CN107502657A - 一种极速pcr（聚合酶链式反应）扩增和终点检测方法 - Google Patents
一种极速pcr（聚合酶链式反应）扩增和终点检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种可在短时间内完成的极速PCR（聚合酶链式反应）扩增和可视化的终点检测的方法，包括如下步骤：I．极速PCR扩增中，极速PCR扩增包含（a）变性和（b）退火两个阶段，单个循环时间少于20秒；在（a）变性阶段，变性温度控制在85‑98℃；在（b）退火阶段，退火温度控制在40‑72℃，引物的浓度为0.1‑1μM，热稳定性聚合酶的浓度为5‑30U，镁离子的浓度为1‑3mM；II.扩增产物的检测中，通过荧光物质确定样本的检测结果。本发明加快了扩增速度，提高了扩增效率；检测阶段可视化地确定检测结果，简便易行，避免了开盖造成的交叉污染，避免对人体的危害，也降低了检测成本。
Description
技术领域
本发明涉及核酸扩增和检测技术领域，具体涉及一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法。
背景技术
PCR(聚合酶链式反应)作为黄金标准，被广泛应用于医学诊断、食品安全检测等领域。对于传统的PCR扩增而言，每个循环需要提供三个反应温度及相应的反应时间。每个循环包括变性(95℃，10s)、退火(50℃～65℃，30s)、延伸(72℃，1min)三个阶段，为了使反应达到平衡，须提供精密温控的热块，且每个阶段保持相应时长，因此完成整个PCR反应至少需要一个小时。然而，现实中的物理设备不会发生瞬时的温度变化，以及考虑到传质，上述提到的“平衡范例”并不能与现实中的物理设备实现良好的契合。况且，此“平衡范例”也并不完全适用于动力学原理，一旦发生引物退火，则酶延伸紧随其后，即模板变性，引物退火和聚合酶延伸可能短时重叠，其反应速率随着温度的变化而变化。可见，在每个循环中保持三个温度的恒定并不是必须的。
此外，对于扩增产物的检测，传统的方法采用凝胶电泳，费时费力，对人体存在危害，尤为严重的是开盖易造成交叉污染。另外，实时荧光定量PCR需要集成昂贵的荧光设备，大大提高了检测成本。
因此，开发一种更为便携、快速、无需集成热块的PCR扩增和现场检测的方法十分必要。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种可在短时间内完成并可视化检测的极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测的方法。
为了达到上述目的，本发明可以通过以下技术方案来实现：
一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法，包括如下步骤：
I.极速PCR扩增
极速PCR扩增由(a)变性和(b)退火两个阶段组成，单个循环时间少于20秒；
在(a)变性阶段，变性温度控制在85-98℃；
在(b)退火阶段，退火温度控制在40-72℃，引物的浓度为0.1-1μM，热稳定性聚合酶的浓度为5-30U，镁离子的浓度为1-3mM；
II.扩增产物的检测
通过荧光物质确定样本的检测结果。
所述扩增产物的检测可以采用以下步骤：
在极速PCR扩增完成后，将事先滴加在反应盖上的高浓度荧光染料通过离心方式加入到扩增液中，在紫外灯的照射下观察，确定样本的检测结果。
扩增产物的检测也可以采用以下步骤：
在极速PCR扩增前向扩增体系中加入浓度为0.01-1μM的荧光探针，待扩增完成后在凝胶电泳仪或荧光设备上拍照成像并进行灰度值提取，通过比值分析确定样本的检测结果。
优选地，极速PCR扩增中，变性温度控制在90-98℃。
优选地，极速PCR扩增中，退火温度控制在45-65℃；更优选地，极速PCR扩增中，退火温度控制在50-65℃；更优选地，极速PCR扩增中，退火温度控制在55-65℃；更优选地，极速PCR扩增中，退火温度控制在55-60℃。
优选地，极速PCR扩增中，引物的浓度为0.2-0.8μM；更优选地，极速PCR扩增中，引物的浓度为0.4-0.5μM。
优选地，极速PCR扩增中，热稳定性聚合酶的浓度为10-20U；更优选地，极速PCR扩增中，热稳定性聚合酶的浓度为10-15U。
优选地，极速PCR扩增中，镁离子的浓度为1.5-2mM。
优选地，极速PCR扩增的单个循环时间少于10秒；更优选地，极速PCR扩增的单个循环时间少于7.5秒；更优选地，极速PCR扩增的单个循环时间少于5秒。当单个循环时间小于5秒时，优选地，扩增子的长度小于300bp；更优选地，扩增子的长度小于250bp；更优选地，扩增子的长度小于200bp。
优选地，所述热稳定性聚合酶为Taq HS,扩增原料包含dUTP，镁离子的浓度为2-3mM。
优选地，扩增产物的检测中，荧光染料包括SYBR Green I、Ethidium bromide、Gold、SYTO、EvaGreen等双链DNA荧光嵌入荧光染料。
优选地，扩增产物的检测中，荧光探针包括水解探针、分子信标、双链DNA荧光嵌入染料、钙黄绿素和锰离子等。
优选地，荧光探针的浓度为0.01-1μM；更优选地，荧光探针的浓度为0.03-1μM；更优选地，荧光探针的浓度为0.05-0.5μM；更优选地，荧光探针的浓度为0.1-0.4μM。
本发明的第二个目的是提供一种可在短时间内完成的极速PCR(聚合酶链式反应)扩增方法。
为了达到上述目的，本发明可以通过以下技术方案来实现：
一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增方法，包括如下步骤：
极速PCR扩增包含(a)变性和(b)退火两个阶段，单个循环时间少于20秒；
在(a)变性阶段，变性温度控制在85-98℃；
在(b)退火阶段，退火温度控制在40-72℃，引物的浓度为0.1-1μM，热稳定性聚合酶的浓度为5-30U，镁离子的浓度为1-3mM。
优选地，极速PCR扩增中，变性温度控制在90-98℃。
优选地，极速PCR扩增中，退火温度控制在45-65℃；更优选地，极速PCR扩增中，退火温度控制在50-65℃；更优选地，极速PCR扩增中，退火温度控制在55-65℃；更优选地，极速PCR扩增中，退火温度控制在55-60℃。
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优选地，极速PCR扩增中，热稳定性聚合酶的浓度为10-20U；更优选地，极速PCR扩增中，热稳定性聚合酶的浓度为10-15U。
优选地，极速PCR扩增中，镁离子的浓度为1.5-2mM。
优选地，极速PCR扩增的单个循环时间少于10秒；更优选地，极速PCR扩增的单个循环时间少于7.5秒；更优选地，极速PCR扩增的单个循环时间少于5秒。当单个循环时间小于5秒时，优选地，扩增子的长度小于300bp；更优选地，扩增子的长度小于250bp；更优选地，扩增子的长度小于200bp。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
本发明是一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和可视化终点检测方法。扩增阶段通过对扩增体系的浓度、温度、反应时间的控制，加快了扩增速度，提高了扩增效率，同时也能保证扩增子的长度；扩增阶段对浓度、温度、反应时间优选范围的选择，有助于检测阶段更清楚地识别样本的阴性或阳性表现。终点检测阶段通过无需开盖的离心方式加入荧光染料或在扩增前就加入荧光探针的方式，可视化地确定检测结果，简便易行，避免了开盖造成的交叉污染，避免对人体的危害，也降低了检测成本。
附图说明
图1是本发明一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法实施例1终点可视荧光检测对GTS 40-3-2转基因大豆检测结果图。
图2是本发明一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法实施例2终点可视荧光检测对GTS 40-3-2转基因大豆检测结果图。
图3是本发明一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法实施例3终点可视荧光检测对GTS 40-3-2转基因大豆样本检测结果图。
图4是本发明一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法实施例4终点可视荧光检测对虾样本中的副溶血弧菌检测结果图。
图5是本发明一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法实施例5终点可视荧光检测对虾样本中的副溶血弧菌检测结果图。
图6是本发明一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法实施例6终点可视荧光检测对虾样本中的副溶血弧菌检测结果图。
图7是本发明一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法实施例7终点可视荧光检测对GTS 40-3-2转基因大豆检测结果图。
图8是本发明一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法实施例8终点可视荧光检测对GTS 40-3-2转基因大豆的检测结果图。
图9是本发明一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法实施例9灰度值提取方法对牛肉样本的检测结果图。
图10是本发明一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法实施例10灰度值提取方法对牛肉样本的检测结果图。
图11是本发明一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法实施例11灰度值提取方法对牛肉样本的检测结果图。
图12是本发明一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法实施例11灰度值提取检测结果列表。
图13是本发明一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法实施例11样本扩增时的实时荧光曲线图。
图14是本发明一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法实施例12灰度值提取方法对牛肉样本的检测结果图。
图15是本发明一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法实施例12灰度值提取检测结果列表。
图16是本发明一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法实施例13样本扩增时的实时荧光曲线图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的实施例作进一步详细的描述。
实施例1-8极速PCR扩增结合终点可视荧光检测的方法。
实施例1
PCR扩增及检测对象：GTS 40-3-2转基因大豆
极速PCR扩增体系：PCR反应在15μL体积中进行，该体积中含有Taq HS聚合酶为12.5U，Tris-HCl为10mM，KCl为50mM，MgCl2为1.5mM，dNTP各0.2mM，引物浓度各为0.4μM(购买自大连宝生物工程有限公司，货号R007A)。
极速PCR扩增程序：95度热启动30s，35个循环，每个循环包括95℃变性反应5s，60℃退火反应5s，扩增总耗时7min 30s。
使用的引物序列如下：
F：5'CGCACAATCCCACTATCCTTC3'(SEQ ID NO.1)
R：5'TCAGCTTGTCAGCGTGTCCTC3'(SEQ ID NO.2)
扩增的模板序列(SEQ ID NO.3)：
CGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACGCTGACAAGCTGA(GenBank:AB209952.1)
终点可视荧光检测对GTS 40-3-2转基因大豆检测结果如图1所示。
结果显示：GTS 40-3-2转基因大豆样本呈现阳性结果，非转基因大豆样本呈现阴性结果。
实施例2
PCR扩增及检测对象：GTS 40-3-2转基因大豆。
极速PCR扩增体系：PCR反应在15μL体积中进行，该体积中含有SpeedSTARTM HS聚合酶为12.5U，Tris-HCl为10mM，KCl为50mM，MgCl2为1.5mM，dNTP各0.2mM，引物浓度各为0.4μM(购买自大连宝生物工程有限公司，货号RR070A)。
极速PCR扩增程序：95度热启动30s，42个循环，每个循环包括95℃变性反应2s，60℃退火反应3s，共耗时4min。
使用的引物序列如下：
F：5'CGCACAATCCCACTATCCTTC3'(SEQ ID NO.4)
R：5'TCAGCTTGTCAGCGTGTCCTC3'(SEQ ID NO.5)
扩增的模板序列(SEQ ID NO.6)：
CGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACGCTGACAAGCTGA(GenBank:AB209952.1)
终点可视荧光检测对GTS 40-3-2转基因大豆检测结果如图2所示。
结果显示：GTS 40-3-2转基因大豆样本呈现阳性结果，非转基因大豆样本呈现阴性结果。
实施例3
PCR扩增及检测对象：GTS 40-3-2转基因大豆。
极速PCR扩增循环30次，总耗时为3min，其他工作条件同实施例2。
终点可视荧光检测对GTS 40-3-2转基因大豆样本的检测结果如图3所示。
结果显示：GTS 40-3-2转基因大豆样本呈现阳性结果，非转基因大豆样本呈现阴性结果。
实施例4
PCR扩增及检测对象：虾样本中的副溶血弧菌。
极速PCR扩增体系：PCR反应在15μL体积中进行，该体积中含有Taq HS聚合酶为12.5U，Tris-HCl为10mM，KCl为50mM，MgCl2为1.5mM，dNTP各0.2mM，引物浓度各为0.4μM(购买自大连宝生物工程有限公司，货号R007A)。
极速PCR扩增程序：95度热启动30s，35个循环，每个循环包括95℃变性反应5s，60℃退火反应5s，扩增总耗时7min 30s。
使用的引物序列1如下：
F1：5'CATTACGTTCTTCGCCGCTG3'(SEQ ID NO.7)
R1：5'CACCGAGTGCAACCACTTTG3'(SEQ ID NO.8)
对应的扩增模板序列(SEQ ID NO.9)(107bp)：
CATTACGTTCTTCGCCGCTGACAATCGCTTCTCATACAACCACACGATCTGGAGCAACGACGCAGCAATGCAGCCAGATCAAATCAACAAAGTGGTTGCACTCGGTG(GenBank:M36437)
使用的引物序列2：
F2：5'CATTACGTTCTTCGCCGCTG3'(SEQ ID NO.10)
R2：5'CACCGAGTGCAACCACTTTG3'(SEQ ID NO.11)
对应的扩增模板序列(SEQ ID NO.12)(354bp)：
GACATTACGTTCTTCGCCGCTGACAATCGCTTCTCATACAACCACACGATCTGGAGCAACGACGCAGCAATGCAGCCAGATCAAATCAACAAAGTGGTTGCACTCGGTGACAGCTTGTCTGATACAGGCAACATCTTTAACGCATCACAATGGCGCTTCCCTAACCCGAACAGCTGGTTCTTAGGTCACTTCTCCAACGGTTTTGTGTGGACAGAATACATTGCCAAAGCGAAGAACCTTCCGCTCTACAACTGGGCAGTTGGCGGCGCGGCTGGTGAGAACCAATACATCGCGCTAACAGGGGTTGGTGATCAAGTTTCTTCGTACTTAACCTACGCAAAACTGGCGAAGAAC(GenBank:M36437)
使用的引物序列3：
F3：5'AAGCGGATTATGCAGAAGCACTG3'(SEQ ID NO.13)
R3：5'GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC3'(SEQ ID NO.14)
对应的扩增模板序列(SEQ ID NO.15)(449bp)：
AAGCGGATTATGCAGAAGCACTGATTCGTTTGACGGACGCAGGTGCGAAGAACTTCATGTTGATGACACTGCCAGATGCGACGAAAGCGCCTCAGTTTAAGTACTCAACACAAGAAGAGATCGACAAAATTCGTGCGAAAGTGCTTGAGATGAACGAGTTCATCAAGGCACAAGCGATGTACTACAAAGCGCAAGGTTACAACATCACGTTGTTTGATACTCACGCCTTGTTCGAGACGCTAACTTCTGCGCCCGAAGAGCACGGTTTCGTGAACGCGAGCGATCCTTGTTTGGACATCAACCGCTCATCGTCTGTCGATTACATGTACACCCACGCATTGCGCTCTGAGTGTGCAGCGTCTGGTGCTGAGAAGTTTGTGTTCTGGAATGTCACGCATCCAACAACAGCAACTCACCGCTATGTTGCAGAGAAAATGCTAGAAAGTAGC(GenBank:M36437)
终点可视荧光检测对虾样本中的副溶血弧菌检测结果如图4所示。
结果显示：对于虾样本中副溶血弧菌的检测，采用Taq H聚合酶扩增7min30s，当扩增模板的长度小于300bp时，阳性样本和阴性样本能有明显区分；当扩增模板的长度大于300bp时，无法区分阳性样本和阴性样本。
实施例5
PCR扩增及检测对象：虾样本中的副溶血弧菌。
极速PCR扩增体系：PCR反应在15μL体积中进行，该体积中含有SpeedSTARTM HS聚合酶为12.5U，Tris-HCl为10mM，KCl为50mM，MgCl2为1.5mM，dNTP各0.2mM，引物浓度各为0.4μM(购买自大连宝生物工程有限公司，货号RR070A)。
极速PCR扩增程序：95度热启动30s，35个循环，每个循环包括95℃反应2s，60℃反应3s，扩增总耗时5min。
使用的引物序列1：
F1：5'CATTACGTTCTTCGCCGCTG3'(SEQ ID NO.16)
R1：5'CACCGAGTGCAACCACTTTG3'(SEQ ID NO.17)
对应的扩增模板序列(SEQ ID NO.18)(107bp)：
CATTACGTTCTTCGCCGCTGACAATCGCTTCTCATACAACCACACGATCTGGAGCAACGACGCAGCAATGCAGCCAGATCAAATCAACAAAGTGGTTGCACTCGGTG(GenBank:M36437)
使用的引物序列2：
F2：5'CATTACGTTCTTCGCCGCTG3'(SEQ ID NO.19)
R2：5'CACCGAGTGCAACCACTTTG3'(SEQ ID NO.20)
对应的扩增模板序列(SEQ ID NO.21)(354bp)：
GACATTACGTTCTTCGCCGCTGACAATCGCTTCTCATACAACCACACGATCTGGAGCAACGACGCAGCAATGCAGCCAGATCAAATCAACAAAGTGGTTGCACTCGGTGACAGCTTGTCTGATACAGGCAACATCTTTAACGCATCACAATGGCGCTTCCCTAACCCGAACAGCTGGTTCTTAGGTCACTTCTCCAACGGTTTTGTGTGGACAGAATACATTGCCAAAGCGAAGAACCTTCCGCTCTACAACTGGGCAGTTGGCGGCGCGGCTGGTGAGAACCAATACATCGCGCTAACAGGGGTTGGTGATCAAGTTTCTTCGTACTTAACCTACGCAAAACTGGCGAAGAAC(GenBank:M36437)
使用的引物序列3：
F3：5'AAGCGGATTATGCAGAAGCACTG3'(SEQ ID NO.22)
R3：5'GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC3'(SEQ ID NO.23)
对应的扩增模板序列(SEQ ID NO.24)(449bp)：
AAGCGGATTATGCAGAAGCACTGATTCGTTTGACGGACGCAGGTGCGAAGAACTTCATGTTGATGACACTGCCAGATGCGACGAAAGCGCCTCAGTTTAAGTACTCAACACAAGAAGAGATCGACAAAATTCGTGCGAAAGTGCTTGAGATGAACGAGTTCATCAAGGCACAAGCGATGTACTACAAAGCGCAAGGTTACAACATCACGTTGTTTGATACTCACGCCTTGTTCGAGACGCTAACTTCTGCGCCCGAAGAGCACGGTTTCGTGAACGCGAGCGATCCTTGTTTGGACATCAACCGCTCATCGTCTGTCGATTACATGTACACCCACGCATTGCGCTCTGAGTGTGCAGCGTCTGGTGCTGAGAAGTTTGTGTTCTGGAATGTCACGCATCCAACAACAGCAACTCACCGCTATGTTGCAGAGAAAATGCTAGAAAGTAGC(GenBank:M36437)
终点可视荧光检测对虾样本中的副溶血弧菌检测结果如图5所示。
结果显示：对于虾样本中副溶血弧菌的检测，采用SpeedSTARTM HS聚合酶扩增5min，当扩增模板的长度小于300bp时，阳性样本和阴性样本能有明显区分；当扩增模板的长度大于300bp时，无法区分阳性样本和阴性样本。
实施例6
PCR扩增及检测对象：虾样本中的副溶血弧菌。
极速PCR循环程序为95度，热启动30s，42个循环，每个循环包括95℃反应5s，60℃反应5s，扩增总耗时7min 30s，其他工作条件同实施例5。
终点可视荧光检测对虾样本中的副溶血弧菌检测结果如图6所示。
结果显示：对于虾样本中副溶血弧菌的检测，采用SpeedSTARTM HS聚合酶扩增5min，当扩增模板的长度小于450bp时，阳性样本和阴性样本能有明显区分；当扩增模板的长度为450bp时，无法区分阳性样本和阴性样本。
实施例7
PCR扩增及检测对象：GTS 40-3-2转基因大豆检测限测定。
极速PCR扩增体系：PCR反应在15μL体积中进行，该体积中含有SpeedSTARTM HS聚合酶为12.5U，Tris-HCl为10mM，KCl为50mM，MgCl2为1.5mM，dNTP各0.2mM，引物浓度各为0.4μM(购买自大连宝生物工程有限公司，货号RR070A)。
极速PCR扩增程序：95度热启动30s，54个循环，每个循环包括95℃变性反应2s，60℃退火反应3s，扩增总耗时5min。
使用的引物序列：
F：5'AACAACATGGCACAAGGGATACAAACC3'(SEQ ID NO.25)
R：5'CCACTGATGCTGAAATCCTAAAGGAAC3'(SEQ ID NO.26)
扩增的模板序列(SEQ ID NO.27)：
AACAACATGGCACAAGGGATACAAACCCTTAATCCCAATTCCAATTTCCATAAACCCCAAGTTCCTAAATCTTCAAGTTTTCTTGTTTTTGGATCTAAAAAACTGAAAAATTCAGCAAATTCTATGTTGGTTTTGAAAAAAGATTCAATTTTTATGCAAAAGTTTTGTTCCTTTAGGATTTCAGCATCAGT
(GenBank:AB209952.1)
终点可视荧光检测对GTS 40-3-2转基因大豆检测结果如图7所示。
结果显示：对于转基因大豆GTS 40-3-2的检测，检测限为2个拷贝每个反应体系。
实施例8
PCR扩增及检测对象：GTS 40-3-2转基因大豆。
极速PCR扩增体系中，将dNTP用相同浓度的dUTP代替，镁离子的工作浓度为2mM，其他工作条件同实施例5。
终点可视荧光检测对GTS 40-3-2转基因大豆的检测结果如图8所示。
结果显示：GTS 40-3-2转基因大豆样本呈现阳性结果，非转基因大豆样本呈现阴性结果。
实施例9-10，极速PCR扩增结合灰度值提取检测的方法。
实施例9
特异性检测牛肉样本。
极速PCR扩增体系：PCR反应在15μL体积中进行，该体积中含有SpeedSTARTM HS聚合酶为12.5U，Tris-HCl为10mM，KCl为50mM，MgCl2为1.5mM，dNTP各0.2mM，引物浓度各为0.4μM(购买自大连宝生物工程有限公司，货号RR070A)，荧光探针浓度为0.1μM。
极速PCR扩增程序：95度热启动30s，42个循环，每个循环包括95℃变性反应2s，60℃退火反应3s，扩增总耗时4min。
灰度值提取方法：将极速PCR扩增后的样本常温下置于凝胶电泳仪中进行拍照，然后将拍照获得的图像选取灰度均匀的部分进行灰度值提取并取平均值(灰度值提取部分的位置及面积大小(如图9中所标方框包围的部分)。然后，将待测样本的灰度平均值除以阴性对照样本的灰度平均值。若比值大于或等于1.5，说明待测样本为阳性样本；若比值小于1.5，说明待测样本为阴性样本。
使用的引物序列：
F：5'GTAGGTGCACAGTACGTTCTGAAG3'(SEQ ID NO.28)
R：5'GGCCAGACTGGGCACATG3'(SEQ ID NO.29)
P：5'Hex-GAACCTCATTCTGGGGCCCCG-Eclipse3'(SEQ ID NO.30)
扩增的模板序列(SEQ ID NO.31)：
GTAGGTGCACAGTACGTTCTGAAGTGAACCTCATTCTGGGGCCCCGGCACACTCGGCTGTGTTCCTTGCACTCTTCTGCATGTGCCCAGTCTGGCC(GenBank:EH170825)
灰度值提取方法对牛肉样本的检测结果如图9所示。
如图9所示，左边毛细管中为阴性对照样本，右边毛细管中为待测样本。待两者扩增完成后，同时进行凝胶电泳仪拍照，并对灰度均匀的部分进行灰度值提取(如被所标方框包围的部分)。
结果显示：左边阴性对照样本提取的灰度平均值为6847.65，右边待测样本提取的灰度平均值为11021.35，因此右边待测样本与左边阴性对照样本灰度值的比值为1.61，说明右边的待测样本为阳性样本。
实施例10
特异性检测牛肉样本。
此实施例中，极速PCR扩增体系中，荧光探针的工作浓度为0.2μM，其他工作条件同实施例9。
灰度值提取方法对牛肉样本的检测结果如图10所示。
如图10所示，左边毛细管中为阴性对照样本，右边毛细管中为待测样本。待两者扩增完成后，同时进行凝胶电泳仪拍照，并对灰度均匀的部分进行灰度值提取(如被所标方框包围的部分)。
结果显示：左边阴性对照样本提取的灰度平均值为9295.13，右边待测样本提取的灰度平均值为20032.24，因此右边待测样本与左边阴性对照样本灰度值的比值为2.16，说明右边的待测样本为阳性样本。
实施例11-12，两种检测方法的检测限比较。
实施例11
采用梯度稀释的牛肉样本，比较灰度值提取方法与实时荧光曲线方法的检测限。
PCR扩增体系：PCR反应在25μL体积中进行，采用罗氏探针试剂盒进行扩增(购买自罗氏诊断公司，货号：06402682001)，探针浓度为0.1μM。
PCR扩增程序：95度热启动10min，45个循环，每个循环包括95度10s，60度30s。
灰度值提取方法：将PCR扩增后的样本常温下置于凝胶电泳仪中进行拍照，然后将拍照获得的图像选取灰度均匀的部分进行灰度值提取并取平均值(灰度值提取部分的位置及面积大小如图11中被所标方框包围的部分)。然后，将待测样本的灰度平均值除以阴性对照样本的灰度平均值。若比值大于或等于1.5，说明待测样本为阳性样本，若比值小于1.5，说明待测样本为阴性样本。
使用的引物序列：
F：5'GTAGGTGCACAGTACGTTCTGAAG3'(SEQ ID NO.32)
R：5'GGCCAGACTGGGCACATG3'(SEQ ID NO.33)
P：5'Hex-GAACCTCATTCTGGGGCCCCG-Eclipse3'(SEQ ID NO.34)
扩增的模板序列(SEQ ID NO.35)：
GTAGGTGCACAGTACGTTCTGAAGTGAACCTCATTCTGGGGCCCCGGCACACTCGGCTGTGTTCCTTGCACTCTTCTGCATGTGCCCAGTCTGGCC(GenBank:EH170825)
灰度值提取方法对牛肉样本的检测结果如图11所示。
如图11所示，从左到右，对待测牛肉模板进行10倍连续梯度稀释，即从左到右，模板浓度依次为初始模板浓度的10-1，10-2,10-3,10-4,10-5,10-6，水代替模板做空白对照(NTC)，水代替模板做空白对照(NTC)。待PCR扩增完成后，在常温下对样本进行拍照，对灰度均匀的部分进行灰度值提取(如被所标方框包围的部分)。对同一样本提取的灰度值取平均值，然后与NTC样本的灰度值做比，若比值大于或等于1.5，则待测样本为阳性样本，若比值小于1.5，则待测样本为阴性样本。
灰度值提取检测结果如图12所示。
上述样本进行扩增时所获得的实时荧光曲线如图13所示。
如图13所示，实时荧光曲线中三个呈S型的扩增曲线从左到右，从高到低对应的牛肉样本分别为初始模板浓度的10-1,10-2和10-3。
结果显示：灰度值提取方法与实时荧光曲线检测方法对梯度稀释的牛肉样本的检测限相同。
实施例12
采用梯度稀释的牛肉样本，比较灰度值提取方法与实时荧光曲线方法的检测限。
此实施例中，极速PCR扩增体系中，探针的工作浓度为0.2μM，其他工作条件同实施例11。
灰度值提取方法对牛肉样本的检测结果如图14所示。
如图14所示，为测定灰度提取方法检测牛肉样本的检测限，对待测牛肉模板进行10倍梯度稀释，从左到右，模板浓度依次为初始模板浓度10-1，10-2，10-4，10-3，10-5，10-6，水代替模板做空白对照(NTC)，水代替模板做空白对照(NTC)。待PCR扩增完成后，在常温下对样本进行拍照，对灰度均匀的部分进行灰度值提取(如黑点标注的地方所示)。对同一样本提取的灰度值取平均值，然后与NTC样本的灰度值做比，若比值大于或等于1.5，则待测样本为阳性样本，若比值小于1.5，则待测样本为阴性样本。
灰度值提取检测结果如图15所示。
上述样本进行扩增时所获得的实时荧光曲线如图16所示。
如图16所示，实时荧光曲线中三个呈S型的扩增曲线从左到右，从高到低对应的牛肉样本分别为初始模板浓度的10-1,10-2和10-3。
结果显示：灰度值提取方法与实时荧光曲线检测方法对梯度稀释的牛肉样本的检测限相同。
实施例13-19极速PCR扩增结合终点可视荧光检测的方法。
实施例13
终点可视荧光法结合极速PCR检测GTS 40-3-2转基因大豆。
此实施例中，极速PCR扩增体系中，引物的工作浓度均为0.1μM，其他工作条件同实施例1。
结果显示：GTS 40-3-2转基因大豆样本呈现阳性结果，非转基因大豆样本呈现阴性结果。
实施例14
终点可视荧光法结合极速PCR检测GTS 40-3-2转基因大豆。
此实施例中，极速PCR扩增体系中，引物的工作浓度均为1μM，其他工作条件同实施例2。
结果显示：GTS 40-3-2转基因大豆样本呈现阳性结果，非转基因大豆样本呈现阴性结果。
实施例15
终点可视荧光法结合极速PCR检测GTS 40-3-2转基因大豆。
此实施例中，极速PCR扩增体系中，SpeedSTARTM HS聚合酶的工作浓度为10U，其他工作条件同实施例2。
结果显示：GTS 40-3-2转基因大豆样本呈现阳性结果，非转基因大豆样本呈现阴性结果。
实施例16
终点可视荧光法结合极速PCR检测GTS 40-3-2转基因大豆。
此实施例中，极速PCR扩增体系中，SpeedSTARTM HS聚合酶的工作浓度为20U，其他工作条件同实施例2。
结果显示：GTS 40-3-2转基因大豆样本呈现阳性结果，非转基因大豆样本呈现阴性结果。
实施例17
终点可视荧光法结合极速PCR检测GTS 40-3-2转基因大豆。
极速PCR扩增体系：PCR反应在15μL体积中进行，该体积中含有Taq HS聚合酶为12.5U，Tris-HCl为10mM，KCl为50mM，MgCl2为1.5mM，dATP、dGTP、dCTP各0.2mM，dUTP 0.4mM，引物浓度各为0.4μM(购买自大连宝生物工程有限公司，货号R007A)。
极速PCR扩增程序：95度热启动30s，35个循环，每个循环包括95℃反应5s，55℃反应5s，扩增总耗时7min 30s。
使用的引物序列：
F：5'CGCACAATCCCACTATCCTTC3'(SEQ ID NO.36)
R：5'TCAGCTTGTCAGCGTGTCCTC3'(SEQ ID NO.37)
扩增的模板序列(SEQ ID NO.38)：
CGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACGCTGACAAGCTGA(GenBank:AB209952.1)
检测结果：GTS 40-3-2转基因大豆样本呈现阳性结果，非转基因大豆样本呈现阴性结果。
实施例18
终点可视荧光法结合极速PCR检测GTS 40-3-2转基因大豆。
此实施例中，极速PCR扩增体系中，MgCl2的工作浓度均为3mM，其他工作条件同实施例17。
结果显示：GTS 40-3-2转基因大豆样本呈现阳性结果，非转基因大豆样本呈现阴性结果。
实施例19
终点可视荧光法结合极速PCR检测GTS 40-3-2转基因大豆。
此实施例中，极速PCR扩增体系中，MgCl2的工作浓度均为1.0mM，其他工作条件同实施例17。
结果显示：GTS 40-3-2转基因大豆样本呈现阳性结果，非转基因大豆样本呈现阴性结果。
实施例20
采用灰度值提取方法，特异性检测牛肉样本。
此实施例中，极速PCR扩增体系中，探针的工作浓度为0.4μM，其他工作条件同实施例9。
结果显示：待测样本与阴性对照样本灰度值的比值大于1.5，可判定待测样本为阳性样本。
以上所述仅是本发明优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明保护范围内。
<110> 浙江大学
<120> 一种极速PCR（聚合酶链式反应）扩增和终点检测方法
<160> 38
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
CGCACAATCC CACTATCCTT C 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
TCAGCTTGTC AGCGTGTCCT C 21
<210> 3
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
CGCACAATCC CACTATCCTT CGCAAGACCC TTCCTCTATA TAAGGAAGTT CATTTCATTT 60
GGAGAGGACA CGCTGACAAG CTGA 84
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
CGCACAATCC CACTATCCTT C 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
TCAGCTTGTC AGCGTGTCCT C 21
<210> 6
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
CGCACAATCC CACTATCCTT CGCAAGACCC TTCCTCTATA TAAGGAAGTT CATTTCATTT 60
GGAGAGGACA CGCTGACAAG CTGA 84
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 7
CATTACGTTC TTCGCCGCTG 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 8
CACCGAGTGC AACCACTTTG 20
<210> 9
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 9
CATTACGTTC TTCGCCGCTG ACAATCGCTT CTCATACAAC CACACGATCT GGAGCAACGA 60
CGCAGCAATG CAGCCAGATC AAATCAACAA AGTGGTTGCA CTCGGTG 107
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 10
CATTACGTTC TTCGCCGCTG 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 11
CACCGAGTGC AACCACTTTG 20
<210> 12
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 12
GACATTACGT TCTTCGCCGC TGACAATCGC TTCTCATACA ACCACACGAT CTGGAGCAAC 60
GACGCAGCAA TGCAGCCAGA TCAAATCAAC AAAGTGGTTG CACTCGGTGA CAGCTTGTCT 120
GATACAGGCA ACATCTTTAA CGCATCACAA TGGCGCTTCC CTAACCCGAA CAGCTGGTTC 180
TTAGGTCACT TCTCCAACGG TTTTGTGTGG ACAGAATACA TTGCCAAAGC GAAGAACCTT 240
CCGCTCTACA ACTGGGCAGT TGGCGGCGCG GCTGGTGAGA ACCAATACAT CGCGCTAACA 300
GGGGTTGGTG ATCAAGTTTC TTCGTACTTA ACCTACGCAA AACTGGCGAA GAAC 354
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 13
AAGCGGATTA TGCAGAAGCA CTG 23
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 14
GCTACTTTCT AGCATTTTCT CTGC 24
<210> 15
<211> 449
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 15
AAGCGGATTA TGCAGAAGCA CTGATTCGTT TGACGGACGC AGGTGCGAAG AACTTCATGT 60
TGATGACACT GCCAGATGCG ACGAAAGCGC CTCAGTTTAA GTACTCAACA CAAGAAGAGA 120
TCGACAAAAT TCGTGCGAAA GTGCTTGAGA TGAACGAGTT CATCAAGGCA CAAGCGATGT 180
ACTACAAAGC GCAAGGTTAC AACATCACGT TGTTTGATAC TCACGCCTTG TTCGAGACGC 240
TAACTTCTGC GCCCGAAGAG CACGGTTTCG TGAACGCGAG CGATCCTTGT TTGGACATCA 300
ACCGCTCATC GTCTGTCGAT TACATGTACA CCCACGCATT GCGCTCTGAG TGTGCAGCGT 360
CTGGTGCTGA GAAGTTTGTG TTCTGGAATG TCACGCATCC AACAACAGCA ACTCACCGCT 420
ATGTTGCAGA GAAAATGCTA GAAAGTAGC 449
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 16
CATTACGTTC TTCGCCGCTG 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 17
CACCGAGTGC AACCACTTTG 20
<210> 18
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 18
CATTACGTTC TTCGCCGCTG ACAATCGCTT CTCATACAAC CACACGATCT GGAGCAACGA 60
CGCAGCAATG CAGCCAGATC AAATCAACAA AGTGGTTGCA CTCGGTG 107
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 19
CATTACGTTC TTCGCCGCTG 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 20
CACCGAGTGC AACCACTTTG 20
<210> 21
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 21
GACATTACGT TCTTCGCCGC TGACAATCGC TTCTCATACA ACCACACGAT CTGGAGCAAC 60
GACGCAGCAA TGCAGCCAGA TCAAATCAAC AAAGTGGTTG CACTCGGTGA CAGCTTGTCT 120
GATACAGGCA ACATCTTTAA CGCATCACAA TGGCGCTTCC CTAACCCGAA CAGCTGGTTC 180
TTAGGTCACT TCTCCAACGG TTTTGTGTGG ACAGAATACA TTGCCAAAGC GAAGAACCTT 240
CCGCTCTACA ACTGGGCAGT TGGCGGCGCG GCTGGTGAGA ACCAATACAT CGCGCTAACA 300
GGGGTTGGTG ATCAAGTTTC TTCGTACTTA ACCTACGCAA AACTGGCGAA GAAC 354
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 22
AAGCGGATTA TGCAGAAGCA CTG 23
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 23
GCTACTTTCT AGCATTTTCT CTGC 24
<210> 24
<211> 449
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 24
AAGCGGATTA TGCAGAAGCA CTGATTCGTT TGACGGACGC AGGTGCGAAG AACTTCATGT 60
TGATGACACT GCCAGATGCG ACGAAAGCGC CTCAGTTTAA GTACTCAACA CAAGAAGAGA 120
TCGACAAAAT TCGTGCGAAA GTGCTTGAGA TGAACGAGTT CATCAAGGCA CAAGCGATGT 180
ACTACAAAGC GCAAGGTTAC AACATCACGT TGTTTGATAC TCACGCCTTG TTCGAGACGC 240
TAACTTCTGC GCCCGAAGAG CACGGTTTCG TGAACGCGAG CGATCCTTGT TTGGACATCA 300
ACCGCTCATC GTCTGTCGAT TACATGTACA CCCACGCATT GCGCTCTGAG TGTGCAGCGT 360
CTGGTGCTGA GAAGTTTGTG TTCTGGAATG TCACGCATCC AACAACAGCA ACTCACCGCT 420
ATGTTGCAGA GAAAATGCTA GAAAGTAGC 449
<210> 25
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 25
AACAACATGG CACAAGGGAT ACAAACC 27
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 26
CCACTGATGC TGAAATCCTA AAGGAAC 27
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 27
AACAACATGG CACAAGGGAT ACAAACCCTT AATCCCAATT CCAATTTCCA TAAACCCCAA 60
GTTCCTAAAT CTTCAAGTTT TCTTGTTTTT GGATCTAAAA AACTGAAAAA TTCAGCAAAT 120
TCTATGTTGG TTTTGAAAAA AGATTCAATT TTTATGCAAA AGTTTTGTTC CTTTAGGATT 180
TCAGCATCAG T 191
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 28
GTAGGTGCAC AGTACGTTCT GAAG 24
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 29
GGCCAGACTG GGCACATG 18
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 30
GAACCTCATT CTGGGGCCCC G 21
<210> 31
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 31
GTAGGTGCAC AGTACGTTCT GAAGTGAACC TCATTCTGGG GCCCCGGCAC ACTCGGCTGT 60
GTTCCTTGCA CTCTTCTGCA TGTGCCCAGT CTGGCC 96
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 32
GTAGGTGCAC AGTACGTTCT GAAG 24
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 33
GGCCAGACTG GGCACATG 18
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 34
GAACCTCATT CTGGGGCCCC G 21
<210> 35
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 35
GTAGGTGCAC AGTACGTTCT GAAGTGAACC TCATTCTGGG GCCCCGGCAC ACTCGGCTGT 60
GTTCCTTGCA CTCTTCTGCA TGTGCCCAGT CTGGCC 96
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 36
CGCACAATCC CACTATCCTT C 21
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 37
TCAGCTTGTC AGCGTGTCCT C 21
<210> 38
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 38
CGCACAATCC CACTATCCTT CGCAAGACCC TTCCTCTATA TAAGGAAGTT CATTTCATTT 60
GGAGAGGACA CGCTGACAAG CTGA 84
Claims (10)
1.一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法，其特征在于包括如下步骤：
I.极速PCR扩增
极速PCR扩增由(a)变性和(b)退火两个阶段组成，单个循环时间少于20秒；
在(a)变性阶段，变性温度控制在85-98℃；
在(b)退火阶段，退火温度控制在40-72℃，引物的浓度为0.1-1μM，热稳定性聚合酶的浓度为5-30U，镁离子的浓度为1-3mM；
II.扩增产物的检测
通过荧光物质确定样本的检测结果。
2.根据权利要求1所述的一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法，其特征在于步骤II的检测方法为：
在极速PCR扩增完成后，将事先滴加在反应盖上的高浓度荧光染料通过离心方式加入到扩增液中，在紫外灯的照射下观察，确定样本的检测结果。
3.根据权利要求1所述的一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法，其特征在于步骤II的检测方法为：
在极速PCR扩增前向扩增体系中加入浓度为0.01-1μM的荧光探针，待扩增完成后在凝胶电泳仪或荧光设备上拍照成像并进行灰度值提取，通过比值分析确定样本的检测结果。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法，其特征在于：极速PCR扩增中，变性温度控制在90-98℃，退火温度控制在45-65℃。
5.根据权利要求1或2或3所述的一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法，其特征在于：极速PCR扩增中，引物的浓度为0.2-0.8μM，热稳定性聚合酶的浓度为10-20U，镁离子的浓度为1.5-2mM。
6.根据权利要求1或2或3所述的一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法，其特征在于：极速PCR扩增的单个循环时间少于5秒，扩增子的长度小于300bp。
7.根据权利要求1或2或3所述的一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法，其特征在于：所述热稳定性聚合酶为Taq HS,扩增原料包含dUTP。
8.根据权利要求2所述的一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法，其特征在于：扩增产物的检测中，荧光染料包括SYBR Green I、Ethidium bromide、Gold、SYTO、EvaGreen等双链DNA荧光嵌入荧光染料。
9.根据权利要求3所述的一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法，其特征在于：扩增产物的检测中，荧光探针包括水解探针、分子信标、双链DNA荧光嵌入染料、钙黄绿素和锰离子等，荧光探针的浓度为0.01-1μM。
10.一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增方法，其特征在于包括如下步骤：极速PCR扩增包含(a)变性和(b)退火两个阶段，单个循环时间少于20秒；
在(a)变性阶段，变性温度控制在85-98℃；
在(b)退火阶段，退火温度控制在40-72℃，引物的浓度为0.1-1μM，热稳定性聚合酶的浓度为5-30U，镁离子的浓度为1-3mM。
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|---|---|---|---|---|
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| CN111117984A (zh) * | 2018-11-01 | 2020-05-08 | 浙江大学 | 可视化特异检测核酸目标的crispr体系及方法和装置 |
| CN114549528A (zh) * | 2022-04-26 | 2022-05-27 | 浙江大学 | 一种微液滴数字pcr液滴检测方法及系统 |
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| CN104662160A (zh) * | 2012-05-24 | 2015-05-27 | 犹他州大学研究基金会 | 极端pcr |
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2017
- 2017-07-12 CN CN201710566156.XA patent/CN107502657A/zh active Pending
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |