CN112646931A - 一种用于检测猪圆环病毒4型的引物对、探针、试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测猪圆环病毒4型的引物对、探针、试剂盒及其检测方法。该引物对包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的特异性引物；探针序列如SEQ ID NO.3所示。本申请根据猪圆环病毒4型ORFs保守区域设计了一对特异性引物和一条探针，优化实时荧光定量PCR反应条件和体系，建立了能够特异性检测PCV4的荧光定量PCR方法，最低检测值仅为20拷贝目的DNA，灵敏度高；并且，采用本申请方法检测不同稀释度PCV4标准品的Ct值变异系数均小于1％，表明本申请方法具有很好的重复性。

Description

一种用于检测猪圆环病毒4型的引物对、探针、试剂盒及其检 测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测猪圆环病毒4型的引物对、探针、试剂盒及其检测方法。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是一种小型单股环状无囊膜的DNA病毒，病毒粒子呈二十面体对称，直径仅17～20nm。PCV已逐渐成为危害全球养猪业健康发展的又一主要致病病原，给世界养猪业带来巨大经济损失。目前猪圆环病毒可分为4个基因型，PCV1对猪无致病性，PCV2在临床上主要引起仔猪多系统衰竭综合症、肺炎、猪皮炎和肾病综合征(PDNS)及繁殖障碍，可导致机体免疫抑制。PCV4于2016年首次报道，并证实PDNS、繁殖障碍以及流产等症状可能与PCV4感染有关。PCV4是最新发现的一种圆环病毒，2019年被报道在我国湖南患有严重呼吸道疾病、腹泻以及PDNS的猪只中发现，基因组大小为1770个核苷酸，与PCV其他型基因组的同源性仅为43.2％～51.5％，与水貂圆环病毒基因组同源性最高(66.9％)。PCV4是一种新型猪圆环病毒，与其他圆环病毒亲缘关系较远，目前关于PCV4的研究报道较少，现仍未成功分离到PCV4，因此，建立PCV4的快速检测方法对于开展该病毒的致病性、流行情况及遗传多样性研究具有重要意义。

现在普遍应用的常规PCR检测方法较为操作繁琐，耗时长，容易出现交叉污染及产生假阳性，对于隐性感染和混合感染的猪群病毒含量较低的情况，检出率低于实际感染率。而实时荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、快速高效等优点，其中分为染料法与探针法，染料法存在引物二聚体以及特异性差等问题，探针法既克服了常规PCR技术只能定性检测的不足，又解决了染料法特异性不强等缺点，更加适用于临床检测。

申请人兆丰华生物科技有限公司于2020年10月26日提出了发明专利申请CN202011156736.X，公开了检测PCV4的环介导等温扩增引物组、试剂盒及应用。该方法引物组由1对外引物和1对内引物组成，对于反应结果的判定需要眼观，无法准确定量检测，并且不能进行多重检测。

申请人咸阳职业技术学院于2020年01月06日提出了发明专利申请CN202010008953.8，公开了一种猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒及其检测方法。该发明采用的是常规PCR方法，存在敏感度低等技术缺陷，尽管最低检出值为10拷贝数，但与实时荧光定量PCR相比，反应时间长，不能满足临床上快速确诊相应疾病的需要。

基于此，亟需开发一种用于检测猪圆环病毒4型的引物对、探针、设计盒及其检测方法，以快速特异地对PCV4进行检测。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种用于检测猪圆环病毒4型的引物对、探针、试剂盒及其检测方法，本申请通过设计针对PCV4 ORFs的特异性引物，探索引物和探针最佳工作浓度，进一步确定最适反应体系及扩增条件，应用荧光定量PCR技术建立了定量检测PCV4的方法，该方法特异性强、重复性好、灵敏度高，为PCV4临床鉴别诊断提供了有力的技术支持。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种用于检测猪圆环病毒4型的引物对，包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的特异性引物。

进一步地，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对用于扩增猪圆环病毒4型的高度保守区域。

进一步地，采用所述引物对进行PCR检测时，还需使用如SEQ ID NO.3所示的探针。

一种用于检测猪圆环病毒4型的试剂盒，包括权利要求1的引物对以及权利要求3的探针。

一种猪圆环病毒4型的检测方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样本DNA；

(2)以步骤(1)所得DNA为模板，采用权利要求1所述引物和权利要求3所述探针对其进行PCR扩增，回收纯化扩增产物后，根据检测结果判断是否含有猪圆环病毒4型。

进一步地，PCR反应体系为：2×Premix Ex Taq^TM 12μL、PCV4-F 1μL、PCV4-R 1μL、PCV4探针1μL、模板DNA 2.0μL，最后用ddH₂O补充至20μL。

进一步地，PCV4-F、PCV4-R以及PCV4探针的浓度均为0.5μmol/L。

进一步地，PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性10s；60℃退火30s，共40个循环。

本发明的有益效果为：

本申请根据猪圆环病毒4型高度保守区域设计了一对特异性引物和一条探针，优化实时荧光定量PCR反应条件和体系，建立了能够特异性检测PCV4的荧光定量PCR方法。该方法最低检测值为2×10¹拷贝/μL，灵敏度高。并且，采用本申请方法检测不同稀释度PCV4标准品的Ct值变异系数均小于1％，表明本申请方法具有很好的重复性。

附图说明

图1为本申请构建的荧光定量PCR方法检测PCV4的标准曲线；

图2为10倍系列稀释PCV4质粒标准品的荧光定量PCR扩增结果。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

1、主要试剂及仪器设备

2×Premix Ex Taq^TM、DL2000 DNA Marker均购自宝日医生物工程(北京)有限公司；病毒基因组DNA提取试剂盒购自康宁生命科学(吴江)有限公司。NANODROP 2000(微量分光光度计，ThermoFisher Scientific)；实时荧光定量PCR仪(CFX Connect Real-Timesystem，BIO RAD)。

实施例1设计引物和探针序列

参照GenBank中发表的PCV4基因组序列，针对猪圆环病毒高度保守区域，应用生物信息软件primer peimier 5.0分别设计一对特异性引物和一条特异性探针，并送生工生物工程(上海)有限公司合成。引物和探针序列信息详见表1。

表1 PCV4引物及探针序列信息

实施例2试验方法的优化

1、重组质粒标准品的制备

参照DNA试剂盒提取说明书提取PCV4阳性病料DNA，并以其为模板用上述PCV4引物分别进行目的基因扩增，扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测阳性目的基因，回收纯化PCR扩增产物并克隆至pDC316载体，连接产物转化E.Coli DH5α感受态细胞，挑取在氨苄青霉素抗性的LB平板上生长的阳性克隆，测序正确后提取质粒。使用NANODROP 2000(ThermoFisher Scientific)测定质粒浓度，PCV4重组质粒标准品的浓度分别为189.2ng/μL，并按以下公式计算拷贝数，为2×10¹⁰拷贝/μL。

拷贝数(拷贝/μL)＝(6.02×10²³)×(ng/μL×10^-9)/(DNA length×660)

2、引物和标记探针最佳工作浓度的确定

浓度为10μmol/L的引物和探针，用ddH₂O分别稀释至终浓度为0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.3μmol/L、0.4μmol/L、0.5μmol/L，以上述重组质粒标准品为模板，利用矩阵法进行荧光定量PCR试验筛选最适工作浓度，以获得最小Ct值及典型的S型扩增曲线为判定依据，最终确定检测PCV4所用引物的最适终浓度为0.5μmol/L；最适探针的终浓度为0.5μmol/L。(μmol/L即是最终的浓度)

3、酶最适添加量的确定

在引物和探针最佳工作浓度条件下，扩增体系中酶添加量依次为4μL、6μL、8μL、10μL、12μL，进行荧光定量PCR试验筛选出酶最适添加量。

试验结果表明反应体系中酶添加量为12μL时，可获得最小△Ct值、较高的荧光强度增加值△Rn，出现典型S型扩增曲线。

4、最佳反应体系及扩增条件的确定

在引物和探针最佳工作浓度以及最适酶添加量条件下，退火延伸温度分别设置为55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃和62℃，进行荧光定量PCR试验筛选最佳退火延伸温度，最终确定最佳退火延伸温度为60℃。最优扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性10s；60℃退火30s，共40个循环。最佳反应体系见表2。

表2荧光定量PCR检测方法最佳反应体系

5、标准曲线的建立

将PCV4(2×10¹⁰拷贝数)标准质粒进行10倍系列稀释，对应的浓度为2×10³～2×10⁹拷贝/μL，每个浓度作2个重复，以确定的最适反应体系和扩增条件进行荧光定量PCR扩增。以每反应拷贝数的对数为X轴，循环阈值(Ct值)为Y轴作回归曲线，分别建立质粒拷贝浓度与循环阈值对应的定量标准曲线。评估建立的双重荧光定量PCR方法优劣的条件：扩增效率0.8～1.2，决定系数R²>0.97，△Ct值变异系数小于10％。PCR扩增结果和标准曲线分别见图1和图2。

如图1和图2所示，PCR方法检测PCV4获得的标准曲线回归方程为：y＝-3.6007x+42.993，相关系数(R²)为0.9967，扩增效率E为0.895。表明所设计的引物及探针扩增效率和结合率高，优化的反应条件适宜，可用于PCV4核酸的定性和定量检测。

实施例3 PCR方法特异性、敏感性、及重复性试验

1、特异性试验

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)、猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪伪狂犬病毒(PRV)等核酸，按优化的反应体系进行扩增，结果均为阴性(没有扩增曲线及表示阴性，所以未附图，只有列表)。表明本发明建立的检测PCV4荧光定量PCR方法特异性强。

表3 PCV4荧光定量PCR特异性结果

PRRSV

PCV2

PCV3

PPV

JEV

TGEV

PEDV

PRV

PCV4

结果

NA

NA

NA

NA

NA

NA

NA

NA

18.97

注：NA表示无扩增曲线，如为数字则表示扩增为阳性，具体的数字表示PCR扩增的CT值。下同。

2、敏感性试验

PCV4的重组质粒标准品作10倍系列稀释，稀释至2×10¹～2×10³拷贝/μL，按照上述检测PCV4实时荧光定量PCR方法进行试验，同时进行常规PCR方法检测，其结果见表4。

表4 PCV4荧光定量PCR敏感性结果

如表4所示，本申请构建的荧光定量PCR检测方法最低检出浓度为2×10¹拷贝/μL，而常规PCR方法的最低检测值则是为2×10³拷贝/μL，本申请检测方法比常规PCR的灵敏度高100倍，表明本研究建立的检测PCV4的荧光定量PCR方法敏感性优于常规PCR方法，检出率更高。

3、重复性试验

选取3个稀释度重组质粒(2×10⁵～2×10⁷拷贝数)为模板，进行荧光定量PCR检测，共检测3次且每个稀释度作3个平行试验，对Ct值结果进行统计学分析，并计算组间及组内变异系数(CV)，以验证建立的荧光定量PCR检测方法的重复性。试验结果详见表5。

表5 PCV4荧光定量PCR重复性结果

如表5所示，不同浓度标准品模板的组内及组间重复试验变异系数均小于1％，表明此方法稳定性和重复性好。

序列表

<110> 畜科生物工程有限公司

<120> 一种用于检测猪圆环病毒4型的引物对、探针、试剂盒及其检测方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ataaggtatg ggcgtggcct 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggatacccac gatgacgtgc 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acgtcattac tgcaggcctg ggcca 25

Claims (7)

1.一种用于检测猪圆环病毒4型的引物对，其特征在于，包括如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的特异性引物。

2.根据权利要求1所述的用于检测猪圆环病毒4型的引物对，其特征在于，采用所述引物对进行PCR检测时，还需使用如SEQ ID NO.3所示的探针。

3.一种用于检测猪圆环病毒4型的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物对以及权利要求2所述探针。

4.一种猪圆环病毒4型的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测样本DNA；

(2)以步骤(1)所得DNA为模板，采用权利要求1所述引物和权利要求3所述探针对其进行PCR扩增，回收纯化扩增产物后，根据检测结果判断是否含有猪圆环病毒4型。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述PCR反应体系为：2×Premix ExTaq^TM 12μL、PCV4-F 1μL、PCV4-R 1μL、PCV4探针1μL、模板DNA2.0μL，最后用ddH₂O补充至20μL。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述PCV4-F、PCV4-R以及PCV4探针的浓度均为0.5μmol/L。

7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性10s；60℃退火30s，共40个循环。

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