CN109735657A - 一种用于非洲猪瘟病毒检测的试剂、检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种用于非洲猪瘟病毒检测的试剂、检测方法及应用。本申请的非洲猪瘟病毒检测试剂，包括特异性引物对和探针，引物对的上下游引物分别为Seq ID No.1和2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列或其反向互补序列；SEQ ID No.3所示探针序列中，第28碱基修饰荧光淬灭基团‑dT，第31碱基替换为碱基类似物，第33碱基修饰荧光基团‑dT，3’末端修饰C3 Spacer。本申请的试剂，通过重组酶聚合酶扩增对非洲猪瘟病毒进行敏感、特异、高效检测；与现有常规或实时荧光PCR相比，本申请试剂和检测方法，检测时间短，操作简便，特别适于现场检测，对非洲猪瘟病毒快速防控，保障生产安全具有重大意义。

Description

一种用于非洲猪瘟病毒检测的试剂、检测方法及应用

技术领域

本申请涉及非洲猪瘟病毒检测领域，特别是涉及一种用于非洲猪瘟病毒检测的试剂、检测方法及应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASF virus，ASFV)感染引起的猪的一种急性、烈性、高度传染性疾病，以高热、网状内皮系统出血和高死亡率为特征。ASFV超强毒株感染可导致猪在12～14天内100％死亡，中等毒力毒株感染猪的死亡率一般为30％～50％，对养猪业危害巨大。世界动物卫生组织(OIE)将非洲猪瘟列为重要动物传染病，我国农业农村部将其列为一类动物疫病。

ASFV是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)的唯一成员，是一种具有二十面体形态的有包膜的双链DNA病毒，平均直径约为200nm，不同分离株的基因组长度在170-190kb之间变化，具有共价的闭合末端、反转重复区和发夹结构。ASFV是目前唯一已知核酸为DNA的虫媒病毒，只有一个血清型，可分为22个基因型。病毒粒子的主要结构组分，如p72、p24、p12、p17和p37等分别参与病毒吸附、侵入宿主靶细胞、参与病毒复制、调节宿主功能、参与早期mRNA的合成与加工、参与病毒形态形成等功能。P72蛋白是ASFV的主要结构蛋白，由基因B646L编码，该基因高度保守，是病毒检测中最常用的靶基因。

ASF最早发生于肯尼亚，随后逐渐在非洲、美洲和欧洲的多个国家流行，近十年来，全球已有四十多个国家报告发生ASF疫情。2018年非洲猪瘟疫情在全球比较活跃，全球共有俄罗斯、罗马尼亚、波兰等22个国家报告发生5900多起疫情。2018年8月3日，辽宁省沈阳市沈北新区发生一起生猪非洲猪瘟疫情，这是我国首次发生非洲猪瘟疫情。截至2019年1月10日，全国共有23个省份72市县发生近百起非洲猪瘟疫情，因非洲猪瘟疫情累计扑杀生猪八十多万头。由于目前尚无有效的治疗方法或疫苗来预防ASF，一旦发生疫情很难根除和净化，只能通过执行严格的卫生防疫措施，扑杀染疫动物控制疫情蔓延。我国既是养猪大国，也是猪肉消费大国，猪肉年消费量超过5000万吨，非洲猪瘟疫情的防控成效对我国社会和谐稳定及养猪业的发展至关重要。当前我国非洲猪瘟疫情处于点状散发状态，且发生势头开始减缓，疫情总体可控。但同时，传统养殖结构难以短时间内根本改变，疫情传播途径错综复杂，防控形势仍然复杂严峻，快速高效的现场检测对非洲猪瘟疫情防控具有重要意义。

发明内容

本申请的目的是提供一种用于非洲猪瘟病毒检测的试剂、检测方法及其应用。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种用于非洲猪瘟病毒检测的试剂，该试剂包括用于重组酶聚合酶扩增的非洲猪瘟病毒特异性引物对和探针，探针在引物对的扩增靶标区域内，引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，下游引物为Seq ID No.2所示序列，探针为SeqID No.3所示序列或者Seq ID No.3所示序列的反向互补序列；

Seq ID No.1：5’-TATTGTGAGAGTTCTCGGGAAAATGTTGTG-3’

Seq ID No.2：5’-CATTCATGATTTGCACAAGCCGCACCAAAGC-3’

Seq ID No.3：

5’-GGAATTTCGGGTTGGTATGGCTGCACGTTCGCTGCGTATCATTTTCAT-3’

其中，SEQ ID No.3所示的探针序列中，第28个碱基修饰荧光淬灭基团-dT，第31个碱基替换为碱基类似物，第33个碱基修饰荧光基团-dT，3’末端修饰C3Spacer。

需要说明的是，本申请的试剂中，引物对和探针是针对非洲猪瘟病毒设计的，是特别用于重组酶聚合酶扩增的引物和探针。重组酶聚合酶扩增，缩写RPA，是英国TwistDx公司开发的一种新型的核酸等温扩增技术；该技术的关键之一是设计合适的扩增引物对和探针。但是，常规PCR引物对和探针并不适合RPA；常规PCR的引物相对太短、重组效率低；常规的探针系统，与RPA也不兼容。因此，无法通过常规的引物或探针设计软件直接输出适用于RPA的引物对和探针。目前设计RPA引物对和探针，主要根据TwistDx公司网站上提供的筛选指南，人工设计多条特异性引物和探针进行试验筛选，以获得扩增效率高、灵敏度高、特异性强的引物和探针。本申请的一种实现方式中，分别设计了2条RPA探针，并针对每条探针分别设计了3条上游引物和3条下游引物，用于试验筛选，最终筛选出Seq ID No.1所示序列和Seq ID No.2所示序列的引物对，以及SEQ ID No.3所示序列的探针，作为本申请的非洲猪瘟病毒检测试剂。

还需要说明的是，RPA的原理是采用三个酶，在恒温下使一对引物对靶标进行指数扩增；本申请的试剂中，考虑到通过荧光检测的方式对RPA扩增产物进行检测，因此，在一对特异性引物的基础上提供了相应的特异性探针。可以理解，RPA扩增产物也可以采用其它方式，例如侧流层析试纸条、生物芯片、凝胶电泳等进行检测；因此，如果不采用荧光检测，则可以不使用SEQ ID No.3所示序列的探针。也就是说，本申请的试剂中，可以单独使用SeqID No.1和Seq ID No.2所示序列的引物，也可以与探针一起使用，具体使用方式可以根据检测条件和环境选择。本申请的一种实现方式中，由于采用便携式的常温等温扩增荧光检测仪，优选的将引物和探针一起使用，通过荧光法对RPA扩增产物进行检测。

优选的，荧光淬灭基团-dT为BHQ1-dT。

优选的，碱基类似物为dSpacer。

优选的，荧光基团-dT为6-FAM-dT。

需要说明的是，根据探针的设计原则，只需要在碱基类似物的两端分别修饰荧光基团和荧光淬灭基团即可，本申请的优选方案中，优选的使用FAM荧光基团和BHQ1荧光淬灭基团。可以理解，荧光基团的选择是根据所使用的荧光检测仪的荧光通道进行的，不同的荧光检测仪具有检测一种或多种荧光基团的通道，例如FAM、TET、JOE、HEX、CY3、CY5等；而荧光淬灭基团则是根据荧光基团进行选择的，荧光淬灭基团的吸收光谱只要能够覆盖荧光基团的发射光谱即可，不只限于BHQ1。

优选的，本申请的用于非洲猪瘟病毒检测的试剂还包括用于重组酶聚合酶扩增的反应液、酶和反应添加剂。

需要说明的是，本申请的试剂，是特别针对非洲猪瘟病毒的重组酶聚合酶扩增检测设计的，因此，为了使用方便，试剂中完全可以进一步的包括用于重组酶聚合酶扩增的反应液、酶和反应添加剂。其中，反应液在本申请的一种实现方式中为RehydrationBuffer，酶可以是混合有多种酶的RPA冻干酶粉，反应添加剂在本申请的一种实现方式中采用的是MgAc。

本申请的另一面公开了本申请的用于非洲猪瘟病毒检测的试剂在非洲猪瘟病毒检测中的应用。

本申请的另一面公开了本申请的用于非洲猪瘟病毒检测的试剂在制备非洲猪瘟病毒检测试剂盒或设备中的应用。

本申请的再一面公开了一种用于非洲猪瘟病毒检测的试剂盒，该试剂盒中含有本申请的用于非洲猪瘟病毒检测的试剂。

本申请的再一面公开了一种非洲猪瘟病毒的检测方法，包括采用本申请的用于非洲猪瘟病毒检测的试剂，对待测样品的核酸进行重组酶聚合酶扩增检测，并采用荧光检测仪收集荧光。

需要说明的是，本申请的检测方法，通过重组酶聚合酶扩增对非洲猪瘟病毒进行快速检测，一方面，重组酶聚合酶扩增检测速度快，只需要十几二十分钟就可以完成检测；另一方面，整个检测只需要在相对较低的恒温下就可以完成，例如采用便携式的常温等温扩增荧光检测仪即可。因此，本申请检测方法特别适合于非洲猪瘟病毒的现场快速检测，为疫病的快速检测和防控提供有力的科学依据。

优选的，重组酶聚合酶扩增的反应条件为，40℃恒温反应15分钟。

需要说明的是，RPA所采用的酶的活性最适合温度范围为37℃-42℃，RPA通常二十分钟内就可以完成检测；本申请优选的方案中，引物探针扩增效率较高，优选在40℃恒温反应15分钟。

本申请的有益效果在于：

本申请用于非洲猪瘟病毒检测的试剂，能够通过重组酶聚合酶扩增，对非洲猪瘟病毒进行敏感、特异、高效的检测。采用本申请的试剂进行非洲猪瘟病毒检测，与现有的常规PCR或实时荧光PCR方法相比，本申请的试剂和检测方法，检测时间短，且操作简单方便，可很快做出结果判定，特别适用于现场检测，这对于非洲猪瘟病毒的快速防控，防止疫情传播，最大限度的保障生产安全具有重大意义。

附图说明

图1是本申请实施例中非洲猪瘟病毒特异性检测结果；

图2是本申请实施例中非洲猪瘟病毒灵敏度检测结果；

图3是本申请实施例中OIE推荐的实时荧光PCR法的灵敏度检测结果；

图4是本申请实施例中非洲猪瘟病毒重复性检测结果。

具体实施方式

近年来，多种恒温核酸扩增技术的出现解决了传统PCR技术成本高、耗时长、依赖精密温度循环仪器等局限。其中，重组酶聚合酶扩增技术(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)是一种新型的等温核酸扩增技术，被视为“最可能替代传统PCR”的恒温扩增技术。RPA技术主要依赖三种酶：单链DNA结合蛋白(Single-strandedDNABingding，SSB)、重组酶、链置换DNA聚合酶。该技术原理是在恒温下，重组酶与引物结合形成复合体，酶促使引物定位到DNA双链模板的同源靶序列上，并在单链DNA结合蛋白的协助下，解链模板DNA，随后在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，循环进行从而实现DNA的指数增长，反应体系中增加反转录酶则可以对RNA模板进行一步法快速扩增。RPA最佳反应温度范围是37℃至42℃，反应时间少于二十分钟。结合荧光探针使用的实时RPA检测技术，可在便携式恒温扩增荧光检测仪中实现检测结果的直接读取，极大简化了反应程序，检测时间和便利性优于传统PCR法，非常适用于设备简配的基层或现场实验室，在动物疫病检测方面具有广泛的应用前景，因此，本申请研发了用于非洲猪瘟病毒快速检测的试剂。

需要说明的是，现有的非洲猪瘟病毒快速检测方法中，虽然也有类似的研究，但是，受限于其检测靶标以及引物和探针的设计，灵敏度较低，不能很好的满足实际检测需求。随着非洲猪瘟疫情的发展，为了更好的快速防控非洲猪瘟病毒的传播和扩散，更有效的保障养殖生产安全，有必要研发灵敏度更高的检测方法或试剂。基于此，本申请一种用于非洲猪瘟病毒检测的试剂，该试剂包括用于重组酶聚合酶扩增的非洲猪瘟病毒特异性引物对和探针，探针在引物对的扩增靶标区域内，引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，下游引物为Seq ID No.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列或者Seq ID No.3所示序列的反向互补序列；其中，SEQ ID No.3所示的探针序列中，第28个碱基修饰荧光淬灭基团-dT，第31个碱基替换为碱基类似物，第33个碱基修饰荧光基团-dT，3’末端修饰C3Spacer。

本申请的非洲猪瘟病毒检测试剂，在本申请的一种实现方式中，其灵敏度可以达到2×10¹copies/μL，比现有的已报道类似方法灵敏度高至少10倍，能够更好的对非洲猪瘟疫情进行防控，防止疫情传播，从而更有效的保障养殖生产安全。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

一、材料与方法

1.供试核酸

本例根据NCBI GenBank中公布的非洲猪瘟病毒主要结构蛋白基因B646L基因(p72基因)，送生工生物工程(上海)股份有限公司合成该基因片段并克隆到pMD19-T载体中，命名为ASFV-p72。其它核酸模板：猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)、猪圆环病毒II型(PCV2)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪A型塞内卡病毒(SVA)等均为灭活病毒核酸。

2.主要的试剂和仪器

TwistAmp exo kit为英国TwistDx公司产品，BioDrop超微量核酸蛋白浓度分析仪，Axxin恒温扩增仪，Eppendorf5415R型高速离心机等。

3.RPA引物和探针的设计与筛选

本例根据非洲猪瘟病毒因组中序列保守稳定的B646L基因(p72蛋白基因)序列，设计了多条特异性的引物和探针，设计好引物和探针后，通过BLAST比对确定其特异性，然后再用于后续试验筛选，引物和探针具体序列如表1所示。本例所有的引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1重组酶聚合酶扩引物和探针

表1中，SEQ ID No.3所示序列的ASFV exo-probe2探针中，第28个碱基修饰荧光淬灭基团-dT，第31个碱基替换为碱基类似物，第33个碱基修饰荧光基团-dT，3’末端修饰C3Spacer。SEQ ID No.4所示序列的ASFV exo-probe1探针中，第28个碱基修饰荧光淬灭基团-dT，第31个碱基替换为碱基类似物，第33个碱基修饰荧光基团-dT，3’末端修饰C3Spacer。

4.反应体系和反应条件

本例采用TwistAmp exo Kit试剂盒进行RPA扩增。

反应体系为50μL。将RehydrationBuffer 29.5μL、两条浓度为10μM的引物各2.1μL、浓度为10μM的探针0.6μL、DEPC水10.7μL、核酸模板2.5μL混合均匀后加入到RPA冻干酶粉的反应管中，混匀，最后加入浓度为280mM的MgAc溶液2.5μL，混匀。将上述反应管置于Axxin恒温扩增仪中，40℃反应4分钟，取出混合，再继续反应11分钟，反应过程中实时读取荧光信号。

其中，两条浓度为10μM的引物是指上游引物和下游引物。

5.引物和探针筛选

在筛选的过程中，先采用其中一条上游引物，对下游引物进行筛选，然后再根据筛选出来的下游引物，再去筛选上游引物，以获得最佳的非洲猪瘟病毒检测用引物探针组合。引物和探针筛选采用“4.反应体系和反应条件”。

6.特异性试验

采用筛选的引物和探针组合，按“4.反应体系和反应条件”，对ASFVp72、CSFV、PRRSV、PCV2、FMDV、SVA等核酸模板进行检测。并设置一个阴性对照和一个空白水对照。

7.灵敏度试验

本例将ASFV p72按10倍梯度稀释至10^-8，采用各梯度浓度的稀释核酸模板，按“4.反应体系和反应条件”进行RPA试验，试验中设置一个水空白对照，以测试引物探针的灵敏度。

同时，与OIE推荐的实时荧光PCR法进行比较，即采用相同的稀释核酸模板，按照OIE推荐的实时荧光PCR法对各稀释核酸模板进行检测。

8.重复性试验

采用10^-2、10^-3稀释浓度的核酸为模板，按“4.反应体系和反应条件”进行RPA试验，重复检测三次分析其稳定性。

9.临床样品的检测

采用本例筛选出的引物和探针，对深圳口岸200份进口冻猪产品及供港猪场420份猪抗凝血按照“4.反应体系和反应条件”进行检测，同时用OIE推荐的实时荧光PCR法进行检测。所有样品均由深圳海关动植中心提供和保藏。

二、结果和分析

1.引物和探针筛选

经过筛选，本例最终从表1的引物探针中，筛选出Seq ID No.1所示序列的上游引物ASFVprobe2-F1、Seq ID No.2所示序列的下游引物ASFVprobe2-R1和Seq ID No.3所示序列的探针ASFV exo-probe2，该引物和探针组合可用于对非洲猪瘟病毒进行特异性检测。

根据筛选结果可见，即使是相同的探针，不同的上游和下游引物组合，对重组酶聚合酶扩增的扩增效率、特异性和灵敏度都有影响。

2.特异性试验结果

特异性检测结果如图1所示，图中，曲线1为ASFVp72的检测结果、曲线2-8分别为CSFV、PRRSV、PCV2、FMDV、SVA、阴性对照和水空白对照的检测结果。可见，仅ASFV有荧光曲线，呈阳性；而其它病原核酸和空白水对照都没有荧光曲线，呈阴性。因此，本例的引物和探针能对ASFV进行特异性检测，与CSFV、PRRSV、PCV2、FMDV、SVA灭活病毒核酸无交叉反应，具有良好的特异性。

3.灵敏度试验结果

(1)本例RPA试剂和方法的灵敏度

灵敏度检测结果如图2所示，图2中，曲线1至曲线6依序为ASFVp72稀释度为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的扩增曲线，曲线7至曲线9依序为10^-7、10^-8以及水空白对照的扩增曲线。由检测结果可知，本例中RPA最低可以检测到ASFVp7210^-6稀释度。测得ASFVp72DNA的原始浓度为0.105μg/mL，拷贝数为2×10⁷copies/μl，10^-6稀释度对应的质粒浓度为2×10¹copies/μL。相对于现有已报到的与本例类似的方法，其灵敏度仅为10²copies/μL；本例RPA试剂和方法的灵敏度比现有类似方法高一个数量级，能够更灵敏有效的检出非洲猪瘟病毒。

(2)OIE推荐的实时荧光PCR法的灵敏度

对相同的稀释核酸模板，使用OIE推荐的实时荧光PCR法进行灵敏度检测，检测结果如图3所示，图3中，曲线1至曲线7依序为ASFVp72稀释度为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7的扩增曲线，曲线8、曲线9分别为10^-8以及水空白对照的扩增曲线。检测结果可见，OIE推荐的实时荧光PCR法的灵敏度为10^-7稀释度，对应的质粒浓度为2×100copies/μL。

可见，本例的非洲猪瘟病毒检测引物、探针和检测方法具有较高的灵敏度；并且，相对于目前常规使用的OIE推荐的实时荧光PCR检测方法，本例的ASFV RPA检测方法，检测时间短，不需要大型仪器设备，大大缩短了检测时间，提升了检测效率。

4.重复性试验结果

重复性检测结果如图4所示，图中，曲线1至曲线3为10^-2稀释的ASFVp72扩增曲线，曲线4至曲线6为10^-3稀释的ASFVp72扩增曲线，曲线7为水空白对照的扩增曲线。可见曲线1至曲线3检测结果一致，曲线4至曲线6检测结果一致，在相同位置均可观察到相对应的荧光曲线，说明本例RPA方法重复性良好。

5.临床样品的检测

临床样品检测结果显示，采用本例的引物和探针，200份进口冻猪产品及供港猪场420份猪抗凝血均无扩增曲线出现，检测结果为阴性，与OIE推荐的实时荧光PCR法检测结果相同。

本例的非洲猪瘟病毒检测方法和试剂，检测时间短，反应条件简单且无需大型仪器设备，大大提升了检测效率。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心

<120> 一种用于非洲猪瘟病毒检测的试剂、检测方法及应用

<130> 19I27818

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tattgtgaga gttctcggga aaatgttgtg 30

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cattcatgat ttgcacaagc cgcaccaaag c 31

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggaatttcgg gttggtatgg ctgcacgttc gctgcgtatc attttcat 48

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tctcgggaaa atgttgtgaa aggaatttcg ggttggtatg gctgca 46

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttgtttacct gctgtttgga tattgtgaga g 31

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cttgtttacc tgctgtttgg atattgtgag 30

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tatcttgttt acctgctgtt tggatattgt g 31

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

caagccgcac caaagcaaac ctattcttac cg 32

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cattcatgat ttgcacaagc cgcaccaaag c 31

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctagtggccc tctcctatgc aacattcatg atttg 35

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tggatattgt gagagttctc gggaaaatgt tg 32

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ttggatattg tgagagttct cgggaaaatg ttgtg 35

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cttgtgcaaa tcatgaatgt tgcataggag agggc 35

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tcggccagga ggtatcggtg gagggaacta gtggc 35

Claims (10)

1.一种用于非洲猪瘟病毒检测的试剂，其特征在于：所述试剂包括用于重组酶聚合酶扩增的非洲猪瘟病毒特异性引物对和探针，所述探针在引物对的扩增靶标区域内，所述引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，下游引物为Seq ID No.2所示序列，所述探针为Seq ID No.3所示序列或者Seq ID No.3所示序列的反向互补序列；

Seq ID No.1：5’-TATTGTGAGAGTTCTCGGGAAAATGTTGTG-3’

Seq ID No.2：5’-CATTCATGATTTGCACAAGCCGCACCAAAGC-3’

Seq ID No.3：

5’-GGAATTTCGGGTTGGTATGGCTGCACGTTCGCTGCGTATCATTTTCAT-3’其中，SEQ ID No.3所示的探针序列中，第28个碱基修饰荧光淬灭基团-dT，第31个碱基替换为碱基类似物，第33个碱基修饰荧光基团-dT，3’末端修饰C3Spacer。

2.根据权利要求1所述的用于非洲猪瘟病毒检测的试剂，其特征在于：所述荧光淬灭基团-dT为BHQ1-dT。

3.根据权利要求1所述的用于非洲猪瘟病毒检测的试剂，其特征在于：所述碱基类似物为dSpacer。

4.根据权利要求1所述的用于非洲猪瘟病毒检测的试剂，其特征在于：所述荧光基团-dT为6-FAM-dT。

5.根据权利要求1-4任一项所述的用于非洲猪瘟病毒检测的试剂，其特征在于：还包括用于重组酶聚合酶扩增的反应液、酶和反应添加剂。

6.根据权利要求1-5任一项所述的用于非洲猪瘟病毒检测的试剂在非洲猪瘟病毒检测中的应用。

7.根据权利要求1-5任一项所述的用于非洲猪瘟病毒检测的试剂在制备非洲猪瘟病毒检测试剂盒或设备中的应用。

8.一种用于非洲猪瘟病毒检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1-5任一项所述的用于非洲猪瘟病毒检测的试剂。

9.一种非洲猪瘟病毒的检测方法，其特征在于：包括采用权利要求1-5任一项所述的用于非洲猪瘟病毒检测的试剂，对待测样品的核酸进行重组酶聚合酶扩增检测，并采用荧光检测仪收集荧光。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：所述重组酶聚合酶扩增的反应条件为，40℃恒温反应15分钟。