CN113136457A - 一种非洲马瘟病毒核酸现场快速提取及检测试剂盒 - Google Patents

一种非洲马瘟病毒核酸现场快速提取及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种非洲马瘟病毒核酸现场快速提取及检测试剂盒，由A盒和B盒组成，A盒含有核酸提取试剂板，核酸层析试纸条和刺针，B盒含有阴性对照、阳性对照、RT‑RPA反应液；所述核酸提取试剂板由预分装的核酸提取试剂组成；所述RT‑RPA反应液由荧光型RT‑RPA核酸扩增试剂、1对引物和1个探针混合而成；所述1对引物和1个探针用于识别AHSV VP7基因。本发明试剂盒可在几分钟内完成非洲马瘟病毒RNA提取，可在20min完成非洲马瘟病毒RNA体外扩增，特异性100％，检测敏感性15copies/μL。本发明试剂盒具有操作简单、快速、灵敏的特点，适用于非洲马瘟的现场快速诊断和大批量样品筛查。

Description

一种非洲马瘟病毒核酸现场快速提取及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种非洲马瘟病毒核酸提取和检测试剂盒，具体地说，涉及一种非洲马瘟病毒便携式现场快速核酸提取和恒温荧光检测试剂盒及其应用方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
非洲马瘟(African horse sickness,AHS)是由非洲马瘟病毒(African horsesickness virus,AHSV)引起单蹄动物的一种急性或亚急性非接触性传染病。AHS主要依靠虫媒介传播，由库蠓类昆虫叮咬在易感动物间传播。AHS对易感马的致死率达到95％，是严重危害养马业和赛马比赛的最重要的疾病之一。鉴于其扩散速度快、无法明确预测爆发地点及其可能造成的严重后果，世界动物卫生组织将其列为A类动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。
1719年首次记载该病的暴发，全球共有41个国家报告疫情，其中非洲国家较多。该病主要流行于非洲南部，曾传播到北非、中东、阿拉伯半岛、西南亚和地中海区域国家。1987～1990年，传播至西班牙、葡萄牙。2020年3月27日，泰国首次向世界动物卫生组织报告发生非洲马瘟疫情。我国尚无非洲马瘟疫情，但边境地区有蓝舌病的流行，两种疾病具有相同的传播媒介，加上国际贸易频繁，AHSV有传入我国的自然条件。目前非洲马瘟没有特效药物，传统上对于非洲马瘟的防治主要以疫苗进行免疫预防和针对病源进行控制为主，面对这种外来动物疫病，做好防控工作、有效进行病原检测显得尤为重要。
AHSV病原学诊断技术可以利用分子探针或者以其VP3和VP7蛋白基因序列为模板设计引物进行RT-PCR，对组织中含有的病毒进行鉴定。间接夹心ELISA也可以快速诊断急性感染死亡动物体内固体组织中AHSV抗原。另外，群特异性试验补体结合试验、直接和间接荧光试验也可以鉴定分离病毒。但是上述方法操作程序复杂、检测耗时较长，需要依赖众多实验设备和专业技术人员完成，在现场快速检测和应急检测应用中存在难度。
近年来，重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplificationassay，RPA assay)在生命科学研究及疾病诊断等相关诸多领域得到了广泛应用。重组酶是从细菌或真菌中提取的活性成分，该酶在常温下(37℃～42℃)可与引物序列紧密结合，形成聚合体。当引物与模板DNA上的互补序列完成匹配时，在单链结合蛋白的帮助下，模板DNA的双链结构被打开，并在DNA聚合酶的作用下，延伸并合成新的DNA互补链。与PCR的高低温交替变温反应不同，RPA在恒温(37℃～42℃)工作，耗能少且气溶胶污染风险降低，5～20min即可完成扩增反应，该技术也被称为是可以替代PCR的新型核酸检测技术。将RPA与荧光探针技术结合，通过检测反应体系中荧光信号的累积，可以实时监测核酸靶标的扩增反应过程。
本发明选取AHSV保守的VP7基因作为靶基因，通过分析VP7基因保守区域，利用RT-RPA技术建立AHSV恒温荧光检测方法，只需20min即可获得检测结果。此外，为进一步实现病毒的现场快速检测，本发明同时开发了一种核酸快速提取方法，不需要使用离心机、移液枪、涡旋仪等实验室专业工具，仅需几分钟即可在现场完成核酸提取。本发明的试剂盒极大的简化操作过程，缩短检测时间，特别适合于AHSV的现场快速检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于AHSV核酸快速提取及检测的试剂盒，利用核酸试纸提取技术和RT-RPA核酸检测技术，可快速、高效的实现AHSV现场检测与疫情诊断。该试剂盒的机理是：以AHSV的VP7基因保守序列为分子标识设计RPA引物和探针，建立RT-RPA恒温荧光检测体系，然后结合核酸层析试纸提取体系，最终组成AHSV核酸现场快速提取及检测试剂盒。
本发明可以通过以下技术方案来实现。
一种非洲马瘟病毒核酸现场快速提取及检测试剂盒，由A盒和B盒组成，A盒含有核酸提取试剂板，核酸层析试纸条和刺针，B盒含有阴性对照、阳性对照、RT-RPA反应液；所述核酸提取试剂板由预分装的核酸提取试剂组成，包括裂解结合液、洗涤液、洗脱液；所述RT-RPA反应液由荧光型RT-RPA核酸扩增试剂、1对引物和1个探针混合而成；所述1对引物和1个探针用于识别AHSV VP7保守基因。A盒用于病毒RNA提取，15-25℃保存；B盒用于RNA的逆转录和扩增反应，-20℃保存。
在一具体实施例中，识别AHSV VP7保守基因的引物及其探针序列如下：
AHSV-HW-F：5’-TTCAGRATGAATGGTGTHGCCRGTAG-3’；
AHSV-HW-R：5’-GTAGGTGTATTCGGTATTGACGTATTACTTA-3’；
AHSV-HW-P：5’-GGTCACCGCTTTCATTAGTGTCGCGTCGGT[FAM-dT][THF][BHQ1-dT]TATGCTGATAAAGTA[C3-Spacer]-3’；
探针部分碱基被THF残基，[FAM-dT]荧光基团和[BHQ1-dT]淬灭基团取代，C3-Spacer为阻断基团。
优选情况下，所述核酸提取试剂板包括一个或多个核酸提取单元，每个核酸提取单元具有基板和封口膜，基板上开设有三个试剂槽；第一试剂槽中预装裂解结合液，第二试剂槽中预装洗涤液，第三试剂槽中预装洗脱液；每个试剂槽周边设有标识条；封口膜用于封装所述三个试剂槽。
优选情况下，所述三个试剂槽的容积都分别为0.2-1.0ml，试剂槽的深度为3-10mm。
优选情况下，第一试剂槽中预装0.1-0.3ml裂解结合液，第二试剂槽中预装0.3-0.6ml洗涤液，第三试剂槽中预装0.05-0.15ml洗脱液。
优选情况下，所述核酸层析试纸条包括手柄区和核酸结合区，核酸结合区含有滤纸或硅胶膜。试纸条整体长4-5cm，宽2-5mm，核酸结合区长3-5mm。
本发明的积极效果是：
1.本发明首次制备了一种现场快速提取非洲马瘟病毒核酸的试剂盒。应用本试剂盒可在现场通过简单手工操作，快速完成非洲马瘟病毒RNA核酸提取，不依赖离心机、移液器、涡旋仪等实验室工具。相对于市场上其他核酸提取试剂，如柱式核酸提取和磁珠核酸提取试剂盒，本试剂盒为非洲马瘟病毒的现场快速检测提供了高效工具。
2.本发明首次制备了一种即时检测非洲马瘟病毒核酸的试剂盒。试剂盒采用恒温荧光核酸检测技术，仅需要20min即可完成RNA核酸的体外扩增和检测。相对于市场上其他核酸检测试剂，如聚合酶链式反应(PCR)和环介导等温扩增(LAMP)检测试剂盒，本试剂盒为非洲马瘟病毒的即时检测提供了高效工具。
3.本试剂盒将传统的核酸提取试剂组分(包括裂解液、结合液、洗涤液、洗脱液)进行简化和预分装，组成核酸提取试剂板(包括裂解结合液、洗涤液、洗脱液)，极大的提高了生产效率更高，使用更为便捷。
4.本试剂盒将核酸检测试剂组分，整合形成RT-RPA反应液(包括荧光型RT-RPA核酸扩增试剂、1对引物和1个探针)，并进行预分装和冻干处理，可在常温运输和保存，取出后可直接添加样品开始检测。相对于市场上其他试剂盒，本试剂盒极大的降低了保存要求和运输成本，试剂盒质量受影响更小，简化了使用操作步骤，方便在临床实践中推广应用。
5.本试剂盒采用39℃反应，相对于PCR的94℃高温变性和LAMP的60℃反应，本试剂盒反应温度更低，耗能少，对仪器设备要求更低。此外，在较低温度下，核酸挥发产生核酸气溶胶的几率更低，核酸检测更安全。
附图说明
图1为本发明中一个实施例的核酸快速提取试剂板的示意图。
图2为本发明中另一个实施例的核酸快速提取试剂板的示意图。
图3为本发明中的核酸层析试纸条的示意图。
图4为本发明试剂盒最低检测限概率回归分析图。
图5为本发明试剂盒恒温荧光扩增法标准曲线。
图6为本发明试剂盒特异性试验结果。
具体实施方式
一种用于非洲马瘟病毒核酸现场快速提取及检测的试剂盒，试剂盒内包括A盒和B盒。A盒内设有核酸提取试剂板，核酸层析试纸条和刺针，B盒内设有阴性对照、阳性对照、RT-RPA反应液。
所述核酸提取试剂板由预分装的核酸提取试剂组成，包括裂解结合液、洗涤液、洗脱液；所述核酸层析试纸条包括手柄区和核酸结合区，核酸结合区含有滤纸或硅胶膜。所述刺针为金属、塑料或PVC材质；所述RT-RPA反应液由荧光型RT-RPA核酸扩增试剂(TwistDx,UK)、1对引物和1个探针混合而成。所述引物和探针用于识别AHSV VP7保守基因。
下述实施例中的实验材料，若没有特殊说明，均是来源于商业途径。所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规实验方法。
一、检测AHSV的引物及探针
检索GenBank上收录的AHSV毒株，共比对19株基因序列(登陆号FJ183371.1,KT187173.1,KT030596.1,KT030606.1,KT007174.1,KM886350.1,KT030616.1,KP009787.1,KT030626.1,KT030646.1,KT030566.1,KT030656.1,KT715637.1,KF860042.1,KT030406.1,MT586218.1,KF860002.1,KT030366.1,KM886361.1)，包含AHSV的9个血清型。选择登录号KT030366.1的病毒基因序列作为靶序列，选择VP7基因为靶基因。依据RPA技术原则，设计特异性引物和探针，其核苷酸序列如表1所示。
表1引物和探针序列信息
Figure BDA0003046930600000051
上述引物和探针由北京六合华大基因科技有限公司合成提供。
二、试剂盒内各组分的来源和制备过程
2.1核酸提取试剂板的制备
配置裂解结合液、洗涤液、洗脱液：
裂解结合液的制备：异硫氰酸胍236.25g，250mmol/L柠檬酸钠(pH7.0)50mL，加DEPC水至500mL；加入0.2mmol/L NaCl(pH 4.5)50ml，氯仿100mL，b-硫基乙醇3.5mL，混匀，分装50mL/瓶，每瓶加入50ml无水乙醇，置15～25℃保存。
洗涤液的制备：用DEPC水配置20mL混合溶液(10mmol/L Tris·Cl pH7.5，100mmol/L NaCl)，用无水乙醇稀释至120ml。搅拌均匀，置15～25℃保存。
洗脱液的制备：取1mL焦炭酸二乙酯加入装有500mL去离子水的瓶中，混匀，高压灭菌121℃，25min，分装，10mL/瓶，置15～25℃保存。
参见图1，本发明采用的核酸提取试剂板包括基板1和封口膜(图中未示出)，基板1上开设有三个试剂槽(或试剂孔)；第一试剂槽2中预装裂解结合液，第二试剂槽3中预装洗涤液，第三试剂槽4中预装洗脱液；每个试剂槽周边设有标识条5。封口膜可以采用铝箔，用于封装所述三个试剂槽。
具体情况下，所述三个试剂槽的容积都分别为0.2-1.0ml，试剂槽的深度(高度)为0.3-1.0cm。优选情况下，所述三个试剂槽的容积都分别为0.5-0.8ml。第一试剂槽2中预装0.1-0.3ml裂解结合液，第二试剂槽3中预装0.3-0.6ml洗涤液，第三试剂槽4中预装0.05-0.15ml洗脱液。
具体情况下，每个试剂槽呈圆柱形，直径为0.5-1.0cm。
参见图2，在另一实施例中，所述试剂板由多组基板1上下或左右组合而成，相邻基板1之间设有弱化线6，在具体使用过程中，可以撕开或用剪刀剪开。
2.2核酸层析试纸条的制备
参见图3，所述核酸层析试纸条由上端的手柄区7和下端的核酸结合区8组成，核酸结合区8由滤纸或硅胶膜形成，手柄区7通过蜡封、胶封或塑封处理。试纸条整体长4-5cm，宽2-5mm，核酸结合区长3-5mm。
2.3阴性对照的制备
量取1ml焦炭酸二乙酯迅速加入装有1000ml去离子水的瓶中，混匀。高压灭菌121℃，25min，分装100μL/瓶，置15-25℃保存。
2.4阳性对照的制备
参考GeneBank中收录的AHSV毒株序列，登录号KT030366，由北京六合华大基因科技有限公司合成VP7基因并提供pUC57-VP7重组质粒，用无RNase水稀释至2×106copies/μL，分装100μL/瓶，冻干处理，置15-25℃保存。
2.5RT-RPA反应液
量取38.5mL荧光型RT-RPA核酸扩增试剂(包括29.5mL rehydration buffer,0.5mL RNase inhibitor,8.5mL nuclease-free H2O)，加入无RNase的容量为100mL试剂瓶中。将上下游引物和探针稀释浓度至20μM，取上下游引物各1.5mL、探针1mL加入混合溶液中，混匀，分装至200μL PCR管中，42.5μL/管，冻干处理，置15-25℃保存。
三、测试过程和原理
3.1测试过程
3.1.1病毒RNA提取
抗凝血、血清和细胞组织等材料直接提取RNA。取铝箔密封的核酸提取试剂板，用刺针依次暴露裂解结合液、洗涤液、洗脱液孔位。在含有裂解结合液的孔中加入样品液60μL，轻轻摇动混匀，室温静置2min；用核酸层析试纸条，将核酸结合区一端浸入裂解结合液中30s；然后将试纸转移到洗涤液孔，轻轻摇动洗涤30s；最后将试纸转移到洗脱液孔，轻轻摇动洗脱30s，样品RNA即溶解于洗脱液中。
3.1.2 RT-RPA
取出RT-RPA反应液，在室温融化后，瞬离，分别向反应液中加入5μL样本RNA或阴性对照或阳性对照，然后在反应管管盖内加入2.5uL 280mM醋酸镁溶液，盖上盖子充分混匀，瞬时离心后转移到等温荧光PCR仪检测，设置反应程序为：39℃，采光间隔30s，反应时间20min，收集荧光信号，荧光通道选择FAM通道。记录每个样品反应管内的荧光信号累积达到设定的阈值时所经历的时间(Threshold Time)即为TT值。
3.1.3结果判定
质量控制：反应结束后，阳性对照有典型的扩增曲线出现，出峰时间小于15min；阴性对照无扩增曲线出现，或出峰时间≥20min，否则实验视为无效；样品判定：出峰时间≤17.5min，判断为阳性；出峰时间≥20min，判断为阴性；17.5min<出峰时间<20min，复检一次，重复结果为阳性者判定为阳性，否则判定为阴性。
3.2试剂盒敏感性试验
采用非洲马瘟病毒恒温荧光扩增方法对10倍梯度稀释的重组质粒pUC57-VP7(103copies/μL、102copies/μL、10copies/μL、1copies/μL)进行检测，每个样品重复3次，以100％可检出的最低浓度水平作为估计检测限。同时使用OIE中荧光RT-PCR方法检测。恒温荧光扩增方法的结果为103copies/μl、102copies/μl、10copies/μl的检出率为100％，1copies/μL未检出，因此以10copies/μL作为估计检测限(表2)；OIE中荧光RT-PCR方法103copies/μL、102copies/μL、10copies/μL均能检出，1copies/μL未检出；两种检测方法结果一致。
表2估计检测限试验结果
Figure BDA0003046930600000071
Figure BDA0003046930600000081
注：“Unde”表示未检出信号，“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性。
在估计检测限10copies/μL的浓度附近制备15copies/μL、5copies/μL、1copies/μL梯度浓度样品，每个浓度重复检测20次，结果显示15copies/μL的检出率分别为100％、10copies/μL的检出率为90％；5copies/μL的检出率为70％，1copies/μL未检出，因此将15copies/μL的浓度样品确定为最低检测限(表3)。概率回归分析，在95％的置信区间内分析敏感性为12.38copies/μL(图4)。以重组质粒不同浓度拷贝数的对数值为横坐标，TT值为纵坐标，获得线性回归方程。结果显示线性回归方程为y＝-2.9778x+15.309R2＝0.8667，梯度稀释的重组质粒与TT值线性关系较好(图5)。
表3最低检测限试验结果
Figure BDA0003046930600000082
Figure BDA0003046930600000091
注：“Unde”表示未检出信号，“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性。
综上，用本发明试剂盒检测稀释样本，灵敏度可以达到15copies/μL。
3.3试剂盒特异性试验
试剂盒具有良好的特异性，采用非洲马瘟病毒恒温荧光扩增方法对马健康组织核酸基因组和空质粒载体pUC57进行检测，结果显示为阴性，而重组质粒pUC57-AHSV-VP7的检测结果为阳性(图6)。
3.4试剂盒重复性试验
对不同浓度梯度的重组质粒pUC57-VP7(103copies/μL、102copies/μL、10copies/μL)进行检测，每个梯度重复5次，并计算其变异系数。结果显示，4个梯度样品的变异系数为5.36％～6.84％，说明该检测方法的重复性和稳定性良好(表4)。
表4重复性试验结果
Figure BDA0003046930600000092
四、试剂盒组装
将各试剂组装成试剂盒，按表5取各组份粘贴内包装标签，组装试剂盒。
表5试剂盒组份
Figure BDA0003046930600000093
Figure BDA0003046930600000101
将组装好的试剂盒A盒和B盒置于15-25℃保存，间隔2个月测定其敏感性和特异性，以确定试剂盒的保存期。本发明的试剂盒保值期为12个月。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种非洲马瘟病毒核酸现场快速提取及检测试剂盒，由A盒和B盒组成，A盒含有核酸提取试剂板，核酸层析试纸条和刺针，B盒含有阴性对照、阳性对照、RT-RPA反应液；所述核酸提取试剂板由预分装的核酸提取试剂组成，包括裂解结合液、洗涤液、洗脱液；所述RT-RPA反应液由荧光型RT-RPA核酸扩增试剂、1对引物和1个探针混合而成；所述1对引物和1个探针用于识别AHSV VP7保守基因。
2.根据权利要求1所述的非洲马瘟病毒核酸现场快速提取及检测试剂盒，所述1对引物和1个探针的序列如下：
AHSV-HW-F：5’-TTCAGRATGAATGGTGTHGCCRGTAG-3’；
AHSV-HW-R：5’-GTAGGTGTATTCGGTATTGACGTATTACTTA-3’；
AHSV-HW-P：5’-GGTCACCGCTTTCATTAGTGTCGCGTCGGT[FAM-dT][THF][BHQ1-dT]TATGCTGATAAAGTA[C3-Spacer]-3’；
探针部分碱基被THF残基，[FAM-dT]荧光基团和[BHQ1-dT]淬灭基团取代，C3-Spacer为阻断基团。
3.根据权利要求1所述的非洲马瘟病毒核酸现场快速提取及检测试剂盒，所述核酸提取试剂板包括一个或多个核酸提取单元，每个核酸提取单元具有基板和封口膜，基板上开设有三个试剂槽；第一试剂槽中预装裂解结合液，第二试剂槽中预装洗涤液，第三试剂槽中预装洗脱液；每个试剂槽周边设有标识条；封口膜用于封装所述三个试剂槽。
4.根据权利要求3所述的非洲马瘟病毒核酸现场快速提取及检测试剂盒，第一试剂槽中预装0.1-0.3ml裂解结合液，第二试剂槽中预装0.3-0.6ml洗涤液，第三试剂槽中预装0.05-0.15ml洗脱液。
5.根据权利要求1所述的非洲马瘟病毒核酸现场快速提取及检测试剂盒，所述核酸层析试纸条包括手柄区和核酸结合区，核酸结合区含有滤纸或硅胶膜。
6.根据权利要求5所述的非洲马瘟病毒核酸现场快速提取及检测试剂盒，试纸条整体长4-5cm，宽2-5mm，核酸结合区长3-5mm。
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