CN115323076B - 一种检测猴d型逆转录病毒的引物探针组合物、试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种检测猴d型逆转录病毒的引物探针组合物、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体提供了一种检测猴D型逆转录病毒的引物探针组合物，包括反转录引物SRV‑RT.RP，检测猴D型逆转录病毒4型的上游引物P‑SRV4‑F、下游引物P‑SRV4‑R和探针SRV4‑P，检测猴D型逆转录病毒5型的上游引物P‑SRV5‑F、下游引物P‑SRV5‑R和探针SRV5‑P，检测猴D型逆转录病毒8型的上游引物P‑SRV8‑F、下游引物P‑SRV8‑R和探针SRV8‑P。本发明还提供了包括该引物探针组合物的试剂盒及采用该引物探针组合物同时检测多血清型猴D型逆转录病毒的方法，特异性强、灵敏度高，极大的缩短了检测时间，为采取有针对性的综合防控措施提供参考数据，利于实验猴病原体SRV的快速检测和流行病学的调查与预防。

Description

一种检测猴D型逆转录病毒的引物探针组合物、试剂盒及检测 方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种检测猴D型逆转录病毒的引物探针组合物、试剂盒及检测方法。
背景技术
猴逆转录病毒(Simian type D retrovirus，SRV)属于逆转录病毒科，肿瘤病毒亚科的D型病毒，也叫猴D型逆转录病毒。SRV是负链RNA病毒，内含逆转录酶，该病毒在自然宿主猕猴中致病率高，容易引发猴群大批死亡，是一种严重干扰猴健康的传染性病原。
猕猴和人类在形态结构、生理生化等方面相似度极高，是解决人类某些疾病和发病机制的理想实验动物。我国是猕猴资源的富产国，南方多个省份的猴人工养殖场已成为国际试验用猴的出口基地，近年来医药技术保持高速发展态势，对实验猴的需求持续增加，然而猴群的引入和出口均存在一定的安全隐患，需要严格把控引入猴的检疫，定期监控猴群的病原体。SRV是SPF级实验猴必检病原体之一，目前SRV被发现存在8个血清型，我国目前发现流行的血清型为猴逆转录病毒血清型4、血清型5和血清型8，给实验猴和使用单位造成了巨大的影响。
为了保证饲养人员和科研人员的安全性，保证实验猴的质量和健康，本发明建立了一种可同时检测猴D型逆转录病毒4型、5型和8型的三重荧光定量PCR引物探针组合物，便捷、高效、灵敏、特异性强，利于我国实验猴病原体SRV的快速检测和流行病学的调查与预防。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术不适用于同时检测样本中4型、5型和8型血清型猴D型逆转录病毒的问题。
为此，本发明提供了一种检测猴D型逆转录病毒的引物探针组合物，包括反转录引物SRV-RT.RP，检测猴D型逆转录病毒4型的上游引物P-SRV4-F、下游引物P-SRV4-R和探针SRV4-P，检测猴D型逆转录病毒5型的上游引物P-SRV5-F、下游引物P-SRV5-R和探针SRV5-P，检测猴D型逆转录病毒8型的上游引物P-SRV8-F、下游引物P-SRV8-R和探针SRV8-P；
所述SRV-RT.RP的序列为
5’-CTTCCTGGTGTGGCTCTAAT-3’
5’-CTTCCTGGTGTGGCTCTAGC-3’；
所述P-SRV4-F的序列为5’-TGCCTCACACCCCTCGC-3’；
所述P-SRV4-R的序列为5’-CCTGACCTTGTCCATCTAC-3’；
所述SRV4-P的序列为5’-CACAGCACTTCCCTCTTG-3’；
所述P-SRV5-F的序列为5’-TGACCCTGACGATGACGAC-3’；
所述P-SRV5-R的序列为5’-TTGTAAGGAGGTGGACGAGTT-3’；
所述SRV5-P的序列为5’-TATCTGGCTGCCGCATCCG-3’；
所述P-SRV8-F的序列为5’-CTGCTATTCGCCCTTAC-3’；
所述P-SRV8-R的序列为5’-CACCCTCCTTTATCCTTATT-3’；
所述SRV8-P的序列为5’-TATCCGCCTTTGTTCG-3’。
本发明还提供了一种检测猴D型逆转录病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物探针组合物。
具体的，上述引物探针组合物中所述SRV-RT.RP、所述P-SRV4-F、所述P-SRV4-R、所述SRV4-P、所述P-SRV5-F、所述P-SRV5-R、所述SRV5-P、所述P-SRV8-F、所述P-SRV8-R和所述SRV8-P的终浓度均为0.1mM-1mM。
具体的，上述SRV4-P、所述SRV5-P和所述SRV8-P在5’端标记的荧光基团为FAM、VIC、HEX、CY5、Texas Red中的任一种，且各探针在5’端标记的荧光基团互不相同；所述SRV4-P、所述SRV5-P和是SRV8-P在3’端标记的荧光基团为BHQ1和BHQ2中的任一种。
具体的，上述试剂盒还包括定量标准品1-7；
所述定量标准品1为1.0×101copies/μl的PUC57-SRV4、1.0×101copies/μl的PUC57-SRV5和1.0×101copies/μl的PUC57-SRV8混合物；
所述定量标准品2为1.0×102copies/μl的PUC57-SRV4、1.0×102copies/μl的PUC57-SRV5和1.0×102copies/μl的PUC57-SRV8混合物；
所述定量标准品3为1.0×103copies/μl的PUC57-SRV4、1.0×103copies/μl的PUC57-SRV5和1.0×103copies/μl的PUC57-SRV8混合物；
所述定量标准品4为1.0×104copies/μl的PUC57-SRV4、1.0×104copies/μl的PUC57-SRV5和1.0×104copies/μl的PUC57-SRV8混合物；
所述定量标准品5为1.0×105copies/μl的PUC57-SRV4、1.0×105copies/μl的PUC57-SRV5和1.0×105copies/μl的PUC57-SRV8混合物；
所述定量标准品6为1.0×106copies/μl的PUC57-SRV4、1.0×106copies/μl的PUC57-SRV5和1.0×106copies/μl的PUC57-SRV8混合物；
所述定量标准品7为1.0×107copies/μl的PUC57-SRV4、1.0×107copies/μl的PUC57-SRV5和1.0×107copies/μl的PUC57-SRV8混合物。
具体的，上述PUC57-SRV4标准品保守区基因序列为：TGCCTCACACCCCTCGCTGGCCAGGTCAACATGTCCCAAGAGGGAAGTGCTGTGCCAGTCGAGAAAAAGAAGAGTTACCCCCTAAAGACATTTTCCCAGTAACAGAAACTGTAGATGGACAAGGTCAGG；
所述PUC57-SRV5标准品保守区基因序列为：TGACCCTGACGATGACGACCCCGACCCGCAAGAAGTAAATTGGGACGATCTTGCGGATGCGGCAGCCAGATATCATAACCCTGACTGGCCGCCATTTTTAACTCGTCCACCTCCTTACAA
所述PUC57-SRV8标准品保守区基因序列为：
GCTGCTATTCGCCCTTACAGAAAGAAAACAGATTTAACTGGTTATATCCGCCTTTGTTCGGATATTGGACCCTCTTATCAGCAAGGCCTGGCCATGGCCGCCGCGTTCAGCGGACAAACTGTGAAAGATTTCCTAAACAACAAAAATAAGGATAAAGGAGGGTG。
具体的，上述试剂盒还包括阳性对照；所述阳性对照为1.0×105copies/μl的PUC57-SRV4、1.0×105copies/μl的PUC57-SRV5和1.0×105copies/μl的PUC57-SRV8的混合物。
本发明还提供了一种猴D型逆转录病毒的检测方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样本RNA的，并制备cDNA模板；
(2)利用上述检测猴D型逆转录病毒的引物探针组合物对待测样本进行荧光定量PCR反应；
(3)根据荧光定量PCR反应结果，判断待测样品中是否含有猴D型逆转录病毒及所含猴D型逆转录病毒的血清型。
具体的，上述步骤(2)中荧光定量PCR反应程序包括：95℃预变性50min；扩增41个循环，每个循环95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s。
具体的，上述步骤(3)中判断方法具体为：当待测样品的荧光曲线为“S”型扩增，且Ct值≤35时，则判断该荧光曲线所对应的猴D型逆转录病毒血清型为阳性。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明提供的这种引物探针组合物可以同时检测猴D型逆转录病毒4型、5型和8型，利用该引物探针组合物进行三重荧光定量PCR，根据CT值和荧光信号类型能够直接判断出样本中是否感染猴D型逆转录病毒并确定其血清型，极大的缩短了检测时间。此外，该引物探针组合物特异性强，与易感细胞株VERO、BHK21、CHO-K1、293和猴副流感病毒5型SV5、小鼠微小病毒MVM均无交叉反应，且灵敏度高，D型逆转录病毒4型、5型和8型的检测度均可达到1.0×101copies/μl，为采取有针对性的综合防控措施提供参考数据，利于实验猴病原体SRV的快速检测和流行病学的调查与预防。
以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1是本发明实施例2中SRV4在单重荧光定量PCR中扩增标准曲线。
图2是本发明实施例2中SRV5在单重荧光定量PCR中扩增标准曲线。
图3是本发明实施例2中SRV8在单重荧光定量PCR中扩增标准曲线。
图4是本发明实施例2中SRV4、SRV5和SRV8在三重荧光定量PCR中扩增标准曲线。
图5是本发明实施例3中SRV4、SRV5和SRV8三重荧光定量PCR检测细胞特异性实验。
图6是本发明实施例3中SRV4、SRV5和SRV8三重荧光定量PCR检测病毒特异性实验。
图7是本发明实施例3中SRV4在三重荧光定量PCR中进行特异性扩增。
图8是本发明实施例3中SRV5在三重荧光定量PCR中进行特异性扩增。
图9是本发明实施例3中SRV8在三重荧光定量PCR中进行特异性扩增。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。尽管已经详细描述了本发明的代表性实施例，但是本发明所属技术领域的普通技术人员将理解，在不脱离本发明范围的情况下可以对本发明进行各种修改和改变。因此，本发明的范围不应局限于实施方案，而应由所附权利要求及其等同物来限定。除非特别说明，本发明所使用的试剂和设备都可通过常规市场购买。
下面通过具体实施例对本发明的检测猴D型逆转录病毒的引物探针组合物、试剂盒及检测方法的效果进行研究。
实施例1：
本实施例提供了一种同时检测猴D型逆转录病毒4型、5型、8型的引物探针组合物。
收集SRV各个血清型核酸序列，比对各个基因组序列后，针对保守区设计反转录引物SRV-RT.RP，检测猴D型逆转录病毒4型的上游引物P-SRV4-F、下游引物P-SRV4-R和探针SRV4-P，检测猴D型逆转录病毒5型的上游引物P-SRV5-F、下游引物P-SRV5-R和探针SRV5-P，检测猴D型逆转录病毒8型的上游引物P-SRV8-F、下游引物P-SRV8-R和探针SRV8-P，其中：
所述SRV-RT.RP的序列为
5’-CTTCCTGGTGTGGCTCTAAT-3’
5’-CTTCCTGGTGTGGCTCTAGC-3’；
所述P-SRV4-F的序列为5’-TGCCTCACACCCCTCGC-3’；
所述P-SRV4-R的序列为5’-CCTGACCTTGTCCATCTAC-3’；
所述SRV4-P的序列为5’-(FAM)-CACAGCACTTCCCTCTTG-(BHQ1)-3’；
所述P-SRV5-F的序列为5’-TGACCCTGACGATGACGAC-3’；
所述P-SRV5-R的序列为5’-TTGTAAGGAGGTGGACGAGTT-3’；
所述SRV5-P的序列为5’-(HEX)-TATCTGGCTGCCGCATCCG-(BHQ2)-3’；
所述P-SRV8-F的序列为5’-CTGCTATTCGCCCTTAC-3’；
所述P-SRV8-R的序列为5’-CACCCTCCTTTATCCTTATT-3’；
所述SRV8-P的序列为5’-(Texas Red)-TATCCGCCTTTGTTCG-(BHQ2)-3’。
实施例2：
本实施例研究了猴D型逆转录病毒的检测方法的检测灵敏度，并建立了标准曲线。
(1)制备PUC57-SRV4、PUC57-SRV5和PUC57-SRV8质粒标准品。
PUC57-SRV4标准品保守区基因序列为TGCCTCACACCCCTCGCTGGCCAGGTCAACATGTCCCAAGAGGGAAGTGCTGTGCCAGTCGAGAAAAAGAAGAGTTACCCCCTAAAGACATTTTCCCAGTAACAGAAACTGTAGATGGACAAGGTCAGG；
PUC57-SRV5标准品保守区基因序列为：TGACCCTGACGATGACGACCCCGACCCGCAAGAAGTAAATTGGGACGATCTTGCGGATGCGGCAGCCAGATATCATAACCCTGACTGGCCGCCATTTTTAACTCGTCCACCTCCTTACAA
PUC57-SRV8标准品保守区基因序列为GCTGCTATTCGCCCTTACAGAAAGAAAACAGATTTAACTGGTTATATCCGCCTTTGTTCGGATATTGGACCCTCTTATCAGCAAGGCCTGGCCATGGCCGCCGCGTTCAGCGGACAAACTGTGAAAGATTTCCTAAACAACAAAAATAAGGATAAAGGAGGGTG。
将PUC57-SRV4、PUC57-SRV5和PUC57-SRV8质粒标准品分别在1.0×101copies/μl-1.0×107copies/μl范围内进行梯度稀释，并制备定量标准品1-7。
定量标准品1为1.0×101copies/μl的PUC57-SRV4、1.0×101copies/μl的PUC57-SRV5和1.0×101copies/μl的PUC57-SRV8混合物；
定量标准品2为1.0×102copies/μl的PUC57-SRV4、1.0×102copies/μl的PUC57-SRV5和1.0×102copies/μl的PUC57-SRV8混合物；
定量标准品3为1.0×103copies/μl的PUC57-SRV4、1.0×103copies/μl的PUC57-SRV5和1.0×103copies/μl的PUC57-SRV8混合物；
定量标准品4为1.0×104copies/μl的PUC57-SRV4、1.0×104copies/μl的PUC57-SRV5和1.0×104copies/μl的PUC57-SRV8混合物；
定量标准品5为1.0×105copies/μl的PUC57-SRV4、1.0×105copies/μl的PUC57-SRV5和1.0×105copies/μl的PUC57-SRV8混合物；
定量标准品6为1.0×106copies/μl的PUC57-SRV4、1.0×106copies/μl的PUC57-SRV5和1.0×106copies/μl的PUC57-SRV8混合物；
定量标准品7为1.0×107copies/μl的PUC57-SRV4、1.0×107copies/μl的PUC57-SRV5和1.0×107copies/μl的PUC57-SRV8混合物。
(2)采用实施例1提供的引物探针组合物配制荧光定量PCR扩增体系：2X PremixEx Taq 10μl，混合引物1μl，混合探针0.4μl，待测样本模板5μl，加无RNA酶去离子水补足至20μl。混合引物由P-SRV4-F、P-SRV4-R、P-SRV5-F、P-SRV5-R、P-SRV8-F和P-SRV8-R组成，P-SRV4-F、P-SRV4-R、P-SRV5-F、P-SRV5-R、P-SRV8-F和P-SRV8-R的终浓度均为0.5mM；混合探针由SRV4-P、SRV5-P和SRV8-P组成，SRV4-P、SRV5-P和SRV8-P的终浓度均为0.5mM。
荧光定量PCR扩增程序：95℃预变性50min；扩增41个循环，每个循环95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s。
采用上述扩增体系和扩增程序分别对梯度稀释后的PUC57-SRV4、PUC57-SRV5和PUC57-SRV8进行单重荧光定量PCR，实验结果如图1-3所示。对定量标准品1-7进行三重荧光定量PCR，结果如图4所示。
对比图1-4，单重荧光定量PCR中SRV4、SRV5和SRV8的扩增效率与图4中对应的SRV4、SRV5、SRV8扩增效率一致，且相关系数R2≥0.99，灵敏度均可达到1.0×101copies/μl，证明本发明所建立的猴D型逆转录病毒的检测方法可准确、灵敏地反映SRV4、SRV5、SRV8的实际扩增情况。
实施例3：
本实施例对猴D型逆转录病毒的检测方法的特异性进行了研究。
所有实验中无模板对照(NTC)为无RNA酶去离子水，阳性对照为实施例2中定量标准品5。使用杭州新景生物试剂开发有限公司的病毒核酸纯化试剂盒提取待测样本核酸后，使用TAKARA的逆转录试剂盒制备相应的cDNA模板，制备过程中使用的反转录引物为SRV-RT.RP。
结果分析和判定：通过荧光扩增曲线和CT值大小来判断结果的阴阳性，确定样品中是否含有D型逆转录病毒4型、5型和8型。如果待测样品在FAM通道内荧光曲线为“S”型扩增，且Ct值≤35，判定为D型逆转录病毒4型阳性，无典型“S”型扩增或CT>35，判定为D型逆转录病毒4型阴性；在HEX通道内荧光曲线为“S”型扩增，且Ct值≤35，判定为D型逆转录病毒5型阳性,无典型“S”型扩增或CT>35，判定为D型逆转录病毒5型阴性；在Texas Red通道内荧光曲线为“S”型扩增，且Ct值≤35，判定为D型逆转录病毒8型阳性，无典型“S”型扩增或CT>35，判定为D型逆转录病毒8型阴性。
1、细胞特异性
采用实施例2中的荧光定量PCR扩增体系和扩增程序检测易感染细胞株VERO、BHK21、CHO-K1、293。结果如图5所示，无模板对照(NTC)为阴性，阳性对照在FAM、HEX、TexasRed通道的荧光曲线均为“S”型扩增，且Ct值≤35，表明荧光定量PCR反应有效，此时VERO、BHK21、CHO-K1、293细胞样本在FAM、HEX、Texas Red通道均无扩增，判断为阴性。表明本发明的引物探针组合物和检测方法细胞特异性良好。
2、病毒特异性
采用实施例2中的荧光定量PCR扩增体系和扩增程序检测SV5、MVM病毒。结果如图6所示，无模板对照(NTC)为阴性，阳性对照在FAM、HEX、Texas Red通道的荧光曲线均为“S”型扩增，且Ct值≤35，表明荧光定量PCR反应有效，此时病毒SV5、MVM在FAM、HEX、Texas Red通道均无扩增，判断为阴性。表明本发明特异性良好，不与其他病毒核酸发生交叉反应。
3、各个血清型之间的特异性
采用实施例2中的荧光定量PCR扩增体系和扩增程序分别检测猴D型逆转录病毒4型、5型和8型。结果如图7、图8、图9所示，FAM通道仅对猴D型逆转录病毒4型进行扩增，HEX通道仅对猴D型逆转录病毒5型进行扩增，Texas Red通道仅对猴D型逆转录病毒8型进行扩增。表明本发明可特异性地扩增和区分D型逆转录病毒4型、5型和8型。
以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种检测猴D型逆转录病毒的引物探针组合物，包括反转录引物SRV-RT.RP，检测猴D型逆转录病毒4型的上游引物P-SRV4-F、下游引物P-SRV4-R和探针SRV4-P，检测猴D型逆转录病毒5型的上游引物P-SRV5-F、下游引物P-SRV5-R和探针SRV5-P，检测猴D型逆转录病毒8型的上游引物P-SRV8-F、下游引物P-SRV8-R和探针SRV8-P，其特征在于：
所述SRV-RT.RP的序列为
5’-CTTCCTGGTGTGGCTCTAAT-3’
5’-CTTCCTGGTGTGGCTCTAGC-3’；
所述P-SRV4-F的序列为5’-TGCCTCACACCCCTCGC-3’；
所述P-SRV4-R的序列为5’-CCTGACCTTGTCCATCTAC-3’；
所述SRV4-P的序列为5’-CACAGCACTTCCCTCTTG-3’；
所述P-SRV5-F的序列为5’- TGACCCTGACGATGACGAC-3’；
所述P-SRV5-R的序列为5’- TTGTAAGGAGGTGGACGAGTT-3’；
所述SRV5-P的序列为5’-TATCTGGCTGCCGCATCCG-3’；
所述P-SRV8-F的序列为5’-CTGCTATTCGCCCTTAC -3’；
所述P-SRV8-R的序列为5’-CACCCTCCTTTATCCTTATT -3’；
所述SRV8-P的序列为5’-TATCCGCCTTTGTTCG -3’。
2.一种检测猴D型逆转录病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物探针组合物。
3.如权利要求2所述的检测猴D型逆转录病毒的试剂盒，其特征在于：所述引物探针组合物中所述SRV-RT.RP、所述P-SRV4-F、所述P-SRV4-R、所述SRV4-P、所述P-SRV5-F、所述P-SRV5-R、所述SRV5-P、所述P-SRV8-F、所述P-SRV8-R和所述SRV8-P的终浓度均为0.1mM -1mM。
4.如权利要求2所述的检测猴D型逆转录病毒的试剂盒，其特征在于：所述SRV4-P、所述SRV5-P和所述SRV8-P在5’端标记的荧光基团为FAM、VIC、HEX、CY5、Texas Red中的任一种，且各探针在5’端标记的荧光基团互不相同；所述SRV4-P、所述SRV5-P和是SRV8-P在3’端标记的荧光基团为BHQ1和BHQ2中的任一种。
5.如权利要求2所述的检测猴D型逆转录病毒的试剂盒，其特征在于：还包括定量标准品1-7；
所述定量标准品1为1.0×101copies/μl的PUC57-SRV4、1.0×101copies/μl的PUC57-SRV5和1.0×101copies/μl的PUC57-SRV8混合物；
所述定量标准品2为1.0×102copies/μl的PUC57-SRV4、1.0×102copies/μl的PUC57-SRV5和1.0×102copies/μl的PUC57-SRV8混合物；
所述定量标准品3为1.0×103copies/μl的PUC57-SRV4、1.0×103copies/μl的PUC57-SRV5和1.0×103copies/μl的PUC57-SRV8混合物；
所述定量标准品4为1.0×104copies/μl的PUC57-SRV4、1.0×104copies/μl的PUC57-SRV5和1.0×104copies/μl的PUC57-SRV8混合物；
所述定量标准品5为1.0×105copies/μl的PUC57-SRV4、1.0×105copies/μl的PUC57-SRV5和1.0×105copies/μl的PUC57-SRV8混合物；
所述定量标准品6为1.0×106copies/μl的PUC57-SRV4、1.0×106copies/μl的PUC57-SRV5和1.0×106copies/μl的PUC57-SRV8混合物；
所述定量标准品7为1.0×107copies/μl的PUC57-SRV4、1.0×107copies/μl的PUC57-SRV5和1.0×107copies/μl的PUC57-SRV8混合物。
6.如权利要求5所述的检测猴D型逆转录病毒的试剂盒，其特征在于：
所述PUC57-SRV4的保守区基因序列为TGCCTCACACCCCTCGCTGGCCAGGTCAACATGTCCCAAGAGGGAAGTGCTGTGCCAGTCGAGAAAAAGAAGAGTTACCCCCTAAAGACATTTTCCCAGTAACAGAAACTGTAGATGGACAAGGTCAGG；
所述PUC57-SRV5的保守区基因序列为TGACCCTGACGATGACGACCCCGACCCGCAAGAAGTAAATTGGGACGATCTTGCGGATGCGGCAGCCAGATATCATAACCCTGACTGGCCGCCATTTTTAACTCGTCCACCTCCTTACAA；
所述PUC57-SRV8的保守区基因序列为GCTGCTATTCGCCCTTACAGAAAGAAAACAGATTTAACTGGTTATATCCGCCTTTGTTCGGATATTGGACCCTCTTATCAGCAAGGCCTGGCCATGGCCGCCGCGTTCAGCGGACAAACTGTGAAAGATTTCCTAAACAACAAAAATAAGGATAAAGGAGGGTG。
7.如权利要求2所述的检测猴D型逆转录病毒的试剂盒，其特征在于：还包括阳性对照；所述阳性对照为1.0×105copies/μl的PUC57-SRV4、1.0×105copies/μl的PUC57-SRV5和1.0×105copies/μl的PUC57-SRV8的混合物。
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