CN110453012A

CN110453012A - 一种raa荧光法检测非洲猪瘟病毒24个基因型通用引物、探针及检测方法

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Publication number: CN110453012A
Application number: CN201910717729.3A
Authority: CN
Inventors: 应清界; 吴晓东; 樊晓旭; 李林; 郭利川; 蔡禹希; 王智宏
Original assignee: CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER; Jiangsu Qitian Gene Biological Science & Technology Co Ltd
Current assignee: CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER; Jiangsu Qitian Gene Biological Science & Technology Co Ltd
Priority date: 2019-08-05
Filing date: 2019-08-05
Publication date: 2019-11-15
Anticipated expiration: 2039-08-05
Also published as: CN110453012B

Abstract

本发明公开了一种RAA荧光法检测非洲猪瘟病毒24个基因型通用引物、探针及检测方法，属于分子生物学技术领域。本发明的引物和探针适用于RAA荧光法检测，并且能够准确地检测出24个基因型非洲猪瘟病毒DNA，与猪瘟病毒、猪丹毒病毒、蓝耳病毒、伪狂犬病毒无交叉反应，特异性达100％；检测方法快速、容易实现高通量，同时降低了检测时间和检测成本，本发明提供的基于RAA荧光法快速检测24个基因型非洲猪瘟病毒DNA的检测方法，灵敏度高，检测灵敏度达到10Copies/反应。

Description

一种RAA荧光法检测非洲猪瘟病毒24个基因型通用引物、探针及检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地说是涉及一种RAA荧光法检测非洲猪瘟病毒24个基因型的通用引物、探针及检测方法。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触传染性疾病。非洲猪瘟病毒为双链DNA病毒，类非洲猪瘟病毒属的唯一代表种。ASF传播快、致死率高，对养猪业危害巨大，是我国一类动物疫病和世界动物卫生组织(OIE)规定的必须报告的动物疫病，受到世界各国的高度重视。非洲猪瘟是唯一以节肢动物作为传播媒介的DNA病毒。迄今为止，ASF已在非洲、欧洲和美洲等几十个国家暴发。如今非洲猪瘟在中国疫情的发现形势非常严峻。非洲猪瘟病毒没有有效疫苗及药物，防治难度大，防止疫情扩大的唯一有效措施就是扑杀；此外非洲猪瘟病毒生存力极强，冷冻可存活数年，4度可存活1年，传播途径也多种多样，极易造成疫情的散播与扩大。ASFV现发现有24种基因型，目前还没有一种检测试剂能覆盖所有的基因型。

现阶段非洲猪瘟的诊断方法主要分为三大类：临床病理诊断、病原学诊断以及免疫学诊断。

非洲猪瘟绝大多数为急性病例，发热3-4天才出现临床症状，此后温度下降，经1-2天即死亡。病猪无毛、少毛部位的皮肤出现紫斑区，界线分明，耳部发紫肿胀，四肢、腹部见紫黑色出血斑点，中央呈黑色，四周干枯状。胸、腹腔、心包内有多量黄色、黄红色液体。肺小叶间、结肠的浆膜、粘膜、肠系膜、胆囊壁常见水肿呈胶样浸润。淋巴结、腹腔内有严重的出血病变，状如小的血疤。猪瘟在体温升高时就已出现明显的临床症状，直到死亡。仅见出血斑点，大理石状出血，未见小血瘤。显微镜检验时可采取淋巴组织切片染色检查，非洲猪瘟可见到淋巴细胞核破裂，而猪瘟则无此病变特征。临床病理诊断仅能针对已经发病，有明显临床症状的猪适用，对于疫情的防控不能起到很好的诊断筛查作用。

ELISA应用于血清抗体的检测，具有操作方便、特异性较好、灵敏度高的特点，适用于大批量样品的检测，OIE将ELISA作为诊断ASF的首选血清学方法。ASFV含有约150种蛋白，目前国内外常用作检测抗原的蛋白有VP73、VP72、P54、P32、P30等。

胶体金免疫层析(GICA)试纸条

张鑫宇等用原核表达的ASFV P54重组蛋白制备了ASFV抗体快速检测胶体金试纸条，通过对ASFV不同感染时期141份猪血清样品进行比对检测，显示该试纸条在感染早期的符合率高于OIE推荐的ELISA检测方法。刘波也运用原核表达系统和胶体金免疫层析技术，对ASFV快速检测试纸条的技术进行了研究。吴海涛运用双抗体夹心法原理纯化后的抗ASFV单克隆抗体制备金标抗体，制备了用于检测ASFV的胶体金免疫层析试纸条。

用血清学方法检测抗体可以了解病毒感染以及疾病发生、发展的进程，然而，由于抗体只有在病毒感染至一定时期后才会出现，甚至一些病猪由于病程发展迅速，在发病死亡后仍然没有出现抗体。因此，抗体检测在作为快速控制ASFV暴发的方法时存在局限性。

PCR法

PCR具有简单快速、灵敏度高和特异性强的优点，是目前ASFV最常用的实验室检测方法。近几年发展起来的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法将PCR与荧光检测结合起来，克服了传统PCR费时、易污染，扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等缺点，可对样品中的核酸进行准确的定量检测，具有通量高、结果直观、敏感性高、特异性强、重复性好等优点，已成为非洲猪瘟病原体检测的重要方法。但荧光PCR法仍然具有仪器昂贵、巨大、对实验场地、人员要求高的问题，难以适用于现场大规模筛查，检测时间偏长，需要1-2小时。

环介导恒温扩增(LAMP)技术

LAMP技术操作简单、灵敏、快速，检测成本远低于荧光定量PCR，且不需要特殊仪器设备，具有较高的临床实用性。江彦增等、王彩霞等、杨吉飞等先后根据ASFV VP72基因序列设计引物，建立了快速检测ASFV的LAMP方法，最低检测限可达10拷贝质粒DNA，且具有良好的特异性。邬旭龙根据ASFV K205R基因序列设计引物，建立了LAMP检测方法。LAMP方法不需要PCR中的变性、退火步骤即可进行靶序列的循环扩增，不但大大缩短了时间，且使反应能够在恒温条件下进行，无需特殊仪器设备，肉眼判读，可以满足基层快速诊断的需要，但LAMP技术需4-6条引物，研发设计过程复杂，并且假阳性率高，存在一定弊端。

因此，基于现有检测技术存在时间长、操作不方便及假阳性高，不能覆盖24种基因型等缺点，提供一种准确、灵敏、操作简便、适用于现场快速检测ASFV 24种基因型的RAA荧光法，是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种RAA荧光法检测非洲猪瘟病毒24个基因型通用引物、探针及检测方法，可实现在39℃条件下5-15分钟完成非洲猪瘟病毒的检测，具有快速、灵敏、操作简便、适用于现场快速检测的特点。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种RAA荧光法检测非洲猪瘟病毒24个基因型的引物，所述引物序列如下：

上游引物：5’-TAGTGATAGACCCCACGTAATCCGTGTCCCAAC-3’；SEQ ID NO.3；

下游引物：5’-CGATGATCCGGGTGCGATGATGATTACCTT-3’；SEQ ID NO.7。

进一步，所述上游引物和下游引物的使用浓度为5～20μM。

优选地，所述上游引物和下游引物的使用浓度为10μM。

进一步，一种RAA荧光法检测非洲猪瘟病毒24个基因型的探针，所述探针序列如下：

5’-GATACGTTAATATGACCACTGGGTTGGTATTCCTCCCGTGGCTTCAAAG-3’；SEQ ID NO.8；

所述探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰，荧光报告基团修饰在探针序列离5’端碱基数31bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3’端碱基数16bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔2个碱基CC，其中靠近3’端碱基C用四氢呋喃残基替换；

修饰后的探针为：GATACGTTAATATGACCACTGGGTTGGTAT(FAM-dT)C(THF)(BHQ1-dT)CCCGTGGCTTCAAAG。

进一步，所述荧光报告基团为FAM、HEX、TET、JOE或VIC；所述荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2或BHQ3。

优选地，所述荧光报告基团为FAM；所述荧光淬灭基团为BHQ1。

进一步，所述探针的浓度为5～40μM。

优选地，所述探针的浓度为10μM。

进一步，一种RAA荧光法检测非洲猪瘟病毒24个基因型的检测方法，具体步骤如下：

(1)提取待检样本DNA，获得DNA提取液；

(2)将恒温荧光基因检测仪接通电源进行预热，对反应参数进行设置；

(3)在42.5μL反应缓冲液中加入浓度为10μM的2μL引物和0.5μL探针，充分混合后添加到RAA荧光基础反应试剂中混合，得到反应预混液；

(4)将5μL所述步骤(1)中得到的DNA提取液与所述步骤(3)中得到的反应预混液充分混合，得到的反应体系放入恒温荧光基因检测仪检测荧光信号；

(5)根据扩增情况，在15分钟内有扩增曲线，判定为阳性；在15分钟内无扩增曲线判定为阴性。

进一步，所述反应参数设置为39℃，反应时间：15分钟。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种RAA荧光法检测非洲猪瘟病毒24个基因型通用引物、探针及检测方法：

(1)本发明提供的引物和探针适用于RAA荧光法检测，并且能够准确地检测出24个基因型非洲猪瘟病毒DNA，与猪瘟病毒、猪丹毒病毒、蓝耳病毒、伪狂犬病毒无交叉反应，特异性达100％；

(2)本发明提供的检测方法快速、容易实现高通量，同时降低了检测时间和检测成本，本发明提供的基于RAA荧光法快速检测24个基因型非洲猪瘟病毒DNA的检测方法，灵敏度高，检测灵敏度达到10Copies/反应；

(3)本发明提供的一种RAA荧光法快速检测非洲猪瘟病毒24个基因型的检测方法，能方便快速准确地鉴定非洲猪瘟病毒DNA，操作简便，检测时间短，15分钟内完成检测；无需像PCR一样通过高温95℃变性使DNA解旋，再在50～60℃退火，最后在72℃完成延伸，只需在39℃下进行等温扩增即可完成检测；也无需像LAMP技术一样使用4-6条引物在65℃情况下进行扩增且容易产生假阳性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明不同浓度非洲猪瘟病毒质粒DNA灵敏度检测结果；

图2附图为本发明非洲猪瘟病毒质粒DNA重复性检测结果；

图3附图为本发明非洲猪瘟病毒DNA的特异性检测结果；

图4附图为本发明非洲猪瘟病毒样本DNA检测结果；

图5附图为本发明非洲猪瘟病毒1-13号基因型的检测结果；

图6附图为本发明非洲猪瘟病毒14-24号基因型的检测结果；

图7附图为本发明1号质粒扩增序列与1号质粒比对结果；

图8附图为本发明2号质粒扩增序列与2号质粒比对结果；

图9附图为本发明3号质粒扩增序列与3号质粒比对结果；

图10附图为本发明4号质粒扩增序列与4号质粒比对结果；

图11附图为本发明5号质粒扩增序列与5号质粒比对结果；

图12附图为本发明6号质粒扩增序列与6号质粒比对结果；

图13附图为本发明7号质粒扩增序列与7号质粒比对结果；

图14附图为本发明8号质粒扩增序列与8号质粒比对结果；

图15附图为本发明9号质粒扩增序列与9号质粒比对结果；

图16附图为本发明10号质粒扩增序列与10号质粒比对结果；

图17附图为本发明11号质粒扩增序列与11号质粒比对结果；

图18附图为本发明12号质粒扩增序列与12号质粒比对结果；

图19附图为本发明13号质粒扩增序列与13号质粒比对结果；

图20附图为本发明14号质粒扩增序列与14号质粒比对结果；

图21附图为本发明15号质粒扩增序列与15号质粒比对结果；

图22附图为本发明16号质粒扩增序列与16号质粒比对结果；

图23附图为本发明17号质粒扩增序列与17号质粒比对结果；

图24附图为本发明18号质粒扩增序列与18号质粒比对结果；

图25附图为本发明19号质粒扩增序列与19号质粒比对结果；

图26附图为本发明20号质粒扩增序列与20号质粒比对结果；

图27附图为本发明21号质粒扩增序列与21号质粒比对结果；

图28附图为本发明22号质粒扩增序列与22号质粒比对结果；

图29附图为本发明23号质粒扩增序列与23号质粒比对结果；

图30附图为本发明24号质粒扩增序列与24号质粒比对结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

根据基因名称非洲猪瘟病毒VP72基因，在gene bank(www.ncbi.nlm.nih.gov)中找到所有24种非洲猪瘟基因型相应的全基因序列的GenBank号和网址如下：

(1)genotype：1(GenBank:KJ526355.1)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KJ526355.1

(2)genotype:2(GenBank:KY963545.1)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KY963545

(3)genotype:3(GenBank:AF504886.1)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF504886

(4)genotype:4(GenBank:DQ250123.1)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/DQ250123

(5)genotype:5(GenBank:KJ526369.1)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KJ526369

(6)genotype:6(GenBank:AF270711.1)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF270711

(7)genotype:7(GenBank:AF302818.1)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF302818

(8)genotype:8(GenBank:AF270707.1)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF270707

(9)genotype:9(GenBank:AY351564.1)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY351564

(10)genotype:10(GenBank:AY351530.1)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY351530

(11)genotype:11(GenBank:AY351522.1)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY351522

(12)genotype:12(GenBank:AY351561.1)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY351561

(13)genotype:13(GenBank:AY351542.1)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY351542

(14)genotype:14(GenBank:AY351555.1)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY351555

(15)genotype:15(GenBank:AY494552.1)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY494552

(16)genotype:16(GenBank:AY494550.1)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY494550

(17)genotype:17(GenBank:DQ250119.1)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/DQ250119

(18)genotype:18(GenBank:DQ250122.1)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/DQ250122

(19)genotype:19(GenBank:DQ250112.1)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/DQ250112

(20)genotype:20(GenBank:DQ250123.1)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/DQ250123

(21)genotype:21(GenBank:DQ250111.1)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/DQ250111

(22)genotype:22(GenBank:DQ250117.1)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/DQ250117

(23)genotype:23(GenBank:KT795354.1)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KT795354

(24)genotype:24(GenBank:KY353989.1)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KY353989

运用DNASTAR软件进行同源性分析和b1ast序列分析，筛选出24个基因型非洲猪瘟病毒VP72基因高度保守序列如下：

GCAGATGCCGATACCACAAGATCAGCCGTAGTGATAGACCCCACGTAATCCGTGTCCCAACTAATATAAAATTCTCTTGCTCTGGATACGTTAATATGACCACTGGGTTGGTATTCCTCCCGTGGCTTCAAAGCAAAGGTAATCATCATCGCACCCGGATCATCGGGGGTTTTAATCGCATTGCCTCCGTAGTGGAAGGGTATGTAAGAGCTGCAGAACTTTGATGGAAATTTATCGATAAGATTGATACCATGAGCAGTTACGGAAATG；SEQ ID NO.1；

以高度保守序列作为检测目的基因，合成阳性质粒并进行24种基因型通用引物、探针设计；

根据以上非洲猪瘟病毒VP72基因保守序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成DNA质粒，质粒大小270bp。

(1)引物设计

采用RAA技术引物设计原则进行设计，上游引物和下游引物长度30-35bp；根据非洲猪瘟病毒VP72基因保守序列，引物设计包括上游引物和下游引物，上游引物和下游引物各设计3条，引物序列如下：

RAA-F1：5’-GATACCACAAGATCAGCCGTRGTGATAGAC-3’；SEQ ID NO.2；

RAA-F2：5’-TAGTGATAGACCCCACGTAATCCGTGTCCCAAC-3’；SEQ ID NO.3；

RAA-F3：5’-TCTCTTGCTCTGGATACGTTAATATGACCAC-3’；SEQ ID NO.4；

RAA-R1：5’-TTCCGTAACTGCTCATGGTATCAATCTTATCG-3’；SEQ ID NO.5；

RAA-R2：5’-CAGCTCTTACATACCCTTCCACTACGGAGGCAAT-3’；SEQ ID NO.6；

RAA-R3：5’-CGATGATCCGGGTGCGATGATGATTACCTT-3’；SEQ ID NO.7；

将上述引物组合成3×3共9个引物组合，引物组合见表1；

表1非洲猪瘟病毒特异性引物

注：“R”代表“A、G”。

通过筛选和评价，确定两对引物组为最佳引物组，见表2。

表2最佳引物组合

经进一步重复性、稳定性、灵敏度、特异性的评估，更优选的为RAA-F2/RAA-R3，具体为：

RAA-F2：5’-TAGTGATAGACCCCACGTAATCCGTGTCCCAAC-3’；SEQ ID NO.3；

RAA-R3：5’-CGATGATCCGGGTGCGATGATGATTACCTT-3’；SEQ ID NO.7。

(2)探针设计

1)采用RAA技术探针设计原则设计探针，根据非洲猪瘟病毒VP72基因保守序列，设计的探针序列为：

5’-GATACGTTAATATGACCACTGGGTTGGTATTCCTCCCGTGGCTT

CAAAG-3’；SEQ ID NO.8。

2)选择荧光修饰基团和荧光淬灭基团

根据实验仪器采用的是无锡奇天生物科学仪器有限公司生产的RAA-F1620荧光基因检测仪，所检测的荧光为FAM荧光，因此荧光修饰基团选为FAM，荧光淬灭基团选为BHQ1；

也可以根据仪器检测荧光的性能，将荧光修饰基团选择为HEX、TET、JOE或VIC；荧光淬灭基团选择BHQ2或BHQ3；

但优选荧光修饰基团为FAM，优选荧光淬灭基团为BHQ1。

3)所述探针的修饰方法包括：荧光报告基团修饰在探针序列离5’端碱基数31bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3’端碱基数16bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔2个碱基CC，其中靠近3’端碱基C用四氢呋喃残基替换；

修饰的探针为：GATACGTTAATATGACCACTGGGTTGGTAT(FAM-dT)C(THF)(BHQ1-dT)CCCGTGGCTTCAAAG。

(3)引物、探针及质粒均委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。

(4)基于RAA荧光法快速检测24个基因型非洲猪瘟病毒的检测试剂，包括RAA荧光基础反应试剂、反应缓冲液、阳性质控品、阴性质控品，引物和探针；

RAA荧光基础反应试剂为经过低温冷冻干燥的冻干粉，购自江苏奇天基因生物科技有限公司，货号为F00001，反应规格为50μL，使用前用反应缓冲液进行重溶，反应缓冲液为RAA荧光基础反应试剂配套试剂。

阳性质控品为含有非洲猪瘟病毒VP72基因的重组质粒，浓度为1×10⁴Copies/μL。质粒通过转接大肠杆菌培养并提取，得到质粒后用超微量紫外分光光度计进行浓度测定并进行拷贝数计算，按浓度梯度稀释制备成1.0×10¹copies/μl-1.0×10¹⁰Copies/μL标准品备用。

阴性质控品为ddH₂O或纯化水。

上游引物和下游引物的浓度为10μM；探针的浓度为10μM。

实施例2

一种RAA荧光法检测非洲猪瘟病毒24个基因型的检测方法，包括如下步骤：

(1)将待检组织样本预处理，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品0.2g于研钵中，再加2.0mL PBS均浆混匀研磨，对处理的待检样品于70℃，30分钟灭活后，3000r/min，4℃离心5分钟，取上清液200μL，用DNA核酸提取试剂盒进行核酸提取，具体提取方法按相应说明书执行，提取的DNA于-20℃保存备用；如样本为全血、血清、血浆采用裂解、磁珠富集、洗涤、洗脱等步骤提取核酸；本实施例样本由中国动物卫生与流行病学中心提供，采用天根DNA提取试剂盒进行DNA提取，样本为非洲猪瘟病毒Ⅱ型。

(2)将恒温荧光基因检测仪RAA-F1620接通电源进行预热，对反应参数进行设置，反应参数设置为39℃，反应时间：15min；

(4)将5μL所述步骤(1)中得到的核酸提取液与所述步骤(3)中得到的反应预混液充分混合，得到的反应体系放入恒温荧光基因检测仪RAA-F1620检测荧光信号；

(5)阳性判定方法按扩增曲线来判定，在15分钟内有明显扩增的判定为阳性，在15分钟内无明显扩增的判定为阴性。

实施例3灵敏度实验

(1)引物

上游引物：5’-TAGTGATAGACCCCACGTAATCCGTGTCCCAAC-3’；SEQ ID NO.3；

下游引物：5’-CGATGATCCGGGTGCGATGATGATTACCTT-3’；SEQ ID NO.7。

(2)探针

探针序列为：

5’-GATACGTTAATATGACCACTGGGTTGGTATTCCTCCCGTGGCTTCAAAG-3’；SEQ ID NO.8；

采用荧光报告基团(FAM)和荧光淬灭基团(BHQ1)修饰探针；

(3)制备质粒标准品，分别为：

标准品1，含有1.0×10⁶Copies/μL非洲猪瘟病毒质粒非传染性DNA片段。

标准品2，含有1.0×10⁵Copies/μL非洲猪瘟病毒质粒非传染性DNA片段。

标准品3，含有1.0×10⁴Copies/μL非洲猪瘟病毒质粒非传染性DNA片段。

标准品4，含有1.0×10³Copies/μL非洲猪瘟病毒质粒非传染性DNA片段。

标准品5，含有1.0×10²Copies/μL非洲猪瘟病毒质粒非传染性DNA片段。

标准品6，含有1.0×10¹Copies/μL非洲猪瘟病毒质粒非传染性DNA片段。

(4)灵敏度实施方法：

步骤1、配制反应液(按7个反应进行配制)：

从反应缓冲液中吸取300μL加入预先准备好的1.5mL EP管，分别加入14μL探针，3.5μL引物(探针的浓度为10μM，引物的浓度为10μM)，充分混匀，得混匀后的反应液。

步骤2、RAA荧光基础反应试剂重溶

准备7个RAA荧光基础反应试剂，每次吸取45μL步骤1中混匀的反应缓冲液分别加入到准备好的7个RAA荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混匀，成为RAA反应体系，并做好标记。

步骤3、加样反应

在以上7个配制好的RAA荧光基础反应试剂试管中分别加入5μL阴性质控品、5μL标准品6、5μL标准品5、5μL标准品4、5μL标准品3、5μL标准品2、5μL标准品1为模板，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为50μL。

步骤4、检测及结果

将混匀的7个反应管放入恒温荧光基因检测仪RAA-F1620中，设定反应温度为39℃，反应时间15分钟。

阳性判定方法按扩增曲线来判定，在15分钟内有明显扩增的判定为阳性，在15分钟内无明显扩增的判定为阴性。

检测结果如图1所示；结果显示最快5分钟明显有扩增，15分钟内所有标准品均有扩增，每个反应管灵敏度可以达到1.0×10¹Copies，即在每个反应管中存在10Copies，就可以在15分钟内检测出来，实现快速灵敏的检出结果。

实施例4重复性实验

(1)引物、探针及阴性质控品序列与实施例1相同。

(2)采用最低灵敏度(标准品6，含有1.0×10¹Copies/μL非洲猪瘟病毒质粒非传染性DNA片段)进行8个验证重复性：

(3)重复性实施方法：

步骤1、配制反应液(按9个反应进行配制)：

从反应缓冲液中吸取383μL加入预先准备好的1.5mL EP管，分别加入18μL探针，4.5μL引物(探针的浓度为10μM，引物的浓度为10μM)，充分混匀，得混匀后的反应液。

步骤2、RAA荧光基础反应试剂重溶

准备9个RAA荧光基础反应试剂，每次吸取45μL步骤1中混匀的反应缓冲液分别加入到准备好的9个RAA荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混匀，成为RAA反应体系，并做好标记。

步骤3、加样反应

在以上9个配制好的RAA荧光基础反应试剂试管中的一个加入5μL阴性质控品、其他8个反应管中分别加入5μL标准品6为模板，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为50μL。

步骤4、检测及结果

将混匀的9个反应管放入恒温荧光基因检测仪RAA-F1620中，设定反应温度为39℃，反应时间15分钟。

检测结果如图2所示；结果显示全部在5分钟内明显扩增，每个反应管灵敏度可以达到1.0×10¹Copies，重复性好。

实施例5特异性实验

(1)引物、探针及阴性质控品序列与实施例1相同。

(2)特异性实验中非洲猪瘟病毒DNA，猪瘟病毒、猪丹毒病毒、蓝耳病毒、伪狂犬病毒样本由国家外来动物疫病研究中心提供。

(3)样本提取方法：

组织样本先进行均浆，再按天根商品化组织提取DNA方法提取核酸；全血、血清、血浆按采用裂解、磁珠富集、洗涤、洗脱等步骤提取核酸；-20℃保存备用。

(4)特异性实验实施方法：

步骤1、配制反应液(按6个反应进行配制)：

从反应缓冲液中吸取255μL加入预先准备好的1.5mL EP管，分别加入12μL探针，3.0μL引物(探针的浓度为10μM，引物的浓度为10μM)，充分混匀，得混匀后的反应液。

步骤2、RAA荧光基础反应试剂重溶

准备6个RAA荧光基础反应试剂，每次吸取45μL步骤1中混匀的反应缓冲液分别加入到准备好的6个RAA荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混匀，成为RAA反应体系，并做好标记。

步骤3、加样反应

在以上6个配制好的RAA荧光基础反应试剂试管中的一个加入5μL阴性质控品、其他5个反应管中分别加入提取的5μL非洲猪瘟病毒样本核酸、5μL猪瘟病毒样本核酸、5μL猪丹毒病毒样本核酸、5μL蓝耳病毒样本核酸、5μL伪狂犬病毒样本核酸，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为50μL。

步骤4、检测及结果

将混匀的6个反应管放入恒温荧光基因检测仪RAA-F1620中，设定反应温度为39℃，反应时间15分钟。

检测结果如图3所示；结果显示只有非洲猪瘟病毒样本核酸有扩增，其他如猪瘟病毒、猪丹毒病毒、蓝耳病毒、伪狂犬病毒样本核酸均没有扩增，显示出良好的特异性。

实施例6样本实验

(1)引物、探针及阴性质控品序列与实施例1相同。

(2)实验中非洲猪瘟病毒样本由国家外来动物疫病研究中心提供，分别为经过确认的感染非洲猪瘟的死猪脾脏、肺各两例，血清、血浆各两例，共8例样本进行验证。

(3)样本提取方法：

组织样本先进行均浆，再按天根商品化组织提取DNA方法提取核酸；血清、血浆按采用裂解、磁珠富集、洗涤、洗脱等步骤提取核酸；-20℃保存备用；

(4)实施方法

步骤1、配制反应液(按9个反应进行配制)：

步骤2、RAA荧光基础反应试剂重溶

步骤3、加样反应

在以上9个配制好的RAA荧光基础反应试剂试管中的一个加入5μL阴性质控品、其他8个反应管中分别加入5μL提取的核酸为模板，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为50μL。

步骤4、检测及结果

检测结果如图4所示；结果显示8例样本均有扩增，显示出良好的检出率。

实施例7样本实验

(1)引物、探针及阴性质控品序列与实施例1相同。

(2)按实施例1中的24种基因型非洲猪瘟病毒VP72基因委托生物合成公司进行全基因序列合成质粒，分别编号为1-24号，进行本发明设计引物、探针的适应性验证。

(3)样本准备：

将1-24号质粒用Nanodrop 2000进行测定浓度，按质粒copy数/μL＝测量浓度×9.12×10¹¹/质粒大小公式进行质粒copy数计算，根据计算结果进行十倍倍比稀释，稀释至1000copies/μL，每个基因型为一个样本，分别对应标为1-24号备用。

(4)实施方法

步骤1、选取1-13号基因型质粒进行适应性实验，配制反应液(按14个反应进行配制)：

从反应缓冲液中吸取595μL加入预先准备好的1.5mL EP管，分别加入28μL探针，7μL引物(探针的浓度为10μM，引物的浓度为10μM)，充分混匀，得混匀后的反应液。

步骤2、RAA荧光基础反应试剂重溶

准备14个RAA荧光基础反应试剂，每次吸取45μL步骤1中混匀的反应缓冲液分别加入到准备好的14个RAA荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混匀，成为RAA反应体系，并做好标记。

步骤3、加样反应

在以上14个配制好的RAA荧光基础反应试剂试管中的一个加入5μL阴性质控品、其他13个反应管中分别加入5μL配制好的1-13号基因型非洲猪瘟质粒为模板，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为50μL。

步骤4、检测及结果

将混匀的14个反应管放入恒温荧光基因检测仪RAA-F1620中，设定反应温度为39℃，反应时间15分钟。

检测结果如图5所示；结果显示13个不同的非洲猪瘟基因质粒型均有扩增，显示出良好的检出率，设计的引物、探针适用于该13个不同的非洲猪瘟基因型的检测。

实施例8样本实验

(1)引物、探针及阴性质控品序列与实施例1相同。

(3)样本准备：

(4)实施方法

步骤1、选取14-24号基因型质粒进行适应性实验，选配制反应液(按12个反应进行配制)：

从反应缓冲液中吸取510μL加入预先准备好的1.5mL EP管，分别加入24μL探针，6μL引物(探针的浓度为10μM，引物的浓度为10μM)，充分混匀，得混匀后的反应液。

步骤2、RAA荧光基础反应试剂重溶

准备12个RAA荧光基础反应试剂，每次吸取45μL步骤1中混匀的反应缓冲液分别加入到准备好的12个RAA荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混匀，成为RAA反应体系，并做好标记。

步骤3、加样反应

在以上12个配制好的RAA荧光基础反应试剂试管中的一个加入5μL阴性质控品、其他11个反应管中分别加入5μL配制好的14－24号基因型非洲猪瘟质粒为模板，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为50μL。

步骤4、检测及结果

将混匀的12个反应管放入恒温荧光基因检测仪RAA-F1620中，设定反应温度为39℃，反应时间15分钟。

检测结果如图6所示；结果显示11个不同的非洲猪瘟基因质粒型均有扩增，显示出良好的检出率，设计的引物、探针适用于该11个不同的非洲猪瘟基因型的检测。

将1-24号质粒的扩增序列分别进行测序，并将测序后的扩增序列与自身模板进行序列比对，结果如图7-30所示。

经过实施例7、实施例8表明，本发明所设计的引物、探针及建立的方法适用于24种不同基因型的非洲猪瘟病毒VP72基因的检测。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 江苏奇天基因生物科技有限公司中国动物卫生与流行病学中心

<120> 一种RAA荧光法检测非洲猪瘟病毒24个基因型通用引物、探针及检测方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 270

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gcagatgccg ataccacaag atcagccgta gtgatagacc ccacgtaatc cgtgtcccaa 60

ctaatataaa attctcttgc tctggatacg ttaatatgac cactgggttg gtattcctcc 120

cgtggcttca aagcaaaggt aatcatcatc gcacccggat catcgggggt tttaatcgca 180

ttgcctccgt agtggaaggg tatgtaagag ctgcagaact ttgatggaaa tttatcgata 240

agattgatac catgagcagt tacggaaatg 270

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gataccacaa gatcagccgt rgtgatagac 30

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

tagtgataga ccccacgtaa tccgtgtccc aac 33

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

tctcttgctc tggatacgtt aatatgacca c 31

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ttccgtaact gctcatggta tcaatcttat cg 32

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

cagctcttac atacccttcc actacggagg caat 34

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

cgatgatccg ggtgcgatga tgattacctt 30

<210> 8

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gatacgttaa tatgaccact gggttggtat tcctcccgtg gcttcaaag 49

Claims

1.一种RAA荧光法检测非洲猪瘟病毒24个基因型的引物，其特征在于，所述引物序列如下：

上游引物：5’-TAGTGATAGACCCCACGTAATCCGTGTCCCAAC-3’；SEQ ID NO.3；

下游引物：5’-CGATGATCCGGGTGCGATGATGATTACCTT-3’；SEQ ID NO.7。

2.根据权利要求1所述的一种RAA荧光法检测非洲猪瘟病毒24个基因型的引物，其特征在于，所述上游引物和下游引物的使用浓度为5～20μM。

3.根据权利要求2所述的一种RAA荧光法检测非洲猪瘟病毒24个基因型的引物，其特征在于，所述上游引物和下游引物的使用浓度为10μM。

4.一种RAA荧光法检测非洲猪瘟病毒24个基因型的探针，其特征在于，所述探针序列如下：

5’-GATACGTTAATATGACCACTGGGTTGGTATTCCTCCCGTGGCTTCAAAG-3’；SEQ ID NO.8；

所述探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰，荧光报告基团修饰在探针序列离5’端碱基数31bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3’端碱基数16bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔2个碱基CC，其中靠近3’端碱基C用四氢呋喃残基替换。

5.根据权利要求4所述的一种RAA荧光法检测非洲猪瘟病毒24个基因型的探针，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM、HEX、TET、JOE或VIC；所述荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2或BHQ3。

6.根据权利要求5所述的一种RAA荧光法检测非洲猪瘟病毒24个基因型的探针，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM；所述荧光淬灭基团为BHQ1。

7.根据权利要求4-6任一项所述的一种RAA荧光法检测非洲猪瘟病毒24个基因型的探针，其特征在于，所述探针的浓度为5～40μM。

8.根据权利要求7所述的一种RAA荧光法检测非洲猪瘟病毒24个基因型的探针，其特征在于，所述探针的浓度为10μM。

9.一种RAA荧光法检测非洲猪瘟病毒24个基因型的检测方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)提取待检样本DNA，获得DNA提取液；

(5)根据扩增情况，在15分钟内有扩增曲线，判定为阳性；在15分钟内无扩增曲线，判定为阴性。

10.根据权利要求9所述的一种RAA荧光法检测非洲猪瘟病毒24个基因型的检测方法，其特征在于，所述反应参数设置为39℃，反应时间：15分钟。