CN116970741A - 一种检测白斑综合征病毒wssv的引物组、试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种检测白斑综合征病毒WSSV的引物组、试剂盒和方法。本发明针对小龙虾白斑综合征病毒WSSV特异性序列设计得到的引物组，能够特异性的检测小龙虾白斑综合征病毒。实验结果表明，利用本发明提供的引物组进行PCR扩增后，根据扩增曲线能够准确地将白斑综合征病毒WSSV和非白斑综合征病毒WSSV进行区分，无交叉反应且最低检出限为6.26×100copies/μL。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种检测白斑综合征病毒WSSV的引物组、试剂盒和方法。
背景技术
白斑综合征病毒属线头病毒科(Nimaviridae)白斑病毒属(Whispovirus)，是由白斑综合征病毒(Whitespotsyndrome virus，WSSV)引起的严重传染性疾病，具有发病急、死亡速度快、死亡率高的特点。
淡水小龙虾(Redswamp crayfishProcambarus clarkia)等水产动物是全球食物和蛋白质来源中日益重要的组成部分，其具有显著的生态效应，影响人类健康。然而，随着小龙虾养殖业的迅猛发展，养殖小龙虾的病害问题日渐突出，尤以小龙虾白斑综合征的危害最为严重，给养殖户造成了重大经济损失。
现有技术中报道采用常规PCR和TaqMan法检测白斑综合征病毒，但常规PCR操作繁琐；而TaqMan法则需要设计探针成本较高。因此，如何低成本、特异性地检测小龙虾白斑综合征病毒是亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测白斑综合征病毒WSSV的引物组、试剂盒和方法，在检测小龙虾白斑综合征病毒的过程中，具有成本低、特异性好、灵敏度高的特点。
本发明提供了一种特异性检测白斑综合征病毒WSSV的引物组，所述引物组包括上游引物和下游引物；
所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明提供了检测白斑综合征病毒WSSV的引物组在制备检测白斑综合征病毒WSSV的产品中的应用。
优选的，所述产品包括试剂盒和/或试剂。
优选的，所述检测的物种为小龙虾。
本发明提供了一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括检测白斑综合征病毒WSSV的引物组和PCR扩增试剂。
优选的，所述PCR扩增试剂包括TB GreenPremix Ex TaqII。
优选的，所述引物组中上游引物和下游引物的浓度分别为8～12μM。
本发明还提供了一种白斑综合征病毒TB GreenⅡ实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：以待测样本的基因组DNA为模板，利用检测白斑综合征病毒WSSV的引物组进行实时荧光PCR扩增，得到荧光定量PCR扩增曲线；
对所述荧光定量PCR扩增曲线进行分析并作出判断；
当无荧光定量PCR扩增曲线时，则所述待测样本为白斑综合征病毒阴性；
当所述荧光定量PCR扩增曲线的Ct≤35，则所述待测样本为白斑综合征病毒阳性；
当所述荧光定量PCR扩增曲线的Ct＞35且Ct≤40时，再次进行TB GreenⅡ实时荧光定量PCR检测，当再次得到的荧光定量PCR扩增曲线的Ct≤40时，则所述待测样本为白斑综合征病毒阳性；当再次得到的荧光定量PCR扩增曲线的Ct＞40或无荧光定量PCR扩增曲线时，则所述待测样本为白斑综合征病毒阴性。
优选的，所述实时荧光PCR扩增的反应体系以20μL计，包括：10.0μL的2×TB GreenPremix Ex Taq II，(2.2～2.4)μL的基因组DNA模板，(1.0～1.5)μL 10μM的上游引物，(1.0～1.5)μL 10μM的下游引物，无RNA酶水补至20μL。
优选的，所述实时荧光PCR扩增的反应程序为：95℃预变性30s，95℃变性5s，(58～60)℃退火34s，运行40个循环。
有益效果：
本发明提供了一种特异性检测白斑综合征病毒WSSV的引物组，所述引物组包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。该引物组是针对小龙虾白斑综合征病毒WSSV特异性序列设计得到的，能够特异性的检测小龙虾白斑综合征病毒。
基于上述技术优势，本发明还提供了一种白斑综合征病毒TB GreenⅡ实时荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：以待测样本的基因组DNA为模板，利用检测白斑综合征病毒WSSV的引物组进行实时荧光PCR扩增，得到荧光定量PCR扩增曲线；对所述荧光定量PCR扩增曲线进行分析并作出判断；当无荧光定量PCR扩增曲线时，则所述待测样本为白斑综合征病毒阴性；当所述荧光定量PCR扩增曲线的Ct≤35，则所述待测样本为白斑综合征病毒阳性；当所述荧光定量PCR扩增曲线的Ct＞35且Ct≤40时，再次进行TB GreenⅡ实时荧光定量PCR检测，当再次得到的荧光定量PCR扩增曲线的Ct≤40时，则所述待测样本为白斑综合征病毒阳性；当再次得到的荧光定量PCR扩增曲线的Ct＞40或无荧光定量PCR扩增曲线时，则所述待测样本为白斑综合征病毒阴性。实验结果表明，采用本申请提供的检测方法能够特异性地将草鱼呼肠弧病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病毒以及小龙虾白斑综合征病毒区分开，无交叉感染且最低检出限为6.26×100copies/μL。因此，本发明的方案具有特异性好、灵敏度高的特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1中引物使用量为0.5μL时的荧光定量PCR扩增曲线；
图2为实施例1中引物使用量为1μL时的荧光定量PCR扩增曲线；
图3为实施例1中引物使用量为1.5μL时的荧光定量PCR扩增曲线；
图4为实施例1中引物使用量为2μL时的荧光定量PCR扩增曲线；
图5为实施例1中模板使用量为2.5μL时的荧光定量PCR扩增曲线；
图6为实施例1中模板使用量为2.4μL时的荧光定量PCR扩增曲线；
图7为实施例1中模板使用量为2.2μL时的荧光定量PCR扩增曲线；
图8为实施例1中模板使用量为2μL时的荧光定量PCR扩增曲线；
图9为实施例1中模板使用量为1.8μL时的荧光定量PCR扩增曲线；
图10为实施例1中模板使用量为1.6μL时的荧光定量PCR扩增曲线；
图11为实施例1中模板使用量为1.5μL时的荧光定量PCR扩增曲线；
图12为实施例1中退火温度为60℃时的荧光定量PCR扩增曲线；
图13为实施例1中退火温度为58℃时的荧光定量PCR扩增曲线；
图14为实施例1中退火温度为57℃时的荧光定量PCR扩增曲线；
图15为实施例1中退火温度为56℃时的荧光定量PCR扩增曲线；
图16为实施例1中退火温度为55℃时的荧光定量PCR扩增曲线；
图17为实施例2中荧光定量PCR的标准曲线；
图18为实施例2中荧光定量PCR的熔解曲线；
图19为实施例4中荧光定量PCR的敏感性实验结果图；
图20为实施例4中普通PCR的敏感性实验结果图；
图21为实施例5中荧光定量PCR的特异性实验结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种特异性检测白斑综合征病毒WSSV的引物组，所述引物组包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
在本发明中，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体为：5’-GGTTGCTGTTGTTCTACTCCTT-3’；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示，具体为：5’-AGGCGTGGAAATGGTAATGAAG-3’。本发明所述上游引物和下游引物能够特异性的检测白斑综合征病毒WSSV。
本发明所述检测白斑综合征病毒WSSV的引物组优选针对小龙虾白斑综合征病毒WSSV特异性序列设计得到，所述WSSV特异性序列优选为如SEQ IDNo.3所示，具体为：5’-CTATAGAACAGTGTTATTTCTTCTATATCTTCCAGTAT TTATACCAGACCCTCTTGCCCCATAGTTTCGTATCTCCATTTTACTATTCCTGTCTCTCTGGTGAACCCATTCTGAGCCAGGTGTTCTGCCCATAATTTCTGATGTTTTATCAACAACAATATCAGCTGAAGGGGCAAAAGGCCCCCCATCTTCCAGTGCACTATTCCCATTAGAAGGAAGTGGACTAGCTGGCATAGGTGACAATAATGAAGGGAGTGGTGAAAACACAGGATAATCATCCACACCCTCTGTCACTAGAGATTCTAGATCCGGGGGAGGAGGTGTAGGCAACATAATTTCCATCTGCATTTCTTCCCCCGACGTGGACGGTTGCTGTTGTTCTACTCCTTCTACCTCTACTTCTACTCTTCCTCCTTCTTTATTATTTTCTGCTTCTAGTTCCTTCATTACCATTTCCACGCCTGTTGCTAGTCTCATTTTCTTATTGTTATTTTTTATGCGTTCTTTAGCTTGCTTTGTTACTTCATATGTAATATCAGATGAGTAGTATTTGCCTGGACAAATAAGGTTATCACTCATGGCTGTATAATTAGTATCAGAATTGCCATGTGCATTATCTTTTGTTATAAACTCTTTGGGTGGTTTATTTGCACCAGCCGTGAAAGTATTTGCCAGAAGAGCCGAGGCTGATGAAGAGTTTTGCTTAACATACTTTTCATCGATAGTTTTATTAAATAATGTAACTAAACTGGCCGAACACTTACTATCCCGGCAATTCGCACATGCATTATTATTCTTCTTTTTATTATCCATTGAGGCCTCCTTTGCAGTTTCAATTAAAGCTGATATTTGGCCCATGATTTTAAGGCTCGCACACAGTGCCATTTCCTGTCCTCCTTTCTCTAGTTGAATTGATCCCCATTCATTAAATTTTTCTTGTAGAGTCAGGAGACTACTCTTGAGAAAAGAGTGTAAAAGTGTTTGAGTAGTTATACAATTTTTCAACGTTTCAGTGATTGGGTCGAACCCGAATTTGATCTGATTTCTTACACTATCCAGTAAATCCTTGTTTAATTCTTCCGTGTCAGAGGAAGGGAAAGAAATTATATCATTAGCTGGAATTGATTCAGAAAAGTGAATATTTTTAAGTACATTTCCGTCTGTTGAAGAAGGGTGCTTTAGATCACACGTGCTAAGCATTACATCTAATGATAAGAAAGGGGTAACTCTTTCTCCTGTATCGAGATTTCCTACAACATTTTCTGGTGTCAAGAGATCGTCTGTTTCTGTCACTCCCACCAATCTCTTGTAATCTTCCTCAGCAACAGTTTGGTTGTTGTTATAGAAAGACCCATAAGTCTGAAAAATTCTCCTCGCAGTCTCATTATCTGCATCATTAGCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTGCCACATTTAAAAGATCTAGGTAGCTACTCAT-3’。
本发明还提供了检测白斑综合征病毒WSSV的引物组在制备检测白斑综合征病毒WSSV的产品中的应用。在本发明中，所述产品优选包括试剂盒和/或试剂，更优选为试剂盒。本发明所述检测的物种为小龙虾。利用本发明提供的引物组能够准确地将白斑综合征病毒WSSV和非白斑综合征病毒WSSV进行区分，且无交叉反应。
本发明还提供了一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括所述检测白斑综合征病毒WSSV的引物组和PCR扩增试剂。
在本发明中，所述PCR扩增试剂优选包括TB Green Premix Ex Taq II，进一步优选包括2×TB Green Premix Ex Taq II。本发明对所述PCR扩增试剂的来源、品牌没有限制，常规购买即可。本发明所述上游引物的浓度优选为8～12μM，更优选为10μM；所述下游引物的浓度优选为8～12μM，更优选为10μM。本发明所述PCR扩增试剂优选还包括DNA聚合酶、dNTPs和缓冲试剂。本发明对所述DNA聚合酶、dNTPs和缓冲试剂的来源、用量没有特殊限定，采用本领域熟知的技术即可。
本发明还提供了一种白斑综合征病毒TB GreenⅡ实时荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：以待测样本的基因组DNA为模板，利用检测白斑综合征病毒WSSV的引物组进行实时荧光PCR扩增，得到荧光定量PCR扩增曲线；对所述荧光定量PCR扩增曲线进行分析并作出判断；当无荧光定量PCR扩增曲线时，则所述待测样本为白斑综合征病毒阴性；当所述荧光定量PCR扩增曲线的Ct≤35，则所述待测样本为白斑综合征病毒阳性；当所述荧光定量PCR扩增曲线的Ct＞35且Ct≤40时，再次进行TB GreenⅡ实时荧光定量PCR检测，当再次得到的荧光定量PCR扩增曲线的Ct≤40时，则所述待测样本为白斑综合征病毒阳性；当再次得到的荧光定量PCR扩增曲线的Ct＞40或无荧光定量PCR扩增曲线时，则所述待测样本为白斑综合征病毒阴性。
本发明优选提取待测样本的基因组DNA，得到待测样本基因DNA。在本发明中，所述待测样本基因组DNA的提取方式优选为采用病毒基因组DNA提取试剂盒。在本发明的具体实施例中，采用南京诺唯赞生物科技股份有限公司提供的病毒基因组DNA提取试剂盒进行基因组DNA的提取。
得到所述待测样本基因组DNA后，本发明以待测样本的基因组DNA为模板，利用检测白斑综合征病毒WSSV的引物组进行实时荧光PCR扩增，得到荧光定量PCR扩增曲线。本发明所述荧光定量PCR扩增的反应体系以20μL计，优选包括：10.0μL的2×TB Green PremixEx Taq II，(2.2～2.4)μL的基因组DNA模板，(1.0～1.5)μL 10μM的上游引物，(1.0～1.5)μL 10μM的下游引物，无RNA酶水补至20μL。
在本发明中，所述基因组DNA模板的添加量进一步优选为2.2μL或2.4μL，更优选为2.2μL。本发明所述上游引物的添加量和下游引物的添加量优选为相同，所述上游引物的添加量进一步优选为1.0μL或1.5μL，更优选为1.0μL；所述下游引物的添加量进一步优选为1.0μL或1.5μL，更优选为1.0μL。通过优化荧光定量PCR扩增的反应体系中各物质的添加量有利于荧光定量PCR扩增曲线Ct值更为稳定。
本发明所述荧光定量PCR扩增的反应程序优选为：95℃预变性30s，95℃变性5s，(58～60)℃退火34s，运行40个循环。在本发明中，所述退火的温度进一步优选为58℃或60℃，更优选为58℃。
得到所述荧光定量PCR扩增曲线后，本发明依据荧光定量PCR扩增曲线的Ct值对检测结果进行分析。在本发明中，当无荧光定量PCR扩增曲线时，则所述待测样本为白斑综合征病毒阴性；当所述荧光定量PCR扩增曲线的Ct≤35，则所述待测样本为白斑综合征病毒阳性；当所述荧光定量PCR扩增曲线的Ct＞35且Ct≤40时，本发明优选再次进行TB GreenⅡ实时荧光定量PCR检测。
本发明所述再次进行TB GreenⅡ实时荧光定量PCR检测的方法优选包括：以待测样本的基因组DNA为模板，利用检测白斑综合征病毒WSSV的引物组再次进行实时荧光PCR扩增，再次得到荧光定量PCR扩增曲线；对所述再次得到的荧光定量PCR扩增曲线进行分析并作出判断；当所述再次得到的荧光定量PCR扩增曲线的Ct≤40时，则所述待测样本为白斑综合征病毒阳性；当所述再次得到的扩增曲线的Ct值＞40或无荧光定量PCR扩增曲线扩增时，则所述待测样本为白斑综合征病毒阴性。
本发明所述再次荧光定量PCR扩增的反应体系和再次荧光定量PCR扩增的反应程序与上述技术方案中的荧光定量PCR扩增的反应体系和荧光定量PCR扩增的反应程序相同，且在上述技术方案中已进行详细的描述和限定，在此不再赘述。通过再次进行荧光定量PCR扩增，有利于提高检测小龙虾白斑综合征病毒的特异性。
本发明所述白斑综合征病毒TB GreenⅡ实时荧光定量PCR检测方法优选为非诊断目的的检测，但是诊断目的的检测方法也属于本发明的保护范围。
实验结果表明，采用本申请提供的检测方法能够特异性地将草鱼呼肠弧病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病毒以及小龙虾白斑综合征病毒区分开，无交叉反应且最低检出限为6.26×100copies/μL。因此，本发明的方案具有特异性好、灵敏度高的特点。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种检测白斑综合征病毒WSSV的引物组、试剂盒和方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
如无特殊说明，本发明实施例中所用试剂、仪器均为常规购买。其中，标准品来自北京擎科生物科技股份有限公司；TB Green Premix Ex Taq II(2x)购买于日本TaKaRa公司产品；病毒基因组DNA提取试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；实时荧光定量PCR仪(Agilent.AriaMx)为英国安捷伦公司产品。
实施例1
白斑综合征病毒TB GreenⅡ实时荧光定量PCR检测方法的构建：
1.引物设计：根据KY827813基因组序列，选择编码WSSV的WSSV131蛋白的保守序列设计引物。对引物进行电泳检测后，选择无引物二聚体及非特异性扩增的引物作为最终用于建立TB GreenⅡ荧光定量PCR检测的引物。引物组具体为：上游引物WSSV131F：5’-GGTTGCTGTTGTTCTACTCCTT-3’，下游引物WSSV131R：5’-AGGCGTGGAAATGGTAATGAAG-3’，扩增片段大小为96bp，引物由擎科生物有限公司合成。
2.标准品的建立：以序列如SEQ ID No.3所示的WSSV病毒序列构建阳性质粒，阳性质粒由北京擎科生物科技股份有限公司合成，其中纯化后的PCR产物以T载体连接，构建重组质粒。重组质粒的拷贝数为6.26×1010copies/μL，对其进行10倍浓度稀释，获得拷贝数为6.26×109～6.26×100copies/μL等10个稀释度的重组质粒作为标准品模板，将拷贝数为6.26×109copies/μL的重组质粒记作标准品1，将拷贝数为6.26×108copies/μL的重组质粒记作标准品2，将拷贝数为6.26×107copies/μL的重组质粒记作标准品3，将拷贝数为6.26×106copies/μL的重组质粒记作标准品4，将拷贝数为6.26×105copies/μL的重组质粒记作标准品5，将拷贝数为6.26×104copies/μL的重组质粒记作标准品6，将拷贝数为6.26×103copies/μL的重组质粒记作标准品7，将拷贝数为6.26×102copies/μL的重组质粒记作标准品8，将拷贝数为6.26×101copies/μL的重组质粒记作标准品9，将拷贝数为6.26×100copies/μL的重组质粒记作标准品10。
3.反应条件的优化
3.1引物使用量的优化
以标准品5为模板DNA，通过控制变量改变条件得到引物的最佳使用量：浓度为10μM的上游引物和下游引物，每对引物的上下游引物均为相同用量，分别设置使用量为0.5μL、1μL、1.5μL和2μL添加到PCR扩增的反应体系中，每个使用量重复扩增三次(结果见图1～图4，图1～图4的横坐标为循环数，纵坐标为拷贝数)。其中，上游引物WSSV131F：5’-GGTTGCTGTTGTTCTACTCCTT-3’，下游引物WSSV131R：5’-AGGCGTGGAAATGGTAATGAAG-3’。
其中，PCR扩增的反应体系如下：10.0μL的2×TB Green Premix Ex Taq II，2.2μL的模板DNA，10μM的上游引物和10μM的下游引物，无RNA酶水补至20μL。PCR扩增的反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性5s，58℃退火34s，运行40个循环。
由图1～图4可以看出，当上游引物和下游引物的使用量分别为1μL时(图2)，扩增曲线的Ct值分别为16.37、16.35和16.33；当上游引物和下游引物的使用量分别为1.5μL(图3)，扩增曲线的Ct值分别为16.34、16.28和16.31相对较为稳定；而当上游引物和下游引物的使用量分别为0.5μL(图1)时，扩增曲线的Ct值分别为17.02、16.96和16.21，当上游引物和下游引物的使用量分别为2μL(图4)时，扩增曲线的Ct值分别为16.98、17.11和16.69，扩增曲线的Ct值稳定性较差，不利于特异性扩增。因此，当上游引物和下游引物的使用量分别为1～1.5μL时，稳定性好且扩增速度快，尤其当上游引物和下游引物的使用量分别为1μL时，稳定性更好且扩增速度更快。
3.2模板使用量的优化
以标准品5为模板DNA，分别设置模板的使用量为2.5μL、2.4μL、2.2μL、2μL、1.8μL、1.6μL和1.5μL添加到PCR扩增的反应体系中，每个使用量重复扩增三次(结果见图5～图11，图5～图11的横坐标为循环数，纵坐标为拷贝数)。其中，上游引物WSSV131F：5’-GGTTGCTGTTGTTCTACTCCTT-3’，下游引物WSSV131R：5’-AGGCGTGGAAATGGTAATGAAG-3’。
其中，PCR扩增的反应体系如下：10.0μL的2×TB Green Premix Ex Taq II，1.0μL10μM的上游引物，1.0μL 10μM的下游引物，模板DNA，无RNA酶水补至20μL。PCR扩增的反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性5s，58℃退火34s，运行40个循环。
由图5～图11可以看出，当模板DNA的使用量为2.2μL时(图7)，其扩增曲线的Ct值分别为16.96、16.67和16.70；当模板DNA的使用量为2.4μL(图6)时，其扩增曲线的Ct值分别为17.00、16.82和16.76，扩增曲线的Ct值更为稳定；而当模板DNA使用量为2.5μL(图5)、2μL(图8)、1.8μL(图9)、1.6μL(图10)和1.5μL(图11)时，扩增曲线的Ct值最高为27.96，最低为16.91浮动较大，稳定性较差，不利于特异性扩增。因此，当模板DNA的使用量为2.2～2.4μL时，其扩增曲线稳定性好且扩增速度快，尤其当模板DNA的使用量为2.2μL时，稳定性最好且扩增速度最快。
3.3退火温度的优化
以标准品5为模板DNA，上游引物WSSV131F：5’-GGTTGCTGTTGTTCTACTCCTT-3’，下游引物WSSV131R：5’-AGGCGTGGAAATGGTAATGAAG-3’。分别设置退火温度为60℃、58℃、57℃、56℃和55℃进行PCR扩增的反应，每个温度设置三次重复扩增(结果见图12～图16，图12～图16的横坐标为循环数，纵坐标为拷贝数)。
其中，PCR扩增的反应体系如下：10.0μL的2×TB Green Premix Ex Taq II，1.0μL10μM的上游引物，1.0μL 10μM的下游引物，2.2μL的模板DNA，无RNA酶水补至20μL。PCR扩增的反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性5s，退火34s，运行40个循环。
由图12～图16可以看出，当退火温度为58℃时(图13)，其扩增曲线的Ct值稳定在16.83左右，当退火温度为60℃时(图13)，其扩增曲线的Ct值稳定在16.90左右，浮动小更为稳定；而当退火温度为57℃(图14)、56℃(图15)和55℃(图16)时，其扩增曲线的Ct值稳定性较差，其浮动范围分别为16.97～17.13、16.67～17.45、16.87～36.24，因此不利于特异性扩增。因此，当退火温度为58～60℃时，扩增曲线的Ct值较为稳定，且当退火温度为58℃时，扩增曲线的Ct值更稳定，扩增速度更快。
综上可知，白斑综合征病毒TB GreenⅡ实时荧光定量PCR检测过程中，PCR扩增的反应体系如下：10.0μL的2×TB Green Premix Ex Taq II，(2.2～2.4)μL的基因组DNA模板，(1.0～1.5)μL 10μM的上游引物，(1.0～1.5)μL 10μM的下游引物，无RNA酶水补至20μL；PCR扩增的反应程序为：95℃预变性30s，95℃变性5s，(58～60)℃退火34s，运行40个循环。最佳PCR扩增的反应体系如下：10.0μL的2×TB GreenPremix Ex Taq II，2.2μL的基因组DNA模板，1.0μL10μM的上游引物，1.0μL 10μM的下游引物，无RNA酶水补至20μL；最佳PCR扩增的反应程序为：95℃预变性30s，95℃变性5s，58℃退火34s，运行40个循环。
实施例2
灵敏度检测
采用实施例1中筛选的特异性扩增引物(上游引物WSSV131F：5’-GGTTGCTGTTGTTCTACTCCTT-3’，下游引物WSSV131R：5’-AGGCGTGGAAATGGTAATGAAG-3’)制备PCR扩增的反应体系，以标准品3～标准品8和空白对照(以无菌无RNA酶水为待测样品)为模板DNA进行检测并绘制标准曲线以及熔解曲线，具体步骤如下：
PCR扩增的反应体系如下：10.0μL的2×TB Green Premix Ex Taq II，1.0μL10μM的上游引物，1.0μL 10μM的下游引物，2.2μL的模板DNA，无RNA酶水补至20μL。PCR扩增的反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性5s，58℃退火34s，运行40个循环。当无荧光定量PCR扩增曲线时，则所述待测样本为白斑综合征病毒阴性；当所述荧光定量PCR扩增曲线的Ct≤35，则所述待测样本为白斑综合征病毒阳性；当所述荧光定量PCR扩增曲线的Ct＞35且Ct≤40时，再次进行TB GreenⅡ实时荧光定量PCR检测，当再次得到的荧光定量PCR扩增曲线的Ct≤40时，则所述待测样本为白斑综合征病毒阳性；当再次得到的荧光定量PCR扩增曲线的Ct＞40或无荧光定量PCR扩增曲线时，则所述待测样本为白斑综合征病毒阴性。
结果发现，标准品3～标准品8均出现典型扩增曲线，检测结果为阳性，空白对照无扩增曲线，检测结果为阴性。根据标准品3～标准品8的Ct值绘制标准曲线和熔解曲线，标准曲线如图17所示(图17中横坐标为拷贝数对数，纵坐标为Ct值)，熔解曲线如图18所示。
经统计，标准3～标准品8的Ct值分别为10.16、13.28、16.46、19.79、23.46和25.81。标准曲线如图17所示，由图17可以看出，标准品3～标准品8得到的Ct值与质粒标准品拷贝数的对数呈良好的线性关系，标准曲线方程为y＝-3.2x+35.13，R2＝0.9974。
由图18可以看出，标准品3～标准品8的熔解曲线的温度为78℃左右，并呈现单一峰，表明采用本发明提供的特异性引物进行扩增时，没有引物二聚体以及非特异性扩增。
实施例3
重复性实验
采用实施例1中筛选的特异性扩增引物(上游引物WSSV131F：5’-GGTTGCTGTTGTTCTACTCCTT-3’，下游引物WSSV131R：5’-AGGCGTGGAAATGGTAATGAAG-3’)以及实施例2中PCR扩增的反应体系和PCR扩增的反应条件，随机选择标准品7、标准品6和标准品4作为模板DNA，进行三次TB GreenⅡ荧光定量PCR重复检测，计算组间变异系数；在同次TBGreenⅡ荧光定量PCR中重复检测三次，计算组内变异系数，结果见表1。
表1组内和组间重复性检测结果表
由表1可以看出，本发明提供的检测方法，其组内变异系数在0.2％～0.5％，组间变异系数在0.04％～0.3％，小于2％，因此，本方法的重复性良好。
实施例4
敏感性实验
采用实施例1中筛选的特异性扩增引物(上游引物WSSV131F：5’-GGTTGCTGTTGTTCTACTCCTT-3’，下游引物WSSV131R：5’-AGGCGTGGAAATGGTAATGAAG-3’)，以标准品3～标准品10作为模板DNA分别进行TB GreenⅡ荧光定量PCR扩增和普通PCR，比较两者的最低拷贝浓度，试验设置空白对照，TB GreenⅡ荧光定量PCR扩增结果见图19；经普通PCR扩增后，对其扩增产物进行脂糖凝胶电泳，结果见图20。
其中，荧光定量PCR扩增的体系与条件与实施例2中PCR扩增的反应体系和PCR扩增的反应条件相同；
普通PCR扩增的反应体系如下：12.5μL的2×Taq MasterMix，1.0μL 10μM的上游引物，1.0μL 10μM的下游引物，2.0μL的模板DNA，无RNA酶水补至25μL。PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸5min。
由图19可以看出，随着标准品稀释倍数递的递减为10-3～10-9时，扩增曲线仍然为一条典型的“S”形曲线，但当稀释倍数递减为10-10时，实时荧光PCR扩增不出典型的“S”型曲线。因此，本方法最低检出限为标准品10，最低检出限为6.26×100copies/μL。
由图20可以看出，当样品的浓度为6.26×107～6.26×101copies/μL时，对其扩增产物进行脂糖凝胶电泳能够显示清晰的条带，而当样品浓度为6.26×100copies/μL时，其扩增产物不能显示条带。因此，本方法最低检出限为标准品9，最低检出限为6.26×101copies/μL。
综上可知，与普通PCR相比，采用本发明提供的TB GreenⅡ荧光定量PCR检测白斑综合征病毒WSSV的敏感性更强，最低检出限为6.26×100copies/μL。
实施例5
特异性实验
采用实施例1中设计的引物制备反应体系(上游引物WSSV131F：5’-GGTTGCTGTTGTTCTACTCCTT-3’，下游引物WSSV131R：5’-AGGCGTGGAAATGGTAATGAAG-3’)，以草鱼呼肠弧病毒DNA、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病毒DNA以及小龙虾白斑综合征病毒DNA基因组DNA为模板，进行特异性分析，试验设置阳性(成分为实施例2中制备的标准品5)及阴性对照，具体步骤如下：
利用北京擎科生物科技股份有限公司合成的草鱼呼肠弧病毒DNA、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病毒DNA以及小龙虾白斑综合征病毒DNA作为基因DNA。
荧光定量PCR扩增的体系与条件与实施例2中PCR扩增的反应体系和PCR扩增的反应条件相同。判定标准：当无荧光定量PCR扩增曲线时，则所述待测样本为白斑综合征病毒阴性；当所述荧光定量PCR扩增曲线的Ct≤35，则所述待测样本为白斑综合征病毒阳性；当所述荧光定量PCR扩增曲线的Ct＞35且Ct≤40时，再次进行TB GreenⅡ实时荧光定量PCR检测，当再次得到的荧光定量PCR扩增曲线的Ct≤40时，则所述待测样本为白斑综合征病毒阳性；当再次得到的荧光定量PCR扩增曲线的Ct＞40或无荧光定量PCR扩增曲线时，则所述待测样本为白斑综合征病毒阴性，结果见图21。
由图21可以看出，阳性对照出现典型扩增曲线，阴性对照未出现扩增信号，实验成立。本实验中检测的草鱼呼肠弧病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病毒均未出现扩增信号。由此可见，本发明提供的方法在检测小龙虾白斑综合征病毒时具有良好的特异性，无交叉反应。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种特异性检测白斑综合征病毒WSSV的引物组，其特征在于，所述引物组包括上游引物和下游引物；
所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.权利要求1所述的引物组在制备检测白斑综合征病毒WSSV的产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒和/或试剂。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测的物种为小龙虾。
5.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求1所述的引物组和PCR扩增试剂。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂包括TB GreenPremix Ex Taq II。
7.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述引物组中上游引物和下游引物的浓度分别为8～12μM。
8.一种白斑综合征病毒TB GreenⅡ实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：以待测样本的基因组DNA为模板，利用权利要求1中所述的引物组进行实时荧光PCR扩增，得到荧光定量PCR扩增曲线；
对所述荧光定量PCR扩增曲线进行分析并作出判断；
当无荧光定量PCR扩增曲线时，则所述待测样本为白斑综合征病毒阴性；
当所述荧光定量PCR扩增曲线的Ct≤35，则所述待测样本为白斑综合征病毒阳性；
当所述荧光定量PCR扩增曲线的Ct＞35且Ct≤40时，再次进行TB GreenⅡ实时荧光定量PCR检测，当再次得到的荧光定量PCR扩增曲线的Ct≤40时，则所述待测样本为白斑综合征病毒阳性；当再次得到的荧光定量PCR扩增曲线的Ct＞40或无荧光定量PCR扩增曲线时，则所述待测样本为白斑综合征病毒阴性。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述实时荧光PCR扩增的反应体系以20μL计，包括：10.0μL的2×TB Green Premix Ex Taq II，(2.2～2.4)μL的基因组DNA模板，(1.0～1.5)μL 10μM的上游引物，(1.0～1.5)μL 10μM的下游引物，无RNA酶水补至20μL。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述实时荧光PCR扩增的反应程序为：95℃预变性30s，95℃变性5s，(58～60)℃退火34s，运行40个循环。
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