CN111876506A

CN111876506A - 检测产毒艰难梭菌的多重荧光定量pcr引物、探针和试剂盒

Info

Publication number: CN111876506A
Application number: CN202010825309.XA
Authority: CN
Inventors: 吴媛; 卢金星; 贾筱溪; 王媛媛; 李文革; 张文竹
Original assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Priority date: 2020-08-17
Filing date: 2020-08-17
Publication date: 2020-11-03

Abstract

本发明涉及产毒艰难梭菌检测技术领域，具体涉及检测产毒艰难梭菌的多重荧光定量PCR引物、探针和试剂盒。本发明提供用于产毒艰难梭菌的多重荧光定量PCR检测的引物探针组和试剂盒以及产毒艰难梭菌的多重荧光定量PCR检测方法。该检测方法具有特异度高、灵敏度高、重复性好的优势，可实现肠毒素A、细胞毒素B和二元毒素CDT三种毒素基因通过一次上机同时高效检测，显著提高了产毒艰难梭菌感染的检测效率。

Description

检测产毒艰难梭菌的多重荧光定量PCR引物、探针和试剂盒

技术领域

本发明涉及产毒艰难梭菌检测技术领域，具体涉及检测产毒艰难梭菌的多重荧光定量PCR引物、探针和试剂盒及其应用。

背景技术

艰难梭菌(Clostridium difficile)是抗生素相关性腹泻的重要病原，是一种严格厌氧、产芽孢的革兰氏阳性杆菌，其培养相对困难且需要厌氧设备。艰难梭菌感染的主要致病因素是肠毒素A、细胞毒素B、和二元毒素CDT，因此，如果不需培养即能够实现产毒艰难梭菌的快速准确的鉴定，对于艰难梭菌感染的诊断以及及时准确的治疗具有重要意义。

基于核酸的艰难梭菌检测方法(NAAT)已被欧洲CDC和美国感染学会列为指南中推荐的快速检测方法(European surveillance of Clostridium difficile infections-Surveillance protocol version 2.4.ECDC,2019.Natasha Bagdasarian,Krishna Rao,Preeti N.Malani.Diagnosis and treatment of Clostridium difficile in adults asystematic review[J].JAMA,2015,313(4):398-408.)。目前，针对产毒艰难梭菌PCR检测的方法或需依赖于特定的仪器(如Xpert等)，限制了其在临床的推广应用，或仅为针对毒素A和B的检测，无法检测二元毒素，因此不能对同时产生肠毒素A、细胞毒素B和二元毒素CDT三种毒素的高毒株(A⁺B⁺CDT⁺)进行预警和提示(金大智，罗芸，罗丽，等.多重荧光PCR结合Allglo探针技术检测艰难梭菌相关毒素基因[J].中华检验医学杂志，2014，37(01):32-35.谢乐，许雨乔，刘成成，等.实时荧光定量PCR直接检测粪便标本艰难梭菌tcd B基因[J].临床检验杂志，2016,3:211-214)。因此，建立一种同时针对产毒艰难梭菌的肠毒素A、细胞毒素B和二元毒素CDT的快速、灵敏、特异的PCR检测方法对于临床感染病例的准确诊断和高毒株的预警是必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有高灵敏度、高特异度、重复性好的用于产毒艰难梭菌检测的引物、探针和试剂盒。本发明还提供该引物、探针和试剂盒的应用。

为实现上述目的，本发明以产毒艰难梭菌的tcdA、tcdB和cdtB基因为检测靶标，通过对NCBI数据库中报道的不同分子型别产毒艰难梭菌的tcdA、tcdB和cdtB基因序列，以及临床分离菌株的全基因组测序序列，进行分析和比对，明确其基因遗传特征和序列突变情况，分别确定了tcdA、tcdB和cdtB基因的引物探针设计区域，针对设计区域设计数对特异性的引物和探针，在线通过NCBI进行BLAST，排除其与其它物种的非特异性结合，并进一步通过实验对其进行验证和筛选，经筛选和优化获得了序列如SEQ ID NO.1-6所示的3对特异性引物以及与之配套使用的序列如SEQ ID NO.7-9所示的3条特异性探针。针对该特异性引物和探针，本发明还开发了产毒艰难梭菌的多重荧光定量PCR检测方法，该方法可实现一次上机高效检测产毒艰难梭菌的肠毒素A、细胞毒素B和二元毒素CDT三种毒素基因。

具体地，本发明的技术方案如下：

本发明提供用于产毒艰难梭菌的多重荧光定量PCR检测的引物探针组，该引物探针组包含3对特异性引物和3条特异性探针，其中，特异性引物的序列如SEQ ID NO.1-6所示，特异性探针的序列如SEQ ID NO.7-9所示。

上述特异性引物中，SEQ ID NO.1-2所示引物和SEQ ID NO.7所示探针用于扩增tcdA(肠毒素A)基因，SEQ ID NO.3-4所示引物和SEQ ID NO.8所示探针用于扩增tcdB(细胞毒素B)基因，SEQ ID NO.5-6所示引物和SEQ ID NO.9所示探针用于扩增cdtB(二元毒素CDT)基因。

上述特异性引物和探针的序列具体如下：

SEQ ID NO.1：tcdA-F：TACTGGTTGGGCAACTATTGAT；

SEQ ID NO.2：tcdA-R:CTCCTATCTGAGGTAAACCATTTCT；

SEQ ID NO.7：tcdA-P：CGAGCCTAATACAGCTATGGGTGCG；

SEQ ID NO.3：tcdB-F:AGCAATGAAAGTCCAAGTTTACGCT；

SEQ ID NO.4：tcdB-R:TGCTGCACCTAAACTTACACCATCTAT；

SEQ ID NO.8：tcdB-P:ACTATTACAGATGCAGCCAAAGTTGTTGAATT；

SEQ ID NO.5：cdtB-F:ACAATTTCTTTGACCCAAGG；

SEQ ID NO.6：cdtB-R:TTTCTTATAGCCTTGTTCTGCAAA；

SEQ ID NO.9：cdtB-P:TGTCTGATTGGGAAGACGAAGATTTGGATACA。

上述特异性引物和探针能够高效、特异地产毒艰难梭菌的靶序列，并通过实验摸索出适合3个靶基因扩增的退火温度和反应条件，能够保证一次上机同时检测3个靶标，并避免了可能的荧光信号互相干扰。

本发明所述的探针优选为TaqMan探针。探针的5’端标记的荧光基团为选自FAM、VIC、HEX、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX中的任一种；3’端标记的淬灭基团为选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl中的任一种。

作为本发明的一种优选实施方式，SEQ ID NO.7所示的特异性探针的5’端标记的荧光基团为FAM，SEQ ID NO.8所示的特异性探针的5’端标记的荧光基团为VIC，SEQ IDNO.9所示的特异性探针的5’端标记的荧光基团为CY5，特异性探针的3’端标记的淬灭基团均为BHQ1。

进一步地，本发明提供以上所述的引物探针组在制备用于产毒艰难梭菌检测的试剂盒中的应用。

本发明还提供以上所述的引物探针组在产毒艰难梭菌检测中的应用。

本发明提供包含以上所述引物探针组的用于产毒艰难梭菌检测的试剂盒。

本发明所述试剂盒还可包含荧光定量PCR反应液、阳性对照和阴性对照中的一种或多种。

以上所述的试剂盒优选在如下条件下进行荧光定量PCR检测产毒艰难梭菌：

荧光定量PCR反应程序如下：95℃、20s；95℃、3s，58℃、30s，40个循环。

荧光定量PCR反应体系中上游或下游引物与探针的摩尔比为1:2。

荧光定量PCR的20μL反应体系包括如下组分：2×荧光定量PCR反应液10μL，10μM上游引物0.4μL，10μM下游引物0.4μL，10μM探针0.8μL，DNA模板2μL。

以上检测条件可更好地保证检测的灵敏度和特异度。

本发明的试剂盒在进行样本检测时需要设置无模板对照(NTC对照)和阳性对照(POS对照)，结合NTC对照、POS对照以及样本的检测结果判断样本是否含有产毒艰难梭菌以及所含产毒艰难梭菌的毒素类型。

具体的结果判定方法如下：

若NTC对照为阴性，POS对照为阳性，则为有效扩增，此时，CT值≤33的标本为阳性结果，CT值＞35的标本为阴性结果，CT值在33-35之间的标本需要重复试验，重复试验如CT值≤33判定为阳性结果，CT值＞35判定为阴性结果。若NTC对照为阳性，POS对照也为阳性，则为无效扩增，提示体系污染。若NTC对照为阴性，POS对照也为阴性，则为无效扩增提示体系错误或者试剂失效。

本发明还提供一种产毒艰难梭菌的多重荧光定量PCR检测方法：以艰难梭菌基因组DNA为模板，利用以上所述的引物探针组或试剂盒进行多重荧光定量PCR，根据扩增曲线和/或Ct值判断检测结果。

以上所述方法中，荧光定量PCR的反应程序如下：95℃、20s；95℃、3s，58℃、30s，40个循环。

以上所述方法中，荧光定量PCR的反应体系包括如下组分：2×荧光定量PCR反应液10μL，10μM上游引物0.4μL，10μM下游引物0.4μL，10μM探针0.8μL，DNA模板2μL。

本发明的有益效果在于：

(1)特异度高、灵敏度高、重复性好：本发明对艰难梭菌肠毒素A(TcdA),、细胞毒素B(TcdB)和二元毒素CDT(CdtB)三种毒素基因的保守区域设计特异性探针和引物，该引物和探针具有较高的特异度和扩增效率。进一步通过多重荧光定量PCR扩增条件优化，建立了可同时检测这三种毒素基因的方法，该方法具有较高的特异度、灵敏度且重复性好，其中，对于肠毒素A的检测下限为10¹copies/μL，高于普通PCR 10倍；细胞毒素B的检测下限为10⁰copies/μL，高于普通PCR 1000倍；二元毒素CdtB的检测下限为10⁰copies/μL，高于普通PCR 100倍；对常见的肠道细菌均无非特异扩增；多次试验表现出良好的重复性。

(2)本发明实现了肠毒素A(TcdA)、细胞毒素B(TcdB)和二元毒素CDT(CdtB)三种毒素基因在一次上机同时检测，简化了原有2/3以上的检测工作量，并缩短检测时间至1小时左右，显著提高了产毒艰难梭菌感染及其产毒类型的检测效率。

附图说明

图1为本发明实施例1中tcdA基因结构和引物设计位置示意图，其中，Kato.1991NK11-NK9代表普通PCR扩增引物NK11和NK9(Kato,N.,C.Y.Ou,H.Kato,etal.Identification of toxigenic Clostridium difficil e by the polymerase chainreaction.J Clin Microbiol.1991；29:33-37.)，Lemee.2004 tcdA代表普通PCR扩增引物(Lemee L,Dhalluin A,Testelin S,et al.Multiplex PCR targeting tpi(triosephosphate isomerase),tcdA(Toxin A),and tcdB(Toxin B)genes for toxigenicculture of Clostridium difficile.J Clin Microbiol.2004；42(12):5710-5714.)，tcdA1代表本发明实施例1的引物对tcdA1F和tcdA1R，tcdA2代表本发明实施例1的引物对tcdA-F和tcdA-R。

图2为本发明实施例2中tcdA、tcdB和cdtB在58℃退火温度条件下的扩增曲线图。

图3为本发明实施例3中tcdA的荧光定量PCR扩增曲线和标准曲线。

图4为本发明实施例3中tcdB的荧光定量PCR扩增曲线和标准曲线。

图5为本发明实施例3中cdtB的荧光定量PCR扩增曲线和标准曲线。

图6A、图6B和图6C为本发明实施例4中特异性的检测结果，其中图6A为tcdA基因，图6B为tcdB基因，图6C为cdtB基因。

图7为本发明实施例5中tcdA、tcdB和cdtB的普通PCR检测灵敏度分析结果，其中，M:Marker，9:10⁹copies，8:10⁸copies，7:10⁷copies，6：10⁶copies，5:10⁵copies，4:10⁴copies，3:10³copies，2:10²copies，1:10¹copies，0:10⁰copies，水：空白对照。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1用于检测产毒艰难梭菌的多重荧光定量PCR引物和探针的设计

本发明以产毒艰难梭菌的tcdA、tcdB和cdtB基因为检测靶标，通过对NCBI数据库中报道的不同分子型别产毒艰难梭菌的tcdA、tcdB和cdtB基因序列，以及临床分离菌株的全基因组测序序列，进行分析和比对，明确其基因遗传特征和序列突变情况，分别确定了tcdA、tcdB和cdtB基因的引物探针设计区域，针对设计区域设计数对特异性的引物和探针，在线通过NCBI进行BLAST，排除其与其它物种的非特异性结合，并进一步通过实验对其进行验证和筛选。其中，需要特别强调的是tcdA基因序列，目前，广泛应用的检测tcdA基因的普通PCR引物，是通过扩增产物大小来进行区分阴阳性，且产物片段较大，无法应用于荧光定量PCR。tcdA基因阴性的菌株存在两种情况，一种是由于毒力岛PaLoc丢失的阴性菌株，完全缺失了全长8kb的tcdA基因；另一种是tcdA阴性tcdB阳性菌株，其tcdA基因只是在3’端的重复区存在共约1.8kb的缺失，因此如果要通过扩增条带有无来判断阴阳性时，需要引物序列落在缺失区，并避免落在残留的tcdA基因片段上，从而造成非特异性扩增(图1)。基于上述问题，本发明设计了多对tcdA基因的扩增引物和探针除tcdA-F(SEQ ID NO.1)、tcdA-R(SEQID NO.2)和tcdA-P(SEQ ID NO.7)外，还包括tcdA1F(SEQ ID NO.10)、tcdA1R(SEQ IDNO.11)和tcdA1P(SEQ ID NO.12)等。

经大量筛选，本发明最终确定了具有较优的与靶序列的亲和力和二级结构以及引物和探针的GC含量、Tm值和扩增效率的引物和探针，其序列如SEQ ID NO.1-9所示。

以上所述的引物和探针序列具体如下：

SEQ ID NO.1：tcdA-F：TACTGGTTGGGCAACTATTGAT；

SEQ ID NO.2：tcdA-R:CTCCTATCTGAGGTAAACCATTTCT；

SEQ ID NO.7：tcdA-P：CGAGCCTAATACAGCTATGGGTGCG；

SEQ ID NO.3：tcdB-F:AGCAATGAAAGTCCAAGTTTACGCT；

SEQ ID NO.4：tcdB-R:TGCTGCACCTAAACTTACACCATCTAT；

SEQ ID NO.8：tcdB-P:ACTATTACAGATGCAGCCAAAGTTGTTGAATT；

SEQ ID NO.5：cdtB-F:ACAATTTCTTTGACCCAAGG；

SEQ ID NO.6：cdtB-R:TTTCTTATAGCCTTGTTCTGCAAA；

SEQ ID NO.9：cdtB-P:TGTCTGATTGGGAAGACGAAGATTTGGATACA；

SEQ ID NO.10：tcdA1F:AATAGATATTACTTCGAGCCT；

SEQ ID NO.11：tcdA1R:ATCCGTATTAGCAGGTGCAA；

SEQ ID NO.12：tcdA1P:TAGTTTTATAACCATTCGCACCCATAGCTG。

为便于荧光定量PCR检测，对上述探针进行标记，其中，SEQ ID NO.7所示的探针的5’端标记的荧光基团为FAM，SEQ ID NO.8所示的探针的5’端标记的荧光基团为VIC，SEQ IDNO.9所示的探针的5’端标记的荧光基团为CY5，各探针3’端标记的淬灭基团均为BHQ1。

实施例2产毒艰难梭菌的多重荧光定量PCR检测方法

针对实施例1确定的最佳引物和探针对多重荧光定量PCR的反应条件进行优化，其中，为同时高效率地扩增毒素编码基因tcdA,tcdB和cdtB，对于PCR反应条件的退火温度的优化过程如下：

多重荧光定量PCR的反应条件如下：第一步，预变性，95℃、20s，一个循环；第二步，PCR反应，95℃、3s，58℃、30s，40个循环。

将退火温度分别设置为56℃，58℃和60℃，结果显示，各退火温度条件下的扩增效率如表1所示。结果表明，三个基因在58℃时均有较好的扩增效率(图2)，因此，选择58℃作为反应的退火温度。

表1不同退火温度下基因的扩增效率

产毒艰难梭菌的多重荧光定量PCR检测的反应体系如表2所示。

表2实时定量PCR反应体系

以上反应体系中，正向引物为SEQ ID NO.1、3、5所示引物的混合物，反向引物为SEQ ID NO.2、4、6所示引物的混合物，各引物的浓度均为10μM，探针为SEQ ID NO.7、8、9所示探针的混合物，各探针的浓度均为10μM。

针对每个样品进行检测时，需分别配置独立的反应体系，同时上机检测。

在进行样本检测时需要设置无模板对照(NTC对照)和阳性对照(POS对照)，结合NTC对照、POS对照以及样本的检测结果判断样本是否含有产毒艰难梭菌以及所含产毒艰难梭菌的产毒类型。检测结果判定方式如下：若NTC对照为阴性，POS对照为阳性，则为有效扩增，此时，CT值≤33的标本为阳性结果，CT值＞35的标本为阴性结果，CT值在33-35之间的标本需要重复试验，重复试验如CT值≤33判定为阳性结果，CT值＞35判定为阴性结果。若NTC对照为阳性，POS对照也为阳性，则为无效扩增，提示体系污染。若NTC对照为阴性，POS对照也为阴性，则为无效扩增提示体系错误或者试剂失效。

实施例3荧光定量PCR对三种艰难梭菌毒素基因检测的灵敏度

利用实施例1确定特异性引物和探针以及实施例2确定的检测方法对三种艰难梭菌毒素基因检测的灵敏度进行分析，以标准浓度模板的lg值为横坐标，以相应的Ct值为纵坐标，建立检测方法对3个毒素编码基因的检测标准曲线。具体如下：

1、毒素A基因(tcdA)

重组质粒DNA的浓度为123μg/μL，计算得质粒拷贝数浓度为5.53×10¹⁰copies/μL，将质粒10倍梯度稀释，获得5.53×10^0～5.53×10⁹copies/μL共计10个梯度的标准品质粒。分别以这10个梯度标准品为模板进行荧光定量PCR扩增，结果如表3所示，在5.53×10¹浓度时，复管的CT值稳定(SD<0.5)，检测下限为5.53×10¹copies/μL。以质粒的拷贝数浓度与CT值绘制的标准曲线显示二者之间的具有非常好的相关性，扩增效率较高(图3)，具体参数为：斜率(Slope)：-3.27，Y轴截距(Y-Inter)：41.287，相关系数R²：0.999，扩增效率Eff％：102.214。

表3 tcdA质粒浓度与其对应的CT值

2、毒素B基因(tcdB)

测得重组质粒DNA的浓度为127μg/μL，质粒拷贝数浓度为4.03×10¹⁰copies/μL，将质粒10倍梯度稀释，获得4.03×10⁰～4.03×10⁹copies/μL共计10个梯度的标准品质粒。分别以这10个梯度标准品为模板，结果如表4所示，在4.03×10⁰浓度时，复管的CT值稳定(SD<0.5)，检测下限为4.03×10⁰copies/μL。以质粒的拷贝数浓度与CT值绘制的标准曲线显示二者之间的具有非常好的相关性，扩增效率较高(图4)，具体参数为：Slope:-3.243，Y-Inter:41.819，R²:0.998扩增效率Eff％:103.407。

表4 tcdB质粒浓度与其对应的CT值

3、二元毒素CdtB基因(cdtB)

测得重组质粒DNA的浓度为134μg/μL，得质粒拷贝数浓度为4.28×10¹⁰copies/μL，将质粒10倍梯度稀释，获得4.28×10⁰～4.28×10⁹copies/μL共计10个梯度的标准品。分别以这10个梯度标准品为模板，结果如表5所示，在4.28×10⁰copies/μL浓度时，复管的CT值稳定(SD<0.5)，检测下限为4.28×10⁰copies/μL。以质粒的拷贝数浓度与CT值绘制的标准曲线显示二者之间的具有非常好的相关性，扩增效率较高(图5)，具体参数为：Slope:-3.257，Y-Inter:40.555，R²:0.998，扩增效率Eff％:102.77。

表5 cdtB质粒浓度与其对应的CT值

实施例4多重荧光定量PCR检测方法的特异度评价

以实施例2确定的多重荧光定量PCR检测方法检测6种常见肠道细菌(表6)，分别以肠毒素A基因、细胞毒素B基因和二元毒素CdtB基因的质粒DNA模板作为阳性对照。结果如图6A、6B和6C所示，除阳性对照外，其余6种常见肠道细菌模板均为阴性扩增，表明本发明的多重荧光定量PCR检测方法的检测特异度为100％。

表6用于检测荧光PCR体系特异性模板

实施例5多重荧光定量PCR检测方法与普通PCR检测方法的检测能力比较

三种毒素基因分别取浓度为10⁰～10⁹copies/μL的标准品各2μL使用普通PCR进行扩增，结果显示(图7)：对于tcdA基因，普通PCR的检测下限为10²copies/μL，多重荧光定量PCR的灵敏度为10¹copies/μL，是普通PCR的10倍。对于tcdB基因，普通PCR的检测下限为10³copies/μL，多重荧光定量PCR的灵敏度为10⁰copies/μL，是普通PCR的1000倍。对于cdtB基因，普通PCR的检测下限为10²copies/μL，多重荧光定量PCR的灵敏度为10⁰copies/μL，是普通PCR的100倍。

实施例6多重荧光定量PCR检测方法的重复性评价

每个基因分别选择三个不同梯度的标准品(高、中、低拷贝数)，隔天进行三次试验，每次试验做三个平行样品，获得以下组内变异系数和组间变异系数(表7、表8和表9)：

表7 tcdA实时PCR重复性评价

表8 tcdB实时PCR重复性评价

表9 cdtB实时PCR重复性评价

结果表明，三个毒素基因组内和组间的变异系数均小于3％，证明多重荧光定量PCR检测方法的重复性和稳定性良好。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

<120> 检测产毒艰难梭菌的多重荧光定量PCR引物、探针和试剂盒

<130> KHP201114424.9

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tactggttgg gcaactattg at 22

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctcctatctg aggtaaacca tttct 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agcaatgaaa gtccaagttt acgct 25

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgctgcacct aaacttacac catctat 27

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acaatttctt tgacccaagg 20

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tttcttatag ccttgttctg caaa 24

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgagcctaat acagctatgg gtgcg 25

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

actattacag atgcagccaa agttgttgaa tt 32

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgtctgattg ggaagacgaa gatttggata ca 32

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aatagatatt acttcgagcc t 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atccgtatta gcaggtgcaa 20

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tagttttata accattcgca cccatagctg 30

Claims

1.用于产毒艰难梭菌的多重荧光定量PCR检测的引物探针组，其特征在于，包含3对特异性引物和3条特异性探针；所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1-6所示，所述特异性探针的序列如SEQ ID NO.7-9所示。

2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述特异性探针的5’端标记的荧光基团为选自FAM、VIC、HEX、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX中的任一种，3’端标记的淬灭基团为选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl中的任一种。

3.根据权利要求1或2所述的引物探针组，其特征在于，SEQ ID NO.7所示的特异性探针的5’端标记的荧光基团为FAM，SEQ ID NO.8所示的特异性探针的5’端标记的荧光基团为VIC，SEQ ID NO.9所示的特异性探针的5’端标记的荧光基团为CY5，所述特异性探针的3’端标记的淬灭基团均为BHQ1。

4.权利要求1～3任一项所述的引物探针组在制备用于产毒艰难梭菌检测的试剂盒中的应用。

5.用于产毒艰难梭菌检测的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～3任一项所述的引物探针组。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含荧光定量PCR反应液、阳性对照和阴性对照中的一种或多种。

7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在工作时的荧光定量PCR反应程序如下：95℃、20s；95℃、3s，58℃、30s，40个循环。

8.根据权利要求5～7任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在工作时的荧光定量PCR反应体系中正向或反向引物与探针的摩尔比为1:2；

优选地，荧光定量PCR的20μL反应体系包括如下组分：2×荧光定量PCR反应液10μL，10μM正向引物0.4μL，10μM反向引物0.4μL，10μM探针0.8μL，DNA模板2μL。

9.一种产毒艰难梭菌的多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，以艰难梭菌基因组DNA为模板，利用权利要求1～3任一项所述的引物探针组或权利要求5～8任一项所述的试剂盒进行多重荧光定量PCR，根据扩增曲线和/或CT值判断检测结果。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的反应程序如下：95℃、20s；95℃、3s，58℃、30s，40个循环；

所述荧光定量PCR的反应体系包括如下组分：2×荧光定量PCR反应液10μL，10μM上游引物0.4μL，10μM下游引物0.4μL，10μM探针0.8μL，DNA模板2μL。