CN109706227A - 一种快速可视化且可防止气溶胶污染的核酸现场检查方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种快速可视化且可防止气溶胶污染的核酸现场检查方法，它将核酸扩增反应液置于反应管中，在核酸扩增反应液上覆盖油相层，进行核酸扩增反应，在核酸扩增反应结束后，在有油相层覆盖在核酸扩增液表明的情况下，将合适体积的CRISPR体系加入反应管，通过离心作用，使核酸扩增子和CRISPR体系混合并进行反应，待反应到一定程度后，在紫外灯照射下，利用肉眼观察或摄像设备观察反应管，如果有荧光，则检查结果为阳性，否则为阴性。本发明利用CRISPR体系结合核酸扩增技术，实现对目标物进行快速特异性的可视化检测，并且在检测过程中可以避免由于添加CRISPR体系带来的气溶胶污染问题。
Description
技术领域
本发明属于核酸扩增和核酸检测领域，其具体内容涉及到一种简单快速可视化且可防止气溶胶污染的核酸现场检查方法。
背景技术
在核酸检测过程中，为提高检测的灵敏度，需要首先对核酸目标物进行大量扩增，以便于后续检测。聚合酶链式反应(PCR)，作为核酸检测的黄金标准，已广泛应用于医学诊断、农产品质量检测、食品安全检查等众多领域。传统的PCR扩增是建立在三个反应温度以及一定循环数上的重复反应。一般而言，PCR扩增每个循环需要提供三个反应温度以及相应适宜的时间。三个反应温度对应三个阶段，分别为变性阶段(95℃)、退火(55℃～65℃)、延伸(72℃)。现有通过PCR扩增的核酸检测总耗时较长。根据模板的不同和扩增酶的不同，可选择性的调整三个阶段的持续时间，以及在起始和结尾加入预变性和延伸阶段。对于PCR反应而言，最关键的是满足每个阶段的温度要求，因此这就需要对温控十分精细的热块，并且对于它还要兼有快速升降温的功能，以减少反应的整体时间。
除了PCR反应之外，一些等温扩增技术也被日益开发出来，诸如环介导的等温扩增(LAMP)、重组酶扩增技术(RPA)等。这些恒温扩增技术其最大的技术特点就是在反应过程中是以恒定的温度进行，无需进行温度的循环控制，相比于PCR反应来说，可以简化反应仪器，并且缩短反应的整体时间。
另外，对于扩增产物的检测，传统的方法为利用凝胶电泳，该检测方法耗费较多时间和人力，且要对扩增产物进行开盖，容易形成气溶胶污染，且电泳所用的化学品对人体危害较大。而现在使用较多的则是实时荧光的检测方法，该方法一般采用DNA双链荧光嵌入剂，如SYTO 9、SYBR Green I、Gel Red等，利用实时荧光PCR仪对反应的整个过程中Ct值的大小来进行记录进而间接表征核酸扩增情况。为了提高检测的特异性，一些分子探针被开发出来，如水解探针(Taqman探针)、杂交探针(分子信标)、复合探针等。它们在核酸扩增的过程中利用碱基互补配对的原则与模板进行互补配对，从而实现对核酸扩增进行特异性实时检测。但这些利用探针的检测方法，通常需要较复杂的实时荧光PCR仪来读取数据，因此成本较高，耗时较长，在推广上受到了限制。
目前，CRISPR体系被逐渐开发应用。这个方法常用于基因编辑领域。随着type V酶的开发，开始有研究人员将该体系应用到核酸检测上。其主要原理是由于type V酶可在体系中guide RNA的辅助下，特异性的识别靶标DNA，同时，在识别靶标物的过程中会激活自身的基因编辑功能，可以对体系中的任意单链DNA进行切割。目前已有的利用CRISPR体系来进行核酸检测的方法普遍需要复杂、大型的仪器进行荧光读取和结果判定。有些则利用该体系集成一些装置如试纸条等来进行检测，但对于实验的环境和操作均有一定的要求。
在目前已知的利用CRISPR检测的体系中，由于受到反应温度的影响，CRISPR体系无法在起始时刻就添加到反应体系中，必须等到反应结束后打开反应管再进行后续添加，这就极易造成严重的气溶胶污染和假阳性问题，并且使得整个检测操作过程变得复杂和繁琐。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速可视化且可防止气溶胶污染的核酸现场检查方法，利用CRISPR体系结合核酸扩增技术，可以包括普通PCR扩增技术，快速PCR扩增技术，核酸等温扩增技术，如LAMP扩增以及RPA扩增技术等来实现对目标物进行快速特异性的可视化检测，并且在检测过程中可以避免由于添加CRISPR体系带来的气溶胶污染问题。
在将CRISPR体系用于PCR、LAMP或RPA等扩增反应的可视化检测体系中，在反应液上覆盖足够厚的油相以隔绝在二次开盖添加CRISPR体系时核酸扩增反应液的弥散以及与外部的空气的直接接触，防止核酸扩增子整个检测扩增中的溢出而带来的气溶胶污染。本发明所涉及到的CRISPR系统结合PCR、LAMP或RPA可视化检测体系，可以在普通的紫外灯照射下就能直接用肉眼观察结果，也可用带有简单拍照或录像功能的手机等观测装置进行结果观察和记录。本发明不受限于复杂的荧光仪器，对于现场检测具有十分重大的意义，也可以应用与生命安全，农产品质量检测等众多方面。
对于CRISPR体系与PCR结合的检测体系，在常规的PCR反应结束后，打开管盖，用移液枪将合适体积的CRISPR体系添加于管盖的内上壁，由于反应体积相对很小(一般≤20μL)，在表面张力的作用下，即使在倒置状况下，该小体积的反应体系也不会自然滴下而是会附着在内壁上(如附图1中的标号1)，盖上盖子，并通过简单的离心或者颠倒震荡等操作使之与底部的PCR反应体系混合。并将混合后的反应管置于37℃的条件下进行短暂反应，之后在简易紫外装置的照射下即可用肉眼判别检测结果。在这样的体系中，由于在反应液上覆盖有油相，反应液中的扩增子不会溢出或者飘散到空气中，因此不会造成气溶胶污染，从而解决了添加CRISPR体系所造成的污染问题。
对于CRISPR体系与LAMP结合的检测体系，提供两种发明方案。其一，可以与上述提到的CRISPR体系与PCR反应结合的操作相似，在常规的LAMP反应结束后，打开管盖，用移液枪将合适体积的CRISPR体系添加于管盖的内上壁，由于反应体积相对很小(一般≤20μL)，在表面张力的作用下，即使在倒置状况下，该小体积的反应体系也不会自然滴下而是会附着在内壁上(如附图1中的标号1)，盖上管盖，并通过简单的离心或者颠倒震荡等操作使之与底部的LAMP反应体系混合。并将混合后的反应管置于37℃的条件下进行短暂反应，之后在简易紫外装置的照射下即可用肉眼判别检测结果。在这样的体系中，由于在反应液上覆盖有油相，反应液中的扩增子不会溢出或者飘散到空气中，因此不会造成气溶胶污染，从而解决了添加CRISPR体系时可能引起的污染问题。其二，也可以在反应前就将CRISPR体系添加到管盖上，将反应管置于LAMP反应的最适温度(65℃左右)进行反应，而添加在内上壁的CRISPR体系不会处于加热环境中，反应结束后，直接离心或者进行简单的颠倒震荡操作，使管盖上的CRISPR体系与底部的LAMP反应液混合，并将混合后的反应管置于37℃的条件下进行短暂反应，之后在简易紫外装置的照射下即可用肉眼判别检测结果。在采用上述其二这样的方案下，从LAMP反应的配置直至检测的终点，都无需二次打开反应管盖添加额外体系，彻底避免了扩增子溢出的防污染问题。
对于CRISPR体系与RPA结合的反应，由于RPA本身的的反应温度也是37℃左右，与CRISPR体系的工作温度相当，在进行CRISPR结合RPA体系进行检测的时候，可以直接在反应起始时用移液枪将合适体积的CRISPR体系添加于管盖的内上壁，由于反应体积相对很小(一般≤20μL)，在表面张力的作用下，即使在倒置状况下，该小体积的反应体系也不会自然滴下而是会附着在内壁上(如附图1中的标号1)，无需待反应结束后二次开盖再加液，在这样的方案下，从RPA反应起始直至检测的终点，都无需再二次打开反应管盖，彻底避免了扩增子溢出的防污染问题。
另一方面，本发明所涉及到的方法可以在最大程度减少仪器装置和操作的情况下完成。通过在反应液上覆盖一定体积的油相，(该油相不会对扩增反应造成任何影响)隔绝了扩增子与外部的环境，通过将CRISPR体系添加到反应管盖上的方式，减少了额外的装置需求。在反应结束后，通过离心或者简单震荡混匀等操作，使反应液相与CRISPR体系在管内混合，成功避免了扩增子溢出造成的气溶胶污染。
在扩增前，可先用粗提取或者试剂盒提取目标样本的基因组DNA，再根据相应的扩增反应体系配置扩增反应液于反应管中，对于添加油相的方案，此时在扩增反应液上覆盖一层油相以防止与外界空气的直接接触，再在合适的温度下进行核酸扩增。反应结束后，在管盖上添加CRISPR体系，由于覆盖有油相层，此时反应液中的扩增子不会溢出造成污染，在盖上盖管后，通过简单离心使管盖上的CRISPR体系与反应液混合，再将反应管置于合适温度下进行短时间的反应。最终，反应管在简易的紫外照射下就可以发出肉眼可见的明亮荧光，从而可以进行直观的结果判断。
在CRISPR体系和PCR/LAMP/RPA可视化检测体系中，扩增反应液上覆盖油相的选择为石蜡油等生物油。一般的，覆盖相油层体积的厚度为2mm至30mm，优选地，覆盖油相层体积的厚度为4mm至20mm，更优选地，覆盖油相层体积的厚度为5mm至12mm。
在CRISPR体系中，一般包含组分为Cas蛋白(如Cas12a蛋白等)，guide RNA(gRNA)，荧光探针(probe)，RNA酶抑制剂等。
在CRISPR体系中，Cas蛋白的工作浓度范围为0.2μM至2.0μM；CRISPR体系中的guide RNA序列(gRNA)的工作浓度高于Cas12a蛋白酶的浓度；CRISPR体系中的单链DNA荧光探针的工作浓度介于0.5μM至8.0μM。Cas蛋白可采用Cas12a蛋白或者有与Cas12a蛋白的旁路单链DNA切割活性类似的Cas蛋白；在不开盖检测的情况下，核酸扩增子的体积可视为核酸扩增反应液的体积。
核酸扩增反应液的体积与CRISPR体系的体积应介于1：20至2：1。
在CRISPR体系和PCR/LAMP/RPA可视化检测体系中，将混合后的反应液进行短时间的孵育并用紫外灯等简易光源直接照射，即可肉眼判断检测结果。一般的，孵育的反应温度为22℃至42℃，优选地，孵育的反应温度为30℃至38℃，更优选地，孵育的反应温度为35℃至38℃。
在CRISPR体系和PCR/LAMP/RPA可视化检测体系中，将混合后的反应液进行短时间的孵育并用紫外灯等简易光源直接照射，即可肉眼判断检测结果，或者用摄像设备观察记录。一般的，孵育时间为3至20分钟，优选地，孵育时间为5至15分钟，更优选地，孵育时间在8至12分钟。能够大幅缩短检测时间，实现快速可视化且可防止气溶胶污染的核酸现场检查。
在快速PCR体系中，DNA聚合酶的浓度范围为4U至30U，且在一定范围内，聚合酶浓度越高，扩增效率越高。优选地，DNA聚合酶的浓度范围以12U至24U提供，更优选地，DNA聚合酶的浓度范围以15U至20U提供。
在快速PCR体系中，引物的浓度以不低于标准PCR扩增体系中的引物浓度提供。相同条件下，引物浓度越高，扩增效率越高。优选地，引物的浓度范围以0.2μM至8.0μM的浓度提供。更优选地，引物以0.6μM至4.0μM提供。更优选地，引物浓度以0.8μM至2.0μM范围提供。
在三温度的快速PCR体系中，每个循环中包含变性、退火、延伸三个温度步骤。在双温度快速PCR扩增体系中，将退火和延伸两个步骤合并，使之在相同温度下进行。对于变性温度，优选地，提供88℃至98℃的温度范围。优选地，提供94℃至98℃的温度范围。对于退火温度，以不高于引物的Tm值温度为上限给出。优选地，退火温度的范围以48℃至65℃提供。更优选地，退火温度介于55℃至62℃。若采用三温度体系，可将延伸温度以65℃至72℃的范围给出。
在快速PCR扩增体系中，优选地，每个循环时间在35s的时间内完成。更优选地，每个循环的时间在20s内完成。更优选地，每个循环的时间在9s内完成。
在快速PCR体系中，对于扩增子的选择，一般应小于300bp，优选地扩增子应小于200bp，更优选地，扩增子的长度应小于100bp。
在LAMP体系中，Bst DNA聚合酶的浓度范围为5U至32U，且在一定范围内，聚合酶浓度越高，扩增效率越高。优选地，DNA聚合酶的浓度范围以12U至24U提供，更优选地，DNA聚合酶的浓度范围以16U至18U提供。
在LAMP体系中，相同条件下，引物浓度越高，扩增效率越高。优选地，FIP/BIP引物的浓度范围以0.8μM至3.0μM的浓度提供。更优选地，引物以1.2μM至2.4μM提供。更优选地，引物浓度以1.5μM至2.0μM范围提供。
在LAMP体系中，相同条件下，引物浓度越高，扩增效率越高。优选地，F3/B3引物的浓度范围以0.1μM至1.0μM的浓度提供。更优选地，引物以0.1μM至0.8μM提供。更优选地，引物浓度以0.1μM至0.4μM范围提供。
在LAMP体系中，相同条件下，引物浓度越高，扩增效率越高。优选地，环引物LF/LB引物的浓度范围以0.1μM至1.0μM的浓度提供。更优选地，引物以0.2μM至0.8μM提供。更优选地，引物浓度以0.3μM至0.6μM范围提供。
在LAMP体系中，反应温度以恒定温度进行，优选地，反应温度以61℃至69℃范围提供，优选地，反应温度以63℃至67℃范围提供，更优选地，反应温度以64℃至66℃范围提供。
在RPA体系中，相同条件下，引物浓度越高，扩增效率越高。优选地，环引物LF/LB引物的浓度范围以0.1μM至1.0μM的浓度提供。更优选地，引物以0.2μM至0.8μM提供。更优选地，引物浓度以0.3μM至0.4μM范围提供。
在RPA体系中，反应温度以恒定温度进行，优选地，反应温度以34℃至39℃范围提供，优选地，反应温度以35℃至37℃范围提供，更优选地，反应温度以35℃至36℃范围提供。
此外，除了上述提到的PCR、LAMP、RPA扩增技术外，本方法还适用于其他的等温扩增后产物的检测。在其他的等温扩增中，本方法可以一样保持反应体系中扩增子和外界环节的分离，有效防止以为开盖而造成的气溶胶污染问题。
此外，上述体系中，除了提到的Cas 12a蛋白外，还可以使用类似的Cas蛋白，诸如可以用于检测RNA的Cas13蛋白，和Cas 9蛋白等。
在该发明体系中，对所用的反应管、热块不作具体限定，需能保证完成正常的核酸反应即可。
附图说明
图1为本发明的基本原理图，利用CRISPR体系结合PCR、LAMP或是RPA反应，并通过添加油封隔绝液的方式，实现对核酸目标物核酸目标物的可视化快速检测，并且避免了开盖污染的问题。
图2为本发明的防污染原理图，通过在起始反应液相(图中标号3)上覆盖致密的生物油(图中标号2)，使扩增子无法溢出，并在反应管盖上添加CRISPR体系(图中标号1)，通过离心作用，巧妙地使反应液相和CRISPR相混合，实现可视化检测。
图3a、3b分别为利用本发明的反应装置进行实验的演示简图。将反应液(图中标号7)加入到反应管中，在上面覆盖上生物油(图中标号6)防止扩增子的溢出，在反应管盖上添加CRISPR体系(图中标号5)，盖上盖子后将反应管置于简易热块(图中标号4)上进行扩增反应(见图3b)。
图4为本发明在实施例1下的实际检测结果图。在将CRISPR体系与反应液相混合后，通过简易的拍照装置，或者肉眼即可观察到阳性样本(图中标号8)有非常明亮的荧光，而阴性样本(图中标号9)则是没有荧光的。
图5为本发明在实施例1下的实际检测结果荧光数据参考图。在将CRISPR体系与反应液相混合后，阳性样本很快的积累出很高的荧光值，在3min左右的时间积累的荧光值已经足够可以达到肉眼区分的成都，在10min内即可达到反应的终点，相反的，阴性样本则没有荧光增长。
具体实施方法
下面结合具体实施例对本发明做进一步描述，但具体实施例并不对本发明作任何限定。
实施例1利用CRISPR体系结合LAMP检测柑橘黄龙病
LAMP扩增体系：LAMP反应在25μL体积中进行，该体系中含有Bst DNA聚合酶16U，Tris-HCl 20mM，KCl 10mM，(NH4)2SO4 10mM，MgSO4 2.0mM，0.1％Triton@x-100，dNTP1.4mM，Betaine 5.0M，石蜡油40μL(约合厚度为10mm)，引物浓度分别为1.6μM，0.2μM和0.4μM，
LAMP反应程序：63℃反应40min。
反应结束后，用移液枪将合适体积的CRISPR体系加到反应管盖内上壁处，由于表面张力的作用，该小体积的反应体系不会直接掉落，而是附着在内壁上，需要再通过简单离心作用使两相混合即可触发荧光反应。
基于Cas12a蛋白的CRISPR反应体系：总体积为20μL，该体系中各试剂的工作浓度为：Tris-HCl 10mM，NaCl 50mM，MgCl2 10mM，100μg/mL BSA，Cas12a 0.75μM,gRNA 1.5μM,单链DNA荧光探针2.5μM,RNA inhibitor 10U和DNA扩增子。(Cas12a购买自New EnglandBiolabs inc.,货号M0653)。
CRISPR体系结合LAMP反应程序：37℃反应25min，之后95℃10min使酶灭活。再用紫外灯或其他简易光源照射(主要波长在365nm)照射下，用肉眼或带有简易观察装置的手机进行拍照。
使用的引物序列：
F3 5’GTCCCATGCATACGCACAT 3’
B3 5’CCCCGAAATCGGACACTTC 3’
FIP 5’ACCTCCGCTGAGGCAAAGTTTTAAGGATTACGGCGAAGAGC3’
BIP 5’TCGACATTGAAACCCGCAGTCCCTCCGCATAAGCCCAAACC3’
LF 5’GACTCCGATACCTCGGTC 3’
LB 5’CTACCTTAGGCAAGGGTTG 3’
Probe 5’6-FAM-TTATT-BHQ1 3’
gRNA序列
5’UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-ACAUUGAUCAGUUCCACGGCA3’
扩增的模板序列：
5’CCCCGAAATCGGACACTTCGGAGTTTAAGGATTACGGCGAAGAGCA AGACTCCGATACCTCGGTCTCAAAACTTTGCCTCAGCGGAGGTGGACTCCGACGCTCTGCCGTGGAACTGATCAATGTCAAAGCTGTTTATCGACATTGAAACCCGCAGTCCTCAACCCTTGCCTAAGGTAGGGGTTTGGGCTTATGCGGAGCAGGCGGTTATCACTTTATGTGCGTATGCATGGGAC 3’
图4为采用简易荧光照射装置对该催化反应荧光变化的实时记录结果，结果显示，黄龙病菌阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。根据图5中结果，在3分钟内阳性样本所积累的荧光值就足以被肉眼观察所区分；在10分内可以达到饱和稳定状态。因此，在实际应用中，整个检测过程可以在3分钟内实现肉眼观察判断结果。
实施例2利用CRISPR体系结合快速PCR检测柑橘黄龙病
快速PCR扩增体系：PCR反应在10μL体积中进行，该体积中含有Taq HS聚合酶12.5U，Tris-HCl 10mM，KCl 50mM，MgCl2 1.5mM，dNTP各0.2mM，石蜡油40μL(约合厚度为10mm)，引物浓度各为0.4μM(购买自大连宝生物工程有限公司，货号R007A)。
快速PCR扩增程序：95度热启动30s，35个循环，每个循环包括95℃的变性反应2s，55℃的退火延伸反应3s，扩增总耗时3min。
使用的引物序列：
FP 5’GTCCCATGCATACGCACAT 3’
BP 5’CCCCGAAATCGGACACTTC 3’
基于Cas12a蛋白的CRISPR反应体系：总体积为20μL，该体系中各试剂的工作浓度为：Tris-HCl 10mM，NaCl 50mM，MgCl2 10mM，100μg/mL BSA，Cas12a 0.75μM,gRNA1.5μM,单链DNA荧光探针2.5μM,RNA inhibitor 10U和DNA扩增子。(Cas12a购买自New EnglandBiolabs inc.,货号M0653)。
CRISPR体系结合PCR反应程序：37℃反应25min，之后95℃10min使酶灭活。再用紫外灯或其他简易光源照射(主要波长在365nm)照射下，用肉眼或带有简易观察装置的手机进行拍照。结果显示，黄龙病菌阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例3利用CRISPR体系结合RPA检测柑橘黄龙病
RPA扩增体系：总体积为25μL，该体系中包含该体积中含有50mM Tris(pH7.9),100mM醋酸钾,14mM醋酸镁,2.0mM DTT,200μM dNTPs,3mM ATP,300nM各引物,50mM磷酸肌酸,100ng/μL肌酸激酶,30ng/μL Bsu,900ng/μL gp32,120ng/μL uxsX,and 30ng/μL uvsY，石蜡油40μL(约合厚度为10mm)和1μL DNA模板。(所用到的蛋白均由南京金斯瑞生物公司合成。)
RPA扩增程序：37℃反应15min，之后95℃10min使酶灭活。
使用的引物序列：
FP：5’TAGATTCATTGCTATCTCAACTGTTTCA3’
RP：5’GGTATAAGTGTGGTGGATTAATATGGTGT 3’
扩增序列：
5’GGTATAAGTGTGGTGGATTAATATGGTGTCTAAAATTTCGAAACGTAT GCAGCAGATTTCTCAGGGGATTGATCGTTCAGCGTTATATGGGTTAAGTGAT GCTGTGGTTATGCTTAAAGAGCGTGCTACGGCTAGGTTTGATGAAACAGTT GAGATAGCAATGAATCTA 3’
基于Cas12a蛋白的CRISPR反应体系：总体积为20μL，该体系中各试剂的工作浓度为：Tris-HCl 10mM，NaCl 50mM，MgCl2 10mM，100μg/mL BSA，Cas12a 0.75μM,gRNA 1.5μM,单链DNA荧光探针2.5μM,RNA inhibitor 10U和DNA扩增子。(Cas12a购买自New EnglandBiolabs inc.,货号M0653)。
CRISPR体系结合RPA反应程序：37℃反应25min，之后95℃10min使酶灭活。再用紫外灯或其他简易光源照射(主要波长在365nm)照射下，用肉眼或带有简易观察装置的手机进行拍照。结果显示，在3min内，即可使得黄龙病菌阳性样本呈现肉眼可区分的阳性结果，无黄龙病菌样本呈现阴性结果。
实施例4利用CRISPR体系结合LAMP检测柑橘黄龙病
此实施例中，基于Cas12a蛋白的CRISPR反应体系中，Cas12a蛋白的工作浓度为0.60μM,其他工作条件同实施例1。结果显示：在3min内，即可使得黄龙病菌阳性样本呈现肉眼可区分的阳性结果，无黄龙病菌样本呈现阴性结果。
实施例5利用CRISPR体系结合LAMP检测柑橘黄龙病
此实施例中，基于Cas12a蛋白的CRISPR反应体系中，Cas12a蛋白的工作浓度为0.45μM,其他工作条件同实施例1。结果显示：在3min内，即可使得黄龙病菌阳性样本呈现肉眼可区分的阳性结果，无黄龙病菌样本呈现阴性结果。
实施例6利用CRISPR体系结合LAMP检测柑橘黄龙病
此实施例中，基于Cas12a蛋白的CRISPR反应体系中，Cas12a蛋白的工作浓度为0.30μM,其他工作条件同实施例1。结果显示：在3min内，即可使得黄龙病菌阳性样本呈现肉眼可区分的阳性结果，无黄龙病菌样本呈现阴性结果。
实施例7利用CRISPR体系结合LAMP检测柑橘黄龙病
此实施例中，基于Cas12a的CRISPR反应体系中，Cas12a蛋白的工作浓度为0.15μM,其他工作条件同实施例1。结果显示：在3min内，即可使得黄龙病菌阳性样本呈现肉眼可区分的阳性结果，无黄龙病菌样本呈现阴性结果。
实施例8利用CRISPR体系结合LAMP检测柑橘黄龙病
此实施例中，基于Cas12a蛋白的CRISPR反应体系中，guide RNA(gRNA)的工作浓度为1.20μM,其他工作条件同实施例1。结果显示：在3min内，即可使得黄龙病菌阳性样本呈现肉眼可区分的阳性结果，无黄龙病菌样本呈现阴性结果。
实施例9利用CRISPR体系结合LAMP检测柑橘黄龙病
此实施例中，基于Cas12a蛋白的CRISPR反应体系中，guide RNA(gRNA)的工作浓度为1.00μM,其他工作条件同实施例1。结果显示：在3min内，即可使得黄龙病菌阳性样本呈现肉眼可区分的阳性结果，无黄龙病菌样本呈现阴性结果。
实施例10利用CRISPR体系结合LAMP检测柑橘黄龙病
此实施例中，基于Cas12a蛋白的CRISPR反应体系中，guide RNA(gRNA)的工作浓度为0.80μM,其他工作条件同实施例1。结果显示：在3min内，即可使得黄龙病菌阳性样本呈现肉眼可区分的阳性结果，无黄龙病菌样本呈现阴性结果。
实施例11利用CRISPR体系结合LAMP检测柑橘黄龙病
此实施例中，基于Cas12a蛋白的CRISPR反应体系中，guide RNA(gRNA)的工作浓度为0.60μM,其他工作条件同实施例1。结果显示：在3min内，即可使得黄龙病菌阳性样本呈现肉眼可区分的阳性结果，无黄龙病菌样本呈现阴性结果。
实施例12利用CRISPR体系结合LAMP检测柑橘黄龙病
此实施例中，基于Cas12a蛋白的CRISPR反应体系中，单链DNA荧光探针的工作浓度为2.00μM,其他工作条件同实施例1。结果显示：在3min内，即可使得黄龙病菌阳性样本呈现肉眼可区分的阳性结果，无黄龙病菌样本呈现阴性结果。
实施例13利用CRISPR体系结合LAMP检测柑橘黄龙病
此实施例中，基于Cas12a蛋白的CRISPR反应体系中，单链DNA荧光探针的工作浓度为1.60μM,其他工作条件同实施例1。结果显示：在3min内，即可使得黄龙病菌阳性样本呈现肉眼可区分的阳性结果，无黄龙病菌样本呈现阴性结果。
实施例14利用CRISPR体系结合LAMP检测柑橘黄龙病
此实施例中，基于Cas12a蛋白的CRISPR反应体系中，单链DNA荧光探针的工作浓度为1.20μM,其他工作条件同实施例1。结果显示：在3min内，即可使得黄龙病菌阳性样本呈现肉眼可区分的阳性结果，无黄龙病菌样本呈现阴性结果。
实施例15利用CRISPR体系结合LAMP检测柑橘黄龙病
此实施例中，基于Cas12a蛋白的CRISPR反应体系中，单链DNA荧光探针的工作浓度为0.80μM,其他工作条件同实施例1。结果显示：在3min内，即可使得黄龙病菌阳性样本呈现肉眼可区分的阳性结果，无黄龙病菌样本呈现阴性结果。
实施例16利用CRISPR体系结合快速PCR检测柑橘黄龙病
此实施例中，基于Cas12a蛋白的CRISPR反应体系中，将退火延伸的温度设置为58℃,其他工作条件同实施例2。结果显示：在3min内，即可使得黄龙病菌阳性样本呈现肉眼可区分的阳性结果，无黄龙病菌样本呈现阴性结果。
实施例17利用CRISPR体系结合快速PCR检测柑橘黄龙病
此实施例中，基于Cas12a蛋白的CRISPR反应体系中，将退火延伸的温度设置为60℃,其他工作条件同实施例2。结果显示：在3min内，即可使得黄龙病菌阳性样本呈现肉眼可区分的阳性结果，无黄龙病菌样本呈现阴性结果。
实施例18利用CRISPR体系结合快速PCR检测柑橘黄龙病
此实施例中，基于Cas12a的CRISPR反应体系中，将退火延伸的温度设置为62℃,其他工作条件同实施例2。结果显示：在3min内，即可使得黄龙病菌阳性样本呈现肉眼可区分的阳性结果，无黄龙病菌样本呈现阴性结果。
实施例19利用CRISPR体系结合快速PCR检测柑橘黄龙病
此实施例中，基于Cas12a蛋白的CRISPR反应体系中，将退火延伸的温度设置为65℃,其他工作条件同实施例2。结果显示：在3min内，即可使得黄龙病菌阳性样本呈现肉眼可区分的阳性结果，无黄龙病菌样本呈现阴性结果。
实施例20利用CRISPR体系结合RPA检测柑橘黄龙病
此实施例中，基于Cas12a蛋白的CRISPR反应体系中，将RPA反应的温度设置为37℃,反应时间12min，其他工作条件同实施例3。在3min内，即可使得黄龙病菌阳性样本呈现肉眼可区分的阳性结果，无黄龙病菌样本呈现阴性结果。
实施例21利用CRIPSPR体系结合RPA检测柑橘黄龙病
此实施例中，基于Cas12a蛋白的CRISPR反应体系中，将RPA反应的温度设置为37℃,反应时间10min，其他工作条件同实施例3。在3min内，即可使得黄龙病菌阳性样本呈现肉眼可区分的阳性结果，无黄龙病菌样本呈现阴性结果。
实施例22利用CRISPR体系结合RPA检测柑橘黄龙病
此实施例中，基于Cas12a蛋白的CRISPR反应体系中，将RPA反应的温度设置为37℃,反应时间为8min，其他工作条件同实施例3。在3min内，即可使得黄龙病菌阳性样本呈现肉眼可区分的阳性结果，无黄龙病菌样本呈现阴性结果。
实施例23利用CRISPR体系结合RPA检测柑橘黄龙病
此实施例中，基于Cas12a蛋白的CRISPR反应体系中，将RPA反应的温度设置为37℃,反应时间为5min，其他工作条件同实施例3。在3min内，即可使得黄龙病菌阳性样本呈现肉眼可区分的阳性结果，无黄龙病菌样本呈现阴性结果。
实施例24利用CRISPR体系结合RPA检测柑橘黄龙病
此实施例中，基于Cas12a蛋白的CRISPR反应体系中，将RPA反应的温度设置为39℃,反应时间15min，其他工作条件同实施例3。在3min内，即可使得黄龙病菌阳性样本呈现肉眼可区分的阳性结果，无黄龙病菌样本呈现阴性结果。
实施例25利用CRISPR体系结合RPA检测柑橘黄龙病
此实施例中，基于Cas12a蛋白的CRISPR反应体系中，将RPA反应的温度设置为35℃,反应时间15min，其他工作条件同实施例3。在3min内，即可使得黄龙病菌阳性样本呈现肉眼可区分的阳性结果，无黄龙病菌样本呈现阴性结果。
实施例26利用CRISPR体系结合快速PCR检测柑橘黄龙病
此实施例中，基于Cas12a蛋白的CRISPR反应体系中，覆盖石蜡油体积的厚度以20mm提供，用于隔绝反应液相与外界环境，防止气溶胶污染，其他工作条件同实施例2。结果显示：在3min内，即可使得黄龙病菌阳性样本呈现肉眼可区分的阳性结果，无黄龙病菌样本呈现阴性结果。
实施例27利用CRISPR体系结合快速PCR检测柑橘黄龙病
此实施例中，基于Cas12a蛋白的CRISPR反应体系中，覆盖石蜡油体积的厚度以12mm提供，用于隔绝反应液相与外界环境，防止气溶胶污染，其他工作条件同实施例2。结果显示：在3min内，即可使得黄龙病菌阳性样本呈现肉眼可区分的阳性结果，无黄龙病菌样本呈现阴性结果。
实施例28利用CRISPR体系结合RPA检测柑橘黄龙病
此实施例中，基于Cas12a蛋白的CRISPR反应体系中，覆盖石蜡油体积的厚度以25mm提供，用于隔绝反应液相与外界环境，防止气溶胶污染，其他工作条件同实施例3。结果显示：在3min内，即可使得黄龙病菌阳性样本呈现肉眼可区分的阳性结果，无黄龙病菌样本呈现阴性结果。
实施例29利用CRISPR体系结合RPA检测柑橘黄龙病
此实施例中，基于Cas12a蛋白的CRISPR反应体系中，覆盖石蜡油体积的厚度以10mm提供，用于隔绝反应液相与外界环境，防止气溶胶污染，其他工作条件同实施例3。结果显示：在3min内，即可使得黄龙病菌阳性样本呈现肉眼可区分的阳性结果，无黄龙病菌样本呈现阴性结果。
实施例30利用CRISPR体系结合LAMP检测柑橘黄龙病
此实施例中，基于Cas12a蛋白的CRISPR反应体系中，覆盖石蜡油体积的厚度以15mm提供，用于隔绝反应液相与外界环境，防止气溶胶污染，其他工作条件同实施例1。在3min内，即可使得黄龙病菌阳性样本呈现肉眼可区分的阳性结果，无黄龙病菌样本呈现阴性结果。
实施例31利用CRISPR体系结合LAMP检测柑橘黄龙病
此实施例中，基于Cas12a蛋白的CRISPR反应体系中，覆盖石蜡油体积的厚度以8mm提供，用于隔绝反应液相与外界环境，防止气溶胶污染，其他工作条件同实施例1。在3min内，即可使得黄龙病菌阳性样本呈现肉眼可区分的阳性结果，无黄龙病菌样本呈现阴性结果。
Claims (6)
1.一种快速可视化且可防止气溶胶污染的核酸现场检查方法，其特征在于它将核酸扩增反应液置于反应管中，在核酸扩增反应液上覆盖油相层，进行核酸扩增反应，在核酸扩增反应结束后，在有油相层覆盖在核酸扩增液表明的情况下，将合适体积的CRISPR体系加入反应管，通过离心作用，使核酸扩增子和CRISPR体系混合并进行反应，待反应到一定程度后，在紫外灯照射下，利用肉眼观察或摄像设备观察反应管，如果有荧光，则检查结果为阳性，否则为阴性。
2.如权利要求1所述的一种快速可视化且可防止气溶胶污染的核酸现场检查方法，其特征在于所述油相采用生物油。
3.如权利要求1所述的一种快速可视化且可防止气溶胶污染的核酸现场检查方法，其特征在于所述方法采用离心或机械震荡，将油相层破碎，使核酸扩增子和CRISPR体系混合。
4.一种快速可视化且可防止气溶胶污染的核酸现场检查方法，其特征在于它将核酸扩增反应液置于反应管中，在反应管的管盖上设置CRISPR体系，然后盖上管盖；
将反应管处于核酸扩增反应的加热器中进行核酸扩增反应，但反应管的上部不处在所述加热器中；
在核酸扩增反应结束后，不打开管盖，使核酸扩增子和CRISPR体系混合并进行反应，待反应到一定程度后，在紫外灯照射下，利用肉眼观察或摄像设备观察，如果有荧光，则检查结果为阳性，否则为阴性。
5.如权利要求4所述的一种快速可视化且可防止气溶胶污染的核酸现场检查方法，其特征在于所述方法采用离心或机械震荡使核酸扩增子和CRISPR体系混合。
6.如权利要求4所述的一种快速可视化且可防止气溶胶污染的核酸现场检查方法，其特征在于如果核酸扩增体系为RPA扩增体系，则反应管的上部不必不处在所述加热器中。
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