TWI730432B - 魚病原體檢測方法 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及一種檢測魚病原體的方法。此外，本發明並涉及用於檢測魚病原體的寡核苷酸對。

Description

魚病原體檢測方法
本發明關於檢測魚病原體的方法，特別是關於使用寡核苷酸對檢測魚病原體的方法。
水產動物是人類重要的能量、蛋白質與必需營養的來源之一。大量捕撈野生水產動物對海洋資源耗盡的疑慮，使得水產養殖業日益受到重視。根據聯合國糧食及農業組織的統計，水產養殖對全球捕撈及養殖總產量的貢獻逐步提升，從2000年的25.7%增至2016年的46.8%。然而，密集養殖加上管理不良可能造成水產動物容易感染疾病、死亡，而造成漁民的損失。此外，水產動物的病害多由細菌或病毒引起，細菌性疾病與病毒性疾病的處理方法相差甚遠，一旦誤診，處理不當，就會造成巨大的損失。由此可見，在飼養漁場、蝦場密集監控疾病對管理而言是不可或缺的一環。本發明即提供了快速、方便的魚病原體檢測方法以供產業利用。
於一方面，本發明涉及一種魚病原體檢測方法，包含提供一可能含有一魚病原體的一或多個核苷酸序列的樣本；提供一寡核苷酸引子對，該寡核苷酸引子對包含一第一引子與一第二引子，該寡核苷酸引子對定義在該病原體的一或多個核苷酸序列上一雙股目標序列的二互補股的5’端；提供一聚合酶；在一容器中混合該樣本、該寡核苷酸引子對、該聚合酶、去氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphates, dATPs)、去氧胞核苷三磷酸(deoxycytidine triphosphates, dCTPs)、去氧鳥苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphates, dGTPs)，以及去氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphates, dTTPs)，以形成一聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)混合物；透過在一固定溫度下加熱該容器的底部，使該PCR混合物進行熱對流聚合酶連鎖反應(convective polymerase chain reaction, cPCR)，以形成一PCR產物；以及偵測該PCR產物以辨識該雙股目標序列。
在某些具體實施例中，該聚合酶連鎖反應(PCR)混合物進一步包含一寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針包含一與該雙股目標序列的一區段互補的寡核苷酸探針序列、一附加於該寡核苷酸探針上的一第一位置的螢光分子，以及一附加於該寡核苷酸探針上的一第二位置的螢光抑制分子，當該寡核苷酸探針未雜合於該雙股目標序列的該區段時，該螢光抑制分子大體上抑制該螢光分子，且當該寡核苷酸探針雜合於該雙股目標序列的該區段時，該螢光分子大體上未被抑制。
於另一方面，本發明涉及一種用於偵測魚病原體的寡核苷酸對，包含一第一引子與一第二引子。
在某些具體實施例中，該寡核苷酸對進一步包含一寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針具有一寡核苷酸探針序列、一附加於該寡核苷酸探針上的一第一位置的螢光分子，以及一附加於該寡核苷酸探針上的一第二位置的螢光抑制分子。
在某些具體實施例中，該病原體為發光桿菌殺魚亞種(Photobacterium damselae subsp. Piscicida)，且該第一引子與該第二引子的序列組合選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO: 1與SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 1與SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 2與SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 2與SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6與SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9與SEQ ID NO: 10，以及SEQ ID NO: 12與SEQ ID NO: 13。
在某些具體實施例中，該病原體為發光桿菌殺魚亞種，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 1與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 2與SEQ ID NO: 3時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體發光桿菌殺魚亞種的青黴素結合蛋白1A (penicillin-binding protein 1A, Pbp-1A)基因(GenBank accession No. EU164926)的第1908至第1946個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 5所示。
在某些具體實施例中，該病原體為發光桿菌殺魚亞種，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 1與SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 2與SEQ ID NO: 4時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體發光桿菌殺魚亞種的青黴素結合蛋白1A (Pbp-1A)基因(GenBank accession No. EU164926)的第1908至第1939個核苷酸之間的13至30個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 5所示。
在某些具體實施例中，該病原體為發光桿菌殺魚亞種，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 6與SEQ ID NO: 7時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體發光桿菌殺魚亞種的青黴素結合蛋白1A (Pbp-1A)基因(GenBank accession No. EU164926)的第1226至第1291個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 8所示。
在某些具體實施例中，該病原體為發光桿菌殺魚亞種，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 9與SEQ ID NO: 10時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體發光桿菌殺魚亞種的青黴素結合蛋白1A (Pbp-1A)基因(GenBank accession No. EU164926)的第1244至第1304個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 11所示。
在某些具體實施例中，該病原體為發光桿菌殺魚亞種，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 12與SEQ ID NO: 13時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體發光桿菌殺魚亞種的青黴素結合蛋白1A (Pbp-1A)基因(GenBank accession No. EU164926)的第1181至第1243個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 14所示。
在某些具體實施例中，該病原體為羅非魚病毒(Tilapia Lake Virus, TiLV)，且該第一引子與該第二引子的序列組合選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO: 15與SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18與SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21與SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24與SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 25與SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 26與SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 24與SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 25與SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 26與SEQ ID NO: 28，以及SEQ ID NO: 30與SEQ ID NO: 31。
在某些具體實施例中，該病原體為羅非魚病毒(TiLV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 15與SEQ ID NO: 16時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體羅非魚病毒(TiLV)蛋白基因(GenBank accession No. KJ605629)的第574至第617個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 17所示。
在某些具體實施例中，該病原體為羅非魚病毒(TiLV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 18與SEQ ID NO: 19時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體羅非魚病毒(TiLV)蛋白基因(GenBank accession No. KJ605629)的第525至第577個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 20所示。
在某些具體實施例中，該病原體為羅非魚病毒(TiLV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 21與SEQ ID NO: 22時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體羅非魚病毒(TiLV)蛋白基因(GenBank accession No. KJ605629)的第1122至第1163個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 23所示。
在某些具體實施例中，該病原體為羅非魚病毒(TiLV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 24與SEQ ID NO: 27時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體羅非魚病毒(TiLV)蛋白基因(GenBank accession No. KJ605629)的第486至第529個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 29所示。
在某些具體實施例中，該病原體為羅非魚病毒(TiLV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 25與SEQ ID NO: 27或SEQ ID NO: 26與SEQ ID NO: 27時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體羅非魚病毒(TiLV)蛋白基因(GenBank accession No. KJ605629)的第499至第529個核苷酸之間的13至30個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 29所示。
在某些具體實施例中，該病原體為羅非魚病毒(TiLV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 24與SEQ ID NO: 28時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體羅非魚病毒(TiLV)蛋白基因(GenBank accession No. KJ605629)的第486至第524個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 29所示。
在某些具體實施例中，該病原體為羅非魚病毒(TiLV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 25與SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 26與SEQ ID NO: 28時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體羅非魚病毒(TiLV)蛋白基因(GenBank accession No. KJ605629)的第499至第524個核苷酸之間的13至25個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 29所示。
在某些具體實施例中，該病原體為羅非魚病毒(TiLV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 30與SEQ ID NO: 31時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體羅非魚病毒(TiLV)蛋白基因(GenBank accession No. KJ605629)的第875至第926個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 32所示。
在某些具體實施例中，該病原體為錦鯉疱疹病毒(Koi herpesvirus, KHV)，且該第一引子與該第二引子的序列組合選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO: 33與SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36與SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39與SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42與SEQ ID NO: 43，以及SEQ ID NO: 45與SEQ ID NO: 46。
在某些具體實施例中，該病原體為錦鯉疱疹病毒(KHV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 33與SEQ ID NO: 34時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體錦鯉疱疹病毒(KHV)基因組(GenBank accession No. KX544848)的第164188至第164234個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 35所示。
在某些具體實施例中，該病原體為錦鯉疱疹病毒(KHV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 36與SEQ ID NO: 37時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體錦鯉疱疹病毒(KHV)基因組(GenBank accession No. KX544848)的第163929至第163986個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 38所示。
在某些具體實施例中，該病原體為錦鯉疱疹病毒(KHV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 39與SEQ ID NO: 40時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體錦鯉疱疹病毒(KHV)基因組(GenBank accession No. KX544848)的第164882至第164918個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 41所示。
在某些具體實施例中，該病原體為錦鯉疱疹病毒(KHV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 42與SEQ ID NO: 43時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體錦鯉疱疹病毒(KHV)基因組(GenBank accession No. KX544848)的第164100至第164129個核苷酸之間的13至30個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 44所示。
在某些具體實施例中，該病原體為錦鯉疱疹病毒(KHV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 45與SEQ ID NO: 46時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體錦鯉疱疹病毒(KHV)基因組(GenBank accession No. KX544848)的第164313至第164358個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 47所示。
在某些具體實施例中，該病原體為神經壞死病毒(Nervous necrosis virus, NNV)，且該第一引子與該第二引子的序列組合選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO: 48與SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 52與SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 52與SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55與SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 58與SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61與SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61與SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63與SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 63與SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 63與SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 66與SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 66與SEQ ID NO: 68，以及SEQ ID NO: 70與SEQ ID NO: 71。
在某些具體實施例中，該病原體為神經壞死病毒(NNV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 48與SEQ ID NO: 49時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體神經壞死病毒(NNV)衣殼蛋白(capsid protein)基因(GenBank accession No. MF565445)的第349至第396個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO: 51所示。
在某些具體實施例中，該病原體為神經壞死病毒(NNV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 52與SEQ ID NO: 53時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體神經壞死病毒(NNV)衣殼蛋白基因(GenBank accession No. MF565445)的第371至第423個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 51所示。
在某些具體實施例中，該病原體為神經壞死病毒(NNV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 52與SEQ ID NO: 54時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體神經壞死病毒(NNV)衣殼蛋白基因(GenBank accession No. MF565445)的第371至第429個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 51所示。
在某些具體實施例中，該病原體為神經壞死病毒(NNV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 55與SEQ ID NO: 56時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體神經壞死病毒(NNV)衣殼蛋白基因(GenBank accession No. MF565445)的第326至第374個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 57所示。
在某些具體實施例中，該病原體為神經壞死病毒(NNV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 58與SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 61與SEQ ID NO: 59時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體神經壞死病毒(NNV)衣殼蛋白基因(GenBank accession No. MF565445)的第308至第352個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 60所示。
在某些具體實施例中，該病原體為神經壞死病毒(NNV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 61與SEQ ID NO: 62時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體神經壞死病毒(NNV)衣殼蛋白基因(GenBank accession No. MF565445)的第307至第367個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 60所示。
在某些具體實施例中，該病原體為神經壞死病毒(NNV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 63與SEQ ID NO: 64或SEQ ID NO: 63與SEQ ID NO: 67時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體神經壞死病毒(NNV)衣殼蛋白基因(GenBank accession No. MF565445)的第311至第380個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 65或SEQ ID NO: 69所示。
在某些具體實施例中，該病原體為神經壞死病毒(NNV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 63與SEQ ID NO: 68時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體神經壞死病毒(NNV)衣殼蛋白基因(GenBank accession No. MF565445)的第351至第380個核苷酸之間的13至30個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 65所示。
在某些具體實施例中，該病原體為神經壞死病毒(NNV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 66與SEQ ID NO: 67時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體神經壞死病毒(NNV)衣殼蛋白基因(GenBank accession No. MF565445)的第310至第371個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 65所示。
在某些具體實施例中，該病原體為神經壞死病毒(NNV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 66與SEQ ID NO: 68時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體神經壞死病毒(NNV)衣殼蛋白基因(GenBank accession No. MF565445)的第351至第371個核苷酸之間的13至21個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 65所示。
在某些具體實施例中，該病原體為神經壞死病毒(NNV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 70與SEQ ID NO: 71時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體神經壞死病毒(NNV)衣殼蛋白基因(GenBank accession No. MF565445)的第345至第363個核苷酸之間的13至19個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 72所示。
在某些具體實施例中，該病原體為淋巴囊腫病毒(Lymphocystis virus)，且該第一引子與該第二引子的序列組合選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO: 73與SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 76與SEQ ID NO: 77，以及SEQ ID NO: 79與SEQ ID NO: 80。
在某些具體實施例中，該病原體為淋巴囊腫病毒，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 73與SEQ ID NO: 74時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體淋巴囊腫病毒主要衣殼蛋白(major capsid protein, MCP)基因(GenBank accession No. HE650106)的第942至第981個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 75所示。
在某些具體實施例中，該病原體為淋巴囊腫病毒，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 76與SEQ ID NO: 77時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體淋巴囊腫病毒主要衣殼蛋白(MCP)基因(GenBank accession No. HE650106)的第124至第167個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 78所示。
在某些具體實施例中，該病原體為淋巴囊腫病毒，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 79與SEQ ID NO: 80時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體淋巴囊腫病毒主要衣殼蛋白(MCP)基因(GenBank accession No. HE650106)的第677至第798個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 81所示。
於一方面，本發明涉及一種魚病原體檢測方法。在某些具體實施例中，該方法為聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)。在某些具體實施例中，該方法為反轉錄聚合酶連鎖反應(reverse-transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)。在某些具體實施例中，該方法為熱對流聚合酶連鎖反應(convective polymerase chain reaction, cPCR)。在某些具體實施例中，該方法為即時聚合酶連鎖反應(real-time polymerase chain reaction, real-time PCR)。
於一方面，本發明涉及一種魚病原體檢測方法，包含: 提供一可能含有魚病原體的一或多個核苷酸序列的樣本； 提供一寡核苷酸引子對，該寡核苷酸引子對包含一第一引子與一第二引子，該寡核苷酸引子對定義在該病原體的一或多個核苷酸序列上一雙股目標序列的二互補股的5’端； 提供一聚合酶； 在一容器中混合該樣本、該寡核苷酸引子對、該聚合酶、去氧腺苷三磷酸(dATPs)、去氧胞核苷三磷酸(dCTPs)、去氧鳥苷三磷酸(dGTPs)，以及去氧胸苷三磷酸(dTTPs)，以形成一聚合酶連鎖反應(PCR)混合物； 透過在一固定溫度下加熱該容器的底部，使該PCR混合物進行熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)，以形成一PCR產物；以及 偵測該PCR產物以辨識該雙股目標序列。
於另一方面，本發明涉及一種魚病原體檢測方法，包含: 提供一可能含有魚病原體的一或多個核苷酸序列的樣本； 提供一寡核苷酸引子對，該寡核苷酸引子對包含一第一引子與一第二引子，該寡核苷酸引子對定義在該病原體的一或多個核苷酸序列上一雙股目標序列的二互補股的5’端； 提供一寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針包含一與該雙股目標序列的一區段互補的寡核苷酸探針序列、一附加於該寡核苷酸探針上的一第一位置的螢光分子，以及一附加於該寡核苷酸探針上的一第二位置的螢光抑制分子，當該寡核苷酸探針未雜合於該雙股目標序列的該區段時，該螢光抑制分子大體上抑制該螢光分子，且當該寡核苷酸探針雜合於該雙股目標序列的該區段時，該螢光分子大體上未被抑制； 提供一聚合酶； 在一容器中混合該樣本、該寡核苷酸引子對、該聚合酶、去氧腺苷三磷酸(dATPs)、去氧胞核苷三磷酸(dCTPs)、去氧鳥苷三磷酸(dGTPs)，以及去氧胸苷三磷酸(dTTPs)，以形成一聚合酶連鎖反應(PCR)混合物； 透過在一固定溫度下加熱該容器的底部，使該PCR混合物進行熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)，以形成一PCR產物；以及 偵測該PCR產物以辨識該雙股目標序列。
於又一方面，本發明涉及一種用於偵測魚病原體的寡核苷酸對。
於再一方面，本發明涉及一種用於偵測魚病原體的寡核苷酸對與寡核苷酸探針。
應當進一步理解的是，在某些具體實施例中，本文揭露的寡核苷酸對及/或寡核苷酸探針可用於各種基礎PCR技術之變異，例如，但不限於，反轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)、熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)、即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)、巢式聚合酶連鎖反應(nested PCR)，以及熱不對稱性交錯聚合酶連鎖反應(thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR)。
如本文所用，術語「魚病原體」意指在魚生物體內外發現的病毒性、細菌性及寄生性病原體。魚病原體的實例如，但不限於：發光桿菌殺魚亞種(P. damselae subsp. Piscicida)、羅非魚病毒(TiLV)、錦鯉疱疹病毒(KHV)、神經壞死病毒(NNV)，以及淋巴囊腫病毒(Lymphocystis virus)。
如本文所用，術語「熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)」是指一種聚合酶連鎖反應，其中，將一裝有一PCR樣品的管狀容器底部嵌入一穩定熱源中，並控制該PCR的參數，包括該PCR樣品的總體積、黏度、表面溫度，以及該管狀容器的內徑，使得該PCR樣品的底部到頂部的溫度梯度下降，誘導熱對流並且使得PCR樣品的變性、黏合、聚合在該管狀容器的不同區域中依序且重複發生。熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)的詳細描述請參見如美國專利號8,187,813，其以引用的方式將其整體併入本文。
如本文所用，術語「螢光分子」意指一物質或其一部份，其係能夠在可偵測的範圍內顯示螢光。如本文所用，術語「螢光抑制分子」意指一物質或其一部份，其係能夠抑制當由一光源激發時由該螢光分子所發射的螢光。在某些具體實施例中，術語「螢光分子」與「螢光抑制分子」為TaqMan™分析套組(Applied Biosystems Inc.，加州，美國)的螢光分子與螢光抑制分子。TaqMan™分析套組的詳細描述請參見如，Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. (1991) 88:7276- 7280；美國專利號5,538,848、5,723,591、5,876,930，以及7,413,708皆以引用的方式將其整體併入本文。
該螢光分子的例子包括，但不限於，3-(ε-羧)-3'-乙基-5,5'-二甲基己羰花青(3-(ε-carboxypentyl)-3'-ethyl-5,5'-dimethyloxa-carbocyanine, CYA)、6-羧基螢光素(6-carboxyfluorescein, FAM)、5,6-羧基羅丹明-L LO (5,6-carboxyrhodamine-l lO, R110)、6羧基羅丹明-6G (6- carboxyrhodamine-6G, R6G)、N’,N’,N’,N’ -四甲基-6-羧基羅丹明(N’,N’,N’,N’ -tetramethyl-6-carboxyrhodamine, TAMRA)、6-羧基-X-羅丹明(6-carboxy-X-rhodamine, ROX)、2’,4’,5’,7’-四氯4-7-二氯螢光素(2’,4’,5’,7’-tetrachloro-4-7-dichlorofluorescein, TET)、2',7-二甲氧基-4',5'-6羧基羅丹明(2’,7-dimethoxy-4’,5’-6 carboxyrhodamine, JOE)、6-羧基-2',4,4',5',7,7'-六氯熒光素(6-carboxy-2’,4,4’,5’,7,7’-hexachlorofluorescein, HEX)、ALEXA螢光、Cy3螢光與Cy5螢光。該螢光抑制分子的例子包括，但不限於，4-(4'-二甲基氨基-苯偶氮基)苯甲酸(4-(4’-dimethylamino-phenylazo)-benzoic acid, Dabcyl)、黑洞螢光抑制劑1 (Black Hole Quencher 1, BHQ1)、黑洞螢光抑制劑2 (Black Hole Quencher 2, BHQ2)、黑洞螢光抑制劑3 (Black Hole Quencher 3, BHQ3)、二氫環吡咯並吲哚三肽小溝結合物(dihydro cyclo pyrrolo indole tripeptide minor groove binder, MGB)、四甲基羅丹明(tetramethylrhodamine, TAMRA)。在某些具體實施例中，該螢光分子為6-羧基螢光素(FAM)，且該螢光抑制分子為二氫環吡咯並吲哚三肽小溝結合物(MGB)。在某些具體實施例中，該螢光分子為6-羧基螢光素(FAM)，且該螢光抑制分子為黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1)或二氫環吡咯並吲哚三肽小溝結合物(MGB)。
除非本文另有定義，否則用以與本文結合的科學與技術術語應具有本領域普通技術人員通常理解的含義。此外，除非上下文另有要求，單數術語應包括複數，並且複數術語應包括單數。本發明的方法與技術一般可根據本領域已知的常規方法進行。一般而言，本文所描述之用以連結以下技術的命名法，以及生物化學、酵素學、分子及細胞生物學、微生物學、遺傳學與蛋白質及核酸化學及雜合反應的技術皆為本領域已知且經常使用者。除非另有說明，本發明的方法與技術一般可根據本領域已知的常規方法進行，且被描述於在本說明書中被引用且討論的各種一般及更具體的參考文獻中。
本發明進一步透過以下的實施例闡釋，其不應以任何方式被解釋為進一步的限縮。本申請案中引用的所有引用文件(包括參考文獻、核准的專利、公開的專利申請，以及一同在申請中的專利申請案)的整體內容，在此透過引用的方式明確地併入本案中。
實施例
實施例 1 病原體發光桿菌殺魚亞種 (P. damselae subsp. Piscicida) 的檢測
病原體發光桿菌殺魚亞種(P. damselae subsp. Piscicida)的青黴素結合蛋白1A (penicillin-binding protein 1A, Pbp-1A)基因(GenBank accession No. EU164926)的片段被插入一選殖載體中，該選殖載體可為，但不限於，pUC57、pGEM-T，以得到pPhoto質體。
1. 傳統聚合酶連鎖反應
進行傳統PCR所用的50 µl PCR混合物含有：106 個拷貝數的pPhoto質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.2 µM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一熱循環儀(例如，但不限於PC818, Astec Co. Ltd.，日本)中進行擴增反應，且包含一個變性的初始循環94o C持續3分鐘，以及35個循環的94o C 30秒、60o C 30秒以及72o C延展30秒。擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠(polyacrylamide gel)在TAE緩衝液(40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA)中分析，並且以溴化乙錠(ethidium bromide)染色顯現。
傳統PCR的結果如表1所示，各引子對擴增了各目標序列的正確大小的片段，而在負對照組中則無目標序列被擴增(結果未顯示)。該結果表明，各引子對可用於傳統PCR擴增反應以檢測發光桿菌殺魚亞種(P. damselae subsp. Piscicida)的存在。 【表1】各引子對與探針組合進行傳統PCR的結果
正向引子 反向引子 合成片段大小(bp)
Photo-F1 (SEQ ID NO: 1) Photo-R1 (SEQ ID NO: 3) 83
Photo-F1 (SEQ ID NO: 1) Photo-R2 (SEQ ID NO: 4) 76
Photo-F2 (SEQ ID NO: 2) Photo-R1 (SEQ ID NO: 3) 86
Photo-F2 (SEQ ID NO: 2) Photo-R2 (SEQ ID NO: 4) 79
Photo-OF1 (SEQ ID NO: 6) Photo-OR1 (SEQ ID NO: 7) 100
Photo-OF2 (SEQ ID NO: 9) Photo-OR2 (SEQ ID NO: 10) 100
Photo-OF3 (SEQ ID NO: 12) Photo-OR3 (SEQ ID NO: 13) 100
2. 熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)
50 µl的PCR混合物含有5 µl發光桿菌殺魚亞種的青黴素結合蛋白1A (Pbp-1A)基因的RNA (分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 拷貝數/µl)或pPhoto質體(分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數)、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))、0.2 µM dNTP、1X cPCR緩衝液，以及1-5 U Taq DNA聚合酶、1-5 U反轉錄酶。將PCR混合物加入一反應試管中，並置於一熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)儀中一段指定的時間(約30~45分鐘)。以該cPCR儀偵測每個樣本中的FAM螢光。重複上述cPCR分析試驗8次(n = 8)以評各估引子對與探針的敏感度。
敏感度測試的結果如表2所示，各引子對及探針的組合皆可100%正確偵測到樣品中含有102 拷貝數/µl的發光桿菌殺魚亞種的青黴素結合蛋白1A (Pbp-1A)基因的RNA或102 個拷貝數的pPhoto質體，其敏感度可達102 拷貝數/µl及102 個拷貝數。 【表2】各引子對與探針組合的敏感度測試結果(n = 8)
引子對及探針的組合 陽性率% 負對照組 Pbp-1A基因的RNA 含量(拷貝數/µl) pPhoto質體 含量(拷貝數)
102 103 104 105 106 102 103 104 105 106
Photo-F1 (SEQ ID NO: 1) Photo-R1 (SEQ ID NO: 3) Photo-P1 (SEQ ID NO: 5) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
Photo-F1 (SEQ ID NO: 1) Photo-R2 (SEQ ID NO: 4) Photo-P1 (SEQ ID NO: 5) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
Photo-F2 (SEQ ID NO: 2) Photo-R1 (SEQ ID NO: 3) Photo-P1 (SEQ ID NO: 5) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
Photo-F2 (SEQ ID NO: 2) Photo-R2 (SEQ ID NO: 4) Photo-P1 (SEQ ID NO: 5) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
Photo-OF1 (SEQ ID NO: 6) Photo-OR1 (SEQ ID NO: 7) Photo-OP1 (SEQ ID NO: 8) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
Photo-OF2 (SEQ ID NO: 9) Photo-OR2 (SEQ ID NO: 10) Photo-OP2 (SEQ ID NO: 11) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
Photo-OF3 (SEQ ID NO: 12) Photo-OR3 (SEQ ID NO: 13) Photo-OP3 (SEQ ID NO: 14) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
此外，以不同的魚病原體基因質體(106 拷貝數/µl)作為cPCR模板分析上述各引子對及探針組合的專一性。cPCR方法如上所述。專一性測試的結果如表3所示，各引子對及探針的組合皆可正確偵測到含有發光桿菌殺魚亞種(Photo)的樣品，而偵測不到含有羅非魚病毒(TiLV)、錦鯉疱疹病毒(KHV)、神經壞死病毒(NNV)，以及淋巴囊腫病毒(Lym)的樣品。該結果顯示各引子對及探針組合具有專一性。 【表3】各引子對與探針組合的專一性測試結果
引子對及探針的組合 Photo TiLV KHV NNV Lym
Photo-F1 (SEQ ID NO: 1) Photo-R1 (SEQ ID NO: 3) Photo-P1 (SEQ ID NO: 5) + - - - -
Photo-F1 (SEQ ID NO: 1) Photo-R2 (SEQ ID NO: 4) Photo-P1 (SEQ ID NO: 5) + - - - -
Photo-F2 (SEQ ID NO: 2) Photo-R1 (SEQ ID NO: 3) Photo-P1 (SEQ ID NO: 5) + - - - -
Photo-F2 (SEQ ID NO: 2) Photo-R2 (SEQ ID NO: 4) Photo-P1 (SEQ ID NO: 5) + - - - -
Photo-OF1 (SEQ ID NO: 6) Photo-OR1 (SEQ ID NO: 7) Photo-OP1 (SEQ ID NO: 8) + - - - -
Photo-OF2 (SEQ ID NO: 9) Photo-OR2 (SEQ ID NO: 10) Photo-OP2 (SEQ ID NO: 11) + - - - -
Photo-OF3 (SEQ ID NO: 12) Photo-OR3 (SEQ ID NO: 13) Photo-OP3 (SEQ ID NO: 14) + - - - -
“+”表示在該樣本中偵測到螢光訊號，而“-”表示在該樣本中未偵測到螢光訊號。
3. 即時聚合酶連鎖反應 (real-time PCR, qPCR)
以稀釋的pPhoto質體(分別為101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 , 107 個拷貝數)於一即時PCR儀(例如，但不限於ABI StepOnePlusTM ; Applied BioSystem, Life Technologies，加州，美國)中進行即時PCR分析。以含有2 µl pPhoto質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))，總體積為20 µl的商用RT-PCR套組(例如，但不限於，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit; Takara Bio Inc.，日本)進行即時PCR分析。即時PCR的程序為42o C 5分鐘、94o C 10秒，以及40個循環的94o C 10秒以及60o C 30分鐘。在60o C的步驟中記錄螢光測量的結果並計算。連續稀釋(10倍)的pPhoto質體的即時PCR分析的標準曲線。結果顯示，至少102 個拷貝數的pPhoto質體可被偵測到，且各引子對與探針組合的標準曲線的R2 值皆大於0.99，表示本發明的引子對與探針可以被用於即時PCR，並產生可信的結果。
上述實施例結果表明，本發明的引子對與探針可用於cPCR擴增反應以檢測發光桿菌殺魚亞種(P. damselae subsp. Piscicida)的存在，並且具有高度敏感度及專一性。
實施例 2 病原體羅非魚病毒 (TiLV) 的檢測
病原體羅非魚病毒(TiLV)的蛋白基因(GenBank accession No. KJ605629)的片段被插入一選殖載體中，該選殖載體可為，但不限於，pUC57、pGEM-T，以得到pTiLV質體。
1. 傳統聚合酶連鎖反應
進行傳統PCR所用的50 µl PCR混合物含有：106 個拷貝數的pTiLV質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.2 µM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一熱循環儀(例如，但不限於PC818, Astec Co. Ltd.，日本)中進行擴增反應，且包含一個變性的初始循環94o C持續3分鐘，以及35個循環的94o C 30秒、60o C 30秒以及72o C延展30秒。擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液(40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA)中分析，並且以溴化乙錠染色顯現。
傳統PCR的結果如表4所示，各引子對擴增了各目標序列的正確大小的片段，而在負對照組中則無目標序列被擴增(結果未顯示)。該結果表明，各引子對可用於傳統PCR擴增反應以檢測羅非魚病毒(TiLV)的存在。 【表4】各引子對與探針組合進行傳統PCR的結果
正向引子 反向引子 合成片段大小(bp)
TiLV-F1 (SEQ ID NO: 15) TiLV-R1 (SEQ ID NO: 16) 91
TiLV-F2 (SEQ ID NO: 18) TiLV-R2 (SEQ ID NO: 19) 93
TiLV-F3 (SEQ ID NO: 21) TiLV-R3 (SEQ ID NO: 22) 87
TiLV-F4 (SEQ ID NO: 24) TiLV-R4 (SEQ ID NO: 27) 92
TiLV-F5 (SEQ ID NO: 25) TiLV-R4 (SEQ ID NO: 27) 80
TiLV-F6 (SEQ ID NO: 26) TiLV-R4 (SEQ ID NO: 27) 78
TiLV-F4 (SEQ ID NO: 24) TiLV-R5 (SEQ ID NO: 28) 87
TiLV-F5 (SEQ ID NO: 25) TiLV-R5 (SEQ ID NO: 28) 75
TiLV-F6 (SEQ ID NO: 26) TiLV-R5 (SEQ ID NO: 28) 73
TiLV-F7 (SEQ ID NO: 30) TiLV-R7 (SEQ ID NO: 31) 98
2. 熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)
50 µl的PCR混合物含有5 µl羅非魚病毒(TiLV)的蛋白基因的RNA (分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 拷貝數/µl)或pTiLV質體(分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數)、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))、0.2 µM dNTP、1X cPCR緩衝液，以及1-5 U Taq DNA聚合酶、1-5 U反轉錄酶。將PCR混合物加入一反應試管中，並置於一熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)儀中一段指定的時間(約30~45分鐘)。以該cPCR儀偵測每個樣本中的FAM螢光。重複上述cPCR分析試驗8次(n = 8)以評各估引子對與探針的敏感度。
敏感度測試的結果如表5所示，各引子對及探針的組合皆可100%正確偵測到樣品中含有102 拷貝數/µl的羅非魚病毒(TiLV)的RNA或102 個拷貝數的pTiLV質體，其敏感度可達102 拷貝數/µl及102 個拷貝數。 【表5】各引子對與探針組合的敏感度測試結果(n = 8)
引子對及探針的組合 陽性率% 負對照組 羅非魚病毒(TiLV)的RNA 含量(拷貝數/µl) pTiLV質體 含量(拷貝數)
102 103 104 105 106 102 103 104 105 106
TiLV-F1 (SEQ ID NO: 15) TiLV-R1 (SEQ ID NO: 16) TiLV-P1 (SEQ ID NO: 17) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
TiLV-F2 (SEQ ID NO: 18) TiLV-R2 (SEQ ID NO: 19) TiLV-P2 (SEQ ID NO: 20) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
TiLV-F3 (SEQ ID NO: 21) TiLV-R3 (SEQ ID NO: 22) TiLV-P3 (SEQ ID NO: 23) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
TiLV-F4 (SEQ ID NO: 24) TiLV-R4 (SEQ ID NO: 27) TiLV-P4 (SEQ ID NO: 29) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
TiLV-F5 (SEQ ID NO: 25) TiLV-R4 (SEQ ID NO: 27) TiLV-P4 (SEQ ID NO: 29) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
TiLV-F6 (SEQ ID NO: 26) TiLV-R4 (SEQ ID NO: 27) TiLV-P4 (SEQ ID NO: 29) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
TiLV-F4 (SEQ ID NO: 24) TiLV-R5 (SEQ ID NO: 28) TiLV-P4 (SEQ ID NO: 29) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
TiLV-F5 (SEQ ID NO: 25) TiLV-R5 (SEQ ID NO: 28) TiLV-P4 (SEQ ID NO: 29) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
TiLV-F6 (SEQ ID NO: 26) TiLV-R5 (SEQ ID NO: 28) TiLV-P4 (SEQ ID NO: 29) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
TiLV-F7 (SEQ ID NO: 30) TiLV-R7 (SEQ ID NO: 31) TiLV-P7 (SEQ ID NO: 32) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
此外，以不同的魚病原體基因質體(106 拷貝數/µl)作為cPCR模板分析上述各引子對及探針組合的專一性。cPCR方法如上所述。專一性測試的結果如表6所示，各引子對及探針的組合皆可正確偵測到含有羅非魚病毒(TiLV)的樣品，而偵測不到含有發光桿菌殺魚亞種(Photo)、錦鯉疱疹病毒(KHV)、神經壞死病毒(NNV)，以及淋巴囊腫病毒(Lym)的樣品。該結果顯示各引子對及探針組合具有專一性。 【表6】各引子對與探針組合的專一性測試結果
引子對及探針的組合 Photo TiLV KHV NNV Lym
TiLV-F1 (SEQ ID NO: 15) TiLV-R1 (SEQ ID NO: 16) TiLV-P1 (SEQ ID NO: 17) - + - - -
TiLV-F2 (SEQ ID NO: 18) TiLV-R2 (SEQ ID NO: 19) TiLV-P2 (SEQ ID NO: 20) - + - - -
TiLV-F3 (SEQ ID NO: 21) TiLV-R3 (SEQ ID NO: 22) TiLV-P3 (SEQ ID NO: 23) - + - - -
TiLV-F4 (SEQ ID NO: 24) TiLV-R4 (SEQ ID NO: 27) TiLV-P4 (SEQ ID NO: 29) - + - - -
TiLV-F5 (SEQ ID NO: 25) TiLV-R4 (SEQ ID NO: 27) TiLV-P4 (SEQ ID NO: 29) - + - - -
TiLV-F6 (SEQ ID NO: 26) TiLV-R4 (SEQ ID NO: 27) TiLV-P4 (SEQ ID NO: 29) - + - - -
TiLV-F4 (SEQ ID NO: 24) TiLV-R5 (SEQ ID NO: 28) TiLV-P4 (SEQ ID NO: 29) - + - - -
TiLV-F5 (SEQ ID NO: 25) TiLV-R5 (SEQ ID NO: 28) TiLV-P4 (SEQ ID NO: 29) - + - - -
TiLV-F6 (SEQ ID NO: 26) TiLV-R5 (SEQ ID NO: 28) TiLV-P4 (SEQ ID NO: 29) - + - - -
TiLV-F7 (SEQ ID NO: 30) TiLV-R7 (SEQ ID NO: 31) TiLV-P7 (SEQ ID NO: 32) - + - - -
“+”表示在該樣本中偵測到螢光訊號，而“-”表示在該樣本中未偵測到螢光訊號。
3. 即時聚合酶連鎖反應 (real-time PCR, qPCR)
以稀釋的pTiLV質體(分別為101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 , 107 個拷貝數)於一即時PCR儀(例如，但不限於ABI StepOnePlusTM ; Applied BioSystem, Life Technologies，加州，美國)中進行即時PCR分析。以含有2 µl pTiLV質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))，總體積為20 µl的商用RT-PCR套組(例如，但不限於，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit; Takara Bio Inc.，日本)進行即時PCR分析。即時PCR的程序為42o C 5分鐘、94o C 10秒，以及40個循環的94o C 10秒以及60o C 30分鐘。在60o C的步驟中記錄螢光測量的結果並計算。連續稀釋(10倍)的pTiLV質體的即時PCR分析的標準曲線。結果顯示，至少10個拷貝數的pTiLV質體可被偵測到，且各引子對與探針組合的標準曲線的R2 值皆大於0.99，表示本發明的引子對與探針可以被用於即時PCR，並產生可信的結果。
上述實施例結果表明，本發明的引子對與探針可用於cPCR擴增反應以檢測羅非魚病毒(TiLV)的存在，並且具有高度敏感度及專一性。
實施例 3 病原體錦鯉疱疹病毒 ( KHV) 的檢測
病原體錦鯉疱疹病毒(KHV)的基因組(GenBank accession No. KX544848)的片段被插入一選殖載體中，該選殖載體可為，但不限於，pUC57、pGEM-T，以得到pKHV質體。
1. 傳統聚合酶連鎖反應
進行傳統PCR所用的50 µl PCR混合物含有：106 個拷貝數的pKHV質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.2 µM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一熱循環儀(例如，但不限於PC818, Astec Co. Ltd.，日本)中進行擴增反應，且包含一個變性的初始循環94o C持續3分鐘，以及35個循環的94o C 30秒、60o C 30秒以及72o C延展30秒。擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液(40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA)中分析，並且以溴化乙錠染色顯現。
傳統PCR的結果如表7所示，各引子對擴增了各目標序列的正確大小的片段，而在負對照組中則無目標序列被擴增(結果未顯示)。該結果表明，各引子對可用於傳統PCR擴增反應以檢測錦鯉疱疹病毒(KHV)的存在。 【表7】各引子對與探針組合進行傳統PCR的結果
正向引子 反向引子 合成片段大小(bp)
KHV-F1 (SEQ ID NO: 33) KHV-R1 (SEQ ID NO: 34) 87
KHV-F2 (SEQ ID NO: 36) KHV-R2 (SEQ ID NO: 37) 97
KHV-F3 (SEQ ID NO: 39) KHV-R3 (SEQ ID NO: 40) 77
KHV-F4 (SEQ ID NO: 42) KHV-R4 (SEQ ID NO: 43) 69
KHV-F5 (SEQ ID NO: 45) KHV-R5 (SEQ ID NO: 46) 86
2. 熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)
50 µl的PCR混合物含有5 µl錦鯉疱疹病毒(KHV)基因組片段的RNA (分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 拷貝數/µl)或pKHV質體(分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數)、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))、0.2 µM dNTP、1X cPCR緩衝液，以及1-5 U Taq DNA聚合酶、1-5 U反轉錄酶。將PCR混合物加入一反應試管中，並置於一熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)儀中一段指定的時間(約30~45分鐘)。以該cPCR儀偵測每個樣本中的FAM螢光。重複上述cPCR分析試驗8次(n = 8)以評各估引子對與探針的敏感度。
敏感度測試的結果如表8所示，各引子對及探針的組合皆可100%正確偵測到樣品中含有102 拷貝數/µl的錦鯉疱疹病毒(KHV)基因組片段的RNA或102 個拷貝數的pKHV質體，其敏感度可達102 拷貝數/µl及102 個拷貝數。 【表8】各引子對與探針組合的敏感度測試結果(n = 8)
引子對及探針的組合 陽性率% 負對照組 錦鯉疱疹病毒(KHV)的RNA含量(拷貝數/µl) pKHV質體 含量(拷貝數)
102 103 104 105 106 102 103 104 105 106
KHV-F1 (SEQ ID NO: 33) KHV-R1 (SEQ ID NO: 34) KHV-P1 (SEQ ID NO: 35) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
KHV-F2 (SEQ ID NO: 36) KHV-R2 (SEQ ID NO: 37) KHV-P2 (SEQ ID NO: 38) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
KHV-F3 (SEQ ID NO: 39) KHV-R3 (SEQ ID NO: 40) KHV-P3 (SEQ ID NO: 41) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
KHV-F4 (SEQ ID NO: 42) KHV-R4 (SEQ ID NO: 43) KHV-P4 (SEQ ID NO: 44) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
KHV-F5 (SEQ ID NO: 45) KHV-R5 (SEQ ID NO: 46) KHV-P5 (SEQ ID NO: 47) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
此外，以不同的魚病原體基因質體(106 拷貝數/µl)作為cPCR模板分析上述各引子對及探針組合的專一性。cPCR方法如上所述。專一性測試的結果如表9所示，各引子對及探針的組合皆可正確偵測到含有錦鯉疱疹病毒(KHV)的樣品，而偵測不到含有發光桿菌殺魚亞種(Photo)、羅非魚病毒(TiLV)、神經壞死病毒(NNV)，以及淋巴囊腫病毒(Lym)的樣品。該結果顯示各引子對及探針組合具有專一性。 【表9】各引子對與探針組合的專一性測試結果
引子對及探針的組合 Photo TiLV KHV NNV Lym
KHV-F1 (SEQ ID NO: 33) KHV-R1 (SEQ ID NO: 34) KHV-P1 (SEQ ID NO: 35) - - + - -
KHV-F2 (SEQ ID NO: 36) KHV-R2 (SEQ ID NO: 37) KHV-P2 (SEQ ID NO: 38) - - + - -
KHV-F3 (SEQ ID NO: 39) KHV-R3 (SEQ ID NO: 40) KHV-P3 (SEQ ID NO: 41) - - + - -
KHV-F4 (SEQ ID NO: 42) KHV-R4 (SEQ ID NO: 43) KHV-P4 (SEQ ID NO: 44) - - + - -
KHV-F5 (SEQ ID NO: 45) KHV-R5 (SEQ ID NO: 46) KHV-P5 (SEQ ID NO: 47) - - + - -
“+”表示在該樣本中偵測到螢光訊號，而“-”表示在該樣本中未偵測到螢光訊號。
3. 即時聚合酶連鎖反應 (real-time PCR, qPCR)
以稀釋的pKHV質體(分別為101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 , 107 個拷貝數)於一即時PCR儀(例如，但不限於ABI StepOnePlusTM ; Applied BioSystem, Life Technologies，加州，美國)中進行即時PCR分析。以含有2 µl pKHV質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))，總體積為20 µl的商用RT-PCR套組(例如，但不限於，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit; Takara Bio Inc.，日本)進行即時PCR分析。即時PCR的程序為42o C 5分鐘、94o C 10秒，以及40個循環的94o C 10秒以及60o C 30分鐘。在60o C的步驟中記錄螢光測量的結果並計算。連續稀釋(10倍)的pKHV質體的即時PCR分析的標準曲線。結果顯示，至少102 個拷貝數的pKHV質體可被偵測到，且各引子對與探針組合的標準曲線的R2 值皆大於0.99，表示本發明的引子對與探針可以被用於即時PCR，並產生可信的結果。
上述實施例結果表明，本發明的引子對與探針可用於cPCR擴增反應以檢測錦鯉疱疹病毒(KHV)的存在，並且具有高度敏感度及專一性。
實施例 4 病原體神經壞死病毒 (NNV) 的檢測
病原體神經壞死病毒(NNV)的衣殼蛋白(capsid protein)基因(GenBank accession No. MF565445)的片段被插入一選殖載體中，該選殖載體可為，但不限於，pUC57、pGEM-T，以得到pNNV質體。
1. 傳統聚合酶連鎖反應
進行傳統PCR所用的50 µl PCR混合物含有：106 個拷貝數的pNNV質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.2 µM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一熱循環儀(例如，但不限於PC818, Astec Co. Ltd.，日本)中進行擴增反應，且包含一個變性的初始循環94o C持續3分鐘，以及35個循環的94o C 30秒、60o C 30秒以及72o C延展30秒。擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液(40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA)中分析，並且以溴化乙錠染色顯現。
傳統PCR的結果如表10所示，各引子對擴增了各目標序列的正確大小的片段，而在負對照組中則無目標序列被擴增(結果未顯示)。該結果表明，各引子對可用於傳統PCR擴增反應以檢測神經壞死病毒(NNV)的存在。 【表10】各引子對與探針組合進行傳統PCR的結果
正向引子 反向引子 合成片段大小(bp)
NNV-F1 (SEQ ID NO: 48) NNV-R1 (SEQ ID NO: 49) 86
NNV-F2 (SEQ ID NO: 52) NNV-R2 (SEQ ID NO: 53) 89
NNV-F2 (SEQ ID NO: 52) NNV-R3 (SEQ ID NO: 54) 94
NNV-F4 (SEQ ID NO: 55) NNV-R4 (SEQ ID NO: 56) 91
NNV-F5 (SEQ ID NO: 58) NNV-R5 (SEQ ID NO: 59) 84
NNV-F6 (SEQ ID NO: 61) NNV-R5 (SEQ ID NO: 59) 86
NNV-F6 (SEQ ID NO: 61) NNV-R6 (SEQ ID NO: 62) 102
NNV-F7 (SEQ ID NO: 63) NNV-R7 (SEQ ID NO: 64) 111
NNV-F7 (SEQ ID NO: 63) NNV-R8 (SEQ ID NO: 67) 111
NNV-F7 (SEQ ID NO: 63) NNV-R9 (SEQ ID NO: 68) 69
NNV-F8 (SEQ ID NO: 66) NNV-R8 (SEQ ID NO: 67) 103
NNV-F8 (SEQ ID NO: 66) NNV-R9 (SEQ ID NO: 68) 61
NNV-F10 (SEQ ID NO: 70) NNV-R10 (SEQ ID NO: 71) 59
2. 熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)
50 µl的PCR混合物含有5 µl神經壞死病毒(NNV)的衣殼蛋白基因的RNA (分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 拷貝數/µl)或pNNV質體(分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數)、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))、0.2 µM dNTP、1X cPCR緩衝液，以及1-5 U Taq DNA聚合酶、1-5 U反轉錄酶。將PCR混合物加入一反應試管中，並置於一熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)儀中一段指定的時間(約30~45分鐘)。以該cPCR儀偵測每個樣本中的FAM螢光。重複上述cPCR分析試驗8次(n = 8)以評各估引子對與探針的敏感度。
敏感度測試的結果如表11所示，各引子對及探針的組合皆可100%正確偵測到樣品中含有102 拷貝數/µl的神經壞死病毒(NNV)的衣殼蛋白基因的RNA或102 個拷貝數的pNNV質體，其敏感度可達102 拷貝數/µl及102 個拷貝數。 【表11】各引子對與探針組合的敏感度測試結果(n = 8)
引子對及探針的組合 陽性率% 負對照組 NNV衣殼蛋白基因的RNA含量(拷貝數/µl) pNNV質體 含量(拷貝數)
102 103 104 105 106 102 103 104 105 106
NNV-F1 (SEQ ID NO: 48) NNV-R1 (SEQ ID NO: 49) NNV-P1 (SEQ ID NO: 50) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
NNV-F1 (SEQ ID NO: 48) NNV-R1 (SEQ ID NO: 49) NNV-P2 (SEQ ID NO: 51) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
NNV-F2 (SEQ ID NO: 52) NNV-R2 (SEQ ID NO: 53) NNV-P2 (SEQ ID NO: 51) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
NNV-F2 (SEQ ID NO: 52) NNV-R3 (SEQ ID NO: 54) NNV-P2 (SEQ ID NO: 51) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
NNV-F4 (SEQ ID NO: 55) NNV-R4 (SEQ ID NO: 56) NNV-P4 (SEQ ID NO: 57) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
NNV-F5 (SEQ ID NO: 58) NNV-R5 (SEQ ID NO: 59) NNV-P5 (SEQ ID NO: 60) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
NNV-F6 (SEQ ID NO: 61) NNV-R5 (SEQ ID NO: 59) NNV-P5 (SEQ ID NO: 60) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
NNV-F6 (SEQ ID NO: 61) NNV-R6 (SEQ ID NO: 62) NNV-P5 (SEQ ID NO: 60) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
NNV-F7 (SEQ ID NO: 63) NNV-R7 (SEQ ID NO: 64) NNV-P7 (SEQ ID NO: 65) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
NNV-F7 (SEQ ID NO: 63) NNV-R8 (SEQ ID NO: 67) NNV-P7 (SEQ ID NO: 65) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
NNV-F7 (SEQ ID NO: 63) NNV-R9 (SEQ ID NO: 68) NNV-P7 (SEQ ID NO: 65) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
NNV-F8 (SEQ ID NO: 66) NNV-R8 (SEQ ID NO: 67) NNV-P7 (SEQ ID NO: 65) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
NNV-F8 (SEQ ID NO: 66) NNV-R9 (SEQ ID NO: 68) NNV-P7 (SEQ ID NO: 65) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
NNV-F7 (SEQ ID NO: 63) NNV-R7 (SEQ ID NO: 64) NNV-P8 (SEQ ID NO: 69) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
NNV-F7 (SEQ ID NO: 63) NNV-R8 (SEQ ID NO: 67) NNV-P8 (SEQ ID NO: 69) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
NNV-F10 (SEQ ID NO: 70) NNV-R10 (SEQ ID NO: 71) NNV-P10 (SEQ ID NO: 72) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
此外，以不同的魚病原體基因質體(106 拷貝數/µl)作為cPCR模板分析上述各引子對及探針組合的專一性。cPCR方法如上所述。專一性測試的結果如表12所示，各引子對及探針的組合皆可正確偵測到含有神經壞死病毒(NNV)的樣品，而偵測不到含有發光桿菌殺魚亞種(Photo)、羅非魚病毒(TiLV)、錦鯉疱疹病毒(KHV)，以及淋巴囊腫病毒(Lym)的樣品。該結果顯示各引子對及探針組合具有專一性。 【表12】各引子對與探針組合的專一性測試結果
引子對及探針的組合 Photo TiLV KHV NNV Lym
NNV-F1 (SEQ ID NO: 48) NNV-R1 (SEQ ID NO: 49) NNV-P1 (SEQ ID NO: 50) - - - + -
NNV-F1 (SEQ ID NO: 48) NNV-R1 (SEQ ID NO: 49) NNV-P2 (SEQ ID NO: 51) - - - + -
NNV-F2 (SEQ ID NO: 52) NNV-R2 (SEQ ID NO: 53) NNV-P2 (SEQ ID NO: 51) - - - + -
NNV-F2 (SEQ ID NO: 52) NNV-R3 (SEQ ID NO: 54) NNV-P2 (SEQ ID NO: 51) - - - + -
NNV-F4 (SEQ ID NO: 55) NNV-R4 (SEQ ID NO: 56) NNV-P4 (SEQ ID NO: 57) - - - + -
NNV-F5 (SEQ ID NO: 58) NNV-R5 (SEQ ID NO: 59) NNV-P5 (SEQ ID NO: 60) - - - + -
NNV-F6 (SEQ ID NO: 61) NNV-R5 (SEQ ID NO: 59) NNV-P5 (SEQ ID NO: 60) - - - + -
NNV-F6 (SEQ ID NO: 61) NNV-R6 (SEQ ID NO: 62) NNV-P5 (SEQ ID NO: 60) - - - + -
NNV-F7 (SEQ ID NO: 63) NNV-R7 (SEQ ID NO: 64) NNV-P7 (SEQ ID NO: 65) - - - + -
NNV-F7 (SEQ ID NO: 63) NNV-R8 (SEQ ID NO: 67) NNV-P7 (SEQ ID NO: 65) - - - + -
NNV-F7 (SEQ ID NO: 63) NNV-R9 (SEQ ID NO: 68) NNV-P7 (SEQ ID NO: 65) - - - + -
NNV-F8 (SEQ ID NO: 66) NNV-R8 (SEQ ID NO: 67) NNV-P7 (SEQ ID NO: 65) - - - + -
NNV-F8 (SEQ ID NO: 66) NNV-R9 (SEQ ID NO: 68) NNV-P7 (SEQ ID NO: 65) - - - + -
NNV-F7 (SEQ ID NO: 63) NNV-R7 (SEQ ID NO: 64) NNV-P8 (SEQ ID NO: 69) - - - + -
NNV-F7 (SEQ ID NO: 63) NNV-R8 (SEQ ID NO: 67) NNV-P8 (SEQ ID NO: 69) - - - + -
NNV-F10 (SEQ ID NO: 70) NNV-R10 (SEQ ID NO: 71) NNV-P10 (SEQ ID NO: 72) - - - + -
“+”表示在該樣本中偵測到螢光訊號，而“-”表示在該樣本中未偵測到螢光訊號。
3. 即時聚合酶連鎖反應 (real-time PCR, qPCR)
以稀釋的pNNV質體(分別為101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 , 107 個拷貝數)於一即時PCR儀(例如，但不限於ABI StepOnePlusTM ; Applied BioSystem, Life Technologies，加州，美國)中進行即時PCR分析。以含有2 µl pNNV質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))，總體積為20 µl的商用RT-PCR套組(例如，但不限於，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit; Takara Bio Inc.，日本)進行即時PCR分析。即時PCR的程序為42o C 5分鐘、94o C 10秒，以及40個循環的94o C 10秒以及60o C 30分鐘。在60o C的步驟中記錄螢光測量的結果並計算。連續稀釋(10倍)的pNNV質體的即時PCR分析的標準曲線。結果顯示，至少102 個拷貝數的pNNV質體可被偵測到，且各引子對與探針組合的標準曲線的R2 值皆大於0.99，表示本發明的引子對與探針可以被用於即時PCR，並產生可信的結果。
上述實施例結果表明，本發明的引子對與探針可用於cPCR擴增反應以檢測神經壞死病毒(NNV)的存在，並且具有高度敏感度及專一性。
實施例 5 病原體淋巴囊腫病毒 (Lymphocystis virus) 的檢測
病原體淋巴囊腫病毒(Lymphocystis virus)的主要衣殼蛋白(major capsid protein, MCP)基因(GenBank accession No. HE650106)的片段被插入一選殖載體中，該選殖載體可為，但不限於，pUC57、pGEM-T，以得到pLym質體。
1. 傳統聚合酶連鎖反應
進行傳統PCR所用的50 µl PCR混合物含有：106 個拷貝數的pLym質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.2 µM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一熱循環儀(例如，但不限於PC818, Astec Co. Ltd.，日本)中進行擴增反應，且包含一個變性的初始循環94o C持續3分鐘，以及35個循環的94o C 30秒、60o C 30秒以及72o C延展30秒。擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液(40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA)中分析，並且以溴化乙錠染色顯現。
傳統PCR的結果如表13所示，各引子對擴增了各目標序列的正確大小的片段，而在負對照組中則無目標序列被擴增(結果未顯示)。該結果表明，各引子對可用於傳統PCR擴增反應以檢測淋巴囊腫病毒的存在。 【表13】各引子對與探針組合進行傳統PCR的結果
正向引子 反向引子 合成片段大小(bp)
Lym-OF1 (SEQ ID NO: 73) Lym-OR1 (SEQ ID NO: 74) 83
Lym-OF2 (SEQ ID NO: 76) Lym-OR2 (SEQ ID NO: 77) 85
Lym-F1 (SEQ ID NO: 79) Lym-R1 (SEQ ID NO: 80) 171
2. 熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)
50 µl的PCR混合物含有5 µl淋巴囊腫病毒的主要衣殼蛋白(MCP)基因的RNA (分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 拷貝數/µl)或pLym質體(分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數)、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))、0.2 µM dNTP、1X cPCR緩衝液，以及1-5 U Taq DNA聚合酶、1-5 U反轉錄酶。將PCR混合物加入一反應試管中，並置於一熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)儀中一段指定的時間(約30~45分鐘)。以該cPCR儀偵測每個樣本中的FAM螢光。重複上述cPCR分析試驗8次(n = 8)以評各估引子對與探針的敏感度。
敏感度測試的結果如表14所示，各引子對及探針的組合皆可100%正確偵測到樣品中含有102 拷貝數/µl的淋巴囊腫病毒的主要衣殼蛋白(MCP)基因的RNA或102 個拷貝數的pLym質體，其敏感度可達102 拷貝數/µl及102 個拷貝數。 【表14】各引子對與探針組合的敏感度測試結果(n = 8)
引子對及探針的組合 陽性率% 負對照組 淋巴囊腫病毒的MCP基因的RNA含量(拷貝數/µl) pLym質體 含量(拷貝數)
102 103 104 105 106 102 103 104 105 106
Lym-OF1 (SEQ ID NO: 73) Lym-OR1 (SEQ ID NO: 74) Lym-OP1 (SEQ ID NO: 75) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
Lym-OF2 (SEQ ID NO: 76) Lym-OR2 (SEQ ID NO: 77) Lym-OP2 (SEQ ID NO: 78) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
Lym-F1 (SEQ ID NO: 79) Lym-R1 (SEQ ID NO: 80) Lym-P1 (SEQ ID NO: 81) 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
此外，以不同的魚病原體基因質體(106 拷貝數/µl)作為cPCR模板分析上述各引子對及探針組合的專一性。cPCR方法如上所述。專一性測試的結果如表15所示，各引子對及探針的組合皆可正確偵測到含有淋巴囊腫病毒(Lym)的樣品，而偵測不到含有發光桿菌殺魚亞種(Photo)、羅非魚病毒(TiLV)、錦鯉疱疹病毒(KHV) ，以及神經壞死病毒(NNV)的樣品。該結果顯示各引子對及探針組合具有專一性。 【表15】各引子對與探針組合的專一性測試結果
引子對及探針的組合 Photo TiLV KHV NNV Lym
Lym-OF1 (SEQ ID NO: 73) Lym-OR1 (SEQ ID NO: 74) Lym-OP1 (SEQ ID NO: 75) - - - - +
Lym-OF2 (SEQ ID NO: 76) Lym-OR2 (SEQ ID NO: 77) Lym-OP2 (SEQ ID NO: 78) - - - - +
Lym-F1 (SEQ ID NO: 79) Lym-R1 (SEQ ID NO: 80) Lym-P1 (SEQ ID NO: 81) - - - - +
“+”表示在該樣本中偵測到螢光訊號，而“-”表示在該樣本中未偵測到螢光訊號。
3. 即時聚合酶連鎖反應 (real-time PCR, qPCR)
以稀釋的pLym質體(分別為101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 , 107 個拷貝數)於一即時PCR儀(例如，但不限於ABI StepOnePlusTM ; Applied BioSystem, Life Technologies，加州，美國)中進行即時PCR分析。以含有2 µl pLym質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))，總體積為20 µl的商用RT-PCR套組(例如，但不限於，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit; Takara Bio Inc.，日本)進行即時PCR分析。即時PCR的程序為42o C 5分鐘、94o C 10秒，以及40個循環的94o C 10秒以及60o C 30分鐘。在60o C的步驟中記錄螢光測量的結果並計算。連續稀釋(10倍)的pLym質體的即時PCR分析的標準曲線。結果顯示，至少102 個拷貝數的pLym質體可被偵測到，且各引子對與探針組合的標準曲線的R2 值皆大於0.99，表示本發明的引子對與探針可以被用於即時PCR，並產生可信的結果。
上述實施例結果表明，本發明的引子對與探針可用於cPCR擴增反應以檢測淋巴囊腫病毒的存在，並且具有高度敏感度及專一性。
上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。
綜上所述，本案所揭露之技術特徵已充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請　貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明，至感德便。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
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Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014

Claims (1)

  1. 一種用於偵測羅非魚病毒(Tilapia Lake Virus,TiLV)的寡核苷酸對，包含一第一引子與一第二引子，該第一引子與該第二引子的序列組合選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO：15與SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18與SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21與SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24與SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：25與SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：26與SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：24與SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：25與SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：26與SEQ ID NO：28，以及SEQ ID NO：30與SEQ ID NO：31；以及一寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針具有一寡核苷酸探針序列、一附加於該寡核苷酸探針上的一第一位置的螢光分子，以及一附加於該寡核苷酸探針上的一第二位置的螢光抑制分子，其中該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO：15與SEQ ID NO：16時，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO：17所示；該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO：18與SEQ ID NO：19時，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO：20所示；該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO：21與SEQ ID NO：22時，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO：23所示；該第一引子與該第二引子的序列組合選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO：24與SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：25與SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：26與SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：24與 SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：25與SEQ ID NO：28，以及SEQ ID NO：26與SEQ ID NO：28時，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO：29所示；以及該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO：30與SEQ ID NO：31時，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO：32所示。
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