CN115927746A - 用于诺如病毒和轮状病毒双重rt-rap检测的引物探针组、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于诺如病毒和轮状病毒双重RT‑RAP检测的引物探针组、试剂盒及其应用，属于分子生物学检测技术领域，所述引物探针组包括诺如病毒检测用引物探针组和轮状病毒检测用引物探针组；所以诺如病毒检测用引物探针组包括：GII‑RAA‑F、GII‑RAA‑R、GII‑F、GII‑R和GII‑P；所述轮状病毒检测用引物探针组包括：RV‑RAA‑F、RV‑RAA‑R、RV‑F、RV‑R和RV‑P。本发明的引物探针组可同时快速检测诺如病毒GII型和轮状病毒A组，灵敏度比普通qPCR高，反应时间大大缩短，且特异性好。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及用于诺如病毒和轮状病毒双重RT-RAP检测的引物探针组、试剂盒及其应用。
背景技术
诺如病毒(Norovirus，NOV)是全球急性胃肠道疾病的常见原因，每年造成全球约五分之一的急性胃肠炎病例。来自基因组II的诺如病毒是造成大多数腹泻暴发的原因。人轮状病毒(Human rotavirus，HRV)是全球5岁以下婴幼儿严重胃肠炎的最常见原因，其中轮状病毒A组占所有病例的90％以上。这两种腹泻病毒的快速检测及早期诊断，并及时采取有效措施，对降低患者因腹泻而导致的脱水和酸中毒发生率，甚至死亡率具有重要意义。
目前，对于诺如病毒和轮状病毒的检测多采用抗原检测试剂盒(酶联免疫法、胶体金法，免疫层析法等)，但其假阳性率较高，且检出率较低，不作为最佳的筛选方法。常用的荧光定量PCR(qPCR)具有特异性和灵敏度均较高的优势，被首推为检测诺如病毒和轮状病毒的生物学方法。
但是目前还没有关于诺如病毒和轮状病毒同时高灵敏检测的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供用于诺如病毒和轮状病毒双重RT-RAP检测的引物探针组、试剂盒及其应用，本发明能够实现同时对诺如病毒GII型和轮状病毒A组进行高灵敏的检测。
本发明提供了用于诺如病毒和轮状病毒双重RT-RAP检测的引物探针组，包括诺如病毒检测用引物探针组和轮状病毒检测用引物探针组；
所以诺如病毒检测用引物探针组包括：GII-RAA-F、GII-RAA-R、GII-F、GII-R和GII-P；
所述GII-RAA-F、GII-RAA-R、GII-F、GII-R和GII-P的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.5所示；
所述轮状病毒检测用引物探针组包括：RV-RAA-F、RV-RAA-R、RV-F、RV-R和RV-P；
所述RV-RAA-F、RV-RAA-R、RV-F、RV-R和RV-P分别如SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.10所示；
所述GII-P和RV-P分别标记不同的荧光基团。
优选的，所述荧光基团包括FAM、HEX、ROX、TET、JOE、CY3、CY5、TAMRA或VIC。
本发明还提供了用于诺如病毒和轮状病毒双重RT-RAP检测的的试剂盒，包括上述方案所述的引物探针组、RT-RAA反应用试剂和qPCR反应用试剂。
优选的，所述试剂盒还包括正二十二烷。
优选的，所述qPCR反应用试剂包括无核酶水、Buffer、Taq热启动酶和dNTP；所述RT-RAA反应用试剂包括反应缓冲液、乙酸镁和双蒸水。
本发明还提供了上述方案所述的RT-RAP检测用引物探针组或所述的试剂盒在非诊断目的的诺如病毒和轮状病毒同时检测中的应用。
本发明还提供了一种非诊断目的的诺如病毒和轮状病毒同时检测的方法，包括以下步骤：
1)提取待测样品的核酸；
2)以所述核酸为模板，采用上述方案所述的引物探针组，依次进行RT-RAA扩增和qPCR扩增，收集荧光信号；
3)若诺如病毒对应的扩增曲线起峰且呈S型扩增，判定待测样品中含有诺如病毒，若诺如病毒对应的扩增曲线不起峰或无明显S型扩增，判定待测样品中不含诺如病毒；若轮状病毒对应的扩增曲线起峰且呈S型扩增，判定待测样品中含有轮状病毒，若轮状病毒对应的扩增曲线不起峰或无明显S型扩增，判定待测样品中不含轮状病毒。
优选的，所述RT-RAA扩增的反应体系包括280mM的乙酸镁水溶液、模板和RT-RAA反应混合液；所述乙酸镁水溶液、模板和RT-RAA反应混合液的体积比为0.5：1：9；
所述RT-RAA反应混合液以40μl计，包括以下组分：反应缓冲液25μl、无核酶水11μl、GII-RAA-F 1μl、GII-RAA-R 1μl、RV-RAA-F 1μl和RV-RAA-R 1μl；
所述RT-RAA扩增的反应程序包括39～42℃、10～12min；
所述qPCR扩增的反应体系以40μl计，包括以下组分：Buffer 12.5μl、无核酶水21.7μl、Taq热启动酶0.5μl、dNTP 0.6μl、MgCl21.2μl、GII-F 0.5μl、GII-R 0.5μl、GII-P0.5μl、RV-F 0.5μl、RV-R 0.5μl和RV-P 0.5μl；
所述qPCR扩增的反应程序包括：95℃、3min；95℃、15s，55℃、30s，72℃、30s，30个循环。
优选的，所述RT-RAA扩增和qPCR扩增的扩增体系采用正二十二烷进行间隔包括：在qPCR扩增的扩增体系中加入熔融的正二十二烷进行静置，正二十二烷浮于qPCR扩增的扩增体系之上，待所述正二十二烷凝固后，在凝固的正二十二烷上加入RT-RAA扩增的扩增体系。
优选的，所述RT-RAA扩增和qPCR扩增于带盖的管内进行；在凝固的正二十二烷上加入RT-RAA扩增的扩增体系包括将除乙酸镁以外的RT-RAA扩增的扩增体系加入到凝固的正十二烷之上，将乙酸镁加到盖内，利用乙酸镁启动RT-RAA反应。
本发明提供了本发明提供了用于诺如病毒和轮状病毒双重RT-RAP检测的引物探针组，包括诺如病毒检测用引物探针组和轮状病毒检测用引物探针组；所以诺如病毒检测用引物探针组包括：GII-RAA-F、GII-RAA-R、GII-F、GII-R和GII-P；所述轮状病毒检测用引物探针组包括：RV-RAA-F、RV-RAA-R、RV-F、RV-R和RV-P；本发明能够利用GII-RAA-F、GII-RAA-R、RV-RAA-F和RV-RAA-R实现对诺如病毒GII型和轮状病毒A组的双重RT-RAA扩增，能够利用GII-F、GII-R、GII-P、RV-F、RV-R和RV-P实现对诺如病毒GII型和轮状病毒A组的双重qPCR扩增。本发明的引物探针组可同时快速检测诺如病毒GII型和轮状病毒A组，灵敏度比普通qPCR高，反应时间大大缩短，且特异性好。
附图说明
图1为RAP原理示意图；
图2为RT-RAP检测原理示意图；
图3为单重NOV-GII RT-RAP(Reverse transcription recombinase aided PCR)灵敏度图；
图4为NOV-GII qPCR灵敏度图；
图5为单重RVART-RAP灵敏度图；
图6为单重RVAqPCR灵敏度图；
图7为双重RAP灵敏度。
具体实施方式
本发明提供了用于诺如病毒和轮状病毒双重RT-RAP检测的引物探针组，包括诺如病毒检测用引物探针组和轮状病毒检测用引物探针组；所以诺如病毒检测用引物探针组包括：GII-RAA-F、GII-RAA-R、GII-F、GII-R和GII-P；所述GII-RAA-F、GII-RAA-R、GII-F、GII-R和GII-P的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示；所述轮状病毒检测用引物探针组包括：RV-RAA-F、RV-RAA-R、RV-F、RV-R和RV-P；所述RV-RAA-F、RV-RAA-R、RV-F、RV-R和RV-P分别如SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.10所示；所述GII-P和RV-P分别标记不同的荧光基团。
在本发明中，所述荧光基团优选的包括FAM、HEX、ROX、TET、JOE、CY3、CY5、TAMRA或VIC，更优选为FAM或HEX。
在本发明中，所述诺如病毒优选为诺如病毒GII型(NOV-GII)；所述轮状病毒优选为轮状病毒A组。
在本发明中，所述GII-RAA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：TTTACGTGCCCAGRCAAGARCCAATGTTCA；所述GII-RAA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：GTCACTCGACGCCATCTTCATTCACAAAAC；所述GII-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：CARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG；所述GII-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：TCGACGCCATCTTCATTCACA；所述GII-P的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：TGGGAGGGCGATCGCAATCT；所述RV-RAA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：TATTAACCATCTWCACRTRACCCTCTATGA；所述RV-RAA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：GGTCACATAACGCCCCTATAGCCATTTAGG；所述RV-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，具体为：ACCATCTWCACRTRACCCTC；所述RV-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，具体为：GGTCACATAACGCCCCTATA；所述RV-P的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，具体为：ATGAGCACAATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA。
在本发明中，用于RAA扩增的引物是在现有的qPCR引物基础上，按照RAA引物的设计原则，延长至30～35bp之间；所述qPCR的探针为TaqMan探针。
在本发明中，所述引物探针组中的每个引物或探针的使用浓度优选为10μmol/L。
本发明还提供了用于诺如病毒和轮状病毒双重RT-RAP检测的的试剂盒，包括上述方案所述的引物探针组、RT-RAA反应用试剂和qPCR反应用试剂。
在本发明中，所述试剂盒优选的还包括和正二十二烷(N-Docosane)。正二十二烷是一种熔点为44℃的白色晶体，常温下为固体，密度为0.7944g/mL，随温度变化可拆解，不会影响核酸扩增反应。由于RT-RAA和qPCR反应所需的温度不同，因此本发明利用正二十二烷将RT-RAA和qPCR两种反应体系分隔开。本发明通过加入正二十二烷作为分隔两种体系的特殊材料实现单管闭管两阶段的一步对诺如病毒GII型和轮状病毒A组进行快速、准确、高灵敏的检测。
在本发明中，所述qPCR反应用试剂优选的包括无核酶水、Buffer、Taq热启动酶和dNTP；所述RT-RAA反应用试剂包括反应缓冲液、乙酸镁和双蒸水。
本发明还提供了上述方案所述的RT-RAP检测用引物探针组或所述的试剂盒在非诊断目的的诺如病毒和轮状病毒同时检测中的应用。
本发明还提供了一种非诊断目的的诺如病毒和轮状病毒同时检测的方法，包括以下步骤：
1)提取待测样品的核酸；
2)以所述核酸为模板，采用上述方案所述的引物探针组，依次进行RT-RAA扩增和qPCR扩增，收集荧光信号；
3)若诺如病毒对应的扩增曲线起峰且呈S型扩增，判定待测样品中含有诺如病毒，若诺如病毒对应的扩增曲线不起峰或无明显S型扩增，判定待测样品中不含诺如病毒；若轮状病毒对应的扩增曲线起峰且呈S型扩增，判定待测样品中含有轮状病毒，若轮状病毒对应的扩增曲线不起峰或无明显S型扩增，判定待测样品中不含轮状病毒。
本发明首先提取待测样品的核酸，本发明对提取待测样品的核酸的方法没有特殊限制。在本发明中，所述待测样品优选为粪便；在本发明具体实施过程中，提取待测样品的核酸优选的采用Qiagen粪便核酸提取试剂盒提取。
得到待测样品的核酸，本发明以所述核酸为模板，采用上述方案所述的引物探针组，依次进行RT-RAA扩增和qPCR扩增，收集荧光信号。
在本发明中，所述RT-RAA扩增的反应体系包括280mM的乙酸镁水溶液、模板和RT-RAA反应混合液；所述乙酸镁水溶液、模板和RT-RAA反应混合液的体积比为0.5：1：9，所述RT-RAA反应混合液以40μl计，优选的包括以下组分：反应缓冲液25μl、无核酶水11μl、GII-RAA-F 1μl、GII-RAA-R 1μl、RV-RAA-F 1μl和RV-RAA-R 1μl；单次RT-RAA反应的RT-RAA反应混合液用量优选为9μl；所述RT-RAA扩增的反应程序优选的包括39～42℃、10～12min。在本发明中，所述反应缓冲液以Tris缓冲液为溶剂，优选的的包括以下浓度的组分：Tris缓冲液45mM、醋酸钾80mM、二硫苏糖醇4mM、质量体积浓度为7.28％的聚乙二醇、ATP 5mM、dNTPs0.24mM、磷酸肌酸30μg/U、单链结合蛋白500ng/μL、重组酶400ng/μL、UvsY蛋白70ng/μL、DNA聚合酶90ng/μL和核酸外切酶85ng/μL。
在本发明中，所述qPCR扩增的反应体系以40μl计，优选的包括以下组分：Buffer12.5μl、无核酶水22.2μl、Taq热启动酶0.5μl、dNTP 0.6μl、MgCl21.2μl、GII-F 0.5μl、GII-R 0.5μl、GII-P 0.5μl、RV-F 0.5μl、RV-R 0.5μl和RV-P 0.5μl；所述qPCR扩增的反应程序优选的包括：95℃、3min；95℃、15s，55℃、30s，72℃、30s，30个循环。
在本发明中，所述RT-RAA扩增和qPCR扩增的扩增体系采用正二十二烷进行间隔优选的包括：在qPCR扩增的扩增体系中加入熔融的正二十二烷进行静置，正二十二烷浮于qPCR扩增的扩增体系之上，待所述正二十二烷凝固后，在凝固的正二十二烷上加入RT-RAA扩增的扩增体系。在本发明中，所述静置的程序优选的包括：60℃、1min，4℃、30s。
在本发明中，所述RT-RAA扩增和qPCR扩增优选的于带盖的管内进行；在凝固的正二十二烷上加入RT-RAA扩增的扩增体系优选的包括将除乙酸镁以外的RT-RAA扩增的扩增体系加入到凝固的正十二烷之上，将乙酸镁加到盖内，利用乙酸镁启动RT-RAA反应。
在本发明的一个实施例中，本发明将qPCR扩增的扩增体系分装入八联管中，加入液态的正二十二烷后，其在室温下迅速冷却凝固，浮于PCR体系之上。经过60℃条件下处理1min、4℃条件下处理30s后使正二十二烷重新熔化后均匀凝固在PCR体系上。本发明将RT-RAA扩增的扩增体系分装在凝固后的正二十二烷上层，使得在同一管中实现RT-RAA先反应，随后在第二阶段加热到95℃同时使重组酶酶失活并且正二十二烷熔化后浮于最上层，进而将第一阶段中RT-RAA反应中的大量目标产物与qPCR体系混合，进行下一步的PCR反应并检测。在第一阶段可以在短时间(12min内)对模板进行大量富集，再进行第二阶段的qPCR。整个扩增过程可以在60min以内完成，实现快速扩增。该方法具有超高灵敏度，可达单拷贝/反应，优于传统的的qPCR。本发明的引物探针组还具有高特异性的优势。
收集荧光信号后，若诺如病毒对应的扩增曲线起峰且呈S型扩增，判定待测样品中含有诺如病毒，若诺如病毒对应的扩增曲线不起峰或无明显S型扩增，判定待测样品中不含诺如病毒；若轮状病毒对应的扩增曲线起峰且呈S型扩增，判定待测样品中含有轮状病毒，若轮状病毒对应的扩增曲线不起峰或无明显S型扩增，判定待测样品中不含轮状病毒。
如无特殊说明，本发明对所用原料的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1检测诺如病毒GII型和轮状病毒A组
1.样品来源及核酸提取：
收集了2021年8月～2022年3月来自河北省儿童医院的120份粪便样本和河北省人民医院的15份粪便样本以及本实验室留存的26份诺如GII型阳性核酸，50份轮状病毒A阳性核酸。
所收集粪便样本使用Qiagen粪便核酸提取试剂盒提取核酸，并存放在-80℃直至使用。
共135份粪便标本的核酸，使用卓成惠生诺如病毒GII型核酸检测试剂盒、硕世轮状病毒A组核酸检测试剂盒(荧光PCR法)进行平行检测。
2.利用表1中针对诺如病毒GII、轮状病毒A组的引物探针进行RT-RAP检测。
RAA试剂盒为江苏齐天有限公司的基础法RT-RAA扩增试剂盒，PCR试剂盒为ABclonal公司的Entrans qPCR Probe Set V2试剂盒，扩增仪器为鲲鹏Archimed X6荧光定量PCR仪。按照表3配置扩增体系。将qPCR体系分装入八联管后加入25μl的正二十二烷，置于LongGene A300(60℃1min，4℃30s)，使得正二十二烷均匀浮于qPCR体系之上。RT-RAA反应体系按照表2配置，每个RT-RAA(基础法)反应单元管加入40ul反应体系溶解干粉，将单元管在奇天B6100混匀仪中混匀两次。，取8μl的RT-RAA体系分装到凝固的正二十二烷上，加入1μl的样本核酸。八联管管盖上加入0.5μl的乙酸镁，封闭管盖。在掌上离心机Eastwin瞬时离心，使得乙酸镁掉落至RT-RAA体系，启动RT-RAA反应。放入PCR仪器中，反应程序按照表4进行。
表1.引物和探针信息
1.探针修饰：FAM，6-羧基荧光素；2.BHQ，黑洞淬灭剂；
3.探针修饰：HEX，6-羧基荧光素；4.BHQ，黑洞淬灭剂；(BHQ被添加到内部的T残基，以减少荧光分子和淬灭剂的距离。)
简并碱基:R或者R a＝A or G，B b＝G or C or T，N c＝A or G or C or T，W d＝A orT，Y＝C or T。
表2.RT-RAA(基础法)试剂盒反应体系
| 组分 | 用量(μL) |
| 反应缓冲液 | 25 |
| 双蒸水 | 11 |
| F | 2 |
| R | 2 |
| Total | 40 |
表3.qPCR试剂盒反应体系
表4.反应程序
实施例2腹泻病毒双重RT-RAP的建立
按照表5分别配置RT-RAA反应体系和qPCR反应体系，将qPCR体系分装入八联管后加入25μl的正二十二烷，置于LongGene A300快速梯度PCR仪(60℃1min，4℃30s)，使得正二十二烷均匀浮于qPCR体系之上。每个RT-RAA(基础法)反应单元管加入40ul反应体系溶解干粉，将单元管在奇天B6100混匀仪中混匀两次。取8μl的RT-RAA体系分装到凝固的正二十二烷上，加入2μl的模板。八联管管盖上加入0.5μl的乙酸镁，封闭管盖。在掌上离心机Eastwin瞬时离心，使得乙酸镁掉落至RT-RAA体系，启动RT-RAA反应。放入PCR仪器中，反应程序按照表6进行。
表5：双重RT-RAP反应体系
表6反应程序
实施例3本发明试剂盒灵敏度评价
表7阳性质粒序列
将靶基因序列用pUC57作为载体合成含靶基因的诺如病毒GII型阳性质粒DNA和含靶基因的轮状病毒A阳性质粒DNA(由北京擎科生物有限公司合成)。将阳性质粒按10倍连续浓度梯度稀释，浓度范围为100～105拷贝/μL，将不同浓度的阳性质粒DNA作为模板，进行RAP实验(当扩增模板为RNA时，需进行逆转录过程)。RAA反应体系采用基础法RAA扩增试剂盒。按照表2和3配置体系，RAA引物的终浓度为0.4um/L。图3和图4为用于检测诺如病毒GII型的RAP方法和常规qPCR方法的分析灵敏度(LOD)，其中图3为RAP灵敏度图；图4为qPCR的灵敏度图。由图3和图4所示，采用RAP检测诺如病毒GII型灵敏度为100拷贝/反应，采用常规qPCR方法灵敏度为102拷贝/反应。图5和图6为用于检测轮状病毒A组的RAP方法和常规qPCR方法的分析灵敏度(LOD)，其中图5为RAP灵敏度图；图6为qPCR的灵敏度图。由图5和图6所示，RAP检测轮状病毒A组灵敏度为100拷贝/反应，采用常规qPCR方法灵敏度为102拷贝/反应。
双重RT-RAP灵敏度评价：将阳性质粒按10倍连续浓度梯度稀释，浓度范围为100～105拷贝/μL，将不同浓度的阳性质粒DNA作为模板。按照表5配置反应体系，进行RAP实验。RAA反应体系采用基础法RAA扩增试剂盒。按照表2和3配置体系，等温扩增阶段采用基础法RAA扩增试剂盒。图7为双重RAP阳性质粒灵敏度扩增信号图，其中FAM通道荧光信号用于检测诺如病毒GII型，HEX荧光通道用于检测轮状病毒A组。由图7所示，双重RAP检测诺如病毒GII型灵敏度为102拷贝/反应，检测轮状病毒A灵敏度为101拷贝/反应。
实施例4本发明试剂盒特异性评价
收集了8种腹泻相关病原的样本，包括诺如病毒GI型、星状病毒、杯状病毒、肠道腺病毒、博卡病毒、札如病毒、沙门氏菌、肠毒性大肠埃希菌。用实施例1建立的RT-RAP方法平行鉴定，结果如表8：
表8
N或Na表示阴性结果。
检测结果显示上述实施例1建立的单重用于分别检测诺如病毒GII型和轮状病毒A组的RT-RAP只能特异性检测诺如病毒GII型和轮状病毒A组，并不与其他病原发生交叉反应。
用实施例2建立的双重同时检测诺如病毒GII型和轮状病毒A组的RT-RAP，只能特异性检测诺如病毒GII型和轮状病毒A组，并不与其他病原发生交叉反应。
有上述实施例的结果表明，本发明提供的引物探针组合物制备成的试剂盒，可快速检测诺如病毒GII型和/或轮状病毒A组，灵敏度比普通qPCR高，反应时间大大缩短，特异性好。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.用于诺如病毒和轮状病毒双重RT-RAP检测的引物探针组，包括诺如病毒检测用引物探针组和轮状病毒检测用引物探针组；
所以诺如病毒检测用引物探针组包括：GII-RAA-F、GII-RAA-R、GII-F、GII-R和GII-P；
所述GII-RAA-F、GII-RAA-R、GII-F、GII-R和GII-P的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示；
所述轮状病毒检测用引物探针组包括：RV-RAA-F、RV-RAA-R、RV-F、RV-R和RV-P；
所述RV-RAA-F、RV-RAA-R、RV-F、RV-R和RV-P分别如SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.10所示；
所述GII-P和RV-P分别标记不同的荧光基团。
2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述荧光基团包括FAM、HEX、ROX、TET、JOE、CY3、CY5、TAMRA或VIC。
3.用于诺如病毒和轮状病毒双重RT-RAP检测的的试剂盒，包括权利要求1或2所述的引物探针组、RT-RAA反应用试剂和qPCR反应用试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括正二十二烷。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述qPCR反应用试剂包括无核酶水、Buffer、Taq热启动酶和dNTP；所述RT-RAA反应用试剂包括反应缓冲液、乙酸镁和无核酶水。
6.权利要求1或2所述的RT-RAP检测用引物探针组或权利要求3～5任意一项所述的试剂盒在非诊断目的的诺如病毒和轮状病毒同时检测中的应用。
7.一种非诊断目的的诺如病毒和轮状病毒同时检测的方法，包括以下步骤：
1)提取待测样品的核酸；
2)以所述核酸为模板，采用权利要求1或2所述的引物探针组，依次进行RT-RAA扩增和qPCR扩增，收集荧光信号；所述RT-RAA扩增和qPCR扩增的扩增体系采用正二十二烷进行间隔；
3)若诺如病毒对应的扩增曲线起峰且呈S型扩增，判定待测样品中含有诺如病毒，若诺如病毒对应的扩增曲线不起峰或无明显S型扩增，判定待测样品中不含诺如病毒；若轮状病毒对应的扩增曲线起峰且呈S型扩增，判定待测样品中含有轮状病毒，若轮状病毒对应的扩增曲线不起峰或无明显S型扩增，判定待测样品中不含轮状病毒；
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述RT-RAA扩增的反应体系包括280mM的乙酸镁水溶液、模板和RT-RAA反应混合液；所述乙酸镁水溶液、模板和RT-RAA反应混合液的体积比为0.5：1：9；
所述RT-RAA反应混合液以40μl计，包括以下组分：反应缓冲液25μl、无核酶水11μl、GII-RAA-F1μl、GII-RAA-R1μl、RV-RAA-F1μl和RV-RAA-R1μl；
所述RT-RAA扩增的反应程序包括39～42℃、10～12min；
所述qPCR扩增的反应体系以40μl计，包括以下组分：Buffer12.5μl、无核酶水22.2μl、Taq热启动酶0.5μl、dNTP0.6μl、MgCl21.2μl、GII-F0.5μl、GII-R0.5μl、GII-P0.5μl、RV-F0.5μl、RV-R0.5μl和RV-P0.5μl；
所述qPCR扩增的反应程序包括：95℃、3min；95℃、15s，55℃、30s，72℃、30s，30个循环。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述RT-RAA扩增和qPCR扩增的扩增体系采用正二十二烷进行间隔，包括：在qPCR扩增的扩增体系中加入熔融的正二十二烷进行静置，正二十二烷浮于qPCR扩增的扩增体系之上，待所述正二十二烷凝固后，在凝固的正二十二烷上加入RT-RAA扩增的扩增体系。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述RT-RAA扩增和qPCR扩增于带盖的管内进行；在凝固的正二十二烷上加入RT-RAA扩增的扩增体系包括将除乙酸镁以外的RT-RAA扩增的扩增体系加入到凝固的正十二烷之上，将乙酸镁加到盖内，利用乙酸镁启动RT-RAA反应。
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