CN111270019A

CN111270019A - 一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物组、荧光可视化快速检测试剂盒及方法

Info

Publication number: CN111270019A
Application number: CN202010264901.7A
Authority: CN
Inventors: 王林; 张玮; 吴迪; 栗云鹏; 高晓龙; 张启龙; 杜鹃; 李蕊; 程汝佳; 王培�; 韦海涛; 宋彦军; 周德刚; 刘晓冬
Original assignee: Center For Animal Disease Control And Prevention Of Beijing
Current assignee: Center For Animal Disease Control And Prevention Of Beijing
Priority date: 2020-04-07
Filing date: 2020-04-07
Publication date: 2020-06-12

Abstract

本发明公开了一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物组、荧光可视化快速检测试剂盒及方法。用于检测非洲猪瘟病毒的引物组包括一对特异性外引物，一对特异性内引物和一条环引物，其对应的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.5所示。利用本发明制备的荧光可视化快速检测试剂盒可实现对非洲猪瘟病毒的高灵敏度和高特异性检测，同时操作简便，仅需能恒温扩增的水浴或恒温扩增仪器即可进行检测，成本较低，设备适用范围广，适于在疫病发生时现场快速诊断疫病，及时治疗。

Description

一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物组、荧光可视化快速检测试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物组荧光、可视化快速试剂盒及方法。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus,ASFV)引起的猪的一种急性、热性、高接触性传染病，又称非洲猪瘟疫或疣猪病。临床以高热、食欲废绝、皮肤和内脏器官出血、高死亡率为特征。非洲猪瘟病毒属于非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属，也是非洲猪瘟病毒科的唯一成员。该病毒粒子二十面体对称，呈同心圆状结构。ASFV不同毒株间基因组大小不同，在170-193kb之间，共编码约150-167个蛋白，包括病毒复制所需蛋白，此外许多基因与病毒的复制无关，但卷入了抑制和逃逸宿主防御系统。因此在临床上需要一种能够快速检测或筛查ASFV毒株的检测方法。

传统的ASFV检测方法主要是血清学检测(酶联免疫吸附试验ELISA、间接免疫过氧化物酶反应检测、间接免疫荧光和免疫印迹法等)和病原学检测(PCR、荧光PCR和胶体金试纸条等)。目前最常用检测方法为荧光定量 PCR，该检测方法灵敏度和特异性较好，但存在需要专业的检测实验室，高成本仪器设备，试验所需时间较长，对操作人员的分子生物学技术背景要求很高，试剂成本贵，难以在基层实际生产中普及应用。目前，用于非洲猪瘟病毒的荧光PCR方法需要专业的实验室、技术人员和设备，易导致检测结果滞后，不适用于现场快速检测。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，能在等温(60-65℃)条件下，短时间(通常是一小时内)内进行大量的核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。与常规PCR相比，该方法不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，具有简单、快速、特异性强的特点；在灵敏度、特异性和检测范围等指标上也能媲美甚至优于PCR技术，且该方法不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场快速检测，但目前由于内、外引物和环引物的设计难度较大，一般较难达到理想的检测效果。

发明内容

本发明的一个目的是提供一组用于检测非洲猪瘟病毒的特异性引物组，该引物组适用于环介导等温扩增进行检测。本发明的另一目的是提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、荧光可视化的LAMP试剂盒，用于非洲猪瘟病毒的现场、快速、精确地检测。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一组用于检测非洲猪瘟病毒的特异性引物组，包括一对特异性外引物，一对特异性内引物和一条环引物，其中，特异性外引物的核苷酸序列分别为如SEQ ID NO.1所示的F3和如SEQ ID NO.2所示的B3，所述特异性内引物的核苷酸序列分别为如SEQ ID NO.3所示的FIP和如SEQ ID NO.4所示的 BIP，所述环引物的核苷酸序列为如SEQ ID NO.5所示。

第二方面，本发明提供了非洲猪瘟病毒的特异性引物组合在制备检测试剂中的应用，所述检测试剂优选为试剂盒，所述试剂盒优选为LAMP试剂盒，本发明的试剂盒适用于水浴锅、PCR仪、恒温金属浴、恒温扩增仪等一系列恒温扩增设备。

如上所述的引物组在制备检测非洲猪瘟病毒的LAMP试剂盒中的应用。

第三方面，本发明提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度和操作简单的检测非洲猪瘟病毒的可视化快速检测试剂盒，其包含一对特异性外引物，一对特异性内引物，一条环引物和Bst DNA聚合酶及荧光目视检测试剂，其特异性外引物的核苷酸序列分别为如SEQ ID NO.1所示的F3和如SEQ ID NO.2所示的B3，所述特异性内引物的核苷酸序列分别为如SEQ ID NO.3所示的FIP和如SEQ ID NO.4所示的BIP，所述环引物的核苷酸序列为如SEQID NO.5所示，所述荧光目视检测试剂为含有Mn²⁺的钙黄绿素溶液。

进一步的，本发明的试剂盒包括检测试剂和样品快速处理试剂。

所述检测试剂包括无DNA酶的蒸馏水、LAMP反应液、阴性质控标准品和阳性质控标准品；所述LAMP反应液包含LAMP预混液、酶溶液和荧光目视检测试剂。

本发明的一个试剂盒中，所述LAMP反应液的配方(一个反应体系中 LAMP反应液20μL)为：

1、LAMP预混液(18μL)：2×反应缓冲液12.5μL(购置于荣研生物科技有限公司，货号SLP206)、8μmol/L的外引物F3 1μL、8μmol/L的外引物 B3 1μL、35μmol/L的内引物FIP 1μL、35μmol/L的内引物BIP 1μL、15μmol/L 的环引物LB 1μL、无DNA酶的蒸馏水0.5μL；

2、酶溶液1μL(购置于荣研生物科技有限公司，货号SLP206)；

3、荧光目视检测试剂1μL(购置于荣研生物科技有限公司，货号 SLP221)。

本发明的试剂盒中，所述阳性质控标准品为含有非洲猪瘟病毒P72基因的质粒，所述P72基因的序列如SEQ ID NO.6所示，阴性质控标准品为无DNA 酶蒸馏水。

本发明的另一优选试剂盒，所述LAMP反应液(一个反应体系中LAMP 反应液20μL)的替代配方为：

1、LAMP预混液(16.5μL)：10×Thermopol buffer 2.5μL、50mmol/L MgSO₄ 3.5μL溶液、5.0mmol/L甜菜碱溶液2.5μL、10mmol/L dNTPs 3μL、8μmol/L 的外引物F3 1μL、8μmol/L的外引物B3 1μL、35μmol/L的内引物FIP 1μL、 35μmol/L的内引物BIP 1μL、15μmol/L的环引物LB 1μL。

2、酶溶液:8.0U/μL的Bst DNA聚合酶1μL。

3、荧光目视检测试剂共2.5μL：10mmol/L MnCl₂溶液1.5μL、1.0mmol/L 的钙黄绿素溶液1μL。

进一步，所述样品快速处理试剂含有聚乙二醇、Triton-X100、EDTA、 Ttis-HCl，海藻糖等。

进一步，所述样品快速处理试剂含有质量百分比为2.5％的聚乙二醇， 3mg/mL的蛋白酶K，0.1％Triton-X100的DNA Extract Solution A，和含 3mmol/LEDTA，1.5mmol/LTtis-HCl，质量百分比为0.25％的海藻糖的DNA Extract Solution B。

本发明经大量实验验证，最后确定采用含聚乙二醇，蛋白酶K， Triton-X100先处理，其中，聚乙二醇的主要作用是与多酚结合，阻止多酚与 DNA的结合；蛋白酶K的主要作用是水解蛋白质，使DNA完整的分离出来；Triton-X100的主要作用是溶解细胞膜蛋白，使DNA从细胞中释放出来；这样DNA先释放出来后，再进行含有EDTA、Ttis-HCl、海藻糖进行对释放出来的DNA的保护，其中，EDTA的主要作用是抑制脱氧核糖核酸酶对DNA 的降解作用；Ttis-HCl的主要作用是缓冲作用，使DNA更稳定的存在；海藻糖的主要作用是保护酶的活性，更有效的降解蛋白质，释放DNA。

本发明的试剂盒，其工作程序为：

(1)在LAMP专用反应试管里，配制LAMP反应体系；LAMP反应体系 25μL配方为：LAMP反应液20μL，待测样品DNA模板为5μL；

(2)将配置好、分装完毕的反应试管置于恒温测定装置中，在63℃下恒温50分钟。

(3)分析数据，显示检测结果。

本发明试剂盒检测结果的判定方法为：(1)阳性对照：50分钟内呈现绿色。(2)阴性对照：50分钟内呈现橘黄色。待测样本结果判定：(1)阳性：50分钟内呈现绿色。(2)阴性：50分钟内呈现橘黄色。

第四方面，本发明提供了一种检测非洲猪瘟病毒的方法，该方法包括利用本发明中第一方面的引物组合或第三方面的试剂盒对非洲猪瘟病毒进行检测。具体地：

一种用于检测非洲猪瘟病毒的方法，其包括如下步骤：

S1、从样品中提取DNA；

S2、对步骤S1提取的所述DNA进行等温扩增；其中，在等温扩增的反应体系中，采用如上所述的引物组，置于63℃恒温反应；

S3、结果判定：50分钟内呈现绿色为阳性，50分钟内呈现橘黄色为阴性。

如上所述的方法，优选地，在步骤(1)中，样品中提取DNA采用如下方法进行：将样本拭子上清10μL加入到1.5mL离心管中，加入100μL DNA Extract Solution A，涡旋震荡20s，室温静置3-5min或95℃金属浴孵育3-5min 进行裂解，之后再加入100μLDNA ExtractSolution B，涡旋震荡30s，获得检测样品DNA；

其中，所述DNA Extract Solution A中含有质量百分比为2.5％的聚乙二醇，3mg/mL的蛋白酶K，0.1％Triton-X100；

所述DNA Extract Solution B含有3mmol/L EDTA，1.5mmol/L Ttis-HCl，质量百分比为0.25％的海藻糖。

如上所述的方法，优选地，在步骤(2)中，所述反应体系中含有2×反应缓冲液12.5μL、8μmol/L的外引物F3 1μL、8μmol/L的外引物B3 1μL、35 μmol/L的内引物FIP 1μL、35μmol/L的内引物BIP 1μL、15μmol/L的环引物 LB 1μL、无DNA酶的蒸馏水0.5μL，1μL含6mmol/L MnCl₂和0.4mmol/L的钙黄绿素溶液的荧光目视检测剂；1μL的Bst DNA聚合酶溶液，加入样品DNA 5μL。

如上所述的方法，优选地，在步骤(2)中，设置有阳性质控和阴性质控，阳性质控为含非洲猪瘟病毒P72基因的重组质粒为阳性模板进行检测，所述P72基因的序列如SEQ IDNO.6所示，阴性质控为使用空载体质粒为阴性模板进行检测。

本发明的检测方法可用于临床样品中病毒的检测，也可用于动物饲料、饮水等环境中的病毒检测，此外，本发明的方法也可用于实验室用途。

本发明提供的试剂盒在非洲猪瘟病毒检测和预防中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的发明人经过大量的探索和尝试，通过调整Tm值、GC含量、 dG临界值、扩增长度及片段区域等参数，最终设计并筛选出用于检测非洲猪瘟病毒最佳引物组合，保护一对内引物，一对外引物和一环引物。本发明的引物组合相对于备选的其他引物而言，在病毒检测方面具有更高的灵敏度、特异性和准确性，能够更好的实现对非洲猪瘟病毒的检测。

利用本发明的引物组合所制备的试剂盒，具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、操作简便等优点，最低检测限在10copies，与实时荧光定量PCR相当，但操作上相对于后者更简便，成本也更低，因此本发明的试剂盒适于在宠物医院或者养殖场进行现场快速诊断疫病，及时控制疫情。

附图说明

图1为引物组1的扩增效果验证，其中，编号1为非洲猪瘟阳性样本(灭活)，编号2-7分别为猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒。

图2为引物组2的扩增效果验证，其中，编号1为非洲猪瘟阳性样本(灭活)，编号2-7分别为猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒。

图3为本发明引物组合的扩增效果验证，其中，编号1为非洲猪瘟病毒质粒，编号1为非洲猪瘟病毒核酸，编号3为阴性对照。

图4为本发明的引物组合制备的试剂盒灵敏度检测结果；其中，管1为10³copies，管2为10²copies，管3为10copies，管4为1copy，管5为0.1 copies，管6为阴性对照，管7为阳性对照。

图5为Real-time PCR检测结果；其中，POS为阳性对照，编号1-3的曲线分别表示10³copies-10copies，编号4-6的曲线分别表示1copies、0.1copies 和阴性对照。

图6为本发明的引物组合制备的试剂盒特异性检测结果；其中，标记的管1为非洲猪瘟病毒，管2为猪伪狂犬病毒，管3为猪瘟病毒，管4为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒，管5为猪细小病毒，管6为猪圆环病毒2型，管7为阴性对照，管8为阳性对照。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 LAMP引物的设计与验证

1、引物的设计

根据Genbank已发表的非洲猪瘟病毒结构蛋白基因(GenBank:MH910 495.1)，通过对GenBank里的60条非洲猪瘟P72基因的比对分析，找出了一段相对保守的基因序列，运用在线生物软件(http://primerexplorer.jp/)，通过调整Tm值、GC含量、dG临界值和扩增长度等参数值，进行设计适用于LAMP的特异性引物组若干组，包括基础引物(F3、B3、FIP、BIP)和环引物(LB)，其中2组如表1所示，加入环引物的主要目的是加速反应过程，缩短检测时间，再进行实验筛选，最终得到本发明的引物组合为1组如表1 所示，该引物组合特异性好，检测时间短。

表1引物序列

2、引物的筛选及验证

(1)毒株与样品

非洲猪瘟阳性样本(灭活)、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒均由北京市动物疫病预防控制中心实验室保存提供。

(2)在

实时浊度测定仪器(LA-320C)上使用实施例1中表1 设计的引物组合进行LAMP扩增，扩增反应体系(25μL)为：

LAMP预混液(18μL)：2×反应缓冲液12.5μL(购置于荣研生物科技有限公司，货号SLP246)、8μmol/L的外引物F3 1μL、8μmol/L的外引物B3 1μL、 35μmol/L的内引物FIP 1μL、35μmol/L的内引物BIP 1μL、15μmol/L的环引物LB 1μL、无DNA酶的蒸馏水0.5μL；

酶溶液1μL(购置于荣研生物科技有限公司，货号SLP206)；

荧光目视检测试剂1μL(购置于荣研生物科技有限公司，货号SLP221)。

DNA样品5μL。

扩增反应工作程序为：63℃，120min。

(3)扩增结果如图1和图2所示，引物1组在第28min检出非洲猪瘟病毒阳性样本核酸(图1中的编号1)，猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒(图1 中的编号2-7)在120min内均未检出。引物2组在第70min检出非洲猪瘟病毒阳性样本核酸(如图2中的编号1)，猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒、欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒(如图2中的编号2-7)在120min内均未检出。结果表明，本发明的引物1组具有较高的扩增效率和特异性。

实施例2在

实时浊度测定仪器上检测非洲猪瘟病毒的LAMP方法及最佳反应温度确定

1、毒株与试剂

非洲猪瘟病毒质粒(含非洲猪瘟病毒重组质粒P72基因序列，其P72基因序列如SEQID NO.6所示的重组质粒)、非洲猪瘟病毒核酸(为临床阳性样本的核酸)由北京市动物疫病预防控制中心实验室保存。

在

实时浊度测定仪器(LA-320C)上使用实施例1中表1引物1 组设计的引物组合进行LAMP扩增，扩增反应体系(25μL)为：

LAMP预混液(18μL)：2×反应缓冲液12.5μL(购置于荣研生物科技有限公司，货号SLP246)、8μmol/L的外引物F31μL、8μmol/L的外引物B31μL、 35μmol/L的内引物FIP 1μL、35μmol/L的内引物BIP 1μL、15μmol/L的环引物LB 1μL、无DNA酶的蒸馏水0.5μL；

酶溶液1μL(购置于荣研生物科技有限公司，货号SLP206)；

DNA样品5μL。

扩增反应工作程序为：65℃，120min。

扩增结果如图3所示，图中，非洲猪瘟病毒质粒(编号1)和非洲猪瘟病毒核酸(编号2)均在50min内检出，阴性对照(编号3)在120min内未检出。结果表明，本发明的引物组合具有较高的扩增效率和特异性。

2、最佳反应温度确定

所用LAMP扩增反应体系如上，即LAMP预混液18μL，酶溶液1μL，荧光目视检测试剂1μL，DNA 5μL。

3、在Loopamp仪上进行扩增，设置61℃，63℃，65℃，67℃四个温度，扩增50分钟。

4、分析结果：63℃条件下扩增效果最好，选择63℃作为本发明的引物组合的扩增温度。

实施例3样品的检测

1、样品采集：病死或扑杀猪，取肺、扁桃体和脑组织；待检活猪，用注射器取血5mL、用棉签蘸取环境拭子放入装有PBS的1.5mL离心管中。采集的样品2～8℃保存，送实验室检测(要求送检病料新鲜，严禁反复冻融病料)。

2、样品处理：每份样品分别处理。

(1)将样本(全血、组织、拭子上清)10μL加入到1.5mL离心管中，加入100μl DNAExtract Solution A，涡旋震荡20s，室温静置3-5min(或95℃金属浴孵育3-5min获得更好的提取效果)。其中，DNA Extract Solution A中含有质量百分比为2.5％的聚乙二醇，3mg/mL的蛋白酶K，0.1％Triton-X100。

(2)样本充分裂解后(95℃金属浴孵育的样本需恢复至室温)，加入1 00μl DNAExtract Solution B，涡旋震荡30s。DNA Extract Solution B含有3mM EDTA，1.5mM Ttis-HCl，质量百分比为0.25％的海藻糖。

上述样本处理试剂与市售的3种样品处理试剂进行比对试验，处理效果要优于市售的样品处理试剂，并且配套LAMP检测试剂，效果更好。

(3)含有非洲猪瘟病毒P72基因重组质粒(P72基因的序列如SEQ ID NO.6所示)作为阳性对照，无DNA酶蒸馏水作为阴性对照，阳性对照与阴性对照无需处理。

(4)处理后的样本进行下一步扩增试验。扩增试验采用，63℃扩增50 min，扩增体系可采用实施例2中的反应体系。

(5)结果判定：结果呈现绿色为阳性，内呈现橘黄色为阴性。

实施例4使用制备的LAMP试剂盒检测非洲猪瘟病毒

1、荧光可视化快速检测非洲猪瘟病毒的LAMP试剂盒的组装

荧光可视化快速检测非洲猪瘟病毒的LAMP试剂盒包括LAMP预混液、荧光目视检测剂和酶溶液，其中，LAMP预混液一个检测反应18μL的配方为：2×反应缓冲液12.5μL、8μmol/L的外引物F3(SEQ ID NO.1)1μL、8 μmol/L的外引物B3(SEQ ID NO.2)1μL、35μmol/L的内引物FIP(SEQ ID NO.3)1μL、35μmol/L的内引物BIP(SEQ ID NO.4)1μL、15μmol/L 的环引物LB(SEQ ID NO.5)1μL、无DNA酶的蒸馏水0.5μL；荧光目视检测剂6mmol/L MnCl₂和0.4mmol/L的钙黄绿素溶液；酶溶液为Bst DNA聚合酶。上述试剂可根据需要配置所需检测次数的试剂盒如48T/盒，96T/盒或 198T/盒等等，用合适的外包装盒包装以下试剂，贴标签，标示名称、批号、生产日期、有效期等。

下面例举48T/盒为例来说明。

溶液A(LAMP预混液)1支，864μL；溶液B(酶反应液)1支48μL，溶液C(荧光目视检测剂)1支，48μL；溶液D(阳性质控标准品)1支， 100μL；溶液E(阴性质控标准品)1支，100μL。阳性质控标准品使用非洲猪瘟病毒基因为阳性模板，阴性质控标准品使用空载体质粒为阴性模板，使用 Tris-EDTA缓冲液(0.01M pH8.0)稀释后冷冻保存。将检验合格的阳性对照和阴性对照制剂均按100μL定量分装。

进一步的，试剂盒还包括有样品处理试剂：DNA Extract Solution A：中含有质量百分比为2.5％的聚乙二醇，3mg/mL的蛋白酶K，0.1％Triton-X100；

DNA Extract Solution B：含有3mM EDTA，1.5mM Ttis-HCl，质量百分比为0.25％的海藻糖。

2、试剂盒的使用流程

(1)将样本(全血、组织、拭子上清)10μL加入到1.5ml离心管中，加入100μLDNAExtract Solution A，涡旋震荡20s，室温静置3-5min(或95℃金属浴孵育3-5min获得更好的提取效果)。

(2)样本充分裂解后(95℃金属浴孵育的样本需恢复至室温)，加入100μL DNAExtract Solution B，涡旋震荡30s。

(3)处理后的样本用于后续检测。

(4)在室温下解冻保存于-20℃的检测试剂，解冻后立即置于冰上保存。

(5)按下表配制反应Mix(每份量反应Mix的配置)见表2：

表2试剂配制组成

混合注意事项：涡旋混合器混合时采用1秒×3次的方式。混合过于激烈，则有可能导致酶失活。

(6)根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量准备反应管，向每个反应管加入20μL反应Mix。

(7)吸取已处理的样本DNA、阴性对照、阳性对照各5μL加入对应反应管中，盖好管盖，转移至扩增区。

加样注意事项：按照阴性对照、样本DNA、阳性对照顺序依次加样并盖好管盖。

(8)将PCR反应管按顺序放入环介导等温扩增仪，设置反应体系为25uL，设置反应条件63℃，50min；热盖83℃(若无此功能则忽略)或者将PCR反应管放入荧光PCR仪中，设置反应体系为25uL，设置反应条件63℃，1min(FAM 通道收集荧光信号)，50个循环。

上机后注意事项：全程实验过程请不要打开反应管盖，防止核酸污染实验室。

(9)结果分析和判定

实施例5灵敏度检验

1、DNA模板的制备：将非洲猪瘟病毒DNA，经荧光定量PCR定量为 10³copies/μL,进行10倍倍比稀释，分别进行本发明的LAMP和现有技术中的Real-time PCR扩增，检测灵敏度。

2、LAMP反应体系(同实施例4)：LAMP预混液18μL，酶反应液1μL，荧光目视检测剂1μL，DNA 5μL，总体积25μL。反应程序为：63℃50min。

3、Real-time PCR反应体系：同时采用非洲猪瘟病毒检测操作规程(试行)中的非洲猪瘟核酸检测技术(方法一)中的实时荧光PCR检测方法进行灵敏度检测，当被检样本出现S型扩增曲线，Ct值小于40.0判为阳性；阴性样本无Ct值或Ct值大于40.0。

4、本发明试剂盒的LAMP检测结果如图4所示，检测结果显示，管1- 管4均为阳性(显示绿色)，即该方法的检测最低限为10copies，

Real-time PCR的检测结果如图5所示，

说明本发明的检测灵敏度与现有技术Real-time PCR检测灵敏度基本一致，但是本发明不需要高昂仪器即可进行，只需水浴锅、PCR仪、恒温金属浴、恒温扩增仪等一系列任一恒温扩增设备即可进行，大大节约了检测成本。

实施例6特异性检验

1、用本发明制备的试剂盒按照实施例4表述的方法分别检测非洲猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒，猪瘟病毒，美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒，猪细小病毒，猪圆环病毒2型，猪健康组织等提取的基因组，验证反应体系的特异性。

2、检测结果如图6所示，从该图可以看出，本发明的试剂盒可以成功检测出非洲猪瘟病毒(管1)；猪伪狂犬病毒，猪瘟病毒，美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒，猪细小病毒，猪圆环病毒2型，猪健康组织均未检出(分别对应管2、管3、管4、管5、管6)，结果表明本发明的引物组合制备的试剂盒具有良好的特异性。

实施例7临床样品检测

1、用本发明的试剂盒和实施例5中的实时荧光定量PCR方法同时检测 30份临床样品(其中22份为阴性样本，8份为阳性样品)，分析两种检测结果的符合率。

2、检测结果显示，用所建立的LAMP方法与荧光定量PCR方法检测结果一致(表2)，符合率为100％。但LAMP方法设备依赖低，检测时间短，结果可视化，适用于现场的快速检测。

表2 LAMP与荧光定量PCR方法检测结果

以上检测结果证明了本发明的试剂盒特异性好、灵敏度高、检测方便快捷、结果准确可靠。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京市动物疫病预防控制中心

<120> 一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物组、荧光可视化快速检测试剂盒及方法

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgcaatatac gctttaaacc a 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acattagttt ttcatcgtgg tg 22

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aggggttaca aacaggttat tgatgggagt cattaatgaa atctcgc 47

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tacacaacct ttttgtaaaa cgcgtattgt tggtgtgggt cac 43

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcgcttttcg ctgatacgtg 20

<210> 6

<211> 205

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgcaatatac gctttaaacc atggtttatc ccaggagtca ttaatgaaat ctcgctcacg 60

aataatgaac tttacatcaa taacctgttt gtaacccctg aaatacacaa cctttttgta 120

aaacgcgttc gcttttcgct gatacgtgtc cataaaacgc aggtgaccca caccaacaat 180

aaccaccacg atgaaaaact aatgt 205

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgctcacgaa taatgaactt 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttccaggtag gttttaatcc t 21

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcgaaaagcg aacgcgtttt aaataacctg tttgtaaccc ct 42

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gatacgtgtc cataaaacgc aggtgggcca tttaagagca g 41

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgacccacac caacaataac c 21

Claims

1.一组用于检测非洲猪瘟病毒的特异性引物组，其特征在于，其包括一对特异性外引物，一对特异性内引物和一条环引物，其特异性外引物的核苷酸序列分别为如SEQ ID NO.1所示的F3和如SEQ ID NO.2所示的B3，所述特异性内引物的核苷酸序列分别为如SEQ IDNO.3所示的FIP和如SEQ ID NO.4所示的BIP，所述环引物的核苷酸序列为如SEQ ID NO.5所示。

2.一种检测非洲猪瘟病毒的LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物组合。

3.一种检测非洲猪瘟病毒的可视化快速检测试剂盒，其特征在于，其包括一对特异性外引物，一对特异性内引物，一条环引物和Bst DNA聚合酶及荧光目视检测试剂，其中，特异性外引物的核苷酸序列分别为如SEQ ID NO.1所示的F3和如SEQ ID NO.2所示的B3，所述特异性内引物的核苷酸序列分别为如SEQ ID NO.3所示的FIP和如SEQ ID NO.4所示的BIP，所述环引物的核苷酸序列为如SEQ ID NO.5所示，所述荧光目视检测试剂为含有Mn²⁺的钙黄绿素溶液。

4.根据权利要求3所述的可视化快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测试剂，所述检测试剂包括无DNA酶的蒸馏水、LAMP反应液、阴性质控标准品和阳性质控标准品；所述LAMP反应液中含有所述的一对特异性外引物，一对特异性内引物，一条环引物和Bst DNA聚合酶及荧光目视检测试剂。

5.根据权利要求3所述的可视化快速检测试剂盒，其特征在于，还包括样品快速处理试剂，所述样品快速处理试剂含有聚乙二醇、Triton-X100、EDTA、Ttis-HCl，海藻糖。

6.根据权利要求5所述的可视化快速检测试剂盒，其特征在于，所述样品快速处理试剂为含有质量百分比为2.5％的聚乙二醇，3mg/mL的蛋白酶K，0.1％Triton-X100的DNAExtract Solution A，和含3mmol/LEDTA，1.5mmol/L Ttis-HCl，质量百分比为0.25％的海藻糖的DNA Extract Solution B。

7.一种用于检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

S1、从样品中提取DNA；

S2、对步骤S1提取的所述DNA进行等温扩增；其中，在反应体系中，采用如权利要求1所述的引物组，置于63℃恒温反应；

8.根据权利要求7所述的用于检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于，在步骤(1)中，样品中提取DNA采用如下方法进行：将样本拭子上清10μL加入到1.5mL离心管中，加入100μLDNA Extract Solution A，涡旋震荡20s，室温静置3-5min或95℃金属浴孵育3-5min进行裂解，之后再加入100μLDNA Extract Solution B，涡旋震荡30s，获得检测样品DNA；

9.根据权利要求7所述的用于检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述反应体系中含有2×反应缓冲液12.5μL、8μmol/L的外引物F3 1μL、8μmol/L的外引物B3 1μL、35μmol/L的内引物FIP 1μL、35μmol/L的内引物BIP 1μL、15μmol/L的环引物LB 1μL、无DNA酶的蒸馏水0.5μL，1μL含6mmol/L MnCl₂和0.4mmol/L的钙黄绿素溶液的荧光目视检测剂；1μL的Bst DNA聚合酶溶液，加入样品DNA 5μL。

10.根据权利要求7所述的用于检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于，在步骤(2)中，设置有阳性质控和阴性质控，阳性质控为使用非洲猪瘟病毒P72基因的重组质粒为阳性模板进行检测，所述P72基因的序列如SEQ ID NO.6所示，阴性质控为使用空载体质粒为阴性模板进行检测。