CN114752704B - 应用多重探针熔解曲线法检测脑炎病毒核酸试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了应用多重探针熔解曲线法检测脑炎病毒核酸试剂盒及方法，包括荧光PCR反应液、酶混合液、阳性对照品、阴性对照品，所述荧光PCR反应液中含有PCR缓冲液、Mgcl2、dNTPs、六种脑炎病毒对应的上游引物、六种脑炎病毒对应的下游引物、六种脑炎病毒对应的荧光探针，所述六种脑炎病毒分别为肠道病毒、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、人巨细胞病毒、EB病毒、水痘带状疱疹病毒；所述上游引物的序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16所示；所述下游引物的序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17所示；所述荧光探针的序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18所示。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种应用多重探针熔解曲线法检测脑炎病毒核酸的试剂盒及方法。
背景技术
病毒性脑炎是一种脑实质感染了病毒的急性感染性疾病，儿童是病毒性脑炎的主要易感人群。病毒性脑炎临床症状主要表现为发热、头痛、抽搐、意识障碍和脑膜刺激症状等，该疾病若不及时治疗，则可能会影响脑功能，甚至会产生不可逆的后遗症，严重威胁我国儿童健康成长。病毒性脑炎治疗主要依靠对症治疗、抗病毒治疗和免疫治疗等手段，因此对于病毒性脑炎的诊断有着至关重要的临床价值。在临床上能引起病毒性脑炎的病原微生物有乙型脑炎病毒、肠道病毒(脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒)、疱疹病毒(单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、EB病毒、巨细胞病毒)等病原微生物，近年来，由于疫苗的改进及普及，乙脑的发病率陆续下降，而肠道病毒和疱疹病毒所引起的病毒性脑炎发病率持续上升；据部分研究表明，80％以上的儿童病毒性脑炎均由肠道病毒所引起，其次为单纯疱疹病毒。肠道病毒性脑炎：肠道病毒性脑炎四季散发。以5～9月份多见。肠道病毒可引起脑炎、脑膜炎、脊髓灰质的炎症，绝大多数肠道病毒临床症状较轻，预后较轻。HSV(HSV-1和HSV-2)最常累及大脑颞叶、额叶和边缘系统，引起脑组织出血性坏死和(或)变态反应性脑损害，故单纯疱疹病毒性脑炎又称为急性坏死性脑炎或出血性脑炎。此病起病急，病情发展快，症状严重，且后遗症较重。巨细胞病毒和EB病毒主要感染免疫功能低下的人群，脑炎相对症状较轻，所致脑脊膜炎很少导致痫性发作，预后较好。在治疗上，肠道病毒脑炎以对症治疗为主，而HSV脑炎以抗病毒治疗和免疫治疗为主。所以，不同病毒感染所致的儿童脑炎在临床症状的轻重、预后的好坏、治疗方案的选择上差异较大，病毒性脑炎的诊断和具体病毒的鉴别对临床病毒性脑炎的防治具有重要意义。
临床对于病毒性脑炎常见的检测方法有脑脊液常规检查配合病毒分离培养，病毒分离培养为病毒检测金标准，虽异性高，但分离成功率偏低，且检测周期较长，不利于临床普遍应用。荧光定量PCR检测是现今临床使用最为广泛的技术方法，该方法优点主要表现为高灵敏度和高特异性。然而该方法学检测通量因为受荧光素特性而受到限制，临床常用的检测荧光定量PCR检测试剂盒只能检测1-2种病毒，无法满足临床多种病毒筛查的需求。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术中存在的上述问题，提供了应用多重探针熔解曲线法检测脑炎病毒核酸试剂盒；本发明的第二个目的是提供一种采用上述试剂盒检测脑炎病毒核酸的方法。
本发明的第一个目的可通过下列技术方案来实现：一种应用多重探针熔解曲线法检测脑炎病毒核酸试剂盒，包括荧光PCR反应液、酶混合液、阳性对照品、阴性对照品，所述荧光PCR反应液中含有PCR缓冲液、Mgcl2、dNTPs、六种脑炎病毒对应的上游引物、六种脑炎病毒对应的下游引物、六种脑炎病毒对应的荧光探针，所述六种脑炎病毒分别为肠道病毒、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、人巨细胞病毒、EB病毒、水痘带状疱疹病毒；
所述上游引物的序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16所示；
所述下游引物的序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17所示；
所述荧光探针的序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18所示。
优选地，还包括盒体，所述盒体设置有多个容器孔，多个所述容器孔用于分别放置荧光PCR反应液管、酶混合液管、阳性对照品管、阴性对照品管。
优选地，所述阳性对照品为采用TE缓冲液溶解后得到的六种脑炎病毒扩增序列混合溶液，所述阳性对照品中六种脑炎病毒的扩增序列如SEQ ID NO:19-SEQ ID NO:24所示。
优选地，所述阴性对照品为无菌注射用水。
优选地，所述酶混合液中含有M-MLV逆转录酶和Taq DNA聚合酶。
本发明的第二个目的可通过下列技术方案来实现：一种采用上述试剂盒检测脑炎病毒核酸的方法，包括如下步骤：
步骤S01，核酸提取：利用磁珠法或柱式提取法提取待检样本的核酸；
步骤S02，试剂配制：取反应液和酶混合液，配制PCR定性反应液体；
步骤S03，扩增检测：取步骤S01中得到的提取产物、阳性对照品、阴性对照品，分别加入上述步骤S02得到的PCR定性反应液体，配制PCR体系，在4色以上的荧光定量PCR仪上进行检测；
步骤S04，进行荧光定量结果分析。
优选地，所述步骤S04中，荧光定量结果分析如下：
FAM探针、VIC探针、ROX探针的CT值均等于45，则为阴性标本；
当FAM探针的CT值≤43，则判定为通用型肠道病毒阳性；
当VIC探针的CT值≤43，则提示为单纯疱疹病毒I型或单纯疱疹病毒II型阳性，再分析熔解曲线，68.0±1℃产生熔解峰判定为单纯疱疹病毒I型阳性，73.0±1℃产生熔解峰判定为单纯疱疹病毒II型阳性；
当ROX探针的CT值≤43，则提示为水痘带状疱疹病毒、EB病毒或人巨细胞病毒阳性，再分析分析熔解曲线，66.0±1℃产生熔解峰判定为水痘带状疱疹病毒阳性，71.0±1℃产生熔解峰判定为EB病毒阳性，77.0±1℃产生熔解峰判定为人巨细胞病毒阳性；
当CT值在43和45之间的，重做之后CT值大于43的为阴性。
优选地，所述步骤S02中，取15μL反应液和5μL酶混合液，配制20μL PCR定性反应液体；所述步骤S03中，取步骤S01中得到的提取产物、阳性对照品、阴性对照品均为10μL，分别加入上述步骤S02得到的20μL PCR定性反应液体，配制PCR体系共30μL。
与现有技术相比，本发明运用多重探针熔解曲线技术，采用3种探针荧光PCR联合多重熔解曲线，开发研制出用于病毒性脑炎常见6种病毒核酸的检测试剂盒。该发明具备了荧光定量PCR的灵敏度和特异性，且比荧光定量PCR方法检测通量更大，操作更简便，成本更低。为临床上病毒性脑炎的诊断提供可靠的实验手段。
附图说明
图1是本发明试剂盒的结构示意图；
图2是本发明通用型肠道病毒临床株的扩增曲线图；
图3是本发明单纯疱疹病毒I型临床株的检测结果图，其中，A为单纯疱疹病毒I型的溶解曲线图，B为单纯疱疹病毒I型的扩增曲线图；
图4是本发明单纯疱疹病毒II型临床株的检测结果图，其中，A为单纯疱疹病毒II型的溶解曲线图，B为单纯疱疹病毒II型的扩增曲线图；
图5是本发明水痘带状疱疹病毒临床株的检测结果图，其中，A为水痘带状疱疹病毒的溶解曲线图，B为水痘带状疱疹病毒的扩增曲线图；
图6是本发明EB病毒临床株的检测结果图，其中，A为EB病毒的溶解曲线图，B为EB病毒的扩增曲线图；
图7是本发明人巨细胞病毒临床株的检测结果图，其中，A为人巨细胞病毒的溶解曲线图，B为人巨细胞病毒的扩增曲线图。
图中，01、荧光PCR反应液管放置孔；02、酶混合液管放置孔；03、阳性对照品管放置孔；04、阴性对照品管放置孔；05、操作说明书；06、盒体；07、盒盖。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1一种应用多重探针熔解曲线法检测脑炎病毒核酸试剂盒，包括荧光PCR反应液、酶混合液、阳性对照品、阴性对照品，荧光PCR反应液中含有PCR缓冲液、Mgcl2、dNTPs、六种脑炎病毒对应的上游引物、六种脑炎病毒对应的下游引物、六种脑炎病毒对应的荧光探针，六种脑炎病毒分别为肠道病毒、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、人巨细胞病毒、EB病毒、水痘带状疱疹病毒；上游引物的序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16所示；下游引物的序列如SEQ ID NO:2、SEQID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17所示；荧光探针的序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18所示，具体地，如表1所示。
表1六种脑炎病毒对应的上游引物序列、六种脑炎病毒对应的下游引物序列、六种脑炎病毒对应的荧光探针序列
本试剂盒中的阳性对照品为六种脑炎病毒扩增序列混合溶液，采用TE缓冲液溶解，其中六种脑炎病毒扩增序列如SEQ ID NO:19-SEQ ID NO:24所示，具体地，如表2所示。根据六种病毒序列设计阳性对照品中的六种脑炎病毒扩增序列。
表2脑炎病毒扩增序列
本试剂盒中的阴性对照品为无菌注射用水，酶混合液中含有M-MLV逆转录酶和TaqDNA聚合酶。本试剂盒保存在-20℃，尽量减少反复冻融。
如图1所示，本试剂盒还包括盒体06和盒盖07，盒体06开设有八个容器孔，用于分别放置两个荧光PCR反应液管、两个酶混合液管、两个阳性对照品管、两个阴性对照品管。荧光PCR反应液管中装有荧光PCR反应液，酶混合液管中装有酶混合液，阳性对照品管中装有阳性对照品，阴性对照品管装有阴性对照品。八个容器孔可以分别记荧光PCR反应液管放置孔01、酶混合液管放置孔02、阳性对照品管放置孔03、阴性对照品管放置孔04。盒盖07中放置有操作说明书05，如图1所示，图1为本申请试剂盒的结构示意图。
实施例2一种采用上述试剂盒检测脑炎病毒核酸的方法，每次检测均应设立阳性对照和阴性对照，包括如下步骤：
(1)核酸提取：取临床上疑似病毒性脑炎患儿脑脊液样本0.5mL于EP管中，利用磁珠法或柱式提取法提取待检样本脑脊液中的核酸。
(2)试剂配制：取19μL反应液和1μL酶混合液，配制20μL PCR定量反应液体；
(3)扩增检测：取步骤S01中得到的提取产物5μL、阳性对照品5μL、阴性对照品5μL，分别加入上述步骤S02得到的20μL PCR定量反应液体，配制PCR体系共25μL，在4色以上的荧光定量PCR仪上进行检测，具体反应程序为(以国产宏石SLAN-96P荧光定量PCR仪为例)，如表3所示。
表3反应程序设置SLAN-96P
(4)荧光定量结果分析
FAM探针、VIC探针、ROX探针的CT值均等于45，则为阴性标本；
当FAM探针的CT值≤43，则判定为通用型肠道病毒阳性；
当VIC探针的CT值≤43，则提示为单纯疱疹病毒I型或单纯疱疹病毒II型阳性，再分析熔解曲线，68.0±1℃(即67.0℃-69.0℃之间)产生熔解峰判定为单纯疱疹病毒I型阳性，73.0±1℃(即72.0℃-74.0℃之间)产生熔解峰判定为单纯疱疹病毒II型阳性；
当ROX探针的CT值≤43，则提示为水痘带状疱疹病毒、EB病毒或人巨细胞病毒阳性，再分析分析熔解曲线，66.0±1℃(即65.0℃-67.0℃之间)产生熔解峰判定为水痘带状疱疹病毒阳性，71.0±1℃(即70.0℃-72.0℃之间)产生熔解峰判定为EB病毒阳性，77.0±1℃(即76.0℃-78.0℃之间)产生熔解峰判定为人巨细胞病毒阳性；
当CT值在43和45之间的，重做之后CT值大于43的为阴性。
实施例3多重探针熔解曲线法检测实验室临床株
(1)材料：肠道病毒通用型、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、人巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒和EB病毒均为本实验室保存。
(2)引物和探针的设计与合成
设计6对引物和6条探针分别针对6种病毒，引物和探针的序列如表1所示，通过引物控制同一类型探针标记病毒的扩增产物长度，熔解曲线分析具体病毒。其中引物及探针均有大连宝生物技术公司合成。
(3)临床株核酸的抽提
步骤(1)中实验室保存的六种病毒为临床株，取临床株的上清液0.5mL分别加入六个EP管中，每一个EP管对应一种病毒，采用磁珠法提取病毒核酸，每一个EP管中取300μL样本加入深孔板中，在EX3600核酸自动提取仪上进行病毒核酸提取。
(4)临床株的多重探针熔解曲线实验
对上述6种病毒临床株进行单管多重探针熔解曲线法检测，结果表明所有病毒均能特异性的检测出。我们设计的引物和探针无任何内部交叉信号出现，具有很高的特异性。
如图2所示，图2为通用型肠道病毒临床株的扩增曲线图。
如图3所示，图3为单纯疱疹病毒I型的临床株检测结果图，其中，A为单纯疱疹病毒I型的溶解曲线图，B为单纯疱疹病毒I型的扩增曲线图；
如图4所示，图4为单纯疱疹病毒II型临床株的检测结果图，其中，A为单纯疱疹病毒II型的溶解曲线图，B为单纯疱疹病毒II型的扩增曲线图；
如图5所示，图5为水痘带状疱疹病毒临床株的检测结果图，其中，A为水痘带状疱疹病毒的溶解曲线图，B为水痘带状疱疹病毒的扩增曲线图；
如图6所示，图6为EB病毒临床株的检测结果图，其中，A为EB病毒的溶解曲线图，B为EB病毒的扩增曲线图；
如图7所示，图7为人巨细胞病毒临床株的检测结果图，其中，A为人巨细胞病毒的溶解曲线图，B为人巨细胞病毒的扩增曲线图。
本发明采用单个反应管里检测三个荧光通道(FAM通道、VIC通道和ROX通道)和熔解曲线，共检测六种病毒(肠道病毒、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、水痘带状疱疹病毒、EB病毒、人巨细胞病毒)，大大提高了单管反应检测通量，仅需要单管反应试剂的成本。检测反应在一般荧光定量PCR仪上都可以进行，结果判读简单、不开盖无污染风险，可以适用于所有临床PCR实验室的医疗机构。同时，本检测技术结合荧光定量PCR和熔解曲线分析，具备了和荧光定量PCR一样的高灵敏度和特异性。
本发明试剂盒联合荧光PCR和熔解曲线技术单管检测病毒性脑炎常见6种病毒，设计了6对引物和6条探针分别针对6种病毒，其中FAM-BHQ1探针特异识别肠道病毒通用型；2条VIC-BHQ1探针分别特异识别单纯疱疹病毒I型和单纯疱疹病毒II型，其中单纯疱疹病毒I型的扩增产物长度为173bp，单纯疱疹病毒II型的扩增产物长度为147bp，进一步熔解曲线分析68℃产生熔解曲线峰为单纯疱疹病毒I阳性，73℃产生熔解曲线峰为单纯疱疹病毒II型阳性；3条ROX-BHQ1探针分别特异识别人巨细胞病毒、EB病毒和水痘带状疱疹病毒，其中人巨细胞病毒的扩增产物长度为165bp，EB病毒的扩增产物长度为149bp，水痘带状疱疹病毒的扩增产物长度为151bp，进一步熔解曲线分析65℃产生熔解曲线峰为水痘带状疱疹病毒阳性，71℃产生熔解曲线峰为EB病毒阳性，77℃产生熔解曲线峰为人巨细胞病毒阳性。在一个反应管中，利用多重探针熔解曲线技术快速鉴定病毒性脑炎相关的6种病原体。
本发明运用多重探针熔解曲线技术，采用3种探针荧光PCR联合多重熔解曲线，开发研制出用于病毒性脑炎常见6种病毒核酸的检测试剂盒。该发明具备了荧光定量PCR的灵敏度和特异性，且比荧光定量PCR方法检测通量更大，操作更简便，成本更低。为临床上病毒性脑炎的诊断提供可靠的实验手段。
本文中所描述的具体实施例仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管本文较多地使用了大量术语，但并不排除使用其它术语的可能性。使用这些术语仅仅是为了更方便地描述和解释本发明的本质；把它们解释成任何一种附加的限制都是与本发明精神相违背的。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 应用多重探针熔解曲线法检测脑炎病毒核酸试剂盒及方法
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<210> 23
<211> 149
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
caagcagcag ctggccatca agtgcacgtg caacgccgtc tacggcttca ccggggtggc 60
caacggcctc tttccctgcc tctccatcgc cgagacggtg acgctgcagg gccgcacgat 120
gttggagcgg gccaaggcct tcgtggagg 149
<210> 24
<211> 165
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tttctacggt tttacaggcg tggtcaacgg catgatgccg tgtctgccca tcgccgccag 60
catcacgcgc atcggtcgcg acatgctaga gcgcacggcg cggttcatca aagacaactt 120
ttcagagccg tgttttttgc acaatttttt taatcaggaa gacta 165
Claims (7)
1.一种应用多重探针熔解曲线法检测脑炎病毒核酸的试剂盒检测脑炎病毒核酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S01，核酸提取：利用磁珠法或柱式提取法提取待检样本的核酸；
步骤S02，试剂配制：取反应液和酶混合液，配制PCR定量反应液体；
步骤S03，扩增检测：取步骤S01中得到的提取产物、阳性对照品、阴性对照品，分别加入上述步骤S02得到的PCR定量反应液体，配制PCR体系，在4色以上的荧光定量PCR仪上进行检测；
步骤S04，进行荧光定量结果分析；
所述脑炎病毒为六种，分别为肠道病毒、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、人巨细胞病毒、EB病毒、水痘带状疱疹病毒；六种脑炎病毒对应的上游引物、六种脑炎病毒对应的下游引物、六种脑炎病毒对应的荧光探针的序列如下：
所述上游引物的序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16所示；
所述下游引物的序列分别如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17所示；
所述荧光探针的序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18所示；
所述步骤S04中，荧光定量结果分析如下：
FAM探针、VIC探针、ROX探针的CT值均等于45，则为阴性标本；
当FAM探针的CT值≤43，则判定为通用型肠道病毒阳性；
当VIC探针的CT值≤43，则提示为单纯疱疹病毒I型或单纯疱疹病毒II型阳性，再分析熔解曲线，68.0±1℃产生熔解峰判定为单纯疱疹病毒I型阳性，73.0±1℃产生熔解峰判定为单纯疱疹病毒II型阳性；
当ROX探针的CT值≤43，则提示为水痘带状疱疹病毒、EB病毒或人巨细胞病毒阳性，再分析分析熔解曲线，66.0±1℃产生熔解峰判定为水痘带状疱疹病毒阳性，71.0±1℃产生熔解峰判定为EB病毒阳性，77.0±1℃产生熔解峰判定为人巨细胞病毒阳性；
当CT值在43和45之间的，重做之后CT值大于43的为阴性；
所述方法用于非诊断目的。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S02中，取15μL反应液和5μL酶混合液，配制20μL PCR定性反应液体；所述步骤S03中，取步骤S01中得到的提取产物、阳性对照品、阴性对照品均为10μL，分别加入上述步骤S02得到的20μL PCR定性反应液体，配制PCR体系共30μL。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述试剂盒包括荧光PCR反应液、酶混合液、阳性对照品、阴性对照品，所述荧光PCR反应液中含有PCR缓冲液、Mgcl2、dNTPs。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述试剂盒还包括盒体（06），所述盒体（06）设置有多个容器孔，多个所述容器孔用于分别放置荧光PCR反应液管、酶混合液管、阳性对照品管、阴性对照品管。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述阳性对照品为采用TE缓冲液溶解后得到的六种脑炎病毒扩增序列混合溶液，所述阳性对照品中六种脑炎病毒的扩增序列如SEQID NO:19-SEQ ID NO:24所示。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述阴性对照品为无菌注射用水。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述酶混合液中含有M-MLV逆转录酶和TaqDNA聚合酶。
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| CN105385787A (zh) * | 2015-12-04 | 2016-03-09 | 南京美宁康诚生物科技有限公司 | 12种脑炎病毒核酸多重pcr检测试剂盒及其应用 |
| CN107513584A (zh) * | 2017-09-25 | 2017-12-26 | 浙江大学 | 一种检测肠道病毒的五重荧光定量试剂盒 |
-
2022
- 2022-03-17 CN CN202210264083.XA patent/CN114752704B/zh active Active
Patent Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN103820573A (zh) * | 2014-01-21 | 2014-05-28 | 浙江大学 | 四种常见人疱疹病毒荧光定量pcr检测试剂盒 |
| CN105385787A (zh) * | 2015-12-04 | 2016-03-09 | 南京美宁康诚生物科技有限公司 | 12种脑炎病毒核酸多重pcr检测试剂盒及其应用 |
| CN107513584A (zh) * | 2017-09-25 | 2017-12-26 | 浙江大学 | 一种检测肠道病毒的五重荧光定量试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Christopher J McIver等.Multiplex PCR testing detection of higher-than-expected rates of cervical mycoplasma, ureaplasma, and trichomonas and viral agent infections in sexually active australian women.J Clin Microbiol.2009,第47卷(第5期),第1358-1363页. * |
| 郑之北等.多重PCR-基因芯片技术检测多种人疱疹病毒.2007年浙江省医学病毒学、医学微生物与免疫学学术年会论文汇编.2007,第124-131页. * |
Also Published As
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