CN114045356B - 一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测柑橘黄龙病的试剂盒及方法 - Google Patents

一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测柑橘黄龙病的试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于RPA‑CRISPR‑Cas12a体系可视化检测柑橘黄龙病的试剂盒及方法。所述试剂盒包含RPA引物和crRNA引导序列；通过先对待测样品进行RPA扩增，再在crRNA序列介导下，引导CRISPR‑Cas12a体系对RPA扩增产物进行识别结合并切割目标双链DNA激活非特异性核酸酶功能，然后任意切割体系中的ssDNA荧光探针得到裂解产物，最后通过裂解产物的显色检测进行判断。本发明通过RPA扩增及crRNA识别可双重特异地对检测柑橘黄龙病进行检测，特异性强，且在灵敏度上可低至2拷贝/μL，可以更早发现感染柑橘黄龙病的植株，对柑橘黄龙病进行防治。

Description

一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测柑橘黄龙病的 试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及植物病理分子诊断技术领域，更具体地，涉及一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测柑橘黄龙病的试剂盒及方法。
背景技术
柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing）是目前柑橘生产上最为严重的病害之一，对世界柑橘产业造成巨大的经济损失。该病害目前认为是由局限于韧皮部筛管细胞内一种革兰氏阴性细菌所引起，该细菌归属于原核生物，薄壁菌门，α-变型菌纲（Proteobacteriacea）的候选韧皮部杆菌属（CandidatusLiberibacter sp.），在柑橘上共发现三个种：亚洲种（CandidatusLiberibacterasiaticus），非洲种（CandidatusLiberibacterafricanus）和美洲种（CandidatusLiberibacter americaus），其中亚洲种“CandidatusLiberibacter asiaticus”是目前分布最广的，在中国发生的黄龙病也是由亚洲种病原引起的。
柑橘黄龙病可以通过接穗、苗木和介体木虱传播。黄龙病病原菌在自然界的寄主植物种类较多，能侵染各类柑橘品种包括宽皮橘类、橙类、柚类、柠檬类等品种，目前未发现免疫品种。柑橘木虱的其它寄主还包括九里香、黄皮等13种芸香科植物。由于至今还没有根治柑橘黄龙病的技术方法，理论上应该有效的“使用无病毒苗、挖病树、扑杀木虱”的黄龙病防控措施，即所谓防控“三板斧”的实际防控效果总是不尽人意。这是因为现有PCR、酶法、血清学、高光谱等检测手段均远不敷苗木普查、病树的早期发现之用，无法用来一网打尽有病的苗木和病树，也就实现不了将田间病原彻底清除的目标。而柑橘木虱在某生态条件下一旦建立起种群，要将这种繁殖系数很高的昆虫彻底消灭的可能性也微乎其微。
前国内外已建立和发展了常规PCR、巢式PCR、半巢式PCR、荧光定量PCR等技术来检测柑橘黄龙病菌，不断地提高了检测的灵敏度和准确率。目前的PCR检测主要针对扩增柑橘黄龙病菌16S rDNA、23S rDNA、16S-23S rRNA ITS、OMP基因、β-operon基因、RNR基因等。中国专利CN112280879A公开了一种快速检测柑橘黄龙病亚洲种的RPA引物、试剂盒及其检测方法与应用，虽然能将检测时间缩短，但是检测灵敏度低，由于柑橘黄龙病感染初期病原菌浓度较低，此方法实际应用效果不理想。因此，要想实现前两板斧即“使用无病毒苗、挖病树”的作用，需要开发出简便易用、更高灵敏度的检测方法来更早发现感染柑橘黄龙病的植株。因此，亟需提供一种检测灵敏度高的柑橘黄龙病快速检测试剂盒及方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种检测柑橘黄龙病亚洲种的试剂盒。
本发明的第二个目的在于提供述试剂盒在可视化检测柑橘黄龙病中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种可视化检测柑橘黄龙病亚洲种的方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种检测柑橘黄龙病亚洲种的试剂盒，包括RPA引物、crRNA引导序列、Cas12a酶和ssDNA荧光探针；所述RPA引物的核苷酸序列为：RPA-CLA-F：5’-GTGAGTAACGCGTAGGAATCTACCTTTTTCTA-3’，RPA-CLA-R：5’-ATCCCTCTCCAATAAAATCTTTCCCCCAATA-3’，所述crRNA引导序列为CLA-16s-crRNA：5’-mC*U*UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUACGGGAUAA CGCAUGGAAAC*G*mU-3’，*为硫代修饰，m为甲氧基修饰。
本发明针对柑橘黄龙病菌基因组中的16s rRNA序列保守区域，设计了特异性RPA扩增引物对及特殊化学修饰的crRNA引导序列；通过先对待测样品进行RPA扩增，再在crRNA序列介导下，引导CRISPR-Cas12a体系对RPA扩增产物进行识别结合并切割目标双链DNA激活非特异性核酸酶功能，然后任意切割体系中的ssDNA荧光探针得到裂解产物，最后通过裂解产物的显色检测进行判断。
优选地，所述ssDNA荧光探针为5’端FAM标记、3’端BHQ1标记的单链核苷酸序列，或5’端FITC标记、3’端Biotin标记的单链核苷酸序列；FAM和BHQ1修饰的ssDNA荧光探针可用于在蓝绿光的激发下肉眼检出目标体系中是否存在黄龙病菌，FITC和Biotin修饰的ssDNA荧光探针用于胶体金试纸条检测。
进一步优选地，所述ssDNA荧光探针的核苷酸序列为5’-FAM-TTTTTT-BHQ1-3’、5’-FAM-ggTTggTgTgg-BHQ1-3’或5’-FITC-TTTTTT-Biotin-3’。
优选地，还包含黄龙病菌16srRNA基因片段的质粒标准品。
优选地，所述试剂盒包含柑橘黄龙病亚洲种胶体金检测试纸条，所述检测试纸条包括：底板、样品垫、胶体金结合垫、层析膜和吸水垫，所述样品垫、胶体金结合垫、层析膜和吸水垫在底板上按照顺序依次固定；所述胶体金结合垫内含有胶体金标记的抗FITC的兔源抗体，所述层析膜上设有相互分离的检测线T和质控线C，检测线T包被抗兔抗的羊源抗体，质控线C包被Biotin的配体Avidin。本发明还提供上述任一所述试剂盒在可视化检测柑橘黄龙病中的应用。
一种可视化检测柑橘黄龙病亚洲种的方法，包括如下步骤：
S1.提取待测样品基因组DNA；
S2.以步骤S1的DNA为模板，利用上述RPA引物进行等温扩增反应，得RPA扩增产物；
S3.利用上述crRNA引导序列制备Cas12a/crRNA复合物，再加入ssDNA荧光探针及步骤S2的RPA扩增产物，在CRISPR/cas12a体系中进行裂解反应，得到裂解产物；
S4.将步骤S3的裂解产物在蓝绿光下进行显色或裸眼观察，若裂解产物在蓝绿光照射下无荧光亮度或裸眼观察无亮度，则表示待测样品未感染柑橘黄龙病亚洲种，若裂解产物在蓝绿光照射下有荧光亮度或裸眼观察有亮度，则表示待测样品有感染柑橘黄龙病亚洲；或将步骤S3得到的裂解产物使用胶体金试纸条进行显色检测，若待测样品检测线出现红色条带或待测样品检测线和阴性样品质控线位置均出现红色条带，则表示待测样品感染柑橘黄龙病亚洲种，若检测线不出现红色条带，在质控线上出现红色条带，则表示待测样品未感染柑橘黄龙病亚洲种。
优选地，步骤S2所述等温扩增反应的体系为：10μM RPA-CLA-F 2.4 μL，10μM RPA-CLA-R 2.4 μL，Rehydration Buffer 29.5 μL，280mM MgOAc 2.5 μL，RNase-free H2O加至49 μL，样品DNA 1 μL，混合均匀后加入单管酶干粉末中重悬，于39℃反应40分钟。
优选地，步骤S3所述裂解反应的体系为：RNase free H2O 66.67 μL，10× NEBbuffer 2 10 μL，1 μM Cas12a 3.33μL，300 mM crRNA 10 μL，置于37℃中15min，取出放室温备用；再加入10 μM ssDNA荧光探针2.5 μL以及RPA扩增产物7.5 μL，37℃反应2个小时。
上述检测方法的原理是CRISPR-Cas12a在crRNA的引导下识别RPA扩增产物中特异性靶标，CRISPR-Cas12a、crRNA和靶标序列分子结合成复合物；所述复合物切割检测体系内的ssDNA荧光探针，探针分子被切开后，产生大量荧光可被检测。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明可视化检测柑橘黄龙病的试剂盒通过先对待测样品进行RPA扩增，再在crRNA引导序列介导下，引导CRISPR-Cas12a体系对RPA扩增产物进行识别结合并切割目标双链DNA激活非特异性核酸酶功能，然后任意切割体系中的ssDNA荧光探针得到裂解产物，最后通过裂解产物的显色检测进行判断。本发明检测柑橘黄龙病的RPA-CRISPR/cas12a技术，通过RPA扩增及crRNA识别双重特异地对检测柑橘黄龙病进行检测，特异性强，且在灵敏度上可低至2拷贝/μL，可以更早发现感染柑橘黄龙病的植株，进行防治。本发明具有成本低、操作便捷、耗时少、灵敏度高和特异性强等特点，全程在37-40℃环境下进行，可以有效脱离实验室大型仪器的依赖。
附图说明
图1为本发明基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测柑橘黄龙病的流程图。
图2为采用未经化学修饰IVTcrRNA，及同一靶点错配的IVTcrRNA进行特异性测试结果。
图3为采用未经化学修饰的IVTcrRNA+Cas12a在非RPA扩增条件的灵敏度测试结果。
图4为采用未经化学修饰的IVTcrRNA+Cas12a在RPA扩增条件下的灵敏度测试结果。其中，T1和T2为两个重复。
图5为采用特殊化学修饰的CMcrRNA+Cas12a在RPA扩增条件及非RPA扩增条件下的灵敏度测试结果。
图6为qPCR仪监控CMcrRNA/Cas12a检测反应的稳定性及反应时间。CMcrRNA为化学合成修饰的crRNA。
图7为侧向层析检测（胶体金法）与裸眼可视法检测黄龙病菌的比较图。裸眼检测的图与侧向层析检测为一一对应的浓度。T为测试线，C为质控线，T线或T和C线同时显色表示为阳性，T线不显色、C线显色表示为阴性。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
含柑橘黄龙病亚洲种16s rRNA序列的标准质粒。所含16s rRNA的序列为：5’-ACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGCGTATGCGAATACGAGCGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTAGGAATCTACCTTTTTCTACGGGATAACGCATGGAAACGTGTGCTAATACCGTATACGCCCTATTGGGGGAAAGATTTTATTGGAGAGGGATGAGCCTGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTAGGGTAAGAGCCTACCAAGGCTACGATCTATAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCGCCGGAGAAGATAATGACGGTAT-3’，由金斯瑞生物科技公司合成并克隆至pUC57质粒载体中。
本发明提供了一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测柑橘黄龙病的方法，流程如图1所示，通过先对待测样品进行RPA扩增，再在crRNA引导序列介导下，引导CRISPR-Cas12a体系对RPA扩增产物进行识别结合并切割目标双链DNA激活非特异性核酸酶功能，然后任意切割体系中的ssDNA荧光探针得到裂解产物，最后通过裂解产物的显色检测进行判断，可采用多种友好的使用终端显示检测结果。
实施例1 RPA引物设计筛选及扩增体系确定
针对柑橘黄龙病菌基因组中的16s rRNA序列保守区域（5’-ACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGCGTATGCGAATACGAGCGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTAGGAATCTACCTTTTTCTACGGGATAACGCATGGAAACGTGTGCTAATACCGTATACGCCCTATTGGGGGAAAGATTTTATTGGAGAGGGATGAGCCTGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTAGGGTAAGAGCCTACCAAGGCTACGATCTATAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCGCCGGAGAAGATAATGACGGTAT-3’），根据所述靶标序列设计得到了一系列满足RPA引物设计原则的引物对，由华大生物合成（PAGE纯化）；经过一系列的前期检测、筛选后。引物筛选结果如下所示：
RPA-CLA-F：5’-GTGAGTAACGCGTAGGAATCTACCTTTTTCTA-3’；
RPA-CLA-R：5’-ATCCCTCTCCAATAAAATCTTTCCCCCAATA-3’；
扩增片段大小为105bp；
确定最佳引物组后，对RPA扩增体系进行建立，对引物浓度、MgOAc浓度，扩增温度、扩增时间等条件进行优化。
RPA扩增体系优化为：10μM RPA-CLA-F 2.4 μL，10μM RPA-CLA-R 2.4 μL，Rehydration Buffer 29.5 μL，280mM MgOAc 2.5 μL，RNase-free H2O加至49 μL，样品DNA1 μL，混合均匀后加入单管酶干粉末（TwistDx公司的TwistAmpTM Basic Kit）中重悬，于39℃反应40分钟。
实施例2 crRNA筛选及CRISPR/cas12a体系优化
在扩增的105bp片段中，选择了一段满足cas12a检测需求的TTTV-（PAM位点）的27bp片段，确定为crRNA引导序列的靶标，所述特异性靶标核苷酸序列为5’-TTTCTACGGGATAACGCATGGAAACGT-3’，同时根据所述特异性靶标核苷酸设计合成相对应的crRNA。
crRNA序列如下：
未经化学修饰IVTcrRNA：
5’-CUUAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUACGGGAUAACGCAUGGAAACGU-3’；
及两端各3个硫代和甲氧基修饰的CM crRNA：
5’-mC*U*UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUACGGGAUAACGCAUGGAAAC*G*mU-3’，*为硫代修饰，m为甲氧基修饰；与上面自己合成的靶点一致但合成方法和修饰不同，化学合成由金斯瑞生物科技公司合成并RNase-free HPLC纯化。
同一靶点错配的IVTcrRNA：
第10位点错配：
5’-CUUAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUACGGGAUAGCGCAUGGAAACGU-3’；
第12位点错配：
5’-CUUAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUACGGGAUAACACAUGGAAACGU-3’；
第14位点错配：
5’-CUUAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUACGGGAUAACGCGUGGAAACGU-3’；
第10+12+14位点错配：
5’-CUUAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUACGGGAUAGCACGUGGAAACGU-3’；
所述CRISPR/cas12a体系的优化为：RNase free H2O 66.67 μL，10× NEB buffer2 10 μL，1 μM Cas12a 3.33μL，300 mM crRNA 10 μL，置于37℃中15min。
实施例3 RPA-CRISPR/cas12a方法的建立
一、方法
首先，稀释标准品至指定浓度：用RNase free H2O稀释含黄龙病菌16s rRNA基因片段的质粒至10的0至10次方的拷贝数/μL的浓度。然后采用实施例2所述CRISPR/cas12a体系制备Cas12a/crRNA复合物（RNP），最后再加入10 μM ssDNA荧光探针2.5 μL以及上述稀释后的标准品经实施例1 RPA扩增后的产物或未经RPA扩增的标准品7.5 μL。在37℃条件下反应2个小时。在蓝绿激发光下用酶标仪、qPCR仪跟踪并测定荧光值，或者拍照直接肉眼判断。所述ssDNA荧光探针为修饰后的寡聚核苷酸有3种：
ssDNA-reporter1：5’-FAM-TTTTTT-BHQ1-3’；
ssDNA-reporter2：5’-FAM-ggTTggTgTgg-BHQ1-3’；
ssDNA-reporter3：5’-FITC-TTTTTT-Biotin-3’；
由广州艾基生物（IGE）公司合成并HPLC纯化。
二、结果
1、检测特异性测试：
采用未经化学修饰IVTcrRNA，及同一靶点错配的IVTcrRNA进行特异性检测，结果如图2所示，当采用同一靶点错配的IVTcrRNA导致检测的特异性大大降低，不同位置错配的crRNA会极大影响检测结果，表明crRNA序列的设计对于特异性检测是至关重要的。
2、检测灵敏度测试：
（1）采用未经化学修饰的IVTcrRNA+Cas12a在非RPA扩增条件下，即采用未经化学修饰的IVTcrRNA+Cas12a直接检测未经RPA扩增的各稀释后标准品，其检测结果如图3所示，IVTcrRNA+Cas12a在非扩增条件检出限度仅为10^10至10^11拷贝/μL。
（2）采用未经化学修饰的IVTcrRNA+Cas12a在RPA扩增条件下，即采用未经化学修饰的IVTcrRNA+Cas12a检测稀释后标准品经RPA扩增后的产物，其检测结果如图4所示，采用未经化学修饰的IVTcrRNA+Cas12a在RPA扩增后检出极限可增至10^3至10^4拷贝/μL。
（3）采用特殊化学修饰的CMcrRNA+Cas12a在RPA扩增条件及非RPA扩增条件下进行检测，其检测结果如图5所示，CMcrRNA+Cas12a在RPA扩增条件下的检测灵敏度可低至2拷贝/μL，可以更及时发现感染柑橘黄龙病的植株，对柑橘黄龙病进行防治。
3、稳定性测试
qPCR仪监控CMcrRNA/Cas12a检测反应的稳定性及反应时间，其结果如图6所示，CMcrRNA/Cas12a检测液可以稳定室温储存5小时以上，并且反应至40-60分钟后检测值趋于稳定，该检测体系可以在较长的时间内保持酶活性且检测值保持稳定。
实施例4 一种可视化检测柑橘黄龙病的试剂盒
1、一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测柑橘黄龙病亚洲种的试剂盒，包括RPA引物、crRNA引导序列、ssDNA荧光探针、RPA反应体系及CRISPR/Cas12a切割检测的体系所需试剂、柑橘黄龙病亚洲种检测试纸条、含黄龙病菌16srRNA基因片段的质粒标准品。
所述RPA引物：
RPA-CLA-F：5’-GTGAGTAACGCGTAGGAATCTACCTTTTTCTA-3’，
RPA-CLA-R：5’-ATCCCTCTCCAATAAAATCTTTCCCCCAATA-3’；
所述crRNA引导序列：
5’-mC*U*UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUACGGGAUAACGCAUGGAAAC*G*mU-3’；
所述ssDNA荧光探针：
5’-FAM-TTTTTT-BHQ1-3’，
5’-FAM-ggTTggTgTgg-BHQ1-3’，
5’-FITC-TTTTTT-Biotin-3’；
其中FAM和BHQ1修饰的ssDNA荧光探针用于在蓝绿光的激发下或裸眼下检测目标体系中是否存在黄龙病菌，FITC和Biotin修饰的ssDNA荧光探针用于侧向层析检测（胶体金法）检测；
所述柑橘黄龙病亚洲种检测试纸条包括：底板、样品垫、胶体金结合垫、层析膜和吸水垫，所述样品垫、胶体金结合垫、层析膜和吸水垫在底板上按照顺序依次固定；所述胶体金结合垫内含有胶体金标记的抗FITC的兔源抗体，所述层析膜上设有相互分离的检测线T和质控线C，检测线T包被抗兔抗的羊源抗体，质控线C包被Biotin的配体Avidin。
2、利用所述试剂盒进行可视化检测柑橘黄龙病亚洲种的方法，包括如下步骤：
（1）提取待测样品基因组DNA；
（2）以步骤S1的DNA为模板，利用上述RPA引物进行等温扩增反应，得RPA扩增产物；
（3）利用上述crRNA引导序列制备Cas12a/crRNA复合物，再加入ssDNA荧光探针及步骤S2的RPA扩增产物，在CRISPR/cas12a体系中进行裂解反应，得到裂解产物；
（4）将步骤S3的裂解产物在蓝绿光下进行显色或裸眼观察，若裂解产物在蓝绿光照射下无荧光亮度或裸眼观察无亮度，则表示待测样品未感染柑橘黄龙病亚洲种，若裂解产物在蓝绿光照射下有荧光亮度或裸眼观察有亮度，则表示待测样品有感染柑橘黄龙病亚洲；或将步骤S3得到的裂解产物使用胶体金试纸条进行显色检测，若检测线或检测线和质控线位置均出现红色条带，则表示待测样品感染柑橘黄龙病亚洲种，若检测线不出现红色条带，在质控线上出现红色条带，则表示待测样品未感染柑橘黄龙病亚洲种。
步骤S2所述等温扩增反应的体系为：10μM RPA-CLA-F 2.4 μL，10μM RPA-CLA-R2.4 μL，Rehydration Buffer 29.5 μL，280mM MgOAc 2.5 μL，RNase-free H2O加至49 μL，样品DNA 1 μL，混合均匀后加入单管酶干粉末中重悬，于39℃反应40分钟。
步骤S3所述裂解反应的体系为：RNase free H2O 66.67 μL，10× NEB buffer 210 μL，1 μM Cas12a 3.33μL，300 mM crRNA 10 μL，置于37℃中15分钟，取出放室温备用；再加入10 μM ssDNA荧光探针2.5 μL以及RPA扩增产物7.5 μL，37℃反应2个小时。
3、将质粒标准品稀释至10的10至0次方的拷贝数/μL的浓度后按照上述方法进行RPA-CRISPR-Cas12a体系检测，比较侧向层析检测（胶体金法）与裸眼可视法检测黄龙病菌的检测效果，同时选择3个未知样品（3个未知样品C4-5、C5-5、C6-4均为仲恺农业工程学院采集并保存的真实黄龙病菌样品）进行测试，比较侧向层析检测（胶体金法）与裸眼可视法实际检测样品的检测效果。结果如图7所示，裸眼检测与侧向层析检测结果具有一致性，检测灵敏度可低至2拷贝/μL；测实际检测到未知样品C4-5和C5-5为10^（1~2）拷贝数，C6-4在10^5以上的拷贝数，再经荧光定量PCR验证后，结果一致。本发明裸眼检测成本可以做到7-15元/个样品，侧向层析检测（胶体金法）成本去到25元/样品。
本发明基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测柑橘黄龙病亚洲种的试剂盒可以更早、更及时的发现感染柑橘黄龙病的植株。由于黄龙病菌感染初期，病菌的浓度较低，因此更高的检测灵敏度意味着可以在黄龙病菌感染初期具有很低浓度时即可及时被发现，从而及时切断病原菌传播链，进行精准防控。
序列表
<110> 仲恺农业工程学院
<120> 一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测柑橘黄龙病的试剂盒及方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 401
<212> DNA
<213> 柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing)
<400> 1
acgctggcgg caggcctaac acatgcaagt cgagcgcgta tgcgaatacg agcggcagac 60
gggtgagtaa cgcgtaggaa tctacctttt tctacgggat aacgcatgga aacgtgtgct 120
aataccgtat acgccctatt gggggaaaga ttttattgga gagggatgag cctgcgttgg 180
attagctagt tggtagggta agagcctacc aaggctacga tctatagctg gtctgagagg 240
acgatcagcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg 300
aatattggac aatgggggca accctgatcc agccatgccg cgtgagtgaa gaaggcctta 360
gggttgtaaa gctctttcgc cggagaagat aatgacggta t 401
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 2
gtgagtaacg cgtaggaatc tacctttttc ta 32
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 3
atccctctcc aataaaatct ttcccccaat a 31
<210> 4
<211> 46
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 4
cuuaauuucu acuaagugua gauuacggga uaacgcaugg aaacgu 46

Claims (9)

1.一种检测柑橘黄龙病亚洲种的试剂盒，其特征在于，包括RPA引物、crRNA引导序列、Cas12a酶和ssDNA荧光探针；所述RPA引物的核苷酸序列为：RPA-CLA-F：5’-GTGAGTAACGCGTAGGAATCTACCTTTTTCTA-3’，RPA-CLA-R：5’-ATCCCTCTCCAATAAAATCTTTCCCCCAATA-3’，所述crRNA引导序列为5’-mC*U*UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUACGGGAUAACGCAUGGAAAC*G*mU-3’，*为硫代修饰，m为甲氧基修饰。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述ssDNA荧光探针为5’端FAM标记、3’端BHQ1标记的单链核苷酸序列，或5’端FITC标记、3’端Biotin标记的单链核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述ssDNA荧光探针的核苷酸序列为5’-FAM-TTTTTT-BHQ1-3’、5’-FAM-ggTTggTgTgg-BHQ1-3’或5’-FITC-TTTTTT-Biotin-3’。
4.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，还包含柑橘黄龙病亚洲种16srRNA基因片段的质粒标准品。
5.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含柑橘黄龙病亚洲种胶体金检测试纸条，所述检测试纸条包括：底板、样品垫、胶体金结合垫、层析膜和吸水垫，所述样品垫、胶体金结合垫、层析膜和吸水垫在底板上按照顺序依次固定；所述胶体金结合垫内含有胶体金标记的抗FITC的兔源抗体，所述层析膜上设有相互分离的检测线T和质控线C，检测线T包被抗兔抗的羊源抗体，质控线C包被Biotin的配体Avidin。
6.权利要求1～5任一所述试剂盒在可视化检测柑橘黄龙病中的应用。
7.一种可视化检测柑橘黄龙病亚洲种的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.提取待测样品基因组DNA；
S2.以步骤S1的DNA为模板，利用权利要求1中所述RPA引物进行等温扩增反应，得到RPA扩增产物；
S3.利用权利要求1中所述crRNA引导序列制备Cas12a/crRNA复合物，再加入ssDNA荧光探针及步骤S2的RPA扩增产物，在CRISPR/cas12a体系中进行裂解反应，得到裂解产物；
S4.将步骤S3的裂解产物在蓝绿光下进行显色或裸眼观察，若裂解产物在蓝绿光照射下无荧光亮度或裸眼观察无亮度，则表示待测样品未感染柑橘黄龙病亚洲种，若裂解产物在蓝绿光照射下有荧光亮度或裸眼观察有亮度，则表示待测样品有感染柑橘黄龙病亚洲；或将步骤S3得到的裂解产物使用胶体金试纸条进行显色检测，若待测样品检测线出现红色条带或待测样品检测线和阴性样品质控线位置均出现红色条带，则表示待测样品感染柑橘黄龙病亚洲种，若检测线不出现红色条带，在质控线上出现红色条带，则表示待测样品未感染柑橘黄龙病亚洲种。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，步骤S2所述等温扩增反应的体系为：10 μMRPA-CLA-F 2.4 μL，10 μM RPA-CLA-R 2.4 μL，Rehydration Buffer 29.5 μL，280mMMgOAc 2.5 μL，RNase-free H2O加至49 μL，样品DNA 1 μL，混合均匀后加入单管酶干粉末中重悬，于39℃反应40分钟。
9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，步骤S3所述裂解反应的体系为：RNase freeH2O 66.67 μL，10× NEB buffer 2 10 μL，1 μM Cas12a 3.33μL，300 mM crRNA 10 μL，置于37℃中15min，取出放室温备用；再加入10 μM ssDNA荧光探针2.5 μL以及RPA扩增产物7.5 μL，37℃反应2个小时。
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