CN113151579A - 鸭甲型肝炎病毒1型和鸭星状病毒3型双重实时荧光定量pcr检测用引物及检测方法 - Google Patents

鸭甲型肝炎病毒1型和鸭星状病毒3型双重实时荧光定量pcr检测用引物及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明通过建立一种鸭甲型肝炎病毒1型和鸭星状病毒3型双重实时荧光定量PCR引物组及试剂盒，该发明属于病毒分子生物学检测领域。该方法可快速检测鸭甲型肝炎病毒1型和鸭星状病毒3型。该方法简单快速，对单个样本检测时间为90分钟，其灵敏度可达10拷贝数/ul，针对较大的样本量可做到同时检测，具有良好的灵敏性、重复性、特异性以及稳定性，可实现对鸭甲型肝炎病毒1型和鸭星状病毒3型快速准确检测的目的。

Description

鸭甲型肝炎病毒1型和鸭星状病毒3型双重实时荧光定量PCR 检测用引物及检测方法
技术领域
本发明涉及病毒分子生物学检测领域，具体涉及用于DHAV-1和DAstV-3多重SYBRGreen I实时荧光定量PCR检测方法的引物及检测方法。
背景技术
鸭病毒性肝炎(duck viral hepatitis，DVH)是由病毒感染雏鸭引起的一种急性高度致死性传染病，其特征是发病急、传播迅速、病程短和病死率高，本病最早发生于美国(1950)，后来在英国、加拿大、德国、意大利、印度、法国、俄罗斯、匈牙利、日本等国家陆续报道了该病的流行情况。鸭肝炎病毒曾被分为三个血清型，即：血清1型鸭肝炎病毒，血清2型鸭肝炎病毒和血清3型鸭肝炎病毒。其中，血清1型鸭肝炎病毒属于小RNA病毒科(Picornaviridae)、禽肝炎病毒属(Avihepatovirus)的鸭甲肝病毒(Duck hepatitis Avirus， DHAV)。DHAV暂时被分为3个基因型，即1型、2型和3型。血清2型鸭肝炎病毒属于星状病毒科(Avastroviridae)、禽星状病毒属(Avastrovirus)的鸭星状病毒1型(Duckastrovirus 1，DAstV-1)。血清3型鸭肝炎病毒目前划归星状病毒科(Avastroviridae)、禽星状病毒属(Avastrovirus)的鸭星状病毒2型(Duck astrovirus 2，DAstV-2)。而后，我国研究者在2014-2015年又发现了鸭星状病毒3型(Duck astrovirus 3，DAstV-3)和鸭星状病毒4型 (Duck astrovirus 4，DAstV-4)。由此可见鸭星状病毒感染鸭也表现为鸭病毒性肝炎。其症状与鸭甲肝病毒引起的鸭病毒性肝炎极其相似，难以区分。
鸭病毒性肝炎所引起的鸭肝炎发病急，传播迅速，病程短，病死率高。其临床症状通常表现为角弓反张，运动失调，精神萎顿，身体倒向一侧，厌食，以头触地。病理变化表现为肝肿大和出血性斑点。DHAV-1和DAstV-3在中国地区流行广泛，其临床鉴别难以通过肉眼观察判断，对其预防控制带来了极大的困难，对养鸭产业造成了巨大的影响。
目前，临床上没有关于DHAV-1和DAstV-3混合感染的检测方法。SYBR Green I实时荧光定量聚合酶链式反应技术是在传统聚合酶链式反应技术(PCR)的基础上利用加入的特异性引物采用实时检测的荧光定量PCR仪来实现的反应技术。荧光定量PCR技术具有特异性高、灵敏性强、重复性好等优点，其可以在2小时之内反应完毕并且具有直观的反应结果。双重实时荧光定量PCR技术是在单重实时荧光定量PCR技术的基础上利用两组引物扩增片段的GC含量的差异导致的Tm值有差异，根据不同的Tm值来快速诊断和鉴别两种病毒的方法。
本发明建立的双重SYBR Green I实时荧光定量聚合酶链式反应技术(duplexSYBR Green I-based real-time PCR assay)是一种可使微量核酸在体外高效扩增的新技术，它能够在短时间内实现对目的片段的高效扩增，整个反应简单快速，检出率高，重复性好，适合样本量较大的情况下使用，推广力强，本发明的建立可填补相关领域的空白。
发明内容
本发明目的在于提供一种鸭甲型肝炎病毒1型和鸭星状病毒3型双重实时荧光定量 PCR检测引物及方法，利用两组引物扩增目的片段的GC含量差异导致Tm值差异，可在SYBR Green I实时荧光定量PCR反应完成后结合溶解温度的差异来对鸭甲型肝炎病毒1型和鸭星状病毒3型进行快速鉴别诊断和感染程度的分析。该方法简单快速，其灵敏度可达101拷贝数/ul，针对较大的样本量可做到同时检测，具有良好的灵敏性、重复性、特异性以及稳定性，可实现同时对鸭甲型肝炎病毒1型和鸭星状病毒3型快速准确检测的目的。
本发明通过以下技术方案来实现：
所述检测的鸭甲型肝炎病毒1型和鸭星状病毒3型的双重实时荧光定量PCR检测引物及方法，根据鸭甲型肝炎病毒1型的VP0和鸭星状病毒3型的ORF1b基因分别设计了两对引物。其中，甲型肝炎病毒1型的特异性引物序列为：
上游引物F1：AACTACACAGACAATACT
下游引物R1：CAGGCATAATAATCATCAT
其中，鸭星状病毒3型的特异性引物序列为：
上游引物F2：ACGACAGTAGATAACAAC
下游引物R2：GTCATCACCATAACAGAT
本发明还提供了一种上面所述的特异性引物检测鸭甲型肝炎病毒1型和鸭星状病毒3型的双重实时荧光定量PCR检测方法。
所述双重实时荧光定量PCR检测方法扩增条件具体如下：反应体系为20ul，SuperReal PreMix Plus10ul，鸭甲型肝炎病毒1型的上游引物、下游引物各0.2ul，鸭星状病毒3型的上游引物、下游引物各0.4ul，DNA模板各1ul，补充灭菌去离子水至终体积20ul。在伯乐CFX96TM Real-Time System机器上进行扩增反应，设定反应程序条件为：95℃，15min预变性；95℃10s、60℃30s，共40个循环；反应结束后，做出溶解曲线。
本发明的优点有以下几点：
(1)灵敏度高，双重实时荧光定量PCR检测技术，采用本发明提供的引物对样本进行检测，其灵敏度可达到101拷贝数/ul，比常规PCR方法敏感100倍。
(2)特异型好，本实验中同时检测了鸭坦布苏病毒、新型鹅细小病毒、鸭圆环病毒、新城疫病毒，该方法不与鸭其他常见传染病发生反应，本方法适用性好。
(3)操作简便，检测用时短，最快1小时30分钟内即可完成检测。
(4)结果可靠，本发明中，采用荧光定量仪器自动生成结果，减少人员操作时造成的污染。
附图说明
图1 DHAV-1标准曲线的建立和DHAV-1敏感性实验。
图2 DAstV-3标准曲线的建立和DAstV-3敏感性实验。
图3 DHAV-1溶解曲线的建立。
图4 DAstV-3溶解曲线的建立。
图5 DHAV-1和DAstV-3双重溶解曲线的建立。
图6双重实时荧光定量PCR特异性实验。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明，本描述中的实施案例仅用于说明本发明而不限制于本发明的范围。本专业技术人员应该理解的是，在不偏离本发明原理和方法的情况下，对本发明技术方案的细节和形式进行部分修改或替换，但基于此修改或替换均属于本发明的保护范围内。
实施例1：
鸭甲型肝炎病毒1型和鸭星状病毒3型的双重实时荧光定量PCR检测方法的有效性实验 1、双重实时荧光定量PCR实验引物的设计
针对鸭甲型肝炎病毒1型的VP0基因和鸭星状病毒3型的ORF1b基因设计能够同时检测鸭甲型肝炎病毒1型和鸭星状病毒3型的特异性引物序列：
甲型肝炎病毒1型的上游引物：AACTACACAGACAATACT。下游引物：CAGGCATAATAATCATCAT。
鸭星状病毒3型的上游引物：ACGACAGTAGATAACAAC。下游引物：GTCATCACCATAACAGAT。
上下游引物由通用公司合成。
2、毒株
实验所用鸭甲型肝炎病毒1型和鸭星状病毒3型由本实验室鉴定并保存。
3、病毒核酸的提取
将采取的样本按照天根基因组试剂盒(天根生物技术有限公司)说明书提取病毒基因组，提取完成后均放置-20℃保存备用。
4、阳性样品的制备
以提取的鸭甲型肝炎病毒1型和鸭星状病毒3型RNA为模板，用所设计的特异性引物扩增，目的扩增产物电泳后，用天根胶回收试剂盒纯化回收，之后使用pMD-19T载体进行连接、转化、菌落PCR鉴定、测序分析，对阳性品进行少量提取和纯化后，于-20℃保存备用。阳性标准品分别命名为：pMD-19T-DHAV-1和pMD-19T-DAstV-3。
5、双重实时荧光定量PCR方法检测
建立双重实时荧光定量PCR反应体系：
反应体系为20ul，鸭甲型肝炎病毒1型的上游引物、下游引物各0.2ul，鸭星状病毒3型的上游引物、下游引物各0.4ul，DNA模板各1ul，补充灭菌去离子水至终体积20ul。在伯乐 CFX96TM Real-Time System机器上进行扩增反应，设定反应程序条件为：95℃，15min预变性；95℃10s、60℃30s，共40个循环；反应结束后，做出溶解曲线。
6、标准曲线的建立
将阳性标准品pMD-19T-DHAV-1和pMD-19T-DAstV-3进行连续10倍倍比稀释(108-101 copies/uL)，以建立好的条件进行扩增，以拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标分别建立DHAV-1和DAstV-3的标准曲线。
7、双重荧光定量溶解曲线的建立
采用阳性标准品pMD-19T-DHAV-1和pMD-19T-DAstV-3(1010copies/uL)使用建立好的双重实时荧光定量PCR反应体系和条件进行扩增，根据伯乐CFX96TM Real-Time System仪器自动生成溶解曲线。
8、特异性实验
用建立好的反应体系和条件分别检测鸭坦布苏病毒(DTMUV)、新型鹅细小病毒(NGPV)、鸭圆环病毒(DuCV)、新城疫病毒(NDV)，对其特异性进行评价。
9、敏感性实验
将阳性标准品pMD-19T-DHAV-1和pMD-19T-DAstV-3进行连续10倍倍比稀释(108-101)，以建立好的条件进行扩增，根据伯乐CFX96TM Real-Time System仪器自动生成扩增曲线，对其检测下限进行评价。
实验结果
1、标准曲线分析
对阳性标准品pMD-19T-DHAV-1和pMD-19T-DAstV-3的标曲显示在反应范围内两条曲线均有很好的线性关系。DHAV-1的标曲方程式为：y＝-3.391x+34.595，相关系数为0.997，扩增效率为97.2％，标准曲线见图1。DAstV-3的标曲方程式为：y＝-3.266x+34.816，相关系数为0.999，扩增效率为102.4％，标准曲线见图2。
2、溶解曲线分析
从溶解曲线分析可见，DHAV-1在Tm值为85℃时出现单一的特异性峰，无引物二聚体和非特异性引物(见图3)；DAstV-3在Tm值为80℃时出现单一的特异性峰，无引物二聚体和非特异性引物(见图4)。在图5中，双重溶解曲线显示DHAV-1的Tm值为85℃， DAstV-3的Tm值为80℃，与单重溶解曲线分析结果一致。
3、特异性实验分析
在建立好的双重荧光定量PCR反应体系和条件下，DTMUV、NGPV、DuCV、NDV的检测均为阴性(见图6)。
4、敏感性实验分析
伯乐CFX96TM Real-Time System仪器收集荧光信号，自动生成样品扩增曲线。如图6所示，在7.34×108到7.34×101拷贝数/μL之间，确定了在该方法下DHAV-1的检测下限为7.34×101拷贝数/μL(见图1)；在3.78×108到3.78×101拷贝数/μL之间，确定了在该方法下DAstV-3的检测下限为3.78×101拷贝数/μL(见图2)。
Figure ISA0000216403730000011

Claims (5)

1.一种用于鸭甲型肝炎病毒1型和鸭星状病毒3型病毒检测的SYBR-Green I荧光定量PCR引物组，所述引物由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物和下游引物的核苷酸序列所示在可读序列表中。
2.权利要求1所述的荧光定量PCR引物组在制备检测鸭甲型肝炎病毒1型和鸭星状病毒3型试剂中的用途。
3.一种用于鸭甲型肝炎病毒1型和鸭星状病毒3型检测的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，含有权利要求1中所述的引物组以及SYBR-Green荧光染料反应液。
4.标准曲线的制作
利用一系列不同浓度梯度的阳性标准器作为模板，并以标准品拷贝数的对数作为X轴，Ct值作为Y轴绘制标准曲线。
5.样本中病毒含量的计算
根据建立的标准曲线分别计算样本中的病毒拷贝数。
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