CN112359131A - 一种检测青稞条纹病的lamp引物组及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测青稞条纹病的LAMP引物组及其应用，包括内引物FIP/BIP、外引物F3/B3和环引物LB，所述的内引物FIP/BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述的外引物F3/B3的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，所述的环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。本发明提供的引物组检测青稞条纹病具有操作简单，耗时少的特点，且具有很好的准确性。

Description

一种检测青稞条纹病的LAMP引物组及其应用

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种检测青稞条纹病的LAMP引物组及其应用。

背景技术

青稞是青藏高原最具特色的农作物，在藏族同胞食物结构中起着营养与健康平衡作用，同时青稞也是主要酿酒业、食品和饲料等加工业的重要原料。青藏高原区域内青稞总播种面积约35万hm²，产量约100万t，分别为整个粮食作物面积的43％和总产的38％，青稞产业的发展对于保障青藏高原地区粮食安全和社会稳定具有重大意义。由麦类核腔菌Pyrenophoragraminea(Rabenk.)ItoetKurib.引起的青稞条纹病是青稞生产上最重要病害，为种子传播侵染的系统性病害，感病种子播种后，在植株叶片上沿叶脉方向出现黄色或褐色状条纹，植株发育不良从而产生不育穗，对青稞产量和品质造成严重损失。在青藏高原青稞条纹病每年造成的产量损失约10％左右，发病严重的田块减产可高达25％。种子带菌是唯一的初侵染源，病原菌侵染后潜伏在青稞种子里，加重了翌年条纹病的再侵染为害。研究表明控制该病害有效的方法就是药剂拌种，或在病害发生初期及时拔除病株，建立无病留种田。但是由于受经济发展和环境条件等的限制，目前青稞生产用种55％以上依靠农户自留种，青稞产区统一供种及外购率仅30％～45％，以粮代种等导致条纹病发生逐年加重。因此，有必要开展青稞种子带菌检测，根据种子带菌率进行播前种子药剂处理，严把健康良种关口是控制该病害的重要技术手段。

目前国际上用于青稞条纹病菌的检测方法主要有病原菌组织分离法利用特异性引物进行PCR或者实时荧光定量PCR的方法等，但是这些技术程序繁琐，周期长，所用仪器级别高且价格昂贵，且实验条件苛刻，只能在配置较高的实验室开展，难以在青藏高原推广应用。因此，开发一种操作简便，检出效率高，用时短，可视化，不需要高级复杂的仪器设备的快速检测方法迫在眉睫。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)2000年由日本学者Notomi等开发，该方法运用4条特异性引物，可以识别靶序列的6个区域，在65℃左右的恒温条件下反应15～60min可以达到10⁶～10⁹拷贝数，扩增结果在指示剂染色下可直接肉眼观察判断，已经广泛应用于动植物体病毒及细菌的检测。

发明内容

本发明的目的在于建立青稞条纹病病菌的LAMP的检测体系，提供一种检测青稞条纹病的LAMP引物组，旨在为有效开展种子中带菌检测和评估，对病害进行有效控制提供技术支撑。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种检测青稞条纹病的LAMP引物组，包括内引物FIP/BIP、外引物F3/B3和环引物LB，所述的内引物FIP/BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述的外引物F3/B3的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，所述的环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

优选的，所述引物还包括将FIP/BIP、F3/B3和LB序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后具有与上述序列具有相同功能的DNA分子。

在本发明的另一方面，提供了一种检测青稞条纹病的试剂盒，所述的试剂盒包括内引物FIP/BIP、外引物F3/B3和环引物LB。

所述的试剂盒中内引物、外引物和环引物的摩尔浓度比为8:2:1。

在本发明的另一方面，还提供了一种检测青稞条纹病的方法，包括以下步骤：

1)提待测样品DNA；

2)以获得的DNA为模板，利用上述内引物FIP/BIP、外引物F3/B3和环引物LF/LB进行扩增反应；

3)反应结束后加入SYBR GreenI染料进行判定(阳性呈荧光绿，阴性呈橘色)。

进一步的，反应体系为：10×Isothermal Amplification Buffer 2.5μL，MgSO₄10mM，dNTP Mixture 1mM，甜菜碱0.8M，Bst2.0

DNA聚合酶0.32U·μL^-1，内外引物及环引物分别为1.6μm，0.2μm和0.4μm，DNA模板为2μL补充无菌去离子水至25μL。

进一步的，反应条件为63℃，60min。

在本发明的另一方面，还提供了上述内引物FIP/BIP、外引物F3/B3和环引物LB在检测青稞条纹病中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明在温度为63℃反应时间为60min的条件下，对P.graminea具有良好的特异性，其最低检测限度为6.541pg·μL^-1。SYBR GreenI显色法判定，操作简单、成本低、灵敏度高，假阳性概率小。

附图说明

图1是本发明不同地区青稞条纹病病菌LAMP检测；1-39：为不同地区的分离的条纹病病菌；40：阴性对照；

图2是本发明以Pyrenophora graminea基因组DNA为模板的LAMP法灵敏度检测；a：不同DNA浓度下扩增反应目视图；b：不同DNA浓度扩增反应产物电泳图；c：常规PCR电泳图；1-7的DNA浓度依次为6.541×10¹ng·μL^-1；6.541×10⁰ng·μL^-1；6.541×10²pg·μL^-1；6.541×10¹pg·μL^-1；6.541×10⁰pg·μL^-1；6.541×10²fg·μL^-1和6.541×10¹fg·μL^-1；8：阴性对照；M：Marker；

图3是本发明LAMP反应的特异性检测；a：不同菌株扩增反应的目视图；b：不同菌株扩增反应产物电泳图；1：麦类核腔菌P.graminea；3-9：其他菌株；10：阴性对照；M：marker；

图4是本发明高感青稞样品LAMP检测；a：高感青稞品种1141目视图；b：高感品种BDM02-13目视图；1：阳性对照；2-31：高感青稞样品；32：阴性对照；

图5是本发明青稞组织液中青稞条纹病的检测；1：阳性对照；2-5：分别是感条纹病种子捣碎处理，感条纹病种子，健康种子，健康种子捣碎处理；6：阴性对照；

图6是本发明混合试剂不同保存时间LAMP检测结果目视图；a-d：分别是混合试剂放置-20℃冰箱1d、7d、14d和28d，再转入4℃冰箱放置24h的检测图；1：阳性对照；2-5：分别是带菌种子捣碎处理，带菌种子，健康种子，健康种子捣碎处理；6：阴性对照。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1试验材料、试剂与仪器

供试菌株：39个分离于青海青稞主产区的条纹病菌株和8个对照菌株(如表1所示)，所有菌株均通过引物ITS1和ITS4 PCR扩增检测验证确实为该病害的致病菌，其中燕麦核腔菌Pyrenophora avena由甘肃农业大学提供，其余病原菌均由青海省农业有害综合治理重点实验室提供。

表1用于检测Pyrenophora graminea引物特异性的青稞病害

供试青稞品系：1141和BDM02-13，乳熟期条纹病发病田间调查带病株率分别为87％和15％以上，以上青稞种子由青海省农业有害综合治理重点实验室提供。

试剂：SYBR GreenI(10000×)，北京索莱宝科技有限公司；Bst2.0

DNA聚合酶，MgSO₄，10×Isothermal Amplification Buffer，NEB(北京)有限公司；甜菜碱，美国Sigma-Aldrich公司；DNA提取试剂盒HP Fungal DNA Kit，Omega Bio-Tek科技有限公司；dNTP Mixture 10mM，RNase-free Water和Lysis Buffer for Microorganism toDirect PCR，宝生物工程(大连)有限公司。

仪器：Qiagen TissueLyserII组织研磨仪，Thermo sorvall ST 16R高速冷冻离心机，Thermo NanoDrop OneC微量核酸蛋白测定仪，Applied Biosystems Veriti PCR仪和BIO-RAD电泳仪等。

2方法

2.1基因组DNA提取

病原菌的基因组DNA提取，参考DNA提取试剂盒HP Fungal DNA Kit说明书提取方法，获得总DNA经2％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，同时DNA稀释10倍后保存于-20℃冰箱。

2.2引物设计及合成

实验室分离的39株条纹病菌菌株在NCBI中比对均为条纹病病菌。GenBank中查找到一条名为pig14 gene(GenBank:AJ277800.1)的序列，在NCBI检索表明该序列与其他菌无同源性。用该段序列经PrimerExplore V5设计出5组引物，引物信息见表2。经特异性和灵敏性分析后，选取引物组4作为检测引物组。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。目的基因片段见图1。

表2用于pg-pig14基因LAMP扩增的引物序列

2.3 LAMP检测方法的建立

建立的LAMP检测方法反应体系：LAMP反应体系设定为25μL：10×IsothermalAmplification Buffer 2.5μL，MgSO₄ 10mM，dNTP Mixture 1mM，甜菜碱8M，Bst2.0

DNA聚合酶0.32U·μL^-1，内外引物及环引物分别为1.6μm，0.2μm和0.4μm，DNA模板为2μL补充无菌去离子水至25μL。加入至少30μL液体石蜡混匀离心后，63℃反应60min。

反应结束后加入SYBR GreenI染料进行判定(阳性呈荧光绿，阴性呈橘色)。

2.4检测结果

LAMP技术检测不同地区青稞条纹病病菌39个采样点分离得到的青稞条纹病病菌提取DNA后用于检测，结果如图1所示，所有地点LAMP检测结果均显示为阳性，表明本研究的LMAP检测技术可有效检测青海地区的青稞条纹病。

实施例2灵敏度检测

以P.graminea基因组DNA溶液为模板，测定其浓度为6.541×10²ng·μL^-1，进行10倍梯度稀释，使其浓度为：6.541×10¹ng·μL^-1；6.541×10⁰ng·μL^-1；6.541×10²pg·μL^-1；6.541×10¹pg·μL^-1；6.541×10⁰pg·μL^-1；6.541×10²fg·μL^-1和6.541×10¹fg·μL^-1共7个梯度，为减少误差，同时稀释三组，稀释结束将三组合为一组。取2μL添加至反应体系，以ddH₂O作为阴性对照，每个梯度重复三次。同时与常规PCR比较其最低检测量，评估其灵敏度。

常规PCR反应程序为：92℃预变性10min；92℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃延伸10min。

如图2所示，当浓度降到6.541×10⁰pg·μL^-1以下，反应液颜色为橙色，且电泳显色表明无DNA扩增(图2a和b)，表明本研究LAMP反应体系检测最低限度为6.541×10⁰pg·μL^-1。用相同DNA模板经常规PCR扩增，产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，DNA浓度为6.541×10⁰pg·μL^-1时，无特异性条带出现；模板浓度为6.541×10¹pg·μL^-1时，仅有微弱条带出现(图2c)，表明常规PCR最低检测限度为6.541×10¹pg·μL^-1。经对比，本研究的LAMP检测方法比常规PCR技术灵敏度高10倍。

实施例3特异性检测

以麦类核腔菌P.graminea，燕麦核腔菌P.avena，坚黑粉菌U.hor dei，裸黑粉菌U.nuda，禾生指葡孢霉D.graminicola，链格孢A.alter nata，禾谷镰刀菌F.graminearum，稻梨孢P.oryae Cav.和条形柄锈菌(小麦专化型)P.striiformis West基因组DNA作为模板，以ddH₂O代替菌DNA作为阴性对照。采用本发明反应体系进行试验，结果通过SYBRGreenI荧光染料法进行分析。

如图3所示，仅麦类核腔菌P.graminea DNA为模板的反应体系有荧光绿色(图3a)，且凝胶电泳显色表明仅P.graminea DNA可以产生特异的梯形条带(图3b)，表明本研究的LAMP反应体系对其它菌株无扩增反应，具有较强特异性。

实施例4青稞种子中条纹病病菌LAMP检测

1)适用于基层富集青稞种子中微生物的方法

镊子夹住单颗青稞种子在自来水下上下翻转冲洗15s，手动甩去种子附着的水珠，放入0.2mL PCR 8连管中并加入无菌水20μL，置于22℃恒温培养箱或温度为20-30℃的室内培养3-4d完成富集。

2)富集种子中微生物提取基因组DNA一步法

富集后的0.2mL PCR管中加入50μL Lysis Buffer for Microo rganism toDirect PCR裂解液，80℃裂解15min，短暂离心后取2μL上清液添加至LAMP反应体系。

3)LAMP检测青稞种子中条纹病菌

选取健康种子和感染条纹菌种子各2个处理，其中处理1用10μL移液器吸头捣碎释放种子组织，处理2不做任何处理，裂解后取2μL添加至LAMP反应体系。同时，以P.graminea基因组DNA溶液和无菌水分别作为阳性和阴性对照。

4)结果

分别以感条纹病种子捣碎处理，感条纹病种子，健康种子，健康种子捣碎处理为LAMP扩增模板进行检测，结果显示如图4，P.graminea DNA，带菌种子捣碎处理裂解液和带菌种子裂解液均为阳性，其余实验组均为阴性，表明本发明LAMP反应体系可以准确检测到种子中的P.graminea且不受青稞种子组织的影响。

实施例5青稞种子中条纹病菌的带菌率检测

选取30粒品种为1141和BDM02-13青稞种子经富集和裂解处理得到裂解液。同时以P.graminea基因组DNA溶液和无菌水分别作为阳性和阴性对照进行LAMP检测。反应前加入0.5μL SYBR GreenⅠ于PCR管顶盖，反应结束后短暂离心混匀，反应液荧光绿为阳性记为被P.graminea感染的种子即带菌种子，橘色为阴性记为未被P.graminea感染的种子即未带菌种子。

种子带菌率＝带菌种子数/总检测种子数

1141和BDM02-13是已知的高感品种，乳熟期条纹病发病田间调查带病株率分别为87％和15％以上，随机选取该品种的30颗种子经实施例4中富集和一步法得到富集微生物的混合裂DNA解液，各取2μL加入LAMP反应体系中，同时以P.graminea DNA和ddH₂O分别作为阳性对照和阴性对照。结果显示如图5，1141和BDM02-1330颗种子中分别有22和12颗显示阳性。感病率为73.3％和43.3％，与田间调查较为一致。表明本研究LAMP反应体系可有效检测青稞种子中条纹病带菌率。

实施例6适用于生产上快速诊断的LAMP检测简化操作

为了能携带试剂在田间及仓库检测青稞是否带菌，将预先混合的试剂A和B，设置了试剂不同的储存时间，混合试剂放置-20℃冰箱1d，7d，14d和28d，再转入4℃冰箱放置24h后，混合试剂A和B(如表3)，取健康种子、含组织液的健康种子、感条纹病种子和含组织液的感条纹病种子的裂解液，同时，以P.graminea基因组DNA溶液和无菌水分别作为阳性和阴性对照，进行LAMP反应。

表3 LAMP混合试剂组分

LAMP检测结果如图6，试剂A和试剂B保存1和7d时，检测结果有效。当试剂A和试剂B保存14d和28d时，仅阳性和阴性对照正常，其他实验组出现不同情况的假阳性，且保存14d时带菌种子出现阴性情况，可能是放置时间太久导致混合试剂里面发生了反应。因此试剂A和试剂B保存7d及7d以内是有效的，可以用于生产上快速检测。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 青海省农林科学院

<120> 一种检测青稞条纹病的LAMP引物组及其应用

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gccagaactg aaccaggcag tacttcgaca ttttgcgatc cg 42

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgcacgaca cctgggaaat agtcgatcgt ctcatccgat 40

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagaataagg gccgtcttgg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aggaccacac attcaaccaa 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgagtctccc tgcgggacaa 20

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctgctactg cctggttc 18

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcccggctga taatactgct 20

<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gatttcccag gtgtcgtgcg gagttctggc gttactcgga 40

<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcggatgaga cgatcgactg ctcactgcgc cagcttatgc 40

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tccaggctgc actatcatca 20

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cggcccttat tctgttcgt 19

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gccattgtgt gcatgcggag tcttttgccc gttcttctcg 40

<210> 13

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tccaaatcca acggctgcga aggcatctca ttgcagaggt 40

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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aatgagatgc cggccaaat 19

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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attgtcccgc agggagac 18

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ggccacacgg atcgcaaaat gcagaataag ggccgtcttg g 41

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ctgcctggtt cagttctggc gtcgatttcc caggtgtcgt 40

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gcccgttctt ctcgttacc 19

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tcgcaaaatg tcgaagcagt 20

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<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cgcagccgtt ggatttggat tttatccttg gtcttgcctc cg 42

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<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cggcctcttt cgcaacctct cggcccttat tctgttcgtt 40

Claims (7)

1.一种检测青稞条纹病的LAMP引物组，其特征在于，包括内引物FIP/BIP、外引物F3/B3和环引物LB，所述的内引物FIP/BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述的外引物F3/B3的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，所述的环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

2.根据权利要求1所述的一种检测青稞条纹病的LAMP引物组，其特征在于，所述引物还包括将FIP/BIP、F3/B3和LB序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后具有与上述序列具有相同功能的DNA分子。

3.一种检测青稞条纹病的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括内引物FIP/BIP、外引物F3/B3和环引物LB。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中内引物、外引物和环引物的摩尔浓度比为8:2:1。

5.一种检测青稞条纹病的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提待测样品DNA；

2)以获得的DNA为模板，利用上述内引物FIP/BIP、外引物F3/B3和环引物LF/LB进行扩增反应；

3)反应结束后加入SYBR GreenI染料进行判定。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，反应体系为：10×IsothermalAmplification Buffer 2.5μL，MgSO₄ 10 mM，dNTP Mixture 1mM，甜菜碱0.8M，Bst2.0

DNA聚合酶0.32U·μL^-1，内外引物及环引物分别为1.6μm，0.2μm和0.4μm，DNA模板为2μL补充无菌去离子水至25μL；反应条件为63℃，60min。

7.权利要求1所述的引物组在检测青稞条纹病中的应用。

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