CN110982814A - 一种引物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种引物及其用途。所述引物由3部分组成：5’端，间隔序列和3’端；其中5’端为一段能够与靶基因序列互补配对、Tm为50～63℃的碱基序列组成；3’端为6～10个能与靶基因互补配对的碱基序列，其GC％≥50％；间隔序列连接5’端与3’端，为4～6个A或者T，间隔序列与对应的靶基因位置至多有一个碱基互补配对。本发明的引物能在几乎不影响试剂开发成本的基础上实现DPO系统所具备的高度特异性扩增，提高靶基因的扩增效率的特性，同时还能减少因引物序列过多、过长与其他基因引物之间的干扰。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，尤其涉及一种引物及其用途。
背景技术
传统的聚合酶链反应技术(PCR)技术由于不能准确定量，且在操作过程中易受到污染而出现假阳性，使其应用受到很大的限制。为克服上述不足，人们采取了许多方法，如杂交法、竞争法、酶联法及尿苷酶降解法等，均未或成功，近年来出现的荧光定量PCR(Flurogenic Quantitative Polymerase Chain Reaction,FQ-PCR)技术克服上述不足，实现了PCR从定性到定量的飞跃。FQ-PCR作为一种核酸定量技术，应用较多且较成熟的主要是在病原体检测方面，为临床上对疾病的早期诊断、疗程的评定、预后的监测等,提供可靠的、准确的、实验室分析数据，其优越性在此方面也得以充分体现。因此将该项技术进一步开发应用于临床，具有很大潜力。
一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定。在诊断实验室中，PCR技术的应用主要受成本的限制，有时是因不能获得足够的待测样本体积。为了克服以上缺点,同时增加PCR技术的诊断能力，多重PCR的技术应运而生。
多重PCR(multiplex PCR)即在同一PCR反应体系里加入二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。该技术已广泛运用于病原微生物，遗传病或癌基因，基因分型，基因突变的检测。多重PCR的高效性、系统性、经济简便性，使用一滴血就可检测多种病原体成为现实。多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支。在实际操作上，用几对引物率先混合成预混液，并算好每对引物在终反应体系中的浓度。在所有后续操作多重PCR实验时，只需加不同比例预混液就可进行实验。极大程度的减少了复杂的实验步骤，并保证了每次做反应引物之间的比例都是固定的。
从一般PCR到多重PCR，其实验设计的难度也随之翻倍。多重PCR需要面临诸多挑战，例如既要避免不同基因引物间的干扰，保证正常扩增靶基因的同时，又要考虑反应体系中加入探针以达到区分不同扩增子，同一反应体系中引物数量越多，存在干扰的可能性相应增加。另一方面多重PCR中的不同扩增片段会互相竞争资源，其结果是高丰度模板能够很容易被检测到，低丰度的模板则沦为背景，即扩增目标越多，条件摸索困难越高。
引物和模板DNA的互补配对结合的程度决定了PCR扩增反应的特异性，因此引物的设计对于PCR特异性扩增起着决定性作用。双启动寡核苷酸引物系统(Dual primingoligonucleotide system，DPO)是2007年韩国Seegene公司首次提出的一种新型的聚合酶链式反应引物设计，其可以有效地防止非特异性引物而不破坏目标序列的有效扩增，极大的提高了PCR反应的特异性。与需要优化引物长度，熔解温度，GC含量并避免二级结构的常规PCR引物设计相比，DPO引物更易于设计，并包含三个区域：较长的5'段，较短的3'段以及连接5'和3'段的聚脱氧肌苷(poly I)接头。DPO引物不仅增强了PCR测定的特异性，而且允许更宽的退火温度范围，因此，DPO引物特别适合于多重PCR检测的开发。然而DPO引物的合成价格相对较为昂贵，约普通引物价格的20倍，显著提高了试剂开发的成本。
因此，迫切需求一种既能增强PCR特异性扩增，又不影响试剂开发成本的新方法。
发明内容
为此，本发明提出了一种增强PCR特异性扩增反应的新引物，所述引物能保证在不增加试剂开发成本的基础上，显著提高扩增特异性及扩增效率，提高灵敏度，所述引物可运用于多重实时荧光PCR。发明人通过实验验证发现，由一条特殊的引物、一条普通的引物组成的引物结合一条特异性探针可以实现对靶基因的快速、高度特异性的扩增。本发明同样能在几乎不影响试剂开发成本的基础上不仅能实现DPO系统所具备的高度特异性扩增，提高靶基因的扩增效率的特性，同时还能减少因引物序列过多、过长与其他基因引物之间的干扰。
为实现上述目的，本发明提供一种引物，其特征在于，所述引物由3部分组成：5’端，间隔序列和3’端；其中5’端为一段能够与靶基因序列互补配对、Tm为50～63℃的碱基序列组成；3’端为6～10个能与靶基因互补配对的碱基序列，其GC％≥50％；间隔序列连接5’端与3’端，为4～6个A或者T，间隔序列与对应的靶基因位置至多有一个碱基互补配对。
进一步，所述间隔序列的碱基数为5个。
进一步，所述间隔序列的碱基数为4或5个时，完全不与靶基因序列互补配对，所述间隔序列碱基数为6个时，与靶基因序列互补配对的碱基数量≤1。
进一步，所述引物作为上游引物和/或下游引物。
进一步，所述引物用于基因分型或多种病原体基因联合检测。
进一步，所述引物用于实时荧光定量PCR。
传统PCR利用一对能够与DNA模板碱基互补配对的引物，在DNA聚合酶、Mg2+等存在下，经变性、退火及延伸过程，实现PCR扩增反应。本发明涉及的引物由三个部分组成：5’端序列，间隔序列和3’端序列。如图1本发明PCR与传统PCR原理示意图所示：模板DNA双链变性后，双链分离；经退火过程，使引物特异性的结合到模板DNA链上，在该过程中，本发明PCR涉及到的引物的5’端序列和3’端序列通过碱基互补原则，特异性地结合模板DNA，而间隔序列则不能够与模板结合，如图1中模板的CCGGC和CGCCG只是示意，并不一定为此序列；然后在DNA聚合酶、Mg2+等底物以及适当的温度下，实现DNA新链的合成，且原始DNA链上与本发明引物间隔序列对应的互补序列将被本发明引物间隔序列的互补序列替代；最后在给予适当的变性、退火及延伸循环过程实现PCR扩增反应。根据本发明引物设计要求及引物组合方式可以实现引物的特异性扩增，并实现多重PCR反应。
附图说明
图1是本发明PCR与传统PCR原理示意图。
图2为根据本发明实施例1的HPV16基因“A”替代型间隔序列碱基数对比验证图；
图3为根据本发明实施例1的HPV18基因“A”替代型间隔序列碱基数对比验证图；
图4是根据本发明实施例2的HPV16基因“A”替代型不同引物组合对比验证图；
图5是根据本发明实施例2的HPV18基因“A”替代型不同引物组合对比验证图；
图6是根据本发明实施例3的HPV16和HPV18基因“A”替代型多重PCR验证图；
图7是根据本发明实施例4的HPV16基因“A”替代型多重PCR特异性扩增验证图；
图8是根据本发明实施例4的HPV18基因“A”替代型多重PCR特异性扩增验证图；
图9是根据本发明实施例5的HPV16和HPV18基因“T”替代型间隔序列碱基数对比验证图；
图10是根据本发明实施例6的HPV16和HPV18基因“T”替代型引物单重/多重及特异性扩增对比验证图。
图11是根据本发明实施例7的HPV16基因3’端“A”替代型碱基数对比验证图(“A”间隔序列)。
图12是根据本发明实施例8的HPV16基因3’端“T”替代型碱基数对比验证图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实施例和附图说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
为了更好的理解上述技术方案，下面将参照附图更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然附图中显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下实施例中的引物、探针、HPV16基因重组质粒、HPV18基因重组质粒均可从市面上合成购买。
以下为靶基因序列(5’-3’)
HPV16-1
GTAGCGGCCCAGCCTCTCCCGGCAGTCCTCGTCATCAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTCAGCAGCATTATATTGGTA TAAAACAGGTATGTCAAATATTAGTGAAGTGCAGTAGCTAGCGCCGGGCACTGGTGGCCTGACTTSEQ ID NO:1。
HPV16-2
GTAGCGGCCCAGCCTCTCCCGGAGTCCTCGTCATCAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTCAGCAGCATTATATTGGTAT AAAACAGGTATGTCAAATATTAGTGAAGTGCAGTAGCTAGCGCCGGCACTGGTGGCCTGACTTSEQ ID NO:2。
HPV16-3
GTAGCGGCCCAGCCTCTCCCGGCGAGTCCTCGTCATCAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTCAGCAGCATTATATTGGT ATAAAACAGGTATGTCAAATATTAGTGAAGTGCAGTAGCTAGCGCCGCGGCACTGGTGGCCTGACTT SEQ ID NO:3。
HPV18-1
AACCGCTGTGTCCAGTTGCCGGCGCTACTCCTCATCAAGCATCGGTGGACGGTGGACAGTTATTACAAGGCCAGAGAAA TGGGATTTAAACATATTAACCACCAGGTGGTGCCAACACTGTAGACGAGTGCCGGCCAACACGTAGAGAAACCGA SEQ ID NO:4。
HPV18-2
AACCGCTGTGTCCAGTTGCCGGGCTACTCCTCATCAAGCATCGGTGGACGGTGGACAGTTATTACAAGGCCAGAGAAAT GGGATTTAAACATATTAACCACCAGGTGGTGCCAACACTGTAGACGAGTGCCGCCAACACGTAGAGAAACCGA SEQ ID NO:5。
HPV18-3
AACCGCTGTGTCCAGTTGCCGGCGGCTACTCCTCATCAAGCATCGGTGGACGGTGGACAGTTATTACAAGGCCAGAGAA ATGGGATTTAAACATATTAACCACCAGGTGGTGCCAACACTGTAGACGAGTGCCGGCCCAACACGTAGAGAAACCGA SEQ ID NO:6。
表1引物和探针序列信息统计表
注：其中N代表脱氧肌苷。
实施例1：HPV16和HPV18基因“A”替代型间隔序列碱基数的对比验证
S1、分别设计并合成用于检测HPV16和HPV18基因的引物和特异性探针。
S2、模板的制备：合成HPV16(-1、-2、-3)和HPV18(-1、-2、-3)基因的重组质粒，用无菌水分别将这些质粒稀释成浓度为1.0×106copies/mL、1.0×103copies/mL，并作为检测模板。
S3、对步骤S2稀释获得的模板进行PCR扩增验证，PCR扩增反应体系及扩增条件见表2和表3。
表2 PCR反应体系表
表3 PCR扩增条件表
所得结果见图1-2和表4-5。
表4 HPV16基因“A”替代型间隔序列碱基数对比验证结果表
表5 HPV18基因“A”替代型间隔序列碱基数对比验证结果表
HPV16和HPV18基因“A”替代型间隔序列碱基数对比验证结果，见图2-3和表4-5。可以看出：高浓度和低浓度的HPV16和HPV18基因模板分别经三种含不同间隔碱基数(4个，5个或6个)的引物扩增发现，当含连续5个A碱基连接的引物扩增时，均表现出极高的扩增灵敏度及良好的扩增线性，且由本发明方法合成的引物扩增效果明显优于DPO引物和普通引物组合。
实施例2：HPV16和HPV18基因“A”替代型不同引物组合对比验证
S1、根据下表6，分别将不同类型HPV16和HPV18基因的引物进行组合验证。
S2、模板：用无菌水分别将HPV16-1和HPV18-1的质粒稀释成浓度为1.0×106copies/mL、1.0×103copies/mL，并作为检测模板。
S3、PCR扩增验证：PCR扩增反应体系及扩增条件详见实施例一中的步骤S3。
表6 HPV16基因“A”替代型不同引物组合PCR验证结果表
表7 HPV18基因“A”替代型不同引物组合PCR验证结果表
HPV16和HPV18基因“A”替代型不同类型引物组合对比验证结果，见图4-5和表6-7。可以看出，由高浓度和低浓度的HPV16和HPV18基因检测结果可知，不同引物类型组合时，涉及本发明方法合成的引物组合均表现出极高的扩增灵敏度，扩增线性效果优于其他DPO引物或普通引物的组合方式，而且最佳引物组合方式为由一条本发明方法合成的引物与一条普通引物的组合方式。
实施例3 HPV16和HPV18基因“A”替代型多重PCR验证
S1、根据下表8，将HPV16和HPV18基因的引物对组合并管，进行多重PCR验证。
S2、模板制备：用无菌水稀释制备浓度为1.0×106copies/mL的HPV16-1与HPV18-1基因混合质粒作为高浓度检测模板、浓度为1.0×103copies/mL的HPV16-1与HPV18-1基因混合质粒作为低浓度检测模板。
S3、PCR扩增验证：PCR扩增反应体系及扩增条件详见实施例一中的步骤S3。
表8 HPV16和HPV18基因“A”替代型多重PCR验证结果表
HPV16-1与HPV18-1基因“A”替代型多重PCR验证结果，见图6和表8。可以看出，由本发明方法合成的引物组合均表现出极高的扩增灵敏度，扩增线性效果优于其他DPO引物或普通引物的组合方式。
实施例4 HPV16和HPV18基因“A”替代型多重PCR特异性扩增验证
S1、根据下表9，将HPV16和HPV18引物并管，配制多重PCR扩增反应液。
S2、模板制备：用无菌水分别将HPV16-1与HPV18-1的质粒稀释成浓度为1.0×106copies/mL、1.0×103copies/mL，并作为检测模板。
S3、PCR扩增验证：PCR扩增反应体系及扩增条件详见实施例一中的步骤S3。
表9 HPV16基因多重PCR特异性扩增验证结果表
表10 HPV18基因多重PCR特异性扩增验证结果表
HPV16和HPV18基因“A”替代型多重PCR特异性扩增验证结果，见图7-8和表9-10。可以看出，由一条本发明方法合成的引物与一条普通引物的组合方式配制的多重PCR反应液扩增效果优于DPO引物或普通引物的组合方式，且灵敏度最高，阴性对照正常，能够特异性区分HPV16和HPV18基因。
实施例5 HPV16和HPV18基因“T”替代型间隔序列碱基数对比验证
S1、根据下表11，分别配制HPV16和HPV18基因不同类型的反应液。
S2、模板制备：用无菌水分别将HPV16(-1、-2、-3)和HPV18(-1、-2、-3)的质粒稀释成浓度为1.0×106copies/mL、1.0×103copies/mL，并作为检测模板。
S3、PCR扩增验证：PCR扩增反应体系及扩增条件详见实施例一中的步骤S3。
表11 HPV16和HPV18基因“T”替代型间隔序列碱基数对比验证结果表
HPV16和HPV18基因“T”替代型间隔序列碱基数对比验证结果，见图9和表11。可以看出，设计合成的、由4～6bp组成新型引物，结果显示其均表现出良好的扩增线性和灵敏度，且涉及到新型引物的反应液扩增效果明显优于普通常规引物。
实施例6：HPV16和HPV18基因“T”替代型引物单重/多重及特异性扩增对比验证
S1、根据下表12，分别配制HPV16和HPV18基因不同类型的反应液。
S2、模板制备：用无菌水稀释制备浓度为1.0×106copies/mL的HPV16-1与HPV18-1基因混合质粒作为高浓度检测模板、浓度为1.0×103copies/mL的HPV16与HPV18基因混合质粒作为低浓度检测模板。
S3、PCR扩增验证：PCR扩增反应体系及扩增条件详见实施例一中的步骤S3。
表12 HPV16和HPV18基因“T”替代型引物单重/多重及特异性扩增对比验证结果表
HPV16和HPV18基因“T”替代型引物单重/多重及特异性扩增对比验证结果，见图10和表12。可以看出，设计合成的引物，根据最优引物组合方式进行组合验证，结果显示其均表现出良好的扩增曲线、灵敏度及特异性。
实施例7：3’端“A”替代型引物不同碱基数对比验证
S1、根据下表13，分别配制HPV16基因不同类型的反应液。。
S2、模板制备：用无菌水分别将HPV16-1的质粒稀释成浓度为1.0×106copies/mL、1.0×103copies/mL，并作为检测模板。
S3、PCR扩增验证：PCR扩增反应体系及扩增条件详见实施例一中的步骤S3。
表13 3’端“A”替代型引物不同碱基数对比验证结果表
HPV16基因3’端“A”替代型引物不同碱基数对比验证结果，见图11和表13。可以看出，设计合成的、由6～10bp组成的引物，根据最优引物组合方式进行组合验证，结果显示其均表现出良好的扩增曲线、灵敏度，且涉及到新型引物的反应液扩增效果明显优于普通常规引物。
实施例8：3’端“T”替代型引物不同碱基数对比验证
S1、根据下表14，分别配制HPV16基因不同类型的反应液。。
S2、模板制备：用无菌水分别将HPV16-1的质粒稀释成浓度为1.0×106copies/mL、1.0×103copies/mL，并作为检测模板。
S3、PCR扩增验证：PCR扩增反应体系及扩增条件详见实施例一中的步骤S3。
表14 3’端“T”替代型引物不同碱基数对比验证结果表
HPV16基因3’端“T”替代型引物不同碱基数对比验证结果，见图12和表14。可以看出，设计合成的、由6～10bp组成的引物，根据最优引物组合方式进行组合验证，结果显示其均表现出良好的扩增曲线、灵敏度，且涉及到新型引物的反应液扩增效果明显优于普通常规引物。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 厦门宝太生物科技有限公司
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cgccgggcac tggtggcctg actt 144
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<400> 22
aagtcaggcc accagtgcct tttttctagc t 31
<210> 23
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 23
aagtcaggcc accagtgcca aaaactagct ac 32
<210> 24
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<212> DNA
<213> 人工合成
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aagtcaggcc accagtgcca aaaactagct actg 34
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<212> DNA
<213> 人工合成
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aagtcaggcc accagtgcct ttttctagct ac 32
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<213> 人工合成
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aagtcaggcc accagtgcct ttttctagct actg 34
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<213> 人工合成
<400> 27
cagaaccgga cagagcccat t 21
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
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<400> 28
aaccgctgtg tccagttg 18
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 29
tcggtttctc tacgtgttgg 20
<210> 30
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<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(23)
<223> N表示脱氧肌苷
<400> 30
aaccgctgtg tccagttgnn nnngctact 29
<210> 31
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(25)
<223> N表示脱氧肌苷
<400> 31
tcggtttctc tacgtgttgg nnnnnactcg t 31
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<213> 人工合成
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aaccgctgtg tccagttgaa aagctact 28
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aaccgctgtg tccagttgaa aaagctact 29
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<213> 人工合成
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aaccgctgtg tccagttgaa aaaagctact 30
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<212> DNA
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aaccgctgtg tccagttgtt tttgctact 29
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<213> 人工合成
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aaccgctgtg tccagttgtt ttgctact 28
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aaccgctgtg tccagttgtt ttttgctact 30
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<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 48
catcggtgga cggtggacag 20
Claims (6)
1.一种引物，其特征在于，所述引物由3部分组成：5’端，间隔序列和3’端；其中5’端为一段能够与靶基因序列互补配对、Tm为50～63℃的碱基序列组成；3’端为6～10个能与靶基因互补配对的碱基序列，其GC％≥50％；间隔序列连接5’端与3’端，为4～6个A或者T，间隔序列与对应的靶基因位置至多有一个碱基互补配对。
2.如权利要求1所述引物，其特征在于，所述间隔序列的碱基数为5个。
3.如权利要求1所述引物，其特征在于，所述间隔序列的碱基数为4或5个时，完全不与靶基因序列互补配对，所述间隔序列碱基数为6个时，与靶基因序列互补配对的碱基数量≤1。
4.如权利要求1所述引物，其特征在于，所述引物作为上游引物和/或下游引物。
5.如权利要求1所述引物，其特征在于，所述引物用于基因分型或多种病原体基因联合检测。
6.如权利要求1所述引物，其特征在于，所述引物用于实时荧光定量PCR。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010004573.7A CN110982814A (zh) | 2020-01-03 | 2020-01-03 | 一种引物及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010004573.7A CN110982814A (zh) | 2020-01-03 | 2020-01-03 | 一种引物及其用途 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110982814A true CN110982814A (zh) | 2020-04-10 |
Family
ID=70080705
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| CN202010004573.7A Pending CN110982814A (zh) | 2020-01-03 | 2020-01-03 | 一种引物及其用途 |
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| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110982814A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP4028559A4 (en) * | 2019-08-15 | 2023-09-20 | Shrestha, Devjani Ghosh | IN VITRO DIAGNOSIS AND RISK STRATIFICATION METHODS FOR HEAD AND NECK CANCER BASED ON EXOSOMAL MARN |
-
2020
- 2020-01-03 CN CN202010004573.7A patent/CN110982814A/zh active Pending
Non-Patent Citations (5)
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