CN114150077B - 用于鉴定水稻黄单胞菌的分子标记、引物组合物、试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定水稻黄单胞菌的分子标记、引物组合物、试剂盒和方法，所述分子标记包括：位于水稻黄单胞菌PXO61的基因组CP033187.3为参考序列的S1、S2、S3、S4、S5和S6。所述引物组合物包括6对引物中的至少一对；所述试剂盒包括权利要求2所述的引物组合物。所述方法包括：获得病斑叶的DNA；以所述DNA为模板，使用所述引物组合物对所述分子标记进行单重或多重PCR扩增，获得PCR产物；依据预期PCR产物的有无获得样本中是否检出水稻黄单胞菌；本发明可在1小时内完成样品中黄单胞菌的检测，为水稻黄单胞菌的快速、简便检测提供一个新的技术。

Description

用于鉴定水稻黄单胞菌的分子标记、引物组合物、试剂盒和方法

技术领域

本发明实施例涉及生物技术领域，特别涉及一种用于鉴定水稻黄单胞菌的分子标记、引物组合物、试剂盒和方法。

背景技术

水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)是一种在世界范围内严重影响水稻产量的细菌性病害，包括oryzae(简称Xoo)和oryzicola(简称Xoc)两个病理型，分别引起水稻白叶枯病(BLB)和水稻条斑病(BLS)。BLB是一种以边缘叶病变为特征的维管束疾病，BLS是影响薄壁细胞而导致叶片呈条纹。水稻黄单胞菌发生范围广、流行速度快、危害大，现今除在亚洲流行外，在非洲、美洲等地也都有发生，一般情况下可造成水稻减产20％-30％，重病田损失80％，甚至绝收，给世界各地水稻种植生产造成了巨大经济损失，属于国内外重点检疫性病害。因此，建立一套简便、快速、低成本的水稻黄单胞菌快速检测方法，对于病害的早期诊断和及时防控病原菌的流行与传播具有重要意义。

传统的水稻白叶枯病和条斑病的检测方法主要是病症直接观察法和病原菌形态观察法，而两者在水稻叶片上的表型很多时候难以用肉眼区分。病症直接观察法是最直接的鉴定方法，但依赖于个人经验，主观性与随意性较大，且难以鉴定混合病原菌感染与相似病症，而且病症出现时，往往损失已难以避免。病原菌形态观察法是长久以来最常使用的鉴定方法，但需要分离培养病原菌，根据病原菌菌落的大小、形状、生物学特性等进行鉴定，耗时费力，且由于同一物种下不同生理型的病原菌几乎无形态区分，无法精准到致病小种。近年来，基于光谱分析、图像处理、机器学习、卷积神经网络等新一代信息技术可用于白叶枯病的鉴定，但存在依赖病症的缺点。随着分子生物学的发展，常规PCR、LAMP和实时荧光定量PCR等分子技术无需分离培养病原菌，直接检测混合提取的宿主和病原菌核酸，具有快速、特异性强、灵敏度高等优点。

PCR基于的检测技术需要开发水稻黄单胞菌特异的分子标记。目前还未有系统的此类分子标记开发的报道。另外，PCR基于的检测技术需要对植物的总DNA进行提取，常用的方法有十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法、十二烷基硫酸钠(SDS)法和试剂盒法等，以上方法均需用到苯酚、三氯甲烷、异戊醇等有毒的试剂，离心机等专业的仪器设备，操作过程繁琐、耗时费力，不利于白叶枯病实时监测和病害的快速诊断。

因此，开发用于鉴定水稻黄单胞菌特异的分子标记、引物组合物、试剂盒和方法以及检测方法，成为亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明目的是提供一种用于鉴定水稻黄单胞菌的分子标记、引物组合物、试剂盒和方法，基于特异分子标记的快速简便的水稻黄单胞菌的检测方法可在1小时内完成样品中黄单胞菌的检测，为水稻黄单胞菌的快速、简便检测提供一个新的技术。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

在本发明的第一方面，提供了一种用于鉴定水稻黄单胞菌的分子标记，所述分子标记包括：位于水稻黄单胞菌PXO61的参考基因组CP033187.3的S1、S2、S3、S4、S5和S6分子标记，所述S1、S2、S3、S4、S5和S6分子标记的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示。

在本发明的第二方面，提供了一种用于鉴定水稻黄单胞菌的引物组合物，所述引物组合物包括6对引物中的至少一对：

S1分子标记的引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.8所示；

S2分子标记的引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.10所示；

S3分子标记的引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.12所示；

S4分子标记的引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.14所示；

S5分子标记的引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.16所示；

S6分子标记的引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.18所示。

进一步地，所述引物组合物还包括在所述引物序列的5’端均标记有荧光基团，3’端标记均有猝灭基团；所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red中的一种，所述猝灭基团包括TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3中的一种。

在本发明的第三方面，提供了一种用于鉴定水稻黄单胞菌的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物组合物。

进一步地，所述试剂盒还包括PCR反应预混液。所述PCR反应预混液包括普通PCR反应预混液和高保真PCR反应预混液。

在本发明的第四方面，提供了一种用于鉴定水稻黄单胞菌的方法，所述方法包括：

提取获得病斑叶的DNA；

以所述病斑叶的DNA为模板，加入所述的引物组合物进行PCR反应，获得PCR产物；

将所述PCR产物经琼脂糖凝胶进行电泳检测，获得检测条带；根据所述检测条带的大小判定是否含有水稻黄单胞菌：若有预期大小的检测条带，则证明含有水稻黄单胞菌；

或者以所述病斑叶的DNA为模板，加入权利要求3所述的引物组合物进行荧光PCR，获取荧光信号；根据所述荧光信号判定是否含有水稻黄单胞菌：若有超过临界值的荧光信号，则证明含有水稻黄单胞菌。

进一步地，所述提取获得病斑叶的DNA，具体包括：

将清洁后的病斑叶浸入裂解液中研磨后获得粗提物；

获得用于股结合DNA的滤纸条，所述滤纸条包括核酸结合区和手柄区；

将所述用于结合DNA的滤纸条依次浸入所述粗取物和清洗液中，获得带有病斑叶的DNA的滤纸条。

进一步地，所述根据所述检测条带的大小判定是否含有水稻黄单胞菌：若有预期大小的检测条带，则证明含有水稻黄单胞菌，具体包括：

若所述的引物组合物含有S1分子标记的引物对，若有大小为251的检测条带，则证明含有水稻黄单胞菌；

若所述的引物组合物含有S2分子标记的引物对，若有大小为261的检测条带，则证明含有水稻黄单胞菌；

若所述的引物组合物含有S3分子标记的引物对，若有大小为275的检测条带，则证明含有水稻黄单胞菌；

若所述的引物组合物含有S4分子标记的引物对，若有大小为272的检测条带，则证明含有水稻黄单胞菌；

若所述的引物组合物含有S5分子标记的引物对，若有大小为240的检测条带，则证明含有水稻黄单胞菌；

若所述的引物组合物含有S6分子标记的引物对，若有大小为266的检测条带，则证明含有水稻黄单胞菌。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

本发明提供了一种用于鉴定水稻黄单胞菌的分子标记、引物组合物、试剂盒和方法，该引物组合物可以快速、灵敏、特异的检测到水稻黄单胞菌的分子标记，本发明基于特异分子标记的快速简便的水稻黄单胞菌的检测方法可在1小时内完成样品中黄单胞菌的检测，为水稻黄单胞菌的快速、简便检测提供一个新的技术。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明实施例的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为S1标记位点的扩增情况；其中图1A：PCR产物经电泳检测是单一条带；图1B：S1的PCR产物经sanger测序为单一峰；图1C：S1的PCR产物序列经序列比对是水稻黄单胞菌特异的；M:DL2000 marker；P1-P10：10个黄单胞菌Xoo病例型小种；

图2为本发明基于特异分子标记的快速简便的水稻黄单胞菌的检测方法的结果图；其中图2A为所述方法检测水稻叶片DNA的样本制备方式和PCR扩增条件探索；图2B为所述方法检测水稻叶片和黄单胞菌梯度稀释液的人工混合物的灵敏度评估；1和2代表通过手摇含钢珠和水稻叶片的离心管的方式制备的DNA粗提液；3和4代表通过用移液吸头破碎水稻叶片的方式制备的DNA粗提液；*代表冷冻保存一周后的DNA粗提液；Xa21：水稻基因；S1：黄单胞菌物种特异的分子标记S1；NCK：阴性对照，不加菌液的人工混合物；PCK：阳性对照，不含水稻叶片，只含10⁴CFU/mL的菌液的人工混合物；

图3为基于病症和分子技术的水稻白叶枯病鉴定结果；其中图3A.TP309接种Xoo病理型的P8小种后0-13天的病斑长度；图3B为P8小种侵染TP309 0-8天后的生长动态；图3C为基于不同DNA提取方法的水稻白叶枯病鉴定；Marker:DL2000。PCK:以P8小种小种基因组DNA为模板的PCR阳性对照；

图4为S2-S6标记位点的扩增情况；其中M:DL2000 marker；S2-S6：分别为对应标记的扩增情况。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明实施例，本发明实施例的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明实施例，而非限制本发明实施例。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明实施例所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明实施例中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：

首先，本发明开发黄单胞菌特异的6个分子标记，包括：以水稻黄单胞菌PXO61为参考基因组CP033187.3的S1、S2、S3、S4、S5和S6分子标记，所述S1、S2、S3、S4、S5和S6分子标记的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示。

接着，本发明设计出了扩增这些标记位点的PCR引物组合物，包括用于扩增所述6个分子标记的6对引物；所述6对引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.18所示。所述引物互相间不冲突，可以通过单重或多重PCR进行高效的扩增，鉴定准确度高、结果重现性强；采用所述引物组合物包括6对引物中的至少一对检测出相应的分子标记，即可鉴定出水稻黄单胞菌。

本发明提供了一种用于鉴定水稻黄单胞菌的方法，如图4所示，所述方法包括：

步骤S1、提取获得病斑叶的DNA；

所述步骤S1可以采用植物基因组DNA提取法提取病斑叶的DNA、细菌基因组DNA提取法提取病斑叶的DNA和快速提取法提取病斑叶的DNA；本发明实施例优选快速提取法提取病斑叶的DNA；

作为一种可选的实施方式，所述快速提取法提取病斑叶的DNA具体包括：将清洁后的病斑叶浸入裂解液中研磨后获得粗提物；获得用于结合DNA的滤纸条，所述滤纸条包括核酸结合区和手柄区；将所述用于结合DNA的滤纸条依次浸入所述粗取物和清洗液中，获得带有病斑叶的DNA的滤纸条。

步骤S2、以所述病斑叶的DNA为模板，加入所述的引物组合物进行PCR反应，获得PCR产物；或者以所述病斑叶的DNA为模板，加入带有荧光基团所述的引物组合物进行荧光PCR，获取荧光信号；

作为一种可选的实施方式，沿用所述快速提取法提取病斑叶的DNA，将带有病斑叶的DNA的滤纸条进入PCR体系，所述PCR体系包括引物对和PCR反应预混液；其中，所述引物组合物包括6对引物中的至少一对；PCR反应预混液可以为普通PCR反应预混液，也可以为高保真PCR反应预混液；优选高保真PCR反应预混液。

步骤S3、将所述PCR产物经琼脂糖凝胶进行电泳检测，获得检测条带；根据所述检测条带判定是否含有水稻黄单胞菌：若有预期大小的检测条带，则证明含有水稻黄单胞菌。

或者根据所述荧光信号判定是否含有水稻黄单胞菌：若有超过临界值的荧光信号，则证明含有水稻黄单胞菌。

作为一种可选的实施方式，快速提取法提取病斑叶的DNA，PCR反应预混液采用高保真PCR反应预混液进行检测，为本发明的所述方法检测方法；所述检测方法可在1小时内完成样品中黄单胞菌的检测，为水稻黄单胞菌的快速、简便检测提供一个新的技术。

下面将结合实施例、对比例及实验数据对本申请的一种用于鉴定水稻黄单胞菌的分子标记、引物组合物、试剂盒和方法进行详细说明。

实施例1、用于鉴定水稻黄单胞菌的分子标记和PCR扩增引物

一、黄单胞菌特异分子标记的开发

我们收集NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae，X.oryzae)物种的458个小种的全长基因组序列，然后采用MAFFTv7.271工具，按照默认的参数进行多重序列对比，筛选物种保守区域；将筛选到的保守区域在NCBI上进行Nucleotide BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，筛选X.oryzae特异的区域；采用NCBI上的Primer-BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，使用相同的参数设计并获得扩增这些X.oryzae特异区域的引物，遵循引物互相不干扰的原则，使得引物即可以通过单重PCR进行扩增，也互相兼容，可以通过多重PCR进行扩增。获得引物后，使用实验室保存的黄单胞菌Xoo病理型的P1-P10的菌株，通过PCR扩增、电泳检测或测序检测，和在NCBI的Nucleotide BLAST的序列比对，对引物的扩增效率和产物单一性、特异性进行评估，最终筛选获得6个黄单胞菌特异的分子标记及其有效的检测引物(表1)。

表1

S2、引物的检测效果验证

图1展示了S1标记位点的引物检测效果，S1标记的扩增产物经电泳检测只有一条单一的条带，测序结果表示为单一峰图(图1A)，表明产物单一(图1B)；产物的序列也只能比对上黄单胞菌的基因组序列(图1C)，表明了引物扩增的高效性和标记的物种特异性。

图4展示了S2-S6标记位点的引物检测效果，S2-S6标记的扩增产物经电泳检测只有一条单一的条带，经测序验证，同样表明了引物扩增的高效性和标记的物种特异性。

实施例2、用于鉴定水稻黄单胞菌的试剂盒

本发明实施例提供一种用于鉴定水稻黄单胞菌的试剂盒，所述试剂盒包括：

(A)引物组合物：所述引物组合物包括6对引物中的至少一对，所述6对引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.18所示；

(B)PCR反应预混液；所述PCR反应预混液可以为普通PCR反应预混液，也可以为高保真PCR反应预混液；优选高保真PCR反应预混液。

实施例3、简便快速灵敏的白叶枯病检测方法的建立

本研究进一步探索了所开发的特异分子标记的快速简便检测体系，包括快速的宿主DNA提取和快速高效的PCR扩增，建立基于特异分子标记的水稻黄单胞菌的检测方法所述方法。

一、水稻DNA的快速提取条件

1.1材料

水稻常用的模式品种粳稻TP309和含水稻白叶枯病抗性基因Xa21的水稻系DXT。

1.2水稻黄单胞菌Xanthomonas oryzae的活化、接种

黄单胞菌是来自菲律宾的Xoo病理型的PXO280小种，简称的P8小种。将低温保存的P8小种小种接种在PSA培养基上活化，28℃培养72h。用无菌水配制悬浮菌液，将浓度调至10⁹cfu/ml。在分蘖期采用剪叶法对4-5片充分伸展的叶片进行接种，并在接种0天，1天，2天，3天，4天，7天和8天后分别采集接种叶片。

剪取距离接种处3cm左右的病健交界处的叶片，重量为0.1g，表面清洁后用于DNA提取。具体地，先用75％乙醇消毒叶片3分钟，然后用灭菌的去离子水清洗3-5次，用灭菌吸水纸吸干表面水分。

1.3病斑叶DNA的提取

1.3.1植物基因组DNA提取法提取病斑叶的DNA

剪取每天采集的叶片距离接菌处3cm左右的组织，总共为0.1g，同1.2相同的方式进行表面清洁后，置于2ml离心管中，加入磨样钢珠，盖紧离心管盖置于液氮中冷却1分钟，在组织研磨仪上制备粉末。然后参照TIANGEN新型植物基因组DNA提取试剂盒的使用说明(货号：DP305-2,TIANGEN BIOTECH(BEIJING)Co.,Ltd.)，提取样品的DNA。

1.3.2细菌基因组DNA提取法提取病斑叶的DNA

和1.3.1相同的处理方式，将0.1g样品制备成粉末，然后参照TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒的使用说明(货号：DP302-02，TIANGEN BIOTECH(BEIJING)Co.,Ltd)，提取样品中的DNA。

1.3.3快速提取法提取病斑叶的DNA

和1.3.1相同的处理方式获得0.1g的样品叶片，然后制备结合DNA的滤纸条:裁剪长约44mm、宽约2mm的whatman滤纸条，将滤纸条的一部分浸泡在融化的石蜡中(长：约4mm；宽：约2mm)，浸过石蜡的滤纸为手柄区域，另一部分没有浸过石蜡的滤纸为核酸结合区域；配制裂解液(20mM pH 8.0的Tris，25mM Nacl,2.5mM EDTA以及质量分数为0.05％的SDS)和清洗液(10mM pH 8.0的Tris，以及质量分数为0.1％的Tween-20)。具体地，将清洁后的病斑叶0.1g浸入500μL裂解液中，在组织研磨仪上制备粗提物；将制备的滤纸条依次浸入粗取物、500μL清洗液中，每个过程约3s，然后将滤纸条浸入已经配置好的PCR反应体系中3s，即可进行后续的PCR反应。

为了方便实验室使用，本研究对实验体系进行简化，粗提物制备方式采用简单的加入钢珠快速的震荡数次或者用移液吸头碾压数次。

本发明以水稻白叶枯病抗性基因Xa21为检测对象，根据Xa21阳性水稻材料中Xa21的扩增效果评估提取的水稻DNA质量是否满足分子标记的PCR扩增。在样本的前处理上，设置了包括简单的手摇破碎和移液吸头机械破碎两种方式，然后采用基于滤纸条方法提取水稻叶片的DNA，结果发现使用高保真的PCR反应预混液，在两种方式处理的样本的DNA粗提液中，都能稳定的扩增出预期的条带，而普通PCR反应预混液只能在少部分样本中能扩增出亮度弱的预期条带。将获取的DNA粗提液冷冻保存一周后，依然能扩增出预期条带，表明两种样本处理方式对DNA的提取效果影响相当，高保真PCR预混液较普通PCR预混液扩增效果好，冷冻保存一周后的样本DNA依然有效(图2A)。经上述探索，采用简单的机械破碎样本，可在30秒内快速获得满足水稻分子标记PCR扩增的DNA模板，DNA提取方法具有简便快速的技术特点。

作为技术比较，同时从采用植物DNA提取试剂盒、细菌DNA提取试剂盒获得的相同质量叶片的DNA中进行S1标记的检测。三种DNA提取方法比较结果如表2所示；

表2三种DNA提取方法所需的试验流程、时间、设备、耗材及成本比较

由表2可知，虽然从这两种方法提取的样本DNA中也成功检出了预期的S1标记，但相比之下，所述方法用时最少，操作最简便，无需液氮、组织研磨仪和离心机等专业耗材和设备，只需要廉价的滤纸条。

二、黄单胞菌特异分子标记的快速PCR扩增条件的探索

探索黄单胞菌特异分子标记的快速PCR扩增条件。以上述快速DNA提取方法提取的水稻叶片的DNA粗提液为模板，使用普通和高保真PCR预混液，对S1标记进行快速PCR扩增。

具体操作步骤为：由北京擎科新业生物技术有限公司合成引物，具体序列见表1。普通PCR反应预混液和高保真PCR反应预混液分别为Rapid Taq Master Mix和Phanta MaxMaster Mix(货号：P222-01，P515-01，Vazyme Biotech Co.,Ltd)。

PCR反应体系为20μL,包括2×Rapid Taq Master Mix或Phanta Max Master Mix10μL，10μmol/L的正反引物各0.5μL，上述1.3.1和1.3.2提取的模板2μL，剩余的用ddH₂O补齐。

上述1.3.3提取的DNA是将滤纸条浸入已经配置好的PCR反应体系中3秒，然后进行后续的PCR反应。PCR反应在ETC811扩增仪上进行(北京东胜创新生物科技有限公司)，反应程序为快速PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸30s，扩增30个循环；72℃延伸5min。PCR产物经1％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测。使用两种PCR预混液都能有效扩增，且相同条件下，高保真PCR预混液扩增产生的电泳条带更亮，说明扩增效果更高，产生了更高浓度的产物(图2A)。

实施例4、基于黄单胞菌特异分子标记的水稻黄单胞菌快速、简便且灵敏的检测方法的灵敏度评估

采用人工混合白叶枯菌Xoo和水稻叶片的方式，即在0.1克的水稻叶片上分别加入10000，1000，100，10，1cfu的白叶枯菌Xoo，制备水稻叶片和白叶枯菌Xoo的人工混合物。然后按照探索的水稻DNA快速提取条件和分子标记扩增方式，采用简单的机械破碎混合物后，各添加1ml的提取液进行DNA提取，获得混合物的DNA粗提液。使用高保真PCR预混液，快速PCR扩增，对所提供的分子标记进行检测。

结果如图2B所示，表明可以在低至10cfu/ml的人工混合物中检出预期的条带，整个流程从DNA提取到经电泳检测获得PCR扩增结果用时约1h，灵敏度达到10cfu/ml的黄单胞菌。经上述探索，建立了基于黄单胞菌特异分子标记的水稻黄单胞菌快速、简便且灵敏的检测方法。

实施例5、鉴定水稻黄单胞菌

为了评估所述方法的应用效果，对大田里获得的水稻病斑叶进行了检测。在生长到分蘖期时，人工对感病水稻品种TP309叶片接种P8小种，并采集未接种的叶片和接种后1-8天的叶片。我们发现在接种后第8天依然未见明显的病斑，到接种后12天可见约4cm的病斑，表现为非典型的感病反应(图3A)。而对采集的叶片上的菌落进行计数，发现前8天的叶片上虽无肉眼可见的病斑，但菌落数量随着接种时间在持续的增加(图3B)，这个结果也表明传统的依赖病症的鉴定方法不利于白叶枯病的早期发现。

用所述方法对接种黄单胞菌0到8天后的叶片进行黄单胞菌S1标记的检测，在0天未检出S1标记，在接种1-8天后的叶片中均成功检测S1标记。更重要的，随着接种天数的增加，所述方法检测的PCR产物量也在逐渐增加，起到了评估病原菌生长动态的效果(图3C)。

本发明的所述方法实现了水稻白叶枯病简单快速的早期检测，对于指导水稻白叶枯病的早期适时防控具有重要意义。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明实施例的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明实施例范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明实施例进行各种改动和变型而不脱离本发明实施例的精神和范围。这样，倘若本发明实施例的这些修改和变型属于本发明实施例权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明实施例也意图包含这些改动和变型在内。

                         序列表

<110>  江汉大学

<120>  用于鉴定水稻黄单胞菌的分子标记、引物组合物、试剂盒和方法

<160>  18

<170>  SIPOSequenceListing 1.0

<210>  1

<211>  251

<212>  DNA

<213>  水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)

<400>  1

cggaggatgt gcagcaattc gccgcgctcc tgcagcaaag caaggcggtg accttgttat  60

gcggcagtgg ctgcgccggt gcgcatgacg cggtggtggc cttggccgac accttgggtg 120

caccggtggt acatgcgctg cgcggcaagg aatacgtgga gtgggaaaac ccgttcgatg 180

tcggcatgac cggcctgatc ggtttcagtt ccggctacca cgcgatgctc aactgcgaca 240

ccttgatcat g                                                      251

<210>  2

<211>  261

<212>  DNA

<213>  水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)

<400>  2

ctgccacgga agctgcatcg caagacgtgt tccgaagacc gccaacgcac cgagtgtggc  60

accacggccg cgcacctgcg caagggcgcg cgcgacgatt tccaacagcg cggctcccca 120

ctgttgacga cgctgcgttc ttcaacagtc cgcttcctgt cacgcaggtt agctgggcac 180

gacgaagcag attatgtgtt ccagcgatgg cgcaacgctg cagtttcggc acgatccagg 240

cccattcacc acgtgcatgc g                                           261

<210>  3

<211>  275

<212>  DNA

<213>  水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)

<400>  3

cgcgacctga tcgattcgat ggcgcggcag atgaaggccg agcgcgaaaa gcgagcgcag  60

atcctcgaag ccgagggctc gcgtcaatcg gaaatcctgc gcgccgatgg cgagaagcag 120

gccgccgtgc tcgaagccga aggccgcaag gaagccgcct tccgcgacgc cgaagcacgc 180

gaacgtctgg ccgaagcgga ggcgcgcgcc acccaggtgg tgtccgatgc gatcgccaac 240

ggcagtgtgc aggcgatcaa ttatttcgtc gcaca                            275

<210>  4

<211>  272

<212>  DNA

<213>  水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)

<400>  4

atacaacgac aagaaggcaa agagctacac gcagaactac atcgcatccg atagccccga  60

caaaaccaag gcgtcggtca tgaccaaaag cgatgccctg cgcgagatgt atcgctattc 120

cgactatctg cccggcaacc tgagtgagga cgaattcgcc aagatcgtcg atggcgacag 180

caagaccggc aagtgcccac cgcagttgat cgcggctgct caatattttc gcgatcatcc 240

ggacgagtgg aaggaatttt caggagacgc cg                               272

<210>  5

<211>  241

<212>  DNA

<213>  水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)

<400>  5

ctgtcgccca gatccagata accggacaga atcgcttcga aatccgcttc tgcggtgcgg  60

taatagtcct cgcttttcca aagcgtatcg tcgccgtcga acccaaccag ttggatcgct 120

tggccgtcgc gttgtgcaag tgcgctcatc tgaccagttt agcagcgcac cgatctggcg 180

ctgtgctcag tcgcctgcgg catcgcccgg gccaggttga taaatggcga attcgtcgcg 240

c                                                                 241

<210>  6

<211>  266

<212>  DNA

<213>  水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)

<400>  6

ggaagatgcc gagcttggtt tccggcaacc cgacgcgcgt actgccatcg tcggaggcca  60

cgcggtagcg gcatgccagc gcgatttcgg tgccgccgcc catgcagaag ccatgaatcg 120

ccgcaacggt cgggcagggc agttcggcca gcttctgaaa gacctgctgc ccgcgatgaa 180

tcgcatcgtt gaccgtgccc ttgtggtcga attgctgaaa ttctttcaga tcggcaccgg 240

cgatgaaacc gttggctttg cccgag                                      266

<210>  7

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<400>  7

catgatcaag gtgtcgcagt t                                            21

<210>  8

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<400>  8

cggaggatgt gcagcaattg                                              20

<210>  9

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<400>  9

ctgccacgga agctgcat                                                18

<210>  10

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<400>  10

cgcatgcacg tggtgaatg                                               19

<210>  11

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<400>  11

tgtgcgacga aataattgat cgc                                          23

<210>  12

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<400>  12

cgcgacctga tcgattcgat                                              20

<210>  13

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<400>  13

atacaacgac aagaaggcaa agagcta                                      27

<210>  14

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<400>  14

cggcgtctcc tgaaaattcc tt                                           22

<210>  15

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<400>  15

ctgtcgccca gatccagata ac                                           22

<210>  16

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<400>  16

cgcgacgaat tcgccattta tc                                           22

<210>  17

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<400>  17

ggaagatgcc gagcttggtt                                              20

<210>  18

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<400>  18

ctcgggcaaa gccaacggtt                                              20

Claims (8)

1.一种用于鉴定水稻黄单胞菌的分子标记，其特征在于，所述分子标记包括：位于水稻黄单胞菌PXO61的参考基因组CP033187.3的S1、S2、S3、S4、S5和S6分子标记，所述S1、S2、S3、S4、S5和S6分子标记的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示。

2.一种用于鉴定水稻黄单胞菌的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括以下6对引物中的至少一对：

S1分子标记的引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.8所示；

S2分子标记的引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.10所示；

S3分子标记的引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.12所示；

S4分子标记的引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.14所示；

S5分子标记的引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.16所示；

S6分子标记的引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.18所示。

3.根据权利要求2所述的一种用于鉴定水稻黄单胞菌的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物还包括在所述引物序列的5’端均标记有荧光基团，3’端标记均有猝灭基团；所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red中的一种，所述猝灭基团包括TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3中的一种。

4.一种用于鉴定水稻黄单胞菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的引物组合物。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应预混液。

6.一种用于鉴定水稻黄单胞菌的方法，其特征在于，所述方法包括：

提取获得病斑叶的DNA；

以所述病斑叶的DNA为模板，加入权利要求2所述的引物组合物进行单重或多重PCR反应，获得PCR产物；

将所述PCR产物经琼脂糖凝胶进行电泳检测，获得检测条带；根据所述检测条带的大小判定是否含有水稻黄单胞菌：若有预期大小的检测条带，则证明含有水稻黄单胞菌；

或者以所述病斑叶的DNA为模板，加入权利要求3所述的引物组合物进行荧光PCR，获取荧光信号；根据所述荧光信号判定是否含有水稻黄单胞菌：若有超过临界值的荧光信号，则证明含有水稻黄单胞菌。

7.根据权利要求6所述的一种用于鉴定水稻黄单胞菌的方法，其特征在于，所述提取获得病斑叶的DNA，具体包括：

将清洁后的病斑叶浸入裂解液中研磨后获得粗提物；

获得用于结合DNA的滤纸条，所述滤纸条包括核酸结合区和手柄区；

将所述用于结合DNA的滤纸条依次浸入所述粗取物和清洗液中，获得带有病斑叶的DNA的滤纸条。

8.根据权利要求6所述的一种用于鉴定水稻黄单胞菌的方法，其特征在于，所述根据所述检测条带的大小判定是否含有水稻黄单胞菌：若有预期大小的检测条带，则证明含有水稻黄单胞菌，具体包括：

若所述的引物组合物含有S1分子标记的引物对，若有大小为251的检测条带，则证明含有水稻黄单胞菌；

若所述的引物组合物含有S2分子标记的引物对，若有大小为261的检测条带，则证明含有水稻黄单胞菌；

若所述的引物组合物含有S3分子标记的引物对，若有大小为275的检测条带，则证明含有水稻黄单胞菌；

若所述的引物组合物含有S4分子标记的引物对，若有大小为272的检测条带，则证明含有水稻黄单胞菌；

若所述的引物组合物含有S5分子标记的引物对，若有大小为240的检测条带，则证明含有水稻黄单胞菌；

若所述的引物组合物含有S6分子标记的引物对，若有大小为266的检测条带，则证明含有水稻黄单胞菌。

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