TWI727444B - 蝦病原體檢測方法 - Google Patents
蝦病原體檢測方法 Download PDFInfo
- Publication number
- TWI727444B TWI727444B TW108135516A TW108135516A TWI727444B TW I727444 B TWI727444 B TW I727444B TW 108135516 A TW108135516 A TW 108135516A TW 108135516 A TW108135516 A TW 108135516A TW I727444 B TWI727444 B TW I727444B
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- seq
- primer
- sequence
- probe
- oligonucleotide
- Prior art date
Links
- 244000052769 pathogen Species 0.000 title abstract description 139
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 25
- 241000143060 Americamysis bahia Species 0.000 title abstract description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 96
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 207
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 claims description 91
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 claims description 91
- 241000607272 Vibrio parahaemolyticus Species 0.000 claims description 33
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 21
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 118
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 103
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 99
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 79
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 66
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 66
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 60
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 60
- 241000380111 Yellow head virus Species 0.000 description 55
- 241001265687 Taura syndrome virus Species 0.000 description 54
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 46
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 42
- 241001539217 Enterocytozoon hepatopenaei Species 0.000 description 40
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 37
- 241000439574 Decapod penstyldensovirus 1 Species 0.000 description 35
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 35
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 35
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 33
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 33
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 32
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 32
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 31
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 31
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 30
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 30
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 206010028320 muscle necrosis Diseases 0.000 description 29
- 241000696962 White spot syndrome virus Species 0.000 description 28
- 241001295810 Microsporidium Species 0.000 description 26
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 24
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 21
- 101710121996 Hexon protein p72 Proteins 0.000 description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 18
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 14
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 14
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 13
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 13
- -1 deoxyadenosine triphosphates Chemical class 0.000 description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 13
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 12
- 201000000628 Gas Gangrene Diseases 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 8
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 7
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 7
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 7
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 7
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 7
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 5
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N Deoxycytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1OC(CO)C(O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 4
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N Adenosine Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 3
- 101710195101 Flagellar filament outer layer protein Proteins 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 101150097623 1B gene Proteins 0.000 description 2
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZIDRAQTRIQDX-UHFFFAOYSA-N 6-carboxy-x-rhodamine Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(C([O-])=O)C=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 WQZIDRAQTRIQDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VWOLRKMFAJUZGM-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyrhodamine 6G Chemical compound [Cl-].C=12C=C(C)C(NCC)=CC2=[O+]C=2C=C(NCC)C(C)=CC=2C=1C1=CC(C(O)=O)=CC=C1C(=O)OCC VWOLRKMFAJUZGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000243190 Microsporidia Species 0.000 description 2
- 241000607568 Photobacterium Species 0.000 description 2
- 241001148062 Photorhabdus Species 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BUCXEFZXWKUCCY-UHFFFAOYSA-N 4-methyl-3-(2-phenylethyl)-1,2,4-oxadiazol-5-one Chemical compound O1C(=O)N(C)C(CCC=2C=CC=CC=2)=N1 BUCXEFZXWKUCCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 241001126829 Nosema Species 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000000298 carbocyanine Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 235000020774 essential nutrients Nutrition 0.000 description 1
- VYXSBFYARXAAKO-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate;hydron;chloride Chemical compound [Cl-].C1=2C=C(C)C(NCC)=CC=2OC2=CC(=[NH+]CC)C(C)=CC2=C1C1=CC=CC=C1C(=O)OCC VYXSBFYARXAAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002229 photoelectron microspectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- ZCOSUVZGFDGWFV-UHFFFAOYSA-N pyrrolo[2,3-e]indole Chemical compound C1=CC2=NC=CC2=C2N=CC=C21 ZCOSUVZGFDGWFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007861 thermal asymmetric interlaced PCR Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/10—Protozoa; Culture media therefor
- C12N1/105—Protozoal isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6893—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for protozoa
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/00022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/00022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/30011—Nodaviridae
- C12N2770/30022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/63—Vibrio
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/90—Protozoa ; Processes using protozoa
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
本發明涉及一種檢測蝦病原體的方法。此外,本發明並涉及用於檢測蝦病原體的寡核苷酸對。
Description
本發明關於檢測蝦病原體的方法,特別是關於使用寡核苷酸對檢測蝦病原體的方法。
水產動物是人類重要的能量、蛋白質與必需營養的來源之一。大量捕撈野生水產動物對海洋資源耗盡的疑慮,使得水產養殖業日益受到重視。根據聯合國糧食及農業組織的統計,水產養殖對全球捕撈及養殖總產量的貢獻逐步提升,從2000年的25.7%增至2016年的46.8%。然而,密集養殖加上管理不良可能造成水產動物容易感染疾病、死亡,而造成漁民的損失。此外,水產動物的病害多由細菌或病毒引起,細菌性疾病與病毒性疾病的處理方法相差甚遠,一旦誤診,處理不當,就會造成巨大的損失。由此可見,在飼養漁場、蝦場密集監控疾病對管理而言是不可或缺的一環。本發明即提供了快速、方便的蝦病原體檢測方法以供產業利用。
於一方面,本發明涉及一種蝦病原體檢測方法,包含提供一可能含有一蝦病原體的一或多個核苷酸序列的樣本;提供一寡核苷酸引子對,該寡核苷酸引子對包含一第一引子與一第二引子,該寡核苷酸引子對定義在該病原體的一或多個核苷酸序列上一雙股目標序列的二互補股的5’端;提供一聚合酶;在一容器中混合該樣本、該寡核苷酸引子對、該聚合酶、去氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphates, dATPs)、去氧胞核苷三磷酸(deoxycytidine triphosphates, dCTPs)、去氧鳥苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphates, dGTPs),以及去氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphates, dTTPs),以形成一聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)混合物;透過在一固定溫度下加熱該容器的底部,使該PCR混合物進行熱對流聚合酶連鎖反應(convective polymerase chain reaction, cPCR),以形成一PCR產物;以及偵測該PCR產物以辨識該雙股目標序列。
在某些具體實施例中,該聚合酶連鎖反應(PCR)混合物進一步包含一寡核苷酸探針,該寡核苷酸探針包含一與該雙股目標序列的一區段互補的寡核苷酸探針序列、一附加於該寡核苷酸探針上的一第一位置的螢光分子,以及一附加於該寡核苷酸探針上的一第二位置的螢光抑制分子,當該寡核苷酸探針未雜合於該雙股目標序列的該區段時,該螢光抑制分子大體上抑制該螢光分子,且當該寡核苷酸探針雜合於該雙股目標序列的該區段時,該螢光分子大體上未被抑制。
於另一方面,本發明涉及一種用於偵測蝦病原體的寡核苷酸對,包含一第一引子與一第二引子。
在某些具體實施例中,該寡核苷酸對進一步包含一寡核苷酸探針,該寡核苷酸探針具有一寡核苷酸探針序列、一附加於該寡核苷酸探針上的一第一位置的螢光分子,以及一附加於該寡核苷酸探針上的一第二位置的螢光抑制分子。
在某些具體實施例中,該病原體為腸炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus
),且該第一引子與該第二引子的序列組合選自由下列所組成之群組:SEQ ID NO: 1與SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4與SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7與SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO:10與SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 10與SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 16與SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 16與SEQ ID NO: 17,以及SEQ ID NO: 13與SEQ ID NO: 14。
在某些具體實施例中,該病原體為腸炎弧菌(V. parahaemolyticus
),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 1與SEQ ID NO: 2時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體腸炎弧菌的與光桿菌同源性的昆蟲相關(Photorhabdus insect-related, Pir)毒素基因(GenBank accession No. KU145400)的第1824至第1854個核苷酸之間的13至30個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 3所示。
在某些具體實施例中,該病原體為腸炎弧菌(V. parahaemolyticus
),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 4與SEQ ID NO: 5時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體腸炎弧菌的Pir毒素基因(GenBank accession No. KU145400)的第996至第1065個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 6所示。
在某些具體實施例中,該病原體為腸炎弧菌(V. parahaemolyticus
),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 7與SEQ ID NO: 8時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體腸炎弧菌的Pir毒素基因(GenBank accession No. KU145400)的第520至第599個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 9所示。
在某些具體實施例中,該病原體為腸炎弧菌(V. parahaemolyticus
),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 10與SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 10與SEQ ID NO: 17時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體腸炎弧菌的Pir毒素基因(GenBank accession No. KU145400)的第1267至第1320個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 12所示。
在某些具體實施例中,該病原體為腸炎弧菌(V. parahaemolyticus
),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 16與SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 16與SEQ ID NO: 17時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體腸炎弧菌的Pir毒素基因(GenBank accession No. KU145400)的第1287至第1320個核苷酸之間的13至30個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 12所示。
在某些具體實施例中,該病原體為腸炎弧菌(V. parahaemolyticus
),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 13與SEQ ID NO: 14時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體腸炎弧菌的Pir毒素基因(GenBank accession No. KU145400)的第580至第636個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 15所示。
在某些具體實施例中,該病原體為微孢子蟲(Enterocytozoon hepatopenaei
, EHP),且該第一引子與該第二引子的序列組合選自由下列所組成之群組:SEQ ID NO: 18與SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21與SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24與SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 24與SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 27與SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27與SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29與SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 29與SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 31與SEQ ID NO: 32,以及SEQ ID NO: 34與SEQ ID NO: 35。
在某些具體實施例中,該病原體為微孢子蟲(EHP),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 18與SEQ ID NO: 19時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體微孢子蟲(EHP)的18s核糖體核糖核酸(ribosomal RNA, rRNA)基因(GenBank accession No. KR021169)的第384至第419個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 20所示。
在某些具體實施例中,該病原體為微孢子蟲(EHP),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 21與SEQ ID NO: 22時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體微孢子蟲(EHP)的18s rRNA基因(GenBank accession No. KR021169)的第388至第412個核苷酸之間的13至25個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 23所示。
在某些具體實施例中,該病原體為微孢子蟲(EHP),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 24與SEQ ID NO: 25時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體微孢子蟲(EHP)的18s rRNA基因(GenBank accession No. KR021169)的第377至第423個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 26所示。
在某些具體實施例中,該病原體為微孢子蟲(EHP),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 24與SEQ ID NO: 30時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體微孢子蟲(EHP)的18s rRNA基因(GenBank accession No. KR021169)的第377至第420個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 26所示。
在某些具體實施例中,該病原體為微孢子蟲(EHP),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 27與SEQ ID NO: 25時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體微孢子蟲(EHP)的18s rRNA基因(GenBank accession No. KR021169)的第387至第423個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 26所示。
在某些具體實施例中,該病原體為微孢子蟲(EHP),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 27與SEQ ID NO: 28時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體微孢子蟲(EHP)的18s rRNA基因(GenBank accession No. KR021169)的第387至第425個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 26所示。
在某些具體實施例中,該病原體為微孢子蟲(EHP),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 29與SEQ ID NO: 25時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體微孢子蟲(EHP)的18s rRNA基因(GenBank accession No. KR021169)的第391至第423個核苷酸之間的13至30個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 26所示。
在某些具體實施例中,該病原體為微孢子蟲(EHP),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 29與SEQ ID NO: 28時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體微孢子蟲(EHP)的18s rRNA基因(GenBank accession No. KR021169)的第391至第425個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 26所示。
在某些具體實施例中,該病原體為微孢子蟲(EHP),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 31與SEQ ID NO: 32時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體微孢子蟲(EHP)的18s rRNA基因(GenBank accession No. KR021169)的第154至第253個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 33所示。
在某些具體實施例中,該病原體為微孢子蟲(EHP),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 34與SEQ ID NO: 35時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體微孢子蟲(EHP)的18s rRNA基因(GenBank accession No. KR021169)的第275至第339個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 36所示。
在某些具體實施例中,該病原體為白點症病毒(White spot syndrome virus, WSSV),且該第一引子與該第二引子的序列組合選自由下列所組成之群組:SEQ ID NO: 37與SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 40與SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43與SEQ ID NO: 44,以及SEQ ID NO: 46與SEQ ID NO: 47。
在某些具體實施例中,該病原體為白點症病毒(WSSV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 37與SEQ ID NO: 38時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體白點症病毒(WSSV)的類VP664核鞘蛋白基因(GenBank accession No. MF101757)的第964至第996個核苷酸之間的13至30個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 39所示。
在某些具體實施例中,該病原體為白點症病毒(WSSV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 40與SEQ ID NO: 41時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體白點症病毒(WSSV)的類VP664核鞘蛋白基因(GenBank accession No. MF101757)的第959至第993個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 42所示。
在某些具體實施例中,該病原體為白點症病毒(WSSV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 43與SEQ ID NO: 44時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體白點症病毒(WSSV)的類VP664核鞘蛋白基因(GenBank accession No. MF101757)的第613至第668個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 45所示。
在某些具體實施例中,該病原體為白點症病毒(WSSV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 46與SEQ ID NO: 47時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體白點症病毒(WSSV)的類VP664核鞘蛋白基因(GenBank accession No. MF101757)的第1121至第1169個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 48所示。
在某些具體實施例中,該病原體為黃頭病毒(Yellow-head Virus, YHV),且該第一引子與該第二引子的序列組合選自由下列所組成之群組:SEQ ID NO: 49與SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 52與SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55與SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 58與SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 58與SEQ ID NO: 61,以及SEQ ID NO: 60與SEQ ID NO: 61。
在某些具體實施例中,該病原體為黃頭病毒(YHV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 49與SEQ ID NO: 50時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體黃頭病毒(YHV)的開放讀碼框(Open reading frame, ORF) 1B基因(GenBank accession No. EU784982)的第142至第171個核苷酸之間的13至30個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 51所示。
在某些具體實施例中,該病原體為黃頭病毒(YHV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 52與SEQ ID NO: 53時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體黃頭病毒(YHV)的ORF1B基因(GenBank accession No. EU784982)的第91至第125個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 54所示。
在某些具體實施例中,該病原體為黃頭病毒(YHV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 55與SEQ ID NO: 56時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體黃頭病毒(YHV)的ORF1B基因(GenBank accession No. EU784982)的第306至第349個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 57所示。
在某些具體實施例中,該病原體為黃頭病毒(YHV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 58與SEQ ID NO: 59時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體黃頭病毒(YHV)的ORF1B基因(GenBank accession No. EU784982)的第308至第329個核苷酸之間的13至22個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 57所示。
在某些具體實施例中,該病原體為黃頭病毒(YHV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 58與SEQ ID NO: 61時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體黃頭病毒(YHV)的ORF1B基因(GenBank accession No. EU784982)的第308至第350個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 57所示。
在某些具體實施例中,該病原體為黃頭病毒(YHV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 60與SEQ ID NO: 61時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體黃頭病毒(YHV)的ORF1B基因(GenBank accession No. EU784982)的第305至第350個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 57所示。
在某些具體實施例中,該病原體為傳染性肌肉壞死病毒(Infectious Myonecrosis Virus, IMNV),且該第一引子與該第二引子的序列組合選自由下列所組成之群組:SEQ ID NO: 62與SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 63與SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 66與SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 68與SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 71與SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 71與SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 72與SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 72與SEQ ID NO: 74,以及SEQ ID NO: 76與SEQ ID NO: 77。
在某些具體實施例中,該病原體為傳染性肌肉壞死病毒(IMNV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 62與SEQ ID NO: 64時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體傳染性肌肉壞死病毒(IMNV)的主要衣殼蛋白(major capsid protein, MCP)基因(GenBank accession No. KJ636788.1)的第1493至第1529個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 65所示。
在某些具體實施例中,該病原體為傳染性肌肉壞死病毒(IMNV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 63與SEQ ID NO: 64時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體傳染性肌肉壞死病毒(IMNV)的主要衣殼蛋白(MCP)基因(GenBank accession No. KJ636788.1)的第1483至第1529個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 65所示。
在某些具體實施例中,該病原體為傳染性肌肉壞死病毒(IMNV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 66與SEQ ID NO: 64時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體傳染性肌肉壞死病毒(IMNV)的主要衣殼蛋白(MCP)基因(GenBank accession No. KJ636788.1)的第1476至第1529個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 67所示。
在某些具體實施例中,該病原體為傳染性肌肉壞死病毒(IMNV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 68與SEQ ID NO: 69時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體傳染性肌肉壞死病毒(IMNV)的主要衣殼蛋白(MCP)基因(GenBank accession No. KJ636788.1)的第1580至第1646個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 70所示。
在某些具體實施例中,該病原體為傳染性肌肉壞死病毒(IMNV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 71與SEQ ID NO: 73或SEQ ID NO: 72與SEQ ID NO: 73時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體傳染性肌肉壞死病毒(IMNV)的主要衣殼蛋白(MCP)基因(GenBank accession No. KJ636788.1)的第1493至第1514個核苷酸之間的13至22個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 75所示。
在某些具體實施例中,該病原體為傳染性肌肉壞死病毒(IMNV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 71與SEQ ID NO: 74或SEQ ID NO: 72與SEQ ID NO: 74時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體傳染性肌肉壞死病毒(IMNV)的主要衣殼蛋白(MCP)基因(GenBank accession No. KJ636788.1)的第1493至第1532個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 75所示。
在某些具體實施例中,該病原體為傳染性肌肉壞死病毒(IMNV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 76與SEQ ID NO: 77時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體傳染性肌肉壞死病毒(IMNV)的主要衣殼蛋白(MCP)基因(GenBank accession No. KJ636788.1)的第2774至第2829個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 78所示。
在某些具體實施例中,該病原體為傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus, IHHNV),且該第一引子與該第二引子的序列組合選自由下列所組成之群組:SEQ ID NO: 79與SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 79與SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 79與SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 82與SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 82與SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 82與SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87與SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 87與SEQ ID NO: 91,以及SEQ ID NO: 90與SEQ ID NO: 88。
在某些具體實施例中,該病原體為傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(IHHNV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 79與SEQ ID NO: 80時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(IHHNV)的基因組(GenBank accession No. AF218266)的第693至第732個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 81所示。
在某些具體實施例中,該病原體為傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(IHHNV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 79與SEQ ID NO: 83時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(IHHNV)的基因組(GenBank accession No. AF218266)的第693至第759個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 81所示。
在某些具體實施例中,該病原體為傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(IHHNV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 79與SEQ ID NO: 85時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(IHHNV)的基因組(GenBank accession No. AF218266)的第693至第757個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 84所示。
在某些具體實施例中,該病原體為傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(IHHNV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 82與SEQ ID NO: 83時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(IHHNV)的基因組(GenBank accession No. AF218266)的第700至第759個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 84所示。
在某些具體實施例中,該病原體為傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(IHHNV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 82與SEQ ID NO: 85時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(IHHNV)的基因組(GenBank accession No. AF218266)的第700至第757個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 84所示。
在某些具體實施例中,該病原體為傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(IHHNV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 82與SEQ ID NO: 86時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(IHHNV)的基因組(GenBank accession No. AF218266)的第700至第745個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 84所示。
在某些具體實施例中,該病原體為傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(IHHNV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 87與SEQ ID NO: 88時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(IHHNV)的基因組(GenBank accession No. AF218266)的第633至第673個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 89所示。
在某些具體實施例中,該病原體為傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(IHHNV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 87與SEQ ID NO: 91時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(IHHNV)的基因組(GenBank accession No. AF218266)的第633至第683個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 89所示。
在某些具體實施例中,該病原體為傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(IHHNV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 90與SEQ ID NO: 88時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(IHHNV)的基因組(GenBank accession No. AF218266)的第640至第673個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 89所示。
在某些具體實施例中,該病原體為陶拉症候群病毒(Taura syndrome virus, TSV),且該第一引子與該第二引子的序列組合選自由下列所組成之群組:SEQ ID NO: 92與SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 95與SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 98與SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 99與SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 99與SEQ ID NO: 102,以及SEQ ID NO: 100與SEQ ID NO: 101。
在某些具體實施例中,該病原體為陶拉症候群病毒(TSV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 92與SEQ ID NO: 93時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體陶拉症候群病毒(TSV)的基因組(GenBank accession No. AF277675)的第7125至第7162個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 94所示。
在某些具體實施例中,該病原體為陶拉症候群病毒(TSV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 95與SEQ ID NO: 96時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體陶拉症候群病毒(TSV)的基因組(GenBank accession No. AF277675)的第3995至第4051個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 97所示。
在某些具體實施例中,該病原體為陶拉症候群病毒(TSV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 98與SEQ ID NO: 101時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體陶拉症候群病毒(TSV)的基因組(GenBank accession No. AF277675)的第9976至第10018個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 103所示。
在某些具體實施例中,該病原體為陶拉症候群病毒(TSV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 99與SEQ ID NO: 101時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體陶拉症候群病毒(TSV)的基因組(GenBank accession No. AF277675)的第9985至第10018個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 103所示。
在某些具體實施例中,該病原體為陶拉症候群病毒(TSV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 99與SEQ ID NO: 102時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體陶拉症候群病毒(TSV)的基因組(GenBank accession No. AF277675)的第9985至第10049個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 103所示。
在某些具體實施例中,該病原體為陶拉症候群病毒(TSV),且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 100與SEQ ID NO: 101時,該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體陶拉症候群病毒(TSV)的基因組(GenBank accession No. AF277675)的第9973至第10018個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸;在某些較佳具體實施例中,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 103所示。
於一方面,本發明涉及一種蝦病原體檢測方法。在某些具體實施例中,該方法為聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)。在某些具體實施例中,該方法為反轉錄聚合酶連鎖反應(reverse-transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)。在某些具體實施例中,該方法為熱對流聚合酶連鎖反應(convective polymerase chain reaction, cPCR)。在某些具體實施例中,該方法為即時聚合酶連鎖反應(real-time polymerase chain reaction, real-time PCR)。
於一方面,本發明涉及一種蝦病原體檢測方法,包含:
提供一可能含有蝦病原體的一或多個核苷酸序列的樣本;
提供一寡核苷酸引子對,該寡核苷酸引子對包含一第一引子與一第二引子,該寡核苷酸引子對定義在該病原體的一或多個核苷酸序列上一雙股目標序列的二互補股的5’端;
提供一聚合酶;
在一容器中混合該樣本、該寡核苷酸引子對、該聚合酶、去氧腺苷三磷酸(dATPs)、去氧胞核苷三磷酸(dCTPs)、去氧鳥苷三磷酸(dGTPs),以及去氧胸苷三磷酸(dTTPs),以形成一聚合酶連鎖反應(PCR)混合物;
透過在一固定溫度下加熱該容器的底部,使該PCR混合物進行熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR),以形成一PCR產物;以及
偵測該PCR產物以辨識該雙股目標序列。
於另一方面,本發明涉及一種蝦病原體檢測方法,包含:
提供一可能含有蝦病原體的一或多個核苷酸序列的樣本;
提供一寡核苷酸引子對,該寡核苷酸引子對包含一第一引子與一第二引子,該寡核苷酸引子對定義在該病原體的一或多個核苷酸序列上一雙股目標序列的二互補股的5’端;
提供一寡核苷酸探針,該寡核苷酸探針包含一與該雙股目標序列的一區段互補的寡核苷酸探針序列、一附加於該寡核苷酸探針上的一第一位置的螢光分子,以及一附加於該寡核苷酸探針上的一第二位置的螢光抑制分子,當該寡核苷酸探針未雜合於該雙股目標序列的該區段時,該螢光抑制分子大體上抑制該螢光分子,且當該寡核苷酸探針雜合於該雙股目標序列的該區段時,該螢光分子大體上未被抑制;
提供一聚合酶;
在一容器中混合該樣本、該寡核苷酸引子對、該聚合酶、去氧腺苷三磷酸(dATPs)、去氧胞核苷三磷酸(dCTPs)、去氧鳥苷三磷酸(dGTPs),以及去氧胸苷三磷酸(dTTPs),以形成一聚合酶連鎖反應(PCR)混合物;
透過在一固定溫度下加熱該容器的底部,使該PCR混合物進行熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR),以形成一PCR產物;以及
偵測該PCR產物以辨識該雙股目標序列。
於又一方面,本發明涉及一種用於偵測蝦病原體的寡核苷酸對。
於再一方面,本發明涉及一種用於偵測蝦病原體的寡核苷酸對與寡核苷酸探針。
應當進一步理解的是,在某些具體實施例中,本文揭露的寡核苷酸對及/或寡核苷酸探針可用於各種基礎PCR技術之變異,例如,但不限於,反轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)、熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)、即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)、巢式聚合酶連鎖反應(nested PCR),以及熱不對稱性交錯聚合酶連鎖反應(thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR)。
如本文所用,術語「蝦病原體」意指在蝦體內外發現的病毒性、細菌性及寄生性病原體。蝦病原體的實例如,但不限於:腸炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus
)、微孢子蟲(Enterocytozoon hepatopenaei
, EHP)、白點症病毒(White spot syndrome virus, WSSV)、黃頭病毒(Yellow-head Virus, YHV)、傳染性肌肉壞死病毒(Infectious Myonecrosis Virus, IMNV)、傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus, IHHNV),以及陶拉症候群病毒(Taura syndrome virus, TSV)。
如本文所用,術語「熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)」是指一種聚合酶連鎖反應,其中,將一裝有一PCR樣品的管狀容器底部嵌入一穩定熱源中,並控制該PCR的參數,包括該PCR樣品的總體積、黏度、表面溫度,以及該管狀容器的內徑,使得該PCR樣品的底部到頂部的溫度梯度下降,誘導熱對流並且使得PCR樣品的變性、黏合、聚合在該管狀容器的不同區域中依序且重複發生。熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)的詳細描述請參見如美國專利號8,187,813,其以引用的方式將其整體併入本文。
如本文所用,術語「螢光分子」意指一物質或其一部份,其係能夠在可偵測的範圍內顯示螢光。如本文所用,術語「螢光抑制分子」意指一物質或其一部份,其係能夠抑制當由一光源激發時由該螢光分子所發射的螢光。在某些具體實施例中,術語「螢光分子」與「螢光抑制分子」為TaqMan™分析套組(Applied Biosystems Inc.,加州,美國)的螢光分子與螢光抑制分子。TaqMan™分析套組的詳細描述請參見如,Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. (1991) 88:7276- 7280;美國專利號5,538,848、5,723,591、5,876,930,以及7,413,708皆以引用的方式將其整體併入本文。
該螢光分子的例子包括,但不限於,3-(ε-羧)-3'-乙基-5,5'-二甲基己羰花青(3-(ε-carboxypentyl)-3'-ethyl-5,5'-dimethyloxa-carbocyanine, CYA)、6-羧基螢光素(6-carboxyfluorescein, FAM)、5,6-羧基羅丹明-L LO (5,6-carboxyrhodamine-l lO, R110)、6羧基羅丹明-6G (6- carboxyrhodamine-6G, R6G)、N’,N’,N’,N’
-四甲基-6-羧基羅丹明(N’,N’,N’,N’
-tetramethyl-6-carboxyrhodamine, TAMRA)、6-羧基-X-羅丹明(6-carboxy-X-rhodamine, ROX)、2’,4’,5’,7’-四氯4-7-二氯螢光素(2’,4’,5’,7’-tetrachloro-4-7-dichlorofluorescein, TET)、2',7-二甲氧基-4',5'-6羧基羅丹明(2’,7-dimethoxy-4’,5’-6 carboxyrhodamine, JOE)、6-羧基-2',4,4',5',7,7'-六氯熒光素(6-carboxy-2’,4,4’,5’,7,7’-hexachlorofluorescein, HEX)、ALEXA螢光、Cy3螢光與Cy5螢光。該螢光抑制分子的例子包括,但不限於,4-(4'-二甲基氨基-苯偶氮基)苯甲酸(4-(4’-dimethylamino-phenylazo)-benzoic acid, Dabcyl)、黑洞螢光抑制劑1 (Black Hole Quencher 1, BHQ1)、黑洞螢光抑制劑2 (Black Hole Quencher 2, BHQ2)、黑洞螢光抑制劑3 (Black Hole Quencher 3, BHQ3)、二氫環吡咯並吲哚三肽小溝結合物(dihydro cyclo pyrrolo indole tripeptide minor groove binder, MGB)、四甲基羅丹明(tetramethylrhodamine, TAMRA)。在某些具體實施例中,該螢光分子為6-羧基螢光素(FAM),且該螢光抑制分子為二氫環吡咯並吲哚三肽小溝結合物(MGB)。在某些具體實施例中,該螢光分子為6-羧基螢光素(FAM),且該螢光抑制分子為黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1)或二氫環吡咯並吲哚三肽小溝結合物(MGB)。
除非本文另有定義,否則用以與本文結合的科學與技術術語應具有本領域普通技術人員通常理解的含義。此外,除非上下文另有要求,單數術語應包括複數,並且複數術語應包括單數。本發明的方法與技術一般可根據本領域已知的常規方法進行。一般而言,本文所描述之用以連結以下技術的命名法,以及生物化學、酵素學、分子及細胞生物學、微生物學、遺傳學與蛋白質及核酸化學及雜合反應的技術皆為本領域已知且經常使用者。除非另有說明,本發明的方法與技術一般可根據本領域已知的常規方法進行,且被描述於在本說明書中被引用且討論的各種一般及更具體的參考文獻中。
本發明進一步透過以下的實施例闡釋,其不應以任何方式被解釋為進一步的限縮。本申請案中引用的所有引用文件(包括參考文獻、核准的專利、公開的專利申請,以及一同在申請中的專利申請案)的整體內容,在此透過引用的方式明確地併入本案中。
實施例
實施例
1
病原體腸炎弧菌
(V. parahaemolyticus
)
的檢測
腸炎弧菌(V. parahaemolyticus
)為急性肝胰臟壞死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND,舊稱EMS)的病原體。腸炎弧菌(V. parahaemolyticus
)的與光桿菌同源性的昆蟲相關(Photorhabdus insect-related, Pir)毒素基因(GenBank accession No. KU145400)的片段被插入一選殖載體中,該選殖載體可為,但不限於,pUC57、pGEM-T,以得到pEMS質體。
1. 傳統聚合酶連鎖反應
進行傳統PCR所用的50 µl PCR混合物含有:106
個拷貝數的pEMS質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.2 µM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一熱循環儀(例如,但不限於PC818, Astec Co. Ltd.,日本)中進行擴增反應,且包含一個變性的初始循環94o
C持續3分鐘,以及35個循環的94o
C 30秒、60o
C 30秒以及72o
C延展30秒。擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠(polyacrylamide gel)在TAE緩衝液(40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA)中分析,並且以溴化乙錠(ethidium bromide)染色顯現。
傳統PCR的結果如表1所示,各引子對擴增了各目標序列的正確大小的片段,而在負對照組中則無目標序列被擴增(結果未顯示)。該結果表明,各引子對可用於傳統PCR擴增反應以檢測腸炎弧菌(V. parahaemolyticus
)的存在。
【表1】各引子對與探針組合進行傳統PCR的結果
2. 熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)
50 µl的PCR混合物含有5 µl腸炎弧菌的與光桿菌同源性的昆蟲相關(Pir)毒素基因的RNA (分別為102
, 103
, 104
, 105
, 106
拷貝數/µl)或pEMS質體(分別為102
, 103
, 104
, 105
, 106
個拷貝數)、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))、0.2 µM dNTP、1X cPCR緩衝液,以及1-5 U Taq DNA聚合酶、1-5 U反轉錄酶。將PCR混合物加入一反應試管中,並置於一熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)儀中一段指定的時間(約30~45分鐘)。以該cPCR儀偵測每個樣本中的FAM螢光。重複上述cPCR分析試驗8次(n = 8)以評各估引子對與探針的敏感度。
敏感度測試的結果如表2所示,各引子對及探針的組合皆可100%正確偵測到樣品中含有102
拷貝數/µl的腸炎弧菌的與光桿菌同源性的昆蟲相關(Pir)毒素基因的RNA或102
個拷貝數的pEMS質體,其敏感度可達102
拷貝數/µl及102
個拷貝數。
【表2】各引子對與探針組合的敏感度測試結果(n = 8)
此外,以不同的蝦病原體基因質體(106
拷貝數/µl)作為cPCR模板分析上述各引子對及探針組合的專一性。cPCR方法如上所述。專一性測試的結果如表3所示,各引子對及探針的組合皆可正確偵測到含有腸炎弧菌(V. parahaemolyticus
,EMS)的樣品,而偵測不到含有微孢子蟲(EHP)、白點症病毒(WSSV)、黃頭病毒(YHV)、傳染性肌肉壞死病毒(IMNV)、傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(IHHNV),以及陶拉症候群病毒(TSV)的樣品。該結果顯示各引子對及探針組合具有專一性。
【表3】各引子對與探針組合的專一性測試結果
“+”表示在該樣本中偵測到螢光訊號,而“-”表示在該樣本中未偵測到螢光訊號。
3. 即時聚合酶連鎖反應 (real-time PCR, qPCR)
以稀釋的pEMS質體(分別為101
, 102
, 103
, 104
, 105
, 106
, 107
個拷貝數)於一即時PCR儀(例如,但不限於ABI StepOnePlusTM
; Applied BioSystem, Life Technologies,加州,美國)中進行即時PCR分析。以含有2 µl pEMS質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1)),總體積為20 µl的商用RT-PCR套組(例如,但不限於,OneStep PrimeScriptTM
RT-PCR Kit; Takara Bio Inc.,日本)進行即時PCR分析。即時PCR的程序為42o
C 5分鐘、94o
C 10秒,以及40個循環的94o
C 10秒以及60o
C 30分鐘。在60o
C的步驟中記錄螢光測量的結果並計算。連續稀釋(10倍)的pEMS質體的即時PCR分析的標準曲線。結果顯示,至少102
個拷貝數的pEMS質體可被偵測到,且各引子對與探針組合的標準曲線的R2
值皆大於0.99,表示本發明的引子對與探針可以被用於即時PCR,並產生可信的結果。
上述實施例結果表明,本發明的引子對與探針可用於cPCR擴增反應以檢測腸炎弧菌(V. parahaemolyticus
)的存在,並且具有高度敏感度及專一性。
實施例
2
病原體微孢子蟲
(E. hepatopenaei
, EHP)
的檢測
病原體微孢子蟲(E. hepatopenaei
, EHP)的18s核糖體核糖核酸(ribosomal RNA, rRNA)基因(GenBank accession No. KR021169)的片段被插入一選殖載體中,該選殖載體可為,但不限於,pUC57、pGEM-T,以得到pEHP質體。
1. 傳統聚合酶連鎖反應
進行傳統PCR所用的50 µl PCR混合物含有:106
個拷貝數的pEHP質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.2 µM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一熱循環儀(例如,但不限於PC818, Astec Co. Ltd.,日本)中進行擴增反應,且包含一個變性的初始循環94o
C持續3分鐘,以及35個循環的94o
C 30秒、60o
C 30秒以及72o
C延展30秒。擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液(40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA)中分析,並且以溴化乙錠染色顯現。
傳統PCR的結果如表4所示,各引子對擴增了各目標序列的正確大小的片段,而在負對照組中則無目標序列被擴增(結果未顯示)。該結果表明,各引子對可用於傳統PCR擴增反應以檢測微孢子蟲(E. hepatopenaei
)的存在。
【表4】各引子對與探針組合進行傳統PCR的結果
2. 熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)
50 µl的PCR混合物含有5 µl微孢子蟲(E. hepatopenaei
)的18s rRNA基因的RNA (分別為102
, 103
, 104
, 105
, 106
拷貝數/µl)或pEHP質體(分別為102
, 103
, 104
, 105
, 106
個拷貝數)、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))、0.2 µM dNTP、1X cPCR緩衝液,以及1-5 U Taq DNA聚合酶、1-5 U反轉錄酶。將PCR混合物加入一反應試管中,並置於一熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)儀中一段指定的時間(約30~45分鐘)。以該cPCR儀偵測每個樣本中的FAM螢光。重複上述cPCR分析試驗8次(n = 8)以評各估引子對與探針的敏感度。
敏感度測試的結果如表5所示,各引子對及探針的組合皆可100%正確偵測到樣品中含有102
拷貝數/µl的微孢子蟲(E. hepatopenaei
)的18s rRNA基因的RNA或102
個拷貝數的pEHP質體,其敏感度可達102
拷貝數/µl及102
個拷貝數。
【表5】各引子對與探針組合的敏感度測試結果(n = 8)
此外,以不同的蝦病原體基因質體(106
拷貝數/µl)作為cPCR模板分析上述各引子對及探針組合的專一性。cPCR方法如上所述。專一性測試的結果如表6所示,各引子對及探針的組合皆可正確偵測到含有微孢子蟲(E. hepatopenaei
,EHP)的樣品,而偵測不到含有腸炎弧菌(V. parahaemolyticus
)、白點症病毒(WSSV)、黃頭病毒(YHV)、傳染性肌肉壞死病毒(IMNV)、傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(IHHNV),以及陶拉症候群病毒(TSV)的樣品。該結果顯示各引子對及探針組合具有專一性。
【表6】各引子對與探針組合的專一性測試結果
“+”表示在該樣本中偵測到螢光訊號,而“-”表示在該樣本中未偵測到螢光訊號。
3. 即時聚合酶連鎖反應 (real-time PCR, qPCR)
以稀釋的pEHP質體(分別為101
, 102
, 103
, 104
, 105
, 106
, 107
個拷貝數)於一即時PCR儀(例如,但不限於ABI StepOnePlusTM
; Applied BioSystem, Life Technologies,加州,美國)中進行即時PCR分析。以含有2 µl pEHP質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1)),總體積為20 µl的商用RT-PCR套組(例如,但不限於,OneStep PrimeScriptTM
RT-PCR Kit; Takara Bio Inc.,日本)進行即時PCR分析。即時PCR的程序為42o
C 5分鐘、94o
C 10秒,以及40個循環的94o
C 10秒以及60o
C 30分鐘。在60o
C的步驟中記錄螢光測量的結果並計算。連續稀釋(10倍)的pEHP質體的即時PCR分析的標準曲線。結果顯示,至少10個拷貝數的pEHP質體可被偵測到,且各引子對與探針組合的標準曲線的R2
值皆大於0.99,表示本發明的引子對與探針可以被用於即時PCR,並產生可信的結果。
上述實施例結果表明,本發明的引子對與探針可用於cPCR擴增反應以檢測微孢子蟲(E. hepatopenaei
)的存在,並且具有高度敏感度及專一性。
實施例
3
病原體白點症病毒
(WSSV)
的檢測
病原體白點症病毒(WSSV)的類VP664核鞘蛋白基因(GenBank accession No. MF101757)的片段被插入一選殖載體中,該選殖載體可為,但不限於,pUC57、pGEM-T,以得到pWSSV質體。
1. 傳統聚合酶連鎖反應
進行傳統PCR所用的50 µl PCR混合物含有:106
個拷貝數的pWSSV質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.2 µM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一熱循環儀(例如,但不限於PC818, Astec Co. Ltd.,日本)中進行擴增反應,且包含一個變性的初始循環94o
C持續3分鐘,以及35個循環的94o
C 30秒、60o
C 30秒以及72o
C延展30秒。擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液(40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA)中分析,並且以溴化乙錠染色顯現。
傳統PCR的結果如表7所示,各引子對擴增了各目標序列的正確大小的片段,而在負對照組中則無目標序列被擴增(結果未顯示)。該結果表明,各引子對可用於傳統PCR擴增反應以檢測白點症病毒(WSSV)的存在。
【表7】各引子對與探針組合進行傳統PCR的結果
2. 熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)
50 µl的PCR混合物含有5 µl白點症病毒(WSSV)的類VP664核鞘蛋白基因的RNA (分別為102
, 103
, 104
, 105
, 106
拷貝數/µl)或pWSSV質體(分別為102
, 103
, 104
, 105
, 106
個拷貝數)、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))、0.2 µM dNTP、1X cPCR緩衝液,以及1-5 U Taq DNA聚合酶、1-5 U反轉錄酶。將PCR混合物加入一反應試管中,並置於一熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)儀中一段指定的時間(約30~45分鐘)。以該cPCR儀偵測每個樣本中的FAM螢光。重複上述cPCR分析試驗8次(n = 8)以評各估引子對與探針的敏感度。
敏感度測試的結果如表8所示,各引子對及探針的組合皆可100%正確偵測到樣品中含有102
拷貝數/µl的白點症病毒(WSSV)的類VP664核鞘蛋白基因的RNA或102
個拷貝數的pWSSV質體,其敏感度可達102
拷貝數/µl及102
個拷貝數。
【表8】各引子對與探針組合的敏感度測試結果(n = 8)
此外,以不同的蝦病原體基因質體(106
拷貝數/µl)作為cPCR模板分析上述各引子對及探針組合的專一性。cPCR方法如上所述。專一性測試的結果如表9所示,各引子對及探針的組合皆可正確偵測到含有白點症病毒(WSSV)的樣品,而偵測不到含有腸炎弧菌(V. parahaemolyticus
)、微孢子蟲(EHP)、黃頭病毒(YHV)、傳染性肌肉壞死病毒(IMNV)、傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(IHHNV),以及陶拉症候群病毒(TSV)的樣品。該結果顯示各引子對及探針組合具有專一性。
【表9】各引子對與探針組合的專一性測試結果
“+”表示在該樣本中偵測到螢光訊號,而“-”表示在該樣本中未偵測到螢光訊號。
3. 即時聚合酶連鎖反應 (real-time PCR, qPCR)
以稀釋的pWSSV質體(分別為101
, 102
, 103
, 104
, 105
, 106
, 107
個拷貝數)於一即時PCR儀(例如,但不限於ABI StepOnePlusTM
; Applied BioSystem, Life Technologies,加州,美國)中進行即時PCR分析。以含有2 µl pWSSV質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1)),總體積為20 µl的商用RT-PCR套組(例如,但不限於,OneStep PrimeScriptTM
RT-PCR Kit; Takara Bio Inc.,日本)進行即時PCR分析。即時PCR的程序為42o
C 5分鐘、94o
C 10秒,以及40個循環的94o
C 10秒以及60o
C 30分鐘。在60o
C的步驟中記錄螢光測量的結果並計算。連續稀釋(10倍)的pWSSV質體的即時PCR分析的標準曲線。結果顯示,至少102
個拷貝數的pWSSV質體可被偵測到,且各引子對與探針組合的標準曲線的R2
值皆大於0.99,表示本發明的引子對與探針可以被用於即時PCR,並產生可信的結果。
上述實施例結果表明,本發明的引子對與探針可用於cPCR擴增反應以檢測白點症病毒(WSSV)的存在,並且具有高度敏感度及專一性。
實施例
4
病原體黃頭病毒
(YHV)
的檢測
病原體黃頭病毒(YHV)的開放讀碼框(Open reading frame, ORF) 1B基因(GenBank accession No. EU784982)的片段被插入一選殖載體中,該選殖載體可為,但不限於,pUC57、pGEM-T,以得到pYHV質體。
1. 傳統聚合酶連鎖反應
進行傳統PCR所用的50 µl PCR混合物含有:106
個拷貝數的pYHV質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.2 µM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一熱循環儀(例如,但不限於PC818, Astec Co. Ltd.,日本)中進行擴增反應,且包含一個變性的初始循環94o
C持續3分鐘,以及35個循環的94o
C 30秒、60o
C 30秒以及72o
C延展30秒。擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液(40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA)中分析,並且以溴化乙錠染色顯現。
傳統PCR的結果如表10所示,各引子對擴增了各目標序列的正確大小的片段,而在負對照組中則無目標序列被擴增(結果未顯示)。該結果表明,各引子對可用於傳統PCR擴增反應以檢測黃頭病毒(YHV)的存在。
【表10】各引子對與探針組合進行傳統PCR的結果
2. 熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)
50 µl的PCR混合物含有5 µl黃頭病毒(YHV)的ORF1B基因的RNA (分別為102
, 103
, 104
, 105
, 106
拷貝數/µl)或pYHV質體(分別為102
, 103
, 104
, 105
, 106
個拷貝數)、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))、0.2 µM dNTP、1X cPCR緩衝液,以及1-5 U Taq DNA聚合酶、1-5 U反轉錄酶。將PCR混合物加入一反應試管中,並置於一熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)儀中一段指定的時間(約30~45分鐘)。以該cPCR儀偵測每個樣本中的FAM螢光。重複上述cPCR分析試驗8次(n = 8)以評各估引子對與探針的敏感度。
敏感度測試的結果如表11所示,各引子對及探針的組合皆可100%正確偵測到樣品中含有102
拷貝數/µl的黃頭病毒(YHV)的ORF1B基因的RNA或102
個拷貝數的pYHV質體,其敏感度可達102
拷貝數/µl及102
個拷貝數。
【表11】各引子對與探針組合的敏感度測試結果(n = 8)
此外,以不同的蝦病原體基因質體(106
拷貝數/µl)作為cPCR模板分析上述各引子對及探針組合的專一性。cPCR方法如上所述。專一性測試的結果如表12所示,各引子對及探針的組合皆可正確偵測到含有黃頭病毒(YHV)的樣品,而偵測不到含有腸炎弧菌(V. parahaemolyticus
)、微孢子蟲(EHP)、白點症病毒(WSSV)、傳染性肌肉壞死病毒(IMNV)、傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(IHHNV),以及陶拉症候群病毒(TSV)的樣品。該結果顯示各引子對及探針組合具有專一性。
【表12】各引子對與探針組合的專一性測試結果
“+”表示在該樣本中偵測到螢光訊號,而“-”表示在該樣本中未偵測到螢光訊號。
3. 即時聚合酶連鎖反應 (real-time PCR, qPCR)
以稀釋的pYHV質體(分別為101
, 102
, 103
, 104
, 105
, 106
, 107
個拷貝數)於一即時PCR儀(例如,但不限於ABI StepOnePlusTM
; Applied BioSystem, Life Technologies,加州,美國)中進行即時PCR分析。以含有2 µl pYHV質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1)),總體積為20 µl的商用RT-PCR套組(例如,但不限於,OneStep PrimeScriptTM
RT-PCR Kit; Takara Bio Inc.,日本)進行即時PCR分析。即時PCR的程序為42o
C 5分鐘、94o
C 10秒,以及40個循環的94o
C 10秒以及60o
C 30分鐘。在60o
C的步驟中記錄螢光測量的結果並計算。連續稀釋(10倍)的pYHV質體的即時PCR分析的標準曲線。結果顯示,至少102
個拷貝數的pYHV質體可被偵測到,且各引子對與探針組合的標準曲線的R2
值皆大於0.99,表示本發明的引子對與探針可以被用於即時PCR,並產生可信的結果。
上述實施例結果表明,本發明的引子對與探針可用於cPCR擴增反應以檢測黃頭病毒(YHV)的存在,並且具有高度敏感度及專一性。
實施例
5
病原體傳染性肌肉壞死病毒
(IMNV)
的檢測
病原體傳染性肌肉壞死病毒(IMNV)的主要衣殼蛋白(major capsid protein, MCP)基因(GenBank accession No. KJ636788.1)的片段被插入一選殖載體中,該選殖載體可為,但不限於,pUC57、pGEM-T,以得到pIMNV質體。
1. 傳統聚合酶連鎖反應
進行傳統PCR所用的50 µl PCR混合物含有:106
個拷貝數的pIMNV質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.2 µM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一熱循環儀(例如,但不限於PC818, Astec Co. Ltd.,日本)中進行擴增反應,且包含一個變性的初始循環94o
C持續3分鐘,以及35個循環的94o
C 30秒、60o
C 30秒以及72o
C延展30秒。擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液(40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA)中分析,並且以溴化乙錠染色顯現。
傳統PCR的結果如表13所示,各引子對擴增了各目標序列的正確大小的片段,而在負對照組中則無目標序列被擴增(結果未顯示)。該結果表明,各引子對可用於傳統PCR擴增反應以檢測傳染性肌肉壞死病毒(IMNV)的存在。
【表13】各引子對與探針組合進行傳統PCR的結果
2. 熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)
50 µl的PCR混合物含有5 µl傳染性肌肉壞死病毒(IMNV)的主要衣殼蛋白(MCP)基因的RNA (分別為102
, 103
, 104
, 105
, 106
拷貝數/µl)或pIMNV質體(分別為102
, 103
, 104
, 105
, 106
個拷貝數)、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))、0.2 µM dNTP、1X cPCR緩衝液,以及1-5 U Taq DNA聚合酶、1-5 U反轉錄酶。將PCR混合物加入一反應試管中,並置於一熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)儀中一段指定的時間(約30~45分鐘)。以該cPCR儀偵測每個樣本中的FAM螢光。重複上述cPCR分析試驗8次(n = 8)以評各估引子對與探針的敏感度。
敏感度測試的結果如表14所示,各引子對及探針的組合皆可100%正確偵測到樣品中含有102
拷貝數/µl的傳染性肌肉壞死病毒(IMNV)的主要衣殼蛋白(MCP)基因的RNA或102
個拷貝數的pIMNV質體,其敏感度可達102
拷貝數/µl及102
個拷貝數。
【表14】各引子對與探針組合的敏感度測試結果(n = 8)
此外,以不同的蝦病原體基因質體(106
拷貝數/µl)作為cPCR模板分析上述各引子對及探針組合的專一性。cPCR方法如上所述。專一性測試的結果如表15所示,各引子對及探針的組合皆可正確偵測到含有傳染性肌肉壞死病毒(IMNV)的樣品,而偵測不到含有腸炎弧菌(V. parahaemolyticus
)、微孢子蟲(EHP)、白點症病毒(WSSV)、黃頭病毒(YHV)、傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(IHHNV),以及陶拉症候群病毒(TSV)的樣品。該結果顯示各引子對及探針組合具有專一性。
【表15】各引子對與探針組合的專一性測試結果
“+”表示在該樣本中偵測到螢光訊號,而“-”表示在該樣本中未偵測到螢光訊號。
3. 即時聚合酶連鎖反應 (real-time PCR, qPCR)
以稀釋的pIMNV質體(分別為101
, 102
, 103
, 104
, 105
, 106
, 107
個拷貝數)於一即時PCR儀(例如,但不限於ABI StepOnePlusTM
; Applied BioSystem, Life Technologies,加州,美國)中進行即時PCR分析。以含有2 µl pIMNV質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1)),總體積為20 µl的商用RT-PCR套組(例如,但不限於,OneStep PrimeScriptTM
RT-PCR Kit; Takara Bio Inc.,日本)進行即時PCR分析。即時PCR的程序為42o
C 5分鐘、94o
C 10秒,以及40個循環的94o
C 10秒以及60o
C 30分鐘。在60o
C的步驟中記錄螢光測量的結果並計算。連續稀釋(10倍)的pIMNV質體的即時PCR分析的標準曲線。結果顯示,至少102
個拷貝數的pIMNV質體可被偵測到,且各引子對與探針組合的標準曲線的R2
值皆大於0.99,表示本發明的引子對與探針可以被用於即時PCR,並產生可信的結果。
上述實施例結果表明,本發明的引子對與探針可用於cPCR擴增反應以檢測傳染性肌肉壞死病毒(IMNV)的存在,並且具有高度敏感度及專一性。
實施例
6
病原體傳染性皮下及造血組織壞死症病毒
(IHHNV)
的檢測
病原體傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(IHHNV)的基因組(GenBank accession No. AF218266)的片段被插入一選殖載體中,該選殖載體可為,但不限於,pUC57、pGEM-T,以得到pIHHNV質體。
1. 傳統聚合酶連鎖反應
進行傳統PCR所用的50 µl PCR混合物含有:106
個拷貝數的pIHHNV質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.2 µM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一熱循環儀(例如,但不限於PC818, Astec Co. Ltd.,日本)中進行擴增反應,且包含一個變性的初始循環94o
C持續3分鐘,以及35個循環的94o
C 30秒、60o
C 30秒以及72o
C延展30秒。擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液(40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA)中分析,並且以溴化乙錠染色顯現。
傳統PCR的結果如表16所示,各引子對擴增了各目標序列的正確大小的片段,而在負對照組中則無目標序列被擴增(結果未顯示)。該結果表明,各引子對可用於傳統PCR擴增反應以檢測傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(IHHNV)的存在。
【表16】各引子對與探針組合進行傳統PCR的結果
2. 熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)
50 µl的PCR混合物含有5 µl傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(IHHNV)的基因組片段的RNA (分別為102
, 103
, 104
, 105
, 106
拷貝數/µl)或pIHHNV質體(分別為102
, 103
, 104
, 105
, 106
個拷貝數)、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))、0.2 µM dNTP、1X cPCR緩衝液,以及1-5 U Taq DNA聚合酶、1-5 U反轉錄酶。將PCR混合物加入一反應試管中,並置於一熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)儀中一段指定的時間(約30~45分鐘)。以該cPCR儀偵測每個樣本中的FAM螢光。重複上述cPCR分析試驗8次(n = 8)以評各估引子對與探針的敏感度。
敏感度測試的結果如表17所示,各引子對及探針的組合皆可100%正確偵測到樣品中含有102
拷貝數/µl的傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(IHHNV)的基因組片段的RNA或102
個拷貝數的pIHHNV質體,其敏感度可達102
拷貝數/µl及102
個拷貝數。
【表17】各引子對與探針組合的敏感度測試結果(n = 8)
此外,以不同的蝦病原體基因質體(106
拷貝數/µl)作為cPCR模板分析上述各引子對及探針組合的專一性。cPCR方法如上所述。專一性測試的結果如表18所示,各引子對及探針的組合皆可正確偵測到含有傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(IHHNV)的樣品,而偵測不到含有腸炎弧菌(V. parahaemolyticus
)、微孢子蟲(EHP)、白點症病毒(WSSV)、黃頭病毒(YHV)、傳染性肌肉壞死病毒(IMNV),以及陶拉症候群病毒(TSV)的樣品。該結果顯示各引子對及探針組合具有專一性。
【表18】各引子對與探針組合的專一性測試結果
“+”表示在該樣本中偵測到螢光訊號,而“-”表示在該樣本中未偵測到螢光訊號。
3. 即時聚合酶連鎖反應 (real-time PCR, qPCR)
以稀釋的pIHHNV質體(分別為101
, 102
, 103
, 104
, 105
, 106
, 107
個拷貝數)於一即時PCR儀(例如,但不限於ABI StepOnePlusTM
; Applied BioSystem, Life Technologies,加州,美國)中進行即時PCR分析。以含有2 µl pIHHNV質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1)),總體積為20 µl的商用RT-PCR套組(例如,但不限於,OneStep PrimeScriptTM
RT-PCR Kit; Takara Bio Inc.,日本)進行即時PCR分析。即時PCR的程序為42o
C 5分鐘、94o
C 10秒,以及40個循環的94o
C 10秒以及60o
C 30分鐘。在60o
C的步驟中記錄螢光測量的結果並計算。連續稀釋(10倍)的pIHHNV質體的即時PCR分析的標準曲線。結果顯示,至少102
個拷貝數的pIHHNV質體可被偵測到,且各引子對與探針組合的標準曲線的R2
值皆大於0.99,表示本發明的引子對與探針可以被用於即時PCR,並產生可信的結果。
上述實施例結果表明,本發明的引子對與探針可用於cPCR擴增反應以檢測傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(IHHNV)的存在,並且具有高度敏感度及專一性。
實施例
7
病原體陶拉症候群病毒
(TSV)
的檢測
病原體陶拉症候群病毒(TSV)的基因組(GenBank accession No. AF277675)片段被插入一選殖載體中,該選殖載體可為,但不限於,pUC57、pGEM-T,以得到pTSV質體。
1. 傳統聚合酶連鎖反應
進行傳統PCR所用的50 µl PCR混合物含有:106
個拷貝數的pTSV質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.2 µM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一熱循環儀(例如,但不限於PC818, Astec Co. Ltd.,日本)中進行擴增反應,且包含一個變性的初始循環94o
C持續3分鐘,以及35個循環的94o
C 30秒、60o
C 30秒以及72o
C延展30秒。擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液(40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA)中分析,並且以溴化乙錠染色顯現。
傳統PCR的結果如表19所示,各引子對擴增了各目標序列的正確大小的片段,而在負對照組中則無目標序列被擴增(結果未顯示)。該結果表明,各引子對可用於傳統PCR擴增反應以檢測陶拉症候群病毒(TSV)的存在。
【表19】各引子對與探針組合進行傳統PCR的結果
2. 熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)
50 µl的PCR混合物含有5 µl陶拉症候群病毒(TSV)的基因組片段的RNA (分別為102
, 103
, 104
, 105
, 106
拷貝數/µl)或pTSV質體(分別為102
, 103
, 104
, 105
, 106
個拷貝數)、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))、0.2 µM dNTP、1X cPCR緩衝液,以及1-5 U Taq DNA聚合酶、1-5 U反轉錄酶。將PCR混合物加入一反應試管中,並置於一熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)儀中一段指定的時間(約30~45分鐘)。以該cPCR儀偵測每個樣本中的FAM螢光。重複上述cPCR分析試驗8次(n = 8)以評各估引子對與探針的敏感度。
敏感度測試的結果如表20所示,各引子對及探針的組合皆可100%正確偵測到樣品中含有102
拷貝數/µl的陶拉症候群病毒(TSV)的基因組片段的RNA或102
個拷貝數的pTSV質體,其敏感度可達102
拷貝數/µl及102
個拷貝數。
【表20】各引子對與探針組合的敏感度測試結果(n = 8)
此外,以不同的蝦病原體基因質體(106
拷貝數/µl)作為cPCR模板分析上述各引子對及探針組合的專一性。cPCR方法如上所述。專一性測試的結果如表21所示,各引子對及探針的組合皆可正確偵測到含有陶拉症候群病毒(TSV)的樣品,而偵測不到含有腸炎弧菌(V. parahaemolyticus
)、微孢子蟲(EHP)、白點症病毒(WSSV)、黃頭病毒(YHV)、傳染性肌肉壞死病毒(IMNV),以及傳染性皮下及造血組織壞死症病毒(IHHNV)的樣品。該結果顯示各引子對及探針組合具有專一性。
【表21】各引子對與探針組合的專一性測試結果
“+”表示在該樣本中偵測到螢光訊號,而“-”表示在該樣本中未偵測到螢光訊號。
3. 即時聚合酶連鎖反應 (real-time PCR, qPCR)
以稀釋的pTSV質體(分別為101
, 102
, 103
, 104
, 105
, 106
, 107
個拷貝數)於一即時PCR儀(例如,但不限於ABI StepOnePlusTM
; Applied BioSystem, Life Technologies,加州,美國)中進行即時PCR分析。以含有2 µl pTSV質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1)),總體積為20 µl的商用RT-PCR套組(例如,但不限於,OneStep PrimeScriptTM
RT-PCR Kit; Takara Bio Inc.,日本)進行即時PCR分析。即時PCR的程序為42o
C 5分鐘、94o
C 10秒,以及40個循環的94o
C 10秒以及60o
C 30分鐘。在60o
C的步驟中記錄螢光測量的結果並計算。連續稀釋(10倍)的pTSV質體的即時PCR分析的標準曲線。結果顯示,至少102
個拷貝數的pTSV質體可被偵測到,且各引子對與探針組合的標準曲線的R2
值皆大於0.99,表示本發明的引子對與探針可以被用於即時PCR,並產生可信的結果。
上述實施例結果表明,本發明的引子對與探針可用於cPCR擴增反應以檢測陶拉症候群病毒(TSV)的存在,並且具有高度敏感度及專一性。
上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明,惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍,凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更,均應包含於本案之專利範圍中。
綜上所述,本案所揭露之技術特徵已充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件,爰依法提出申請,懇請 貴局核准本件發明專利申請案,以勵發明,至感德便。
<110> 福又達生物科技股份有限公司
<120> 蝦病原體檢測方法
<150> US 62/741,635
<151> 2018-10-05
<160> 103
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 20
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 26
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<210> 27
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> prime
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 36
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 38
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 42
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 48
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 51
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<210> 52
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 54
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 57
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<210> 58
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 59
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 62
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 63
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 64
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<210> 66
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 67
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<210> 68
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 69
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 70
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<210> 71
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 72
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 73
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 74
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<210> 76
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 77
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 78
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<210> 79
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 81
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 84
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 86
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 87
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 88
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<210> 90
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 91
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 92
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 93
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 94
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<210> 95
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 96
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 97
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<210> 98
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 99
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 100
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 101
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 102
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<210> 103
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
Claims (1)
- 一種用於偵測腸炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的寡核苷酸對,包含一第一引子與一第二引子,該第一引子與該第二引子的序列組合選自由下列所組成之群組:SEQ ID NO:1與SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4與SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7與SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10與SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:10與SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:16與SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:16與SEQ ID NO:17,以及SEQ ID NO:13與SEQ ID NO:14;以及一寡核苷酸探針,該寡核苷酸探針具有一寡核苷酸探針序列、一附加於該寡核苷酸探針上的一第一位置的螢光分子,以及一附加於該寡核苷酸探針上的一第二位置的螢光抑制分子,其中該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO:1與SEQ ID NO:2時,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO:3所示;該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO:4與SEQ ID NO:5時,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO:6所示;該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO:7與SEQ ID NO:8時,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO:9所示;該第一引子與該第二引子的序列組合選自由下列所組成之群組:SEQ ID NO:10與SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:10與SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:16與SEQ ID NO:11,以及SEQ ID NO:16與 SEQ ID NO:17時,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO:12所示;以及該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO:13與SEQ ID NO:14時,該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO:15所示。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201862741635P | 2018-10-05 | 2018-10-05 | |
US62/741,635 | 2018-10-05 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW202014525A TW202014525A (zh) | 2020-04-16 |
TWI727444B true TWI727444B (zh) | 2021-05-11 |
Family
ID=70054939
Family Applications (5)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW110112366A TWI784467B (zh) | 2018-10-05 | 2019-10-01 | 用於偵測蝦白點症病毒(White spot syndrome virus, WSSV)之寡核苷酸對及探針 |
TW108135518A TWI732303B (zh) | 2018-10-05 | 2019-10-01 | 一種用於偵測魚心肌炎病毒(Piscine myocarditis virus,PMCV)的寡核苷酸對及探針 |
TW108135517A TWI730432B (zh) | 2018-10-05 | 2019-10-01 | 魚病原體檢測方法 |
TW111139608A TWI817777B (zh) | 2018-10-05 | 2019-10-01 | 用於偵測蝦微孢子蟲(Enterocytozoon hepatopenaei)之寡核苷酸對及探針 |
TW108135516A TWI727444B (zh) | 2018-10-05 | 2019-10-01 | 蝦病原體檢測方法 |
Family Applications Before (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW110112366A TWI784467B (zh) | 2018-10-05 | 2019-10-01 | 用於偵測蝦白點症病毒(White spot syndrome virus, WSSV)之寡核苷酸對及探針 |
TW108135518A TWI732303B (zh) | 2018-10-05 | 2019-10-01 | 一種用於偵測魚心肌炎病毒(Piscine myocarditis virus,PMCV)的寡核苷酸對及探針 |
TW108135517A TWI730432B (zh) | 2018-10-05 | 2019-10-01 | 魚病原體檢測方法 |
TW111139608A TWI817777B (zh) | 2018-10-05 | 2019-10-01 | 用於偵測蝦微孢子蟲(Enterocytozoon hepatopenaei)之寡核苷酸對及探針 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP3862443A4 (zh) |
CN (3) | CN111004863A (zh) |
CL (1) | CL2021000615A1 (zh) |
TW (5) | TWI784467B (zh) |
WO (3) | WO2020069658A1 (zh) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112068301A (zh) * | 2020-08-11 | 2020-12-11 | 江苏省海洋水产研究所 | 一种显微染色鉴别肝肠胞虫的方法及其专用装置 |
CN112957392B (zh) * | 2021-03-04 | 2022-03-08 | 上海联旺水产科技有限公司 | 用于防治对虾虾肝肠胞虫病的制剂及其制备方法与用途 |
CN113234814B (zh) * | 2021-06-29 | 2023-08-22 | 江苏海洋大学 | 一种用于同时检测虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的多重rpa引物和探针组合物及检测方法 |
CN113755648B (zh) * | 2021-10-28 | 2024-02-20 | 天津市动物疫病预防控制中心 | Wssv实时荧光定量pcr检测引物探针组合、试剂盒及方法 |
CN113913543B (zh) * | 2021-10-28 | 2023-09-22 | 天津市动物疫病预防控制中心 | Ehp实时荧光定量pcr检测引物探针组合、试剂盒及方法 |
CN116179763A (zh) * | 2023-01-04 | 2023-05-30 | 中国海洋大学三亚海洋研究院 | 一种基于era技术的基因ⅰ型和基因ⅱ型黄头病毒多重快速检测方法及检测用引物和探针 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106048022A (zh) * | 2016-06-16 | 2016-10-26 | 徐锦余 | 一种检测虾肝肠胞虫的试剂盒 |
Family Cites Families (35)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5538848A (en) | 1994-11-16 | 1996-07-23 | Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. | Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe |
JP4040087B2 (ja) | 1995-05-05 | 2008-01-30 | アプレラ コーポレイション | Pcr増幅とハイブリダイゼーションプロービングアッセイとを組み合わせた方法およびそのための試薬 |
JP5315519B2 (ja) * | 2006-04-13 | 2013-10-16 | 国立大学法人東京海洋大学 | コイヘルペスウイルス(khv)の検出方法 |
WO2008003734A1 (en) * | 2006-07-06 | 2008-01-10 | Intervet International B.V. | Combination vaccine against streptococcus |
CN101522919B (zh) * | 2006-08-24 | 2013-08-07 | 纳幕尔杜邦公司 | 用于诊断虾病原体的序列 |
BRPI0714642B1 (pt) * | 2006-08-24 | 2015-08-11 | Du Pont | Kit para a detecção de tsv, métodos para a detecção da presença de tsv em uma amostra e método para a quantificação da quantidade de tsv em uma amostra |
CN101506387B (zh) * | 2006-08-24 | 2014-04-09 | 纳幕尔杜邦公司 | 用于诊断虾病原体的序列 |
NZ587183A (en) | 2008-01-24 | 2012-08-31 | Medigen Biotechnology Corp | Methods and apparatuses for convective polymerase chain reaction (pcr) |
CN101240351B (zh) * | 2008-03-20 | 2010-12-01 | 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 淋巴囊肿病毒的实时定量pcr检测方法 |
WO2011041790A1 (en) * | 2009-10-02 | 2011-04-07 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Piscine reovirus diagnostic compositions |
CN102115786B (zh) * | 2010-01-04 | 2013-02-20 | 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 | 鲑鱼肾杆菌实时荧光rt-pcr检测方法和试剂盒 |
ES2588225T3 (es) * | 2010-04-21 | 2016-10-31 | Pharmaq As | Secuencias de ácido nucleico de un virus de pece y el uso de las mismas |
CN102559484B (zh) * | 2012-01-31 | 2015-12-16 | 鲁东大学 | 对虾传染性肌肉坏死病毒荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法 |
CN102912040B (zh) * | 2012-10-31 | 2014-04-16 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 检测对虾白斑综合征病毒的环介导等温扩增引物及其应用 |
CN102912041B (zh) * | 2012-11-06 | 2014-10-01 | 厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 一种用于检测对虾五种病毒的引物、液相芯片及其用途 |
US20160244849A1 (en) * | 2013-10-08 | 2016-08-25 | University Of Prince Edward Island | Multiplex diagnostic assay for detecting salmonid pathogens |
CN103540687B (zh) * | 2013-10-16 | 2015-03-04 | 广州迪澳生物科技有限公司 | 对虾白斑综合症病毒(wssv)的lamp检测引物组及试剂盒 |
MX2014003938A (es) * | 2014-04-01 | 2015-09-30 | Univ Nac Autónoma De México | Macroarreglos para deteccion en muestras ambientales y biologicas de microorganismos enteropatogenos. |
CA2887840C (en) * | 2014-04-18 | 2020-04-14 | UpstartDNA Co. Ltd. | Methods for detecting pathogen in coldwater fish |
TWI498335B (zh) * | 2014-06-24 | 2015-09-01 | Univ Nat Cheng Kung | 專一性檢測急性肝胰腺壞死病致病原毒素之引子對、方法及用途 |
EP3037823A1 (en) * | 2014-12-22 | 2016-06-29 | BioMar Group A/S | Method for determining pathological tissue damage and diagnosing infectious disease in fish |
CL2014003575A1 (es) * | 2014-12-30 | 2015-07-10 | Univ Chile | Método basado en pcr-rflp para detectar presencia de piscirickettsia salmonis en una muestra, y establecer si la muestra esta contaminada con otras bacterias que podrían cohabitar con el mencionado patógeno; y kit parallevar a cabo el método. |
CN104846098A (zh) * | 2015-05-21 | 2015-08-19 | 广州金水动物保健品有限公司 | 一种试剂盒及检测方法 |
CN105039593A (zh) * | 2015-06-15 | 2015-11-11 | 浙江省海洋开发研究院 | 一种对虾白斑病综合症病毒的快速检测试剂盒及应用 |
CN105002303B (zh) * | 2015-08-23 | 2017-05-31 | 青岛农业大学 | 一种检测淋巴囊肿病毒的pcr方法 |
CN105368985A (zh) * | 2015-12-10 | 2016-03-02 | 国家海洋局第三海洋研究所 | 对虾tsv和imnv荧光定量检测引物和探针及试剂盒 |
CN105567875A (zh) * | 2016-03-03 | 2016-05-11 | 国家海洋局第三海洋研究所 | 一种同时检测对虾imnv、yhv和tsv的多重pcr检测引物及试剂盒 |
CN106636471B (zh) * | 2017-01-16 | 2020-04-24 | 山东省海洋生物研究院 | 同时检测对虾wssv、ahpnd、ehp、ihhnv的多重pcr检测试剂盒 |
CN106591474A (zh) * | 2017-01-19 | 2017-04-26 | 浙江省淡水水产研究所 | 一种虾肝肠微孢子虫lamp检测试剂盒 |
CN107012258B (zh) * | 2017-03-22 | 2020-09-18 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 用于检测鱼类病毒性神经坏死病毒的引物组以及探针序列 |
CN107365858A (zh) * | 2017-08-22 | 2017-11-21 | 中国科学院海洋研究所 | 脊尾白虾感染wssv后检测健康状态lamp检测引物及体系与方法 |
CN107488730A (zh) * | 2017-09-30 | 2017-12-19 | 厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 一种用于我国对虾虾肝肠孢虫检测的荧光检测试剂盒 |
CN107988325B (zh) * | 2017-11-10 | 2021-06-25 | 杭州众测生物科技有限公司 | 虾肝肠胞虫(ehp)的raa恒温荧光检测方法及试剂 |
CN108018378A (zh) * | 2017-12-11 | 2018-05-11 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 一种罗湖病毒Taq-man探针荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法 |
CN108220483A (zh) * | 2018-02-12 | 2018-06-29 | 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 | 一种用于罗非鱼湖病毒检测的试剂、检测方法及应用 |
-
2019
- 2019-09-27 CN CN201910923747.7A patent/CN111004863A/zh active Pending
- 2019-09-27 WO PCT/CN2019/108523 patent/WO2020069658A1/zh active Application Filing
- 2019-09-27 CN CN201910924732.2A patent/CN111004865A/zh active Pending
- 2019-09-27 WO PCT/CN2019/108518 patent/WO2020069656A1/zh active Application Filing
- 2019-09-27 WO PCT/CN2019/108521 patent/WO2020069657A1/zh active Application Filing
- 2019-09-27 EP EP19868650.3A patent/EP3862443A4/en not_active Withdrawn
- 2019-09-27 CN CN201910923766.XA patent/CN111004864A/zh active Pending
- 2019-10-01 TW TW110112366A patent/TWI784467B/zh active
- 2019-10-01 TW TW108135518A patent/TWI732303B/zh active
- 2019-10-01 TW TW108135517A patent/TWI730432B/zh active
- 2019-10-01 TW TW111139608A patent/TWI817777B/zh active
- 2019-10-01 TW TW108135516A patent/TWI727444B/zh active
-
2021
- 2021-03-12 CL CL2021000615A patent/CL2021000615A1/es unknown
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106048022A (zh) * | 2016-06-16 | 2016-10-26 | 徐锦余 | 一种检测虾肝肠胞虫的试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Jee Eun Han et al:qPCR assay for detecting and quantifying a virulence plasmid in acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) due to pathogenic Vibrio parahaemolyticus. Aquaculture Volume 442 (2015) Pages 12-15 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
TW202132574A (zh) | 2021-09-01 |
TW202014525A (zh) | 2020-04-16 |
TWI732303B (zh) | 2021-07-01 |
CN111004865A (zh) | 2020-04-14 |
WO2020069658A1 (zh) | 2020-04-09 |
TWI817777B (zh) | 2023-10-01 |
CN111004863A (zh) | 2020-04-14 |
TW202024338A (zh) | 2020-07-01 |
TW202309278A (zh) | 2023-03-01 |
WO2020069657A1 (zh) | 2020-04-09 |
TWI730432B (zh) | 2021-06-11 |
TWI784467B (zh) | 2022-11-21 |
WO2020069656A1 (zh) | 2020-04-09 |
EP3862443A1 (en) | 2021-08-11 |
CN111004864A (zh) | 2020-04-14 |
TW202014524A (zh) | 2020-04-16 |
EP3862443A4 (en) | 2022-10-12 |
CL2021000615A1 (es) | 2021-07-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
TWI727444B (zh) | 蝦病原體檢測方法 | |
TWI731425B (zh) | 一種用於偵測非洲豬瘟病毒的寡核苷酸對及探針 | |
TWI660176B (zh) | 冷水魚病原菌魚呼吸道與腸道病毒檢測方法 | |
KR20200068738A (ko) | 표적핵산 증폭방법 및 표적핵산 증폭용 조성물 | |
WO2009098789A1 (ja) | Lamp法による甲殻類病原性ウイルスの検出方法及び検出試薬キット | |
KR102030244B1 (ko) | 뎅기 바이러스 검출용 올리고뉴클레오티드 세트 및 이의 용도 | |
TWI659106B (zh) | 檢測黃頭病毒基因一型的遺傳標記以及使用其檢測黃頭病毒基因一型的方法 | |
TW202239971A (zh) | 可分辨非洲豬瘟野毒株與疫苗株病毒的檢測方法 | |
CN110592267A (zh) | 鲤春病毒血症病毒(svcv)的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
CN114075613A (zh) | 家禽病原菌的检测方法 | |
CN115161413A (zh) | 可区分非洲猪瘟野毒株与疫苗株病毒的检测方法 | |
Kamimura et al. | Evaluation of quenching probe (QProbe)-PCR assay for quantification of the koi herpes virus (KHV) | |
KR20150079394A (ko) | 표적 핵산의 유전자변이 분석 방법 및 키트 |