CN112410466A - 猪圆环病毒2型和猪圆环病毒4型双重实时荧光定量pcr检测用引物、探针及检测方法 - Google Patents

猪圆环病毒2型和猪圆环病毒4型双重实时荧光定量pcr检测用引物、探针及检测方法 Download PDF

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张达
白彩霞
李叶秋
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Abstract

本发明通过建立一种猪圆环病毒2型和猪圆环病毒4型双重实时荧光定量PCR引物组、探针及检测方法，该发明属于病毒分子生物学检测领域。该方法可快速检测猪圆环病毒2型和猪圆环病毒4型。该方法简单快速，对单个样本检测时间为60分钟，其灵敏度可达10拷贝数/ul，针对较大的样本量可做到同时检测，具有良好的灵敏性、重复性、特异性以及稳定性，可实现对猪圆环病毒2型和猪圆环病毒4型快速准确检测的目的。

Description

猪圆环病毒2型和猪圆环病毒4型双重实时荧光定量PCR检测 用引物、探针及检测方法
技术领域
本发明涉及病毒分子生物学检测领域，具体涉及用于PCV2和PCV4双重Taqman实时荧光定量PCR检测方法的引物及检测方法。
背景技术
猪圆环病毒(PCV)是直径17nm的无包膜，单链环状DNA病毒，能够感染许多物种动物。1990年，加拿大首次在断奶后多系统消瘦综合征(PMWS)的猪中鉴定出PCV2，基因组长度为1766-1768bp。PCV2是猪圆环病毒相关疾病的主要病原体，包括猪皮炎和肾病综合征(PDNS)，猪呼吸系统疾病综合症(PRDC)，肠炎和生殖衰竭。2019年，在中国河南省发现了一种新的圆环病毒PCV4。基因组长度为1770bp，编码296个氨基酸的蛋白质的复制(Rep)基因和编码228个氨基酸的蛋白质的衣壳(Cap)基因。PCV4可引起 PDNS，呼吸系统疾病和肠炎。发现在健康猪以及感染PRRSV或PCV2的猪中都可以检测到 PCV4。由于PCV2和PCV4引起相似的临床症状，并且在感染PCV2的猪中也可以检测到 PCV4，可能是共感染现象。因此，很难在临床上区分这两种病毒。这项研究的目的是建立一种快速，灵敏，特异的诊断和鉴别诊断方法，以区分这两种病毒。
目前，临床上没有关于PCV2和PCV4混合感染的检测方法。荧光定量PCR技术具有特异性高、灵敏性强、重复性好等优点，其可以在2小时之内反应完毕并且具有直观的反应结果。本发明建立的双重Taqman实时荧光定量聚合酶链式反应技术是一种可使微量核酸在体外高效扩增的新技术，它能够在短时间内实现对目的片段的高效扩增，整个反应简单快速，检出率高，重复性好，适合样本量较大的情况下使用，推广力强，本发明的建立可填补相关领域的空白。
发明内容
本发明目的在于提供一种猪圆环病毒2型和4型双重实时荧光定量PCR检测引物及方法，利用两组引物和探针不同的荧光信号，可在Taqman实时荧光定量PCR反应完成后结合荧光信号的不同来对猪圆环病毒2型和4型进行快速鉴别诊断和感染程度的分析。该方法简单快速，其灵敏度可达101拷贝数/ul，针对较大的样本量可做到同时检测，具有良好的灵敏性、重复性、特异性以及稳定性，可实现同时对猪圆环病毒2型和4型快速准确检测的目的。
本发明通过以下技术方案来实现：
所述检测的猪圆环病毒2型和4型的双重实时荧光定量PCR检测引物及方法，根据猪圆环病毒2型的Cap基因和猪圆环病毒4型的Rep基因分别设计了两对引物和探针。其中，猪圆环病毒2型的特异性引物和探针序列为：
上游引物F1：ACCACCTAGAAACAAGTG
下游引物R1：CTCAGTAGATCATCCCAG
探针P1：FAM-TCATCAATAACAACCACTTCTTCACCA-BHQ1
猪圆环病毒4型的特异性引物和探针序列为：
上游引物F2：CTCTGAGAACTGTGAGTA
下游引物R2：GGAGCAATACTTCTTATTATCA
探针P2：VIC-TGCTCAATATGGCTCCGCTCT-BHQ1
本发明还提供了一种上面所述的特异性引物检测猪圆环病毒2型和4型的双重实时荧光定量 PCR检测方法。
所述双重实时荧光定量PCR检测方法扩增条件具体如下：反应体系为25ul，premixEx Taq 12.5ul，猪圆环病毒2型和4型的上游引物、下游引物和探针各0.5ul，DNA模板各2ul，补充灭菌去离子水至终体积25ul。在伯乐CFX96TM Real-Time System机器上进行扩增反应，设定反应程序条件为：95℃，30s；95℃ 5s、60℃ 30s，共40个循环；反应结束后，得到扩增曲线。
本发明的优点有以下几点：
(1)灵敏度高，双重实时荧光定量PCR检测技术，采用本发明提供的引物对样本进行检测，其灵敏度可达到101拷贝数/ul，比常规PCR方法敏感100倍。
(2)特异型好，本实验中同时检测了猪细小病毒1型、猪细小病毒6型、猪细小病毒7型、猪圆环病毒3型，该方法不与猪其他常见传染病发生反应，本方法适用性好。
(3)操作简便，检测用时短，最快1小时30分钟内即可完成检测。
(4)结果可靠，本发明中，采用荧光定量仪器自动生成结果，减少人员操作时造成的污染。
附图说明
图1 PCV2标准曲线的建立和PCV2敏感性实验。
图2 PCV4标准曲线的建立和PCV4敏感性实验。
图3 PCV2和PCV4灵敏性实验。
图4 双重实时荧光定量PCR特异性实验。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明，本描述中的实施案例仅用于说明本发明而不限制于本发明的范围。本专业技术人员应该理解的是，在不偏离本发明原理和方法的情况下，对本发明技术方案的细节和形式进行部分修改或替换，但基于此修改或替换均属于本发明的保护范围内。
实施例1：
猪圆环病毒2型和4型的双重实时荧光定量PCR检测方法的有效性实验
1、双重实时荧光定量PCR实验引物的设计
针对猪圆环病毒2型的Cap基因和猪圆环病毒4型的Rep基因设计能够同时检测猪圆环病毒 2型和4型的特异性引物和探针序列：
猪圆环病毒2型的特异性引物和探针序列为：
上游引物F1：ACCACCTAGAAACAAGTG
下游引物R1：CTCAGTAGATCATCCCAG
探针P1：FAM-TCATCAATAACAACCACTTCTTCACCA-BHQ1
猪圆环病毒4型的特异性引物和探针序列为：
上游引物F2：CTCTGAGAACTGTGAGTA
下游引物R2：GGAGCAATACTTCTTATTATCA
探针P2：VIC-TGCTCAATATGGCTCCGCTCT-BHQ1
上下游引物和探针由通用公司合成。
2、毒株
实验所用猪圆环病毒2型和4型由本实验室鉴定并保存。
3、病毒核酸的提取
将采取的样本按照天根基因组试剂盒(天根生物技术有限公司)说明书提取病毒基因组，提取完成后均放置-20℃保存备用。
4、阳性样品的制备
以提取的猪圆环病毒2型和4型DNA为模板，用所设计的特异性引物扩增，目的扩增产物电泳后，用天根胶回收试剂盒纯化回收，之后使用pMD-19T载体进行连接、转化、菌落 PCR鉴定、测序分析，对阳性品进行少量提取和纯化后，于-20℃保存备用。阳性标准品分别命名为：pMD-19T-PCV2和pMD-19T-PCV4。
5、双重实时荧光定量PCR方法检测
建立双重实时荧光定量PCR反应体系：
反应体系为25ul，premix Ex Taq 12.5ul，猪圆环病毒2型和4型的上游引物、下游引物和探针各0.5ul，DNA模板各2ul，补充灭菌去离子水至终体积25ul。在伯乐CFX96TM Real-Time System机器上进行扩增反应，设定反应程序条件为：95℃，30s；95℃ 5s、60℃ 30s，共40个循环；反应结束后，得到扩增曲线。
6、标准曲线的建立
将阳性标准品pMD-19T-PCV2和pMD-19T-PCV4进行连续10倍倍比稀释(108-101copies/uL)，以建立好的条件进行扩增，以拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标分别建立PCV2和PCV4的标准曲线。
8、特异性实验
用建立好的反应体系和条件分别检测猪细小病毒1型、猪细小病毒6型、猪细小病毒7型、猪圆环病毒3型，对其特异性进行评价。
实验结果
1、标准曲线分析
对阳性标准品pMD-19T-PCV2和pMD-19T-PCV4的标曲显示在反应范围内两条曲线均有很好的线性关系。PCV2的标准曲线方程式为：y＝-3.351x+40.445，相关系数为0.996，扩增效率为98.8％，标准曲线见图1。PCV4的标准曲线方程式为：y＝-3.446x+39.863，相关系数为0.995，扩增效率为95.1％，标准曲线见图2。
2、双重荧光定量PCR分析
2、敏感性实验分析
伯乐CFX96TM Real-Time System仪器收集荧光信号，自动生成样品扩增曲线。如图3所示，在1×108到1×101拷贝数/μL之间，确定了在该方法下PCV2与PCV4的检测下限均为1×101(见图3)。
3、特异性实验分析
在建立好的双重荧光定量PCR反应体系和条件下，猪细小病毒1型、猪细小病毒6型、猪细小病毒7型、猪圆环病毒3型的检测均为阴性(见图4)。
Figure ISA0000216033550000011
Figure ISA0000216033550000021

Claims (5)

1.一种用于猪圆环病毒2型和猪圆环病毒4型荧光定量PCR引物组和探针，所述引物由上游引物、下游引物和探针组成，所述的上游引物、下游引物和探针的核苷酸序列所示在可读序列表中。
2.权利要求1所述的荧光定量PCR引物组和探针在制备检测猪圆环病毒2型和猪圆环病毒4型试剂中的用途。
3.一种用于猪圆环病毒2型和猪圆环病毒4型检测的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，含有权利要求1中所述的引物组和探针。
4.标准曲线的制作
利用一系列不同浓度梯度的阳性标准器作为模板，并以标准品拷贝数的对数作为X轴，Ct值作为Y轴绘制标准曲线。
5.样本中病毒含量的计算
根据建立的标准曲线分别计算样本中的病毒拷贝数。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112961941A (zh) * 2021-03-16 2021-06-15 安徽农业大学 一种基于mira荧光法快速检测pcv3病毒的引物和探针

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