CN112063763A

CN112063763A - 检测猪圆环病毒4型的环介导等温扩增引物组、试剂盒及应用

Info

Publication number: CN112063763A
Application number: CN202011156736.XA
Authority: CN
Inventors: 赖婷婷; 陈樨; 张永香; 洪智敏; 叶晓慧; 朱海侠; 潘小慧; 傅星源; 李枭辰
Original assignee: Beijing Biomedical Technology Center Of Zhaofenghua Biotechnology Nanjing Co Ltd; Beijing Kemufeng Biological Pharmaceutical Co ltd; Zhaofenghua Biotechnology Fuzhou Co ltd; Zhaofenghua Biotechnology Nanjing Co Ltd
Current assignee: Beijing Biomedical Technology Center Of Zhaofenghua Biotechnology Nanjing Co Ltd; Beijing Kemufeng Biological Pharmaceutical Co ltd; Zhaofenghua Biotechnology Fuzhou Co ltd; Zhaofenghua Biotechnology Nanjing Co Ltd
Priority date: 2020-10-26
Filing date: 2020-10-26
Publication date: 2020-12-11

Abstract

本发明公开检测猪圆环病毒4型的环介导等温扩增引物组、试剂盒及应用，所述引物组由1对外引物和1对内引物组成，所述外引物由F3和B3组成，所述内引物由FIP和BIP组成，2对引物的序列分别如SEQ ID NO.1、2、3、4所示。用该引物组建立的环介导等温扩增方法特异性强、敏感性高、操作简单、成本低廉，反应结果易于观察，可用于快速检测PCV4。

Description

检测猪圆环病毒4型的环介导等温扩增引物组、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及医病原微生物检测技术领域，具体涉及检测猪圆环病毒4型的环介导等温扩增引物组、试剂盒及应用。

背景技术

猪圆环病毒(PCV)是单股环状的DNA病毒，基因组长度约为1.7kb长，是最小的动物DNA病毒之一。目前可感染猪的圆环病毒包括PCV1、PCV2和2016年鉴定的PCV3。PCV1对猪无致病性，最早是1974年由德国学者从多株连续传代的PK15细胞中发现，1982年证实该病毒来源于当初制备PK15细胞的猪肾组织，后来进一步证实该病毒只是一种可以感染猪的常规病毒，不会对感染猪造成危害。PCV2于1998年首次报道，对猪具有致病性，在临床上主要引起仔猪多系统衰竭综合征（PDNS），肺炎，皮炎和肾病综合征以及繁殖障碍。PCV3于2016年首次在美国报道，推测其与母猪丘疹性皮炎、肾病综合征和流产相关，但未见具体实验证实。

2019年，科学家从我国湖南地区出现呼吸道症状、腹泻及PDNS症状的猪群中鉴定出一种新型圆环病毒——猪圆环病毒4型PCV4(porcine circovirus type 4，PCV4)。通过对PCV4全基因组和猪群其他圆环病毒（PCV1、PCV2和PCV3）遗传进化研究发现，PCV4与猪群其他圆环病毒（PCV1、PCV2和PCV3）处于完全不同的遗传进化分支，属于新型的猪圆环病毒（即PCV4）。目前，关于新鉴定的PCV4的致病性的研究较少，致病机理更未见研究涉及。因此，建立一种简便实用的检测方法对开展PCV4相关研究意义重大。

由于新型圆环病毒（PCV4）在2019年刚被发现，因此该病毒的相关研究还很少，目前该病毒的检测主要是采用常规的PCR技术。但是该技术存在以下缺点：1、该方法对仪器设备的要求高，对技术人员也存在较高的要求，一般猪场不具备检测的资质，需要送有资质的实验室进行检测。2、该方法也存在假阳性结果。3、检验成本高。

环介导等温扩增技术（LAMP）能在等温（60-65℃）条件下，短时间（通常是1小时内）内进行核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。

LAMP法的特征是针对靶基因上的六个区域设计四条引物（1组外引物和1组内引物），利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，可在15-60分钟内实现10⁹-10¹⁰倍的扩增，反应能产生大量的扩增产物即焦磷酸镁白色沉淀，可以通过肉眼观察白色沉淀的有无来判断靶基因是否存在。LAMP方法的优势除了高特异性和高灵敏度外，操作还十分的简单，仅需简单的恒温装置就能实现反应，结果检测也非常简单，直接肉眼观察白色沉淀或者绿色荧光即可，无需进行凝胶电泳观察结果，是一种适合现场、基层快速检测的方法。目前，还未见针对PCV4的环介导等温扩增(LAMP)反应方法，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测猪圆环病毒4型的环介导等温扩增引物组、试剂盒及应用

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

检测猪圆环病毒4型的环介导等温扩增引物组，由1对外引物和1对内引物组成，所述外引物由F3和B3组成，所述内引物由FIP和BIP组成，2对引物的序列如下：

F3：5’-CGGAGCCATATTGAGCAGG-3’，

B3：5’-GGCCACGCCCATACCTTA-3’，

FIP：5’-ACTGGGCTCTCCTACTTCCAGT-CCGCGGTACTGATTGTGAT-3’，

BIP：5’-GGAAAGCGCAGCGACCTTAAAG-CGGGCCACTTCACTCATTG-3’。

检测猪圆环病毒4型的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组。

所述的物组可以用于制备PCV4诊断试剂。

本发明的有益效果在于：采用本发明引物组建立的环介导等温扩增方法检测猪圆环病毒4型，具有特异性强、敏感性高、操作简单、成本低廉，反应结果易于观察等优点，可用于快速检测PCV4。本发明对开展猪圆环病毒4型的相关研究意义重大。

附图说明

图1为 LAMP检测PCV4的特异性实验的琼脂糖电泳结果；

其中M：DNA分子量2000标准；1：PCV4；2：PCV1；3：PCV2；4：PCV3；5、PRV；6：PEDV；7：TGEV；8、阴性对照。

图2为LAMP检测PCV4的特异性实验的肉眼观察结果；

其中1：PCV4；2：PCV1；3：PCV2；4：PCV3；5、PRV；6：PEDV；7：TGEV；8、阴性对照。

图3为 LAMP检测PCV4的敏感性实验结果；

其中M：DNA分子量2000标准；1：4.82×10⁴ ng/μL；2：4.82×10³ ng/μL；3：4.82×10²ng/μL；4：4.82×10¹ ng/μL；5：4.82×10⁰ ng/μL；6：阴性对照。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

一、实验方法和步骤

1.1 毒株

猪圆环病毒1型（PCV1）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪圆环病毒3型（PCV3）、猪圆环病毒4型（PCV4）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）由本司鉴定并保存。

1.2 病毒核酸RNA提取和cDNA制备

用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司），按照说明书方法进行操作提取PCV1、PCV2、PCV3、PCV4、PRV的基因组DNA，均放置－20℃保存备用。

用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司），按照说明书方法进行操作提取PEDV、TGEV的基因组RNA，使用FastQuant RT Kit (With gDNase) （天根生化科技（北京）有限公司）反转录为cDNA，均放置－20℃保存备用。

1.3 LAMP引物设计

根据GenBank中登录的所有PCV4基因序列和本司在猪场检测的PCV4基因组序列，利用分子生物学软件进行分析比较，设计特异性的LAMP引物组，包括1对外引物（F3和B3）和1对内引物（FIP和BIP），两对引物的序列如下：

F3：5’-CGGAGCCATATTGAGCAGG-3’、

B3：5’-GGCCACGCCCATACCTTA-3’、

FIP：5’-ACTGGGCTCTCCTACTTCCAGT-CCGCGGTACTGATTGTGAT-3’、

BIP：5’-GGAAAGCGCAGCGACCTTAAAG-CGGGCCACTTCACTCATTG-3’。

1.4 LAMP的体系的建立

按照环介导等温扩增法DNA扩增试剂盒（SLP204 Laoopamp DNA 扩增反应试剂盒）配置LAMP试验反应液，反应体系为25μL。

每25μL反应体系中含有：

12.5μL的2×反应液

1μL的Bst DNA大片段聚合酶、

外引物（F3和B3）（浓度均为5^-12mol/μL）各1μL

内引物FIP和BIP（浓度为50^-12mol/μL）各1μL

1μL的制备的PCV4标准品为模板、

1μL的Loopamp试剂，

补充灭菌去离子水至终体积25μL。

实验不同温度（60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃）、不同时间（15min、30min、45min、60min、75min）检测LAMP试剂盒的反应性能。优化后的反应条件为63℃反应45 min。

1.5 敏感性试验

以提取的PCV4阳性标准品（浓度分别为4.82×10⁰～4.82×10⁴ ng/μL）为模板，进行LAMP反应，确定检测敏感度，并重复实验操作2次。

1.6 特异性实验

取PCV1、PCV2、PCV3、PCV4、PRV提取的DNA；取PEDV、TGEV提取RNA后反转录的cDNA，分别为模板进行LAMP反应，并重复实验操作2次，以去离子水为试验阴性对照。

1.7、临床样品的检测

对本司收集的71份猪组织病料按照步骤1.2中的方法提取DNA后，进行LAMP检测。

二、实验结果

2.1 肉眼判定

PCV1、PCV2、PCV3、PRV提取的DNA；取PEDV、TGEV提取RNA后反转录的cDNA按照本发明建立的LAMP方法检测均为阴性，仅对PCV4阳性DNA有很好的扩增（图1），本结果在自然光条件下可以通过明显的颜色区别进行判定（图2），表明本发明建立的LAMP方法具有很好的特异性。

2.2 敏感性试验

反应结束后，利用2.5%普通琼脂糖凝胶电泳检测，结果可见PCV4在4.82×10¹ ng/μL（见图3第4泳道）时为最低检测限。

2.3 临床样品的检测

对本司收集的71份猪组织病料进行LAMP检测，结果可见有阳性样品9份，阳性率为12.68%。将LAMP阳性样品和文献（Molecular detection and phylogenetic analysis ofPorcine circovirus 4 in Henan and Shanxi Provinces of China）中的PCR检测引物序列（上游引物5′- GTTTTTCCCTTCCCCCACATAG-3′和下游引物5′-ACAGATGCCAATCAGATCTAGGTAC-3，预期片段大小为391bp）中的PCR方法进行对比，9份LAMP阳性样品经常规PCR检测均为阳性，符合率为100%。将相关目的片断经克隆后测序，进行BLAST分析，均为对应的PCV4基因组序列片段，相互之间的核苷酸同源性在98.6%-100%之间。

序列表

<110> 兆丰华生物科技（南京）有限公司

兆丰华生物科技（福州）有限公司

北京科牧丰生物制药有限公司

兆丰华生物科技（南京）有限公司北京生物医药科技中心

<120> 检测猪圆环病毒4型的环介导等温扩增引物组、试剂盒及应用

<130> 2020

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cggagccata ttgagcagg 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggccacgccc atacctta 18

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

actgggctct cctacttcca gtccgcggta ctgattgtga t 41

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggaaagcgca gcgaccttaa agcgggccac ttcactcatt g 41

Claims

1.检测猪圆环病毒4型的环介导等温扩增引物组，其特征在于：所述引物组由1对外引物和1对内引物组成，所述外引物由F3和B3组成，所述内引物由FIP和BIP组成，2对引物的序列如下：

F3：5’-CGGAGCCATATTGAGCAGG-3’，

B3：5’-GGCCACGCCCATACCTTA-3’，

FIP：5’-ACTGGGCTCTCCTACTTCCAGT-CCGCGGTACTGATTGTGAT-3’，

BIP：5’-GGAAAGCGCAGCGACCTTAAAG-CGGGCCACTTCACTCATTG-3’。

2.如权利要求1所述的引物组在制备PCV4诊断试剂中的应用。

3.检测猪圆环病毒4型的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。