CN114196766B - 用于特异鉴定水稻白叶枯菌Xoo的分子标记、引物对、试剂盒和方法 - Google Patents

用于特异鉴定水稻白叶枯菌Xoo的分子标记、引物对、试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于特异鉴定水稻白叶枯菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)的分子标记、引物、试剂盒和方法，所述分子标记位于以CP000967.2为参考基因组的2381740‑2382014位置；所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.3所示，所述方法包括：获得病斑叶的DNA；使用所述引物对所述DNA进行PCR扩增，获得PCR产物进行后电泳检测，依据预期条带的有无获得是否检出Xoo的结论。本发明不依赖于培养和病症，可在1小时内完成水稻样品中Xoo的检测，具有快速、简便和灵敏的检测优势，对白叶枯病害的早发现早治疗具有重要意义。

Description

用于特异鉴定水稻白叶枯菌Xoo的分子标记、引物对、试剂盒和方法
技术领域
本发明实施例涉及生物技术领域，特别涉及一种用于特异鉴定水稻白叶枯菌Xoo的分子标记、引物对、试剂盒和方法。
背景技术
水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)是一种在世界范围内严重影响水稻产量的细菌性病害，包括oryzae(简称Xoo)和oryzicola(简称Xoc)两个病理型，分别引起水稻白叶枯病(BLB)和水稻条斑病(BLS)。Xoo和Xoc在遗传和表型上都高度相关，难以区分。BLB是一种以边缘叶病变为特征的维管束疾病，是水稻三大病害之一，发生范围广、流行速度快、危害大，现今除在亚洲流行外，在非洲、美洲等地也都有发生，一般情况下可造成水稻减产20％-30％，重病田损失80％，甚至绝收，给世界各地水稻种植生产造成了巨大经济损失，属于国内外重点检疫性病害。因此，建立一套简便、快速、低成本的水稻白叶枯菌Xoo快速检测方法，对于病害的早期诊断和及时防控病原菌的流行与传播具有重要意义。
传统的Xoo的检测方法主要是病症直接观察法和病原菌形态观察法，病症直接观察法是最直接的鉴定方法，但依赖于个人经验，主观性与随意性较大，且难以鉴定混合病原菌感染与相似病症，而且病症出现时，往往损失已难以避免。病原菌形态观察法是长久以来最常使用的鉴定方法，但需要分离培养病原菌，根据病原菌菌落的大小、形状、生物学特性等进行鉴定，耗时费力，且由于同一物种下不同生理型的病原菌几乎无形态区分，无法精准到致病小种。近年来，基于光谱分析、图像处理、机器学习、卷积神经网络等新一代信息技术可用于白叶枯病的鉴定，但存在依赖病症的缺点。随着分子生物学的发展，常规PCR、LAMP和实时荧光定量PCR等分子技术无需分离培养病原菌，直接检测混合提取的宿主和病原菌核酸，具有快速、特异性强、灵敏度高等优点。
基于PCR技术检测白叶枯菌Xoo特异的分子标记，通过产物的有无直接判定病源菌的有无，是最简单的方法。另外，基于PCR的检测技术需要对样本的总DNA进行提取，常用的方法有十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法、十二烷基硫酸钠(SDS)法和试剂盒法等，以上方法均需用到苯酚、三氯甲烷、异戊醇等有毒的试剂，离心机等专业的仪器设备，操作过程繁琐、耗时费力，不利于白叶枯病实时监测和病害的快速诊断。
因此，开发用于特异鉴定水稻白叶枯菌Xoo的特异的分子标记、引物对、试剂盒以及快速简便的、免培养的检测方法，成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明目的是提供一种用于特异鉴定水稻白叶枯菌Xoo的分子标记、引物对、试剂盒和方法，可用于特异鉴定水稻白叶枯菌Xoo。基于特异分子标记的水稻白叶枯菌Xoo的检测方法，免去耗时的病源菌的分离培养过程，简化DNA提取步骤，可在1小时内完成样品中白叶枯菌Xoo的检测，为水稻白叶枯菌Xoo的快速、简便检测提供一个新的技术。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
在本发明的第一方面，提供了一种用于特异鉴定水稻白叶枯菌Xoo的分子标记，所述分子标记位于水稻白叶枯菌Xoo PXO99A的参考基因组CP000967.2的2381740-2382014，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的第二方面，提供了一种用于特异鉴定水稻白叶枯菌Xoo的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.3所示。
进一步地，所述引物对还包括在所述引物序列的5’端标记有荧光基团，3’端标记均有猝灭基团；所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red中的一种，所述猝灭基团包括TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3中的一种。
在本发明的第三方面，提供了一种用于特异鉴定水稻白叶枯菌Xoo的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物对。
进一步地，所述试剂盒还包括PCR反应预混液。所述PCR反应预混液包括普通PCR反应预混液和高保真PCR反应预混液。
在本发明的第四方面，提供了一种用于特异鉴定水稻白叶枯菌Xoo的方法，所述方法包括：
提取获得病斑叶的DNA；
以所述病斑叶的DNA为模板，加入所述的引物对进行PCR反应，获得PCR产物；
将所述PCR产物经琼脂糖凝胶进行电泳检测，获得检测条带；根据所述检测条带的大小判定是否含有水稻白叶枯菌Xoo；
或者以所述病斑叶的DNA为模板，加入加有荧光基团的所述的引物对进行荧光PCR，获取荧光信号；根据所述荧光信号判定是否含有水稻白叶枯菌Xoo：若有超过临界值的荧光信号，则证明含有水稻白叶枯菌Xoo。
上述技术方案中，所述根据所述检测条带的大小判定是否含有水稻白叶枯菌Xoo具体为：若有275bp的检测条带，则证明含有水稻白叶枯菌Xoo。
进一步地，所述提取获得病斑叶的DNA，具体包括：
将清洁后的病斑叶浸入裂解液中研磨后获得粗提物；
获得用于结合DNA的滤纸条，所述滤纸条包括核酸结合区和手柄区；
将所述用于结合DNA的滤纸条依次浸入所述粗取物和清洗液中，获得带有病斑叶的DNA的滤纸条。
进一步地，所述PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸15s，扩增30个循环；72℃延伸2min。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明提供了一种用于特异鉴定水稻白叶枯菌Xoo的分子标记、引物对、试剂盒和方法，该引物对可以快速、灵敏、特异的检测到水稻白叶枯菌Xoo的分子标记，本发明基于特异分子标记的水稻白叶枯菌Xoo的检测方法可在1小时内完成样品中白叶枯菌Xoo的检测，免去了耗时的病原菌分离培养过程、简化了DNA提取步骤，为水稻白叶枯菌Xoo的快速、简便检测提供一个新的技术。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明实施例的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明的分子位点的扩增情况；其中图1A：PCR产物经电泳检测是单一条带；图1B为测序结果；
图2为本发明实施例提供的标记和方法鉴定水稻白叶枯菌Xoo的灵敏度评估结果；其中，10^4,10^3,10^2分别代表10000，1000，100cfu的Xoo。阴性对照：不加Xoo的水稻叶片模板；阳性对照：不添加到水稻叶片里的纯的菌液模板。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明实施例，本发明实施例的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明实施例，而非限制本发明实施例。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明实施例所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明实施例中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
首先，本发明开发了用于特异鉴定的白叶枯病致病菌Xanthomonas oryzaepv.oryzae(Xoo)特异的分子标记，所述分子标记位于水稻白叶枯菌Xoo PXO99A的参考基因组CP000967.2的2381740-2382014，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
接着，本发明设计出了扩增所述标记位点的PCR引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.3所示。需要说明的是，所述引物对只要检出就是Xoo，不扩增Xoc。
本发明提供了一种用于特异鉴定水稻白叶枯菌Xoo的方法，所述方法包括：
步骤S1、提取获得病斑叶的DNA；
所述步骤S1可以采用植物基因组DNA提取法提取病斑叶的DNA、细菌基因组DNA提取法提取病斑叶的DNA和快速提取法提取病斑叶的DNA；本发明实施例优选快速提取法提取病斑叶的DNA；
作为一种可选的实施方式，所述快速提取法提取病斑叶的DNA具体包括：将清洁后的病斑叶浸入裂解液中研磨后获得粗提物；获得用于结合DNA的滤纸条，所述滤纸条包括核酸结合区和手柄区；将所述用于结合DNA的滤纸条依次浸入所述粗取物和清洗液中，获得带有病斑叶的DNA的滤纸条。
步骤S2、以所述病斑叶的DNA为模板，加入所述的引物对进行PCR反应，获得PCR产物；或者以所述病斑叶的DNA为模板，加入加有荧光基团的所述的引物对进行荧光PCR，获取荧光信号；
作为一种可选的实施方式，沿用所述快速提取法提取病斑叶的DNA，将带有病斑叶的DNA的滤纸条进入PCR体系，所述PCR体系包括引物对和PCR反应预混液；PCR反应预混液可以为普通PCR反应预混液，也可以为高保真PCR反应预混液；优选高保真PCR反应预混液。
步骤S3、将所述PCR产物经琼脂糖凝胶进行电泳检测，获得检测条带；根据所述检测条带的大小判定是否含有水稻白叶枯菌Xoo：若有275bp的检测条带，则证明含有水稻白叶枯菌Xoo。活着根据所述荧光信号判定是否含有水稻白叶枯菌Xoo：若有超过临界值的荧光信号，则证明含有水稻白叶枯菌Xoo。
作为一种可选的实施方式，快速提取法提取病斑叶的DNA，PCR反应预混液采用高保真PCR反应预混液进行检测，为本发明的所述方法检测方法；所述检测方法可在1小时内完成样品中白叶枯菌Xoo的检测，为水稻白叶枯菌Xoo的快速、简便检测提供一个新的技术。
下面将结合实施例、对比例及实验数据对本申请的一种用于特异鉴定水稻白叶枯菌Xoo的分子标记、引物对、试剂盒和方法进行详细说明。
实施例1、用于特异鉴定水稻白叶枯菌Xoo的分子标记和PCR扩增引物
一、白叶枯菌Xoo特异分子标记的开发
我们收集NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae，X.oryzae)物种的458个小种的全长基因组序列，然后采用MAFFTv7.271工具，按照默认的参数进行多重序列对比，筛选Xoo病理型保守且两端区域在Xoc病理型不保守或不存在的区域，两端区域为引物设计区；将筛选到的区域在NCBI上进行Nucleotide BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，筛选Xoo特异的区域；采用NCBI上的Primer-BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，使用默认参数在引物设计区设计扩增这些Xoo特异区域的引物。获得引物后，使用实验室保存的白叶枯菌Xoo病理型的8个菌株，通过PCR扩增、电泳检测，产物的sanger测序和在NCBI的Nucleotide BLAST的序列比对，对引物的扩增效率和产物单一性、特异性进行评估，最终筛选获得1个白叶枯菌Xoo特异的分子标记及其有效的检测引物(表1)。
表1-白叶枯菌Xoo特异的分子标记及其有效的检测引物
Figure BDA0003336287540000051
S2、引物的检测效果验证
图1展示了分子标记位点的引物检测效果，S1位点的扩增产物经电泳检测只有一条单一的条带，将分子标记的275bp的扩增产物在NCBI genome数据库进行Blastn检索，检索到19个基因组序列，其中有18个是Xoo的基因组，序列一致性均为100％；另有一个是Xanthomonas euvesicatoria pv.Alfalfae的一个小种的基因组序列，其感染的宿主是番茄和辣椒等，在水稻中不能检出。另外，其序列同感染水稻的Xoo也只有94.18％的匹配，从序列上也可以进行区分。这个结果表明了所开发标记的物种特异性和所设计引物扩增的高效性。
实施例2、用于特异鉴定水稻白叶枯菌Xoo的试剂盒
本发明实施例提供一种用于特异鉴定水稻白叶枯菌Xoo的试剂盒，所述试剂盒包括：
(A)引物对：所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.3所示；
(B)PCR反应预混液；所述PCR反应预混液可以为普通PCR反应预混液，也可以为高保真PCR反应预混液；优选高保真PCR反应预混液。
实施例3、简便快速灵敏的白叶枯病检测方法的建立
本研究进一步探索了所开发的特异分子标记的快速简便检测体系，包括快速的宿主DNA提取和快速高效的PCR扩增，建立基于特异分子标记的水稻白叶枯菌Xoo的检测方法所述方法。
一、水稻DNA的快速提取条件
1.1材料
水稻常用的模式品种粳稻TP309和含水稻白叶枯病抗性基因Xa21的水稻系DXT。
1.2水稻白叶枯菌Xoo侵染叶片制备和DNA提取前处理
白叶枯菌Xoo是。将低温保存的来自菲律宾的Xoo病理型的PXO280小种(以下简称P8小种)接种在PSA培养基上活化，28℃培养72h。用无菌水配制悬浮菌液，将浓度调至109cfu/ml。在分蘖期采用剪叶法对4-5片充分伸展的叶片进行接种，并在接种0天，1天，2天，3天，4天，7天和8天后分别采集接种叶片。
剪取距离接种处3cm左右的病健交界处的叶片，表面清洁后用于DAN提取。具体地，先用75％乙醇消毒叶片3分钟，然后用灭菌的去离子水清洗3-5次，用灭菌吸水纸吸干表面水分。1.3病斑叶DNA的提取
1.3.1植物基因组DNA提取法提取病斑叶的DNA
取经1.2方式处理后的0.1g的叶片，置于2ml离心管中，加入磨样钢珠，盖紧离心管盖置于液氮中冷却1分钟，在组织研磨仪上制备粉末。然后参照TIANGEN新型植物基因组DNA提取试剂盒的使用说明(货号：DP305-2,TIANGEN BIOTECH(BEIJING)Co.,Ltd.)，提取样品的DNA。
1.3.2细菌基因组DNA提取法提取病斑叶的DNA
和1.3.1相同的处理方式，将0.1g样品制备成粉末，然后参照TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒的使用说明(货号：DP302-02，TIANGEN BIOTECH(BEIJING)Co.,Ltd)，提取样品中的DNA。
1.3.3快速提取法提取病斑叶的DNA
和1.3.1相同的处理方式获得0.1g的样品叶片，然后制备结合DNA的滤纸条:裁剪长约44mm、宽约2mm的whatman滤纸条，将滤纸条的一部分浸泡在融化的石蜡中(长：约4mm；宽：约2mm)，浸过石蜡的滤纸为手柄区域，另一部分没有浸过石蜡的滤纸为核酸结合区域；配制裂解液(20mM pH 8.0的Tris，25mM Nacl,2.5mM EDTA以及质量分数为0.05％的SDS)和清洗液(10mM pH 8.0的Tris，以及质量分数为0.1％的Tween-20)。具体地，将清洁后的病斑叶0.1g浸入500μL裂解液中，在组织研磨仪上制备粗提物；将制备的滤纸条依次浸入粗取物、500μL清洗液中，每个过程约3s，然后将滤纸条浸入已经配置好的PCR反应体系中3s，即可进行后续的PCR反应。
为了方便实验室使用，本研究对实验体系进行简化，粗提物制备方式采用简单的加入钢珠快速的震荡数次或者用移液吸头碾压数次。
然后以本发明提供的水稻Xoo特异的分子标记L1为检测对象，根据L1在三种DNA的扩增效果评估三种DNA提取方式提取的DNA质量是否满足分子标记的PCR扩增。结果发现，在三种方式提取的DNA中。L1都能有效的扩增。
作为技术比较，本发明对三种DNA提取方法所需的试验流程、时间、设备等进行了详细的比较，比较结果如表2所示；
表2-三种DNA提取方法所需的试验流程、时间、设备、耗材及成本比较
Figure BDA0003336287540000071
由表2可知，虽然从这两种方法提取的样本DNA中也成功检出了预期的标记，但相比之下，所述方法用时最少，操作最简便，无需液氮、组织研磨仪和离心机等专业耗材和设备，只需要廉价的滤纸条，表明本发明所提供的方法，采用简单的机械破碎样本，可在30秒内快速获得满足水稻分子标记PCR扩增的DNA模板，DNA提取方法具有简便快速的技术特点。
二、白叶枯菌Xoo特异分子标记的快速PCR扩增条件的探索
采用高保真和普通的PCR反应预混液，分别扩增经本发明所提供的DNA提取方式获得的DNA粗提液，每个反应液扩增4个样品，结果高保真PCR预混液都能稳定的扩增出预期的条带，而普通PCR反应预混液在部分样本中扩增的预期条带亮度弱于高保真PCR预混液。经上述探索，采用简单的机械破碎样本，可在30秒内快速获得满足水稻分子标记PCR扩增的DNA模板，且采用高保真PCR预混液是优选方案。
PCR扩增的具体操作步骤为：由北京擎科新业生物技术有限公司合成引物，具体序列见表1。普通PCR反应预混液和高保真PCR反应预混液分别为Rapid Taq Master Mix和Phanta Max Master Mix(货号：P222-01，P515-01，Vazyme Biotech Co.,Ltd)。
PCR反应体系为20μL,包括2×Rapid Taq Master Mix或Phanta Max Master Mix10μL，10μmol/L的正反引物各0.5μL，上述1.3.1和1.3.2提取的模板2μL，剩余的用ddH2O补齐。
上述1.3.3提取的DNA是将滤纸条浸入已经配置好的PCR反应体系中3秒，然后进行后续的PCR反应。PCR反应在ETC811扩增仪上进行(北京东胜创新生物科技有限公司)，反应程序为快速PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸30s，扩增30个循环；72℃延伸5min。PCR产物经1％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
实施例4、所提供标记和方法鉴定水稻白叶枯菌Xoo的灵敏度评估
采用人工混合白叶枯菌Xoo和水稻叶片的方式，即在0.1克的水稻叶片上分别加入10000，1000，100，10，1cfu的白叶枯菌Xoo，制备水稻叶片和白叶枯菌Xoo的人工混合物。然后按照探索的水稻DNA快速提取条件和分子标记扩增方式，采用简单的机械破碎混合物后，各添加1ml的提取液进行DNA提取，获得混合物的DNA粗提液。使用高保真PCR预混液，快速PCR扩增，对所提供的分子标记进行检测。
结果如图2所示，表明可以在低至10cfu/ml的人工混合物中检出预期的条带，整个流程从DNA提取到经电泳检测获得PCR扩增结果用时约1h，灵敏度达到10cfu/ml的白叶枯菌Xoo。经上述探索，建立了基于白叶枯菌Xoo特异分子标记的水稻白叶枯菌Xoo快速、简便且灵敏的检测方法。
实施例5、鉴定水稻白叶枯菌Xoo
为了评估所述方法的应用效果，对大田里获得的水稻病斑叶进行了检测，从初有病症开始连续采样8天。用本发明的方法对本发明提供的L1分子标记进行检测，在所有叶片中均成功检出L1分子标记。将275bp的扩增产物在NCBI genome数据库进行Blastn检索，和预期一致，获得序列比对到19个基因组序列，其中有18个是Xoo的基因组，序列一致性均为100％；另有一个是Xanthomonas euvesicatoria pv.Alfalfae的一个小种的基因组序列，序列一致性仅有94.18％的匹配。表明本发明的分子标记、引物对、试剂盒和方法可灵敏地从大田叶片中在病症早期对水稻白叶枯菌Xoo进行检测，具有免培养、简便、快速和灵敏的特点。
本发明的所述方法实现了水稻白叶枯病简单快速的早期检测，对于指导水稻白叶枯病的早期适时防控具有重要意义。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明实施例的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明实施例范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明实施例进行各种改动和变型而不脱离本发明实施例的精神和范围。这样，倘若本发明实施例的这些修改和变型属于本发明实施例权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明实施例也意图包含这些改动和变型在内。
                         序列表
<110>  江汉大学
<120>  用于特异鉴定水稻白叶枯菌Xoo的分子标记、引物对、试剂盒和方法
<160>  3
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  275
<212>  DNA
<213>  水稻白叶枯菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)
<400>  1
ccgttgtcga cagaatcagt gacgaagatg ttcgcaaaga tatccgcctg cctgccacca  60
tcgatccgcc aagaattgaa ggaccgcagt ggaaaattgt ccgtcacacc ccatgacctc 120
cgccatacgt gcgccgtggt tcggctgaat caattgctcc agcaagggga ctcgatggac 180
gaagccctac agaagttgcg cgccttcttc ggttggtcaa gagagtcgca gatgccagtt 240
cgctacgccc gagcagtttt tgaagatcgc ctctc                            275
<210>  2
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  2
ccgttgtcga cagaatcagt ga                                           22
<210>  3
<211>  23
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  3
gagaggcgat cttcaaaaac tgc                                          23

Claims (9)

1.一种用于特异鉴定水稻白叶枯菌Xoo的分子标记，其特征在于，所述分子标记位于水稻白叶枯菌XooPXO99A的参考基因组CP000967.2的2381740-2382014，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种用于特异鉴定水稻白叶枯菌Xoo的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求2所述的一种用于特异鉴定水稻白叶枯菌Xoo的引物对，其特征在于，所述引物对还包括在所述引物序列的5’端标记有荧光基团，3’端标记均有猝灭基团；所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red中的一种，所述猝灭基团包括TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3中的一种。
4.一种用于特异鉴定水稻白叶枯菌Xoo的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2-3任一项所述的引物对。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应预混液。
6.一种水稻白叶枯菌Xoo鉴定的方法，其特征在于，所述方法包括：
提取获得病斑叶的DNA；
以所述病斑叶的DNA为模板，加入权利要求2所述的引物对进行PCR反应，获得PCR产物；
将所述PCR产物经琼脂糖凝胶进行电泳检测，获得检测条带；根据所述检测条带的大小判定是否含有水稻白叶枯菌Xoo；
或者以所述病斑叶的DNA为模板，加入权利要求3所述的引物对进行荧光PCR，获取荧光信号；根据所述荧光信号判定是否含有水稻白叶枯菌Xoo：若有超过临界值的荧光信号，则证明含有水稻白叶枯菌Xoo。
7.根据权利要求6所述的一种水稻白叶枯菌Xoo鉴定的方法，其特征在于，所述根据所述检测条带的大小判定是否含有水稻白叶枯菌Xoo具体为：若有275bp的检测条带，则证明含有水稻白叶枯菌Xoo。
8.根据权利要求6所述的一种用于特异鉴定水稻白叶枯菌Xoo的方法，其特征在于，所述提取获得病斑叶的DNA，具体包括：
将清洁后的病斑叶浸入裂解液中经研磨仪或是清洁后的磨样钢珠、移液吸头等固体物连续碾压破碎后获得粗提物；
获得用于结合DNA的滤纸条，所述滤纸条包括核酸结合区和手柄区；
将所述用于结合DNA的滤纸条依次浸入所述粗提物和清洗液中，获得带有病斑叶的DNA的滤纸条。
9.根据权利要求6所述的一种用于特异鉴定水稻白叶枯菌Xoo的方法，其特征在于，所述PCR的扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸15s，
扩增30个循环；72℃延伸2min。
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