phe Asp Ser Asp Thr Leu Gly Lys Ile Lys Ile Arg Asn Gly

260 265 270

Lys Ser Asp Ala Gln Met Lys Glu Glu Asp Ala Asp Leu Val Ile Thr

275 280 285

Pro Val Glu Gly Arg Ala Leu Glu Val Thr Val Gly Gln Asn Leu Thr

290 295 300

Phe Glu Gly Thr Phe Lys Val Trp Asn Asn Thr Ser Arg Lys Ile Asn

305 310 315 320

Ile Thr Gly Met Gln Met Val Pro Lys Ile Asn Pro Ser Lys Ala Phe

325 330 335

Val Gly Ser Ser Asn Thr Ser Ser Phe Thr Pro Val Ser Ile Asp Glu

340 345 350

Asp Glu Val Gly Thr Phe Val Cys Gly Thr Thr Phe Gly Ala Pro Ile

355 360 365

Ala Ala Thr Ala Gly Gly Asn Leu Phe Asp Met Tyr Val His Val Thr

370 375 380

Tyr Ser Gly Thr Glu Thr Glu Val Asp Pro Asp Pro Met Ser Asp Asn

385 390 395 400

Gln Arg Leu Phe Asn Asn Ala Val Ile Arg Val Gln His Leu His Gln

405 410 415

Leu Ala Ala Lys Met Ile Asn Asp Phe Glu Asp Ser Leu Leu Pro Glu

420 425 430

Glu Arg Arg Gln Leu Ser Lys Ile Phe Pro Leu Ser Phe Cys Asn Ser

435 440 445

Asp Tyr Ile Glu Ala Pro Ala Gly Lys Asp Glu Thr Gln Lys Ser Ser

450 455 460

Met Leu Lys Leu Leu Arg Ile Ser Phe His Leu Ile Glu Ser Trp Glu

465 470 475 480

Phe Pro Ser Gln Ser Leu Ser Gly Thr Val Ser Asn Ser Leu Thr Val

485 490 495

Gly Asn Pro Asn Gln Leu Thr Glu Lys Leu Ala Asp Leu Lys Met Gly

500 505 510

Ile Ser Val Leu Ile Gln Ala Cys Leu Asp Gly Gln Pro Asn Met Asp

515 520 525

Asp Asn Asp Ser Leu Pro Leu Pro Phe Glu Asp Phe Tyr Leu Thr Met

530 535 540

Gly Glu Asn Asn Leu Arg Glu Ser Phe Arg Leu Leu Ala Cys Phe Lys

545 550 555 560

Lys Asp Met His Lys Val Glu Thr Tyr Leu Arg Val Ala Asn Cys Arg

565 570 575

Arg Ser Leu Asp Ser Asn Cys Thr Leu

580 585

Claims

1.一种分离的基因，其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.一种分离的基因工程融合蛋白，其序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

3.一种分离的菌基因工程菌株，其特征在于，该菌株为重组菌株Escherichia coli BL21（DE3）pET-32a-TAT-VP28-GH，CCTCC NO:M 2011197。

4.权利要求3所述的一种大肠杆菌基因工程菌株的制备方法，包括下列步骤：

A.WSSV的VP28基因的制备：在冰上取患病对虾的鳃、胃和心脏，冰浴匀浆，然后加入蛋白酶K，在沸水中煮15分钟，立即冰浴5分钟，12000rpm离心10分钟，取其上清置于4℃保存，设计PCR引物，以上清作为模板DNA，PCR扩增目的基因VP28，PCR产物通过DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物并将其克隆到pGEM-T载体中，转化大肠杆菌JM109，挑取单菌落用碱裂解法提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，得到的阳性克隆子即为包含VP28基因的大肠杆菌，为pGEM-T-VP28，用于基因的增殖和保藏；

B.TAT-VP28融合基因的制备：通过PCR的方法扩增蛋白转导结构域多肽TAT，并将其与VP28基因融合，将PCR产物克隆到pGEM-T载体中，转化大肠杆菌JM109，挑取单菌落用碱裂解法提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，得到的阳性克隆子即为包含TAT-VP28基因的大肠杆菌，为pGEM-T-TAT-VP28，用于基因的增殖和保藏；

C.鲤鱼生长激素成熟肽基因的制备：取鲤鱼脑垂体，按照RNA提取试剂盒的方法提取其脂肪体总mRNA后，通过RT-PCR得到总cDNA，根据GenBank鲤鱼生长激素成熟肽的cDNA序列，设计并合成引物，以总cDNA为模板，PCR扩增得到carp mature growthhormone基因，PCR产物通过DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物并将其克隆到pGEM-T载体中，转化大肠杆菌JM109，挑取单菌落用碱裂解法提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，得到的阳性克隆子即为包含GH基因的大肠杆菌，为pGEM-T-GH，用于基因的增殖和保藏，根据基因carp mature growth hormone的成熟肽序列，去掉信号部分并插入酸水解位点Asp-Pro-Asp，重新设计引物，以pGEM-T-GH质粒为模板，PCR扩增GH基因，将PCR产物组装入pGEM-T载体，转化大肠杆菌JM109，挑取单菌落用碱裂解法提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，得到的阳性克隆子即为包含GH基因的大肠杆菌，为pGEM-T-GH（Asp-Pro-Asp）；

D.融合基因表达载体的构建：双酶切重组质粒pGEM-T-TAT-VP28和质粒pET-32a（+）,胶回收含TAT-VP28基因的片段和开环pET-32a（+）片段，16℃连接两小时后转化到感受态E.coli中，所得到的阳性克隆子是TAT-VP28融合基因的大肠杆菌，命名为pET-32a（+）-TAT-VP28，同时双酶切含GH基因的重组质粒pGEM-T-GH（Asp-Pro-Asp）和重组质粒pET-32a（+）-TAT-VP28，胶回收含GH基因的片段和开环片段pET-32a（+）-TAT-VP28，16℃连接两小时后转化到感受态E.coli中，所得到的阳性克隆子命名为pET-32a-TAT-VP28-GH；

E.大肠杆菌基因工程菌的制备：将质粒pET-32a-TAT-VP28-GH转化到感受态BL21（DE3）中，PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为本发明涉及的能够表达TAT-VP28-GH的大肠杆菌基因工程菌株；

F.基因工程融合蛋白的制备：将基因工程菌转接到2×YT培养基中，经IPTG诱导，融合蛋白TAT-VP28-GH以可溶的形式表达。

5.权利要求2所述的一种基因工程融合蛋白在制备治疗或预防对虾白斑综合症病毒的药物中的应用。

6.权利要求2所述的一种基因工程融合蛋白在对虾养殖业中的应用。