BRPI0714538A2 - Sequências de primers de diagnóstico de ihhnv isolada, par de diferentes sequências de primers de diagnóstico de ihhnv, kit de detecção de ihhnv, métodos de detecção da presença de ihhnv em amostras e método de determinação da qualidade de ihhnv em uma amostra - Google Patents

Description

"SEQÜÊNCIAS DE PRIMERS DE DIAGNÓSTICO DE IHHNV ISOLADA, PAR DE DIFERENTES SEQÜÊNCIAS DE PRIMERS DE DIAGNÓSTICO DE IHHNV, KIT DE DETECÇÃO DE IHHNV, MÉTODOS DE DETECÇÃO DA PRESENÇA DE IHHNV EM AMOSTRAS E MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DA QUANTIDADE DE IHHNV EM UMA AMOSTRA"

Referência Cruzada a Pedido Relacionado O presente pedido reivindica prioridade com base em 35 USC § 119 do Pedido Provisório Norte americano com número de série 60/839.865, depositado em 24 de agosto de 2006. Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao campo de testes de diagnóstico. Mais especificamente, foram desenvolvidos novos primers para uso na detecção do patógeno de Vírus da Necrose Hipodérmica e Hematopoiética Infecciosa de camarão. Antecedentes da Invenção

Fazendas comerciais de camarão sofrem extensas perdas devido aos efeitos de uma série de patógenos comuns. O Vírus da Necrose Hipodérmica e Hematopoiética Infecciosa (IHHNV) é um dos patógenos virais mais sérios de camarões penaeídeos criados em fazendas. Ele é amplamente distribuído em muitos países e possui uma grande variedade de hospedeiros. IHHNV causa mortalidade em massa, por exemplo, entre o camarão azul do oeste (Penaeus stylirostrís) e deformação severa no camarão branco do Pacífico (Penaeus vannamei). IHHNV é um parvovírus que contém DNA de fita única, cujo genoma completo foi sequenciado (Bonami et al, J. Gen. Virology 71 (Pt 11): 657-2664 (1990); GenBank AF218266).

IHHNV é extremamente prejudicial para a indústria de criação de camarão e é responsável por epidemias catastróficas em todo o mundo. A detecção de IHHNV em uma ninhada em eclosão e pós-larvas permite a eliminação do camarão infectado antes da entrada em um sistema de produção comercial. Consequentemente, foi desenvolvida uma série de métodos de detecção de IHHNV em camarão, incluindo métodos com base em ácidos nucléicos e métodos imunológicos (Lightner et al, Aquaculture 164 (1): 201-220 (1998)). Métodos de amplificação de ácidos nucléicos, tais como reação em cadeia de polimerase (PCR) e amplificação isotérmica, são de interesse específico porque são simples, rápidos e sensíveis. Foram descritos métodos de PCR para detecção de IHHNV, que se baseiam na amplificação de diferentes regiões de diagnóstico do genoma (vide, por exemplo, Nunan et al, Mar. Biotechnol. 2 (4): 319-328 (2000); Yue et al, J. AOAC International 89 (1): 240-244 (2006); Tang et al, Dis. Aquat. Org. 44 (2): 79-85 (2001); Hu et al, CN 1410549; e Dhar et al, J. Clin Microbioi 39 (8): 2835-2845 (2001)). Além disso, um método isotérmico mediado por circuito de detecção de IHHNV é descrito por Sun et al (J. Virol Methods 131 (1): 41-46 (2006)). Todos os métodos acima são úteis para a detecção de IHHNV;

geralmente eles sofrem, entretanto, de falta de especificidade, sensibilidade ou são complexos e demorados. Além disso, devido à alta velocidade de mutação genética no vírus, seriam úteis testes dirigidos a regiões diferentes do genoma. Existe, portanto, a necessidade de um teste altamente sensível para IHHNV que seja rápido, preciso e facilmente utilizado no campo. O problema indicado é abordado no presente pela descoberta de primers com base em novas partes do genoma de IHHNV. Os primers identificados no presente podem ser utilizados em métodos de teste de hibridização de ácidos nucléicos ou amplificação direta por primers para a detecção de IHHNV sem os problemas associados a metodologias anteriores.

Descrição Resumida da Invenção Em uma realização, a presente invenção fornece uma seqüência de primer de diagnóstico de IHHNV isolado conforme descrito em qualquer dentre SEQ ID N0 1 a 8 ou uma molécula de ácido nucléico isolada que é completamente complementar a SEQ ID N0 1 a 8.

Em uma outra realização, a presente invenção fornece um par de seqüências de primers de diagnóstico de IHHNV diferentes conforme descrito no presente, em que o par é capaz de servir de primer para uma reação de amplificação de ácido nucléico que amplifica uma região de ácido nucléico no genoma de IHHNV.

Em uma outra realização, a presente invenção fornece um kit de detecção de IHHNV que compreende pelo menos um par de seqüências de primer de diagnóstico de IHHNV descritas no presente.

Em uma outra realização, a presente invenção fornece um método de detecção da presença de IHHNV em uma amostra que compreende:

(i) fornecimento de DNA de uma amostra suspeita de conter o

IHHNV; e

(ii) sondagem do DNA com uma sonda derivada da seqüência de primer de diagnóstico de IHHNV isolada de qualquer dentre SEQ ID N0 1 a 8 sob condições de hibridização apropriadas;

em que a identificação de um fragmento de ácido nucléico hibridizável confirma a presença de IHHNV.

Em outras realizações, os métodos de detecção identificam amostras de DNA que não são infectadas com IHHNV.

Em uma outra realização, a presente invenção fornece um método de detecção da presença de IHHNV em amostras que compreende: (i) fornecimento de DNA de uma amostra suspeita de conter

IHHNV; e

(ii) amplificação do DNA com pelo menos um par de seqüências de primers de diagnóstico de IHHNV descritas no presente, de tal forma que sejam gerados produtos de amplificação;

em que a presença de produtos de amplificação confirma a

presença de IHHNV.

Em uma outra realização, a presente invenção fornece um método de avaliação da quantidade de IHHNV em amostras, que compreende:

(i) fornecimento de DNA de uma amostra suspeita de conter

IHHNV;

(ii) amplificação do DNA com pelo menos um par de seqüências de primers de diagnóstico de IHHNV descritas no presente por

meio de ciclização térmica entre pelo menos uma temperatura de desnaturação e uma temperatura de extensão na presença de um agente fluorescente de união de ácido nucléico ou uma sonda marcada de forma fluorescente;

(iii) medição da quantidade de fluorescência gerada pelo agente fluorescente de união de ácido nucléico ou pela sonda marcada de

forma fluorescente durante a ciclização térmica;

(iv) determinação de um número limite de ciclo em que a quantidade de fluorescência gerada pela molécula fluorescente que une ácido nucléico ou pela sonda marcada de forma fluorescente atinge um valor limite fixo acima de um valor de linha base; e

(v) cálculo da quantidade de IHHNV na amostra por meio de

comparação do número limite de ciclos determinado para o IHHNV na amostra com uma curva padrão do número limite de ciclos com o Iogaritmo da concentração de modelo determinada utilizando soluções padrão com concentração conhecida.

Breve Descrição da Figura ε Descrições de Seqüências

As várias realizações da presente invenção podem ser compreendidas mais completamente a partir da descrição detalhada a seguir, da figura e das descrições de seqüências anexas, que fazem parte do presente pedido.

A Figura 1A exibe a curva de fusão do produto IHHNV4 e do produto controle de amostra interna de actina formado por meio de amplificação por PCR simultânea do DNA de vírus IHHNV e DNA de actina, conforme descrito no Exemplo 10. Os valores de temperatura de fusão (Tm) do IHHNV e produtos de actina são indicados nas suas curvas de fusão

correspondentes.

A Figura 1B exibe os resultados da separação por eletroforese de gel de agarose de amostras que contêm o produto IHHNV4 e o produto controle de amostra interna de actina formado por meio de amplificação por PCR simultânea do DNA de vírus IHHNV e DNA de actina, conforme descrito no Exemplo 10. A quantidade de IHHNV e DNA de camarão é exibida acima de cada linha; "M" é uma cadeia de DNA com 100 bp.

As seqüências a seguir estão de acordo com 37 C. F. R. 1.821- 1.825 (Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures - The Sequenee Rules) e são consistentes com o Padrão ST.25 (1998) da Organização Mundial da Propriedade Intelectual (OMPI) e as exigências de listagens de seqüências do EPO e PCT (Regras 5.2 e 49.5 (a-bis) e Capítulo 208 e Anexo C das Instruções Administrativas). Os símbolos e o formato utilizados para dados de seqüências de aminoácidos e nucleotídeos atendem às regras descritas em 37 C. F. R. § 1.822.

SEQ ID N0 1 a 8 são as seqüências de nucleotídeos de primers de diagnóstico de IHHNV úteis para detecção de IHHNV. SEQ ID N0 9 a 12 são as seqüências de nucleotídeos de modelos

de IHHNV sintéticos descritos no capítulo Métodos Gerais dos Exemplos. Estas seqüências também são as seqüências de nucleotídeos de produtos de amplificação obtidos utilizando pares de primers de diagnóstico de IHHNV descritos no presente.

SEQ ID N0 13 a 16 são as seqüências de nucleotídeos de primers de controle de amostras internas descritos no Exemplo 10.

SEQ ID N0 17 e 18 são as seqüências de nucleotídeos das sondas marcadas de forma fluorescente.

Descrição Detalhada da Invenção

São descritos no presente primers úteis em testes de detecção de vírus da necrose hipodérmica e hematopoiética infecciosa (IHHNV). Os primers podem ser utilizados em métodos de amplificação de ácidos nucléicos, bem como em testes de hibridização para detecção eficiente e quantificação de vírus da necrose hipodérmica e hematopoiética infecciosa.

No presente relatório descritivo, é utilizada uma série de termos e abreviações. São fornecidas as definições a seguir, que deverão ser consultadas para interpretação das reivindicações e do relatório descritivo. "Reação em cadeia de polimerase" é abreviada PCR.

"Vírus da Necrose Hipodérmica e Hematopoiética Infecciosa" é

abreviado IHHNV.

A expressão "seqüência de primers de diagnóstico de IHHNV isolada" indica uma seqüência correspondente a uma parte do genoma de IHHNV que é diagnóstico para determinar a presença de IHHNV.

Da forma utilizada no presente, um "fragmento de ácido nucléico isolado" é um polímero de RNA ou DNA que possui fita simples ou dupla, contendo opcionalmente bases de nucleotídeos sintéticas, não naturais ou alteradas. Um fragmento de ácido nucléico isolado na forma de polímero de DNA pode ser composto de um ou mais segmentos de cDNA, DNA genômico ou DNA sintético.

A expressão "produto de amplificação" ou "amplicon" designa o fragmento de ácido nucléico que é produzido durante uma reação de amplificação dirigida por primer. Métodos típicos de amplificação dirigida por primer incluem reação em cadeia de polimerase (PCR), reação em cadeia de Iigase (LCR)1 amplificação por deslocamento de fita (SDA) ou outros processos de amplificação isotérmica. Caso seja selecionada metodologia de PCR, a composição de reprodução tipicamente incluiria, por exemplo: trifosfatos de deoxinucleotídeos, dois primers com seqüências apropriadas, uma polimerase de DNA termoestável e proteínas. Estes reagentes e detalhes descrevendo os procedimentos de sua utilização na amplificação de ácidos nucléicos são fornecidos na Patente Norte americana n° 4.683.202 (1987, Mullis et al) e na Patente Norte americana n° 4.683.195 (1986, Mullis et al). Caso seja selecionada metodologia de LCR, as composições de reprodução de ácidos nucléicos compreenderiam, por exemplo, uma Iigase termoestável (tal como Iigase de T. aquaticus), dois conjuntos de oligonucleotídeos adjacentes (em que um membro de cada conjunto é complementar a cada uma das fitas alvo), tampão Tris-HCI, KCI, EDTA, NAD, ditiotreitol e DNA de esperma de salmão (vide, por exemplo, Tabor et al, Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A, 82: 1074-1078 (1985)).

O termo "primer" designa um oligonucleotídeo (sintético ou de ocorrência natural) que é capaz de agir como ponto de início de síntese de ácido nucléico ou reprodução ao longo de uma fita complementar quando colocado sob condições em que a síntese de uma fita complementar é catalisada por uma polimerase.

A expressão "ciclização térmica" designa o padrão completo de alteração de temperatura utilizado durante certos métodos de amplificação de ácidos nucléicos, tais como PCR e LCR. Este processo é comum e bem conhecido na técnica. Vide, por exemplo, Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1989); Patente Norteamericana n° 4.683.202 de Mullis et al e Patente Norte americana n° 4.683.195 de Mullis et al. Geralmente, ciclização térmica por PCR inclui uma etapa de desnaturação inicial sob alta temperatura, seguida por uma série repetitiva de ciclos de temperatura projetada para permitir desnaturação de modelos, combinação de primers e extensão dos primers combinados pela polimerase.

A expressão "número limite de ciclos", também indicada no presente como "CT", designa o número de ciclos durante a ciclização térmica em que a quantidade de fluorescência devido à formação de produto atinge um valor limite fixo acima de um valor de linha base.

O termo "sonda" indica um oligonucleotídeo (sintético ou de ocorrência natural) que é significativamente complementar a uma seqüência alvo, também denominada no presente "fragmento" (ou seja, a seqüência a ser detectada ou uma parte da seqüência a ser detectada), e forma uma estrutura em duplex por meio de hibridização com pelo menos uma fita da seqüência alvo. A sonda pode ser marcada para facilitar a detecção utilizando, por exemplo, uma marca fluorescente ou uma marca ligante.

A expressão "porção inibidora de reprodução" indica qualquer átomo, molécula ou grupo químico que seja ligado ao grupo hidroxila 3' terminal de um oligonucleotídeo que bloqueará o início da extensão de cadeia para reprodução de uma fita de ácido nucléico. Exemplos incluem, mas sem limitar-se a 3' deoxinucleotídeos (tais como cordicepina), dideoxinucleotídeos, fosfato, Iigantes (tais como biotina e dinitrofenol), moléculas relatoras (tais como fluoresceína e rodamina), cadeias de carbono (tais como propanol), um polinucleotídeo ou nucleotídeo não coincidente ou unidades de ácido nucléico de peptídeos.

A expressão "não participador" designa a falta de participação de uma sonda ou primer em uma reação de amplificação de uma molécula de ácido nucléico. Especificamente, um primer ou sonda não participadora é aquela que não servirá de substrato para uma polimerase de DNA nem será estendida por ela. Uma "sonda não participadora" é inerentemente incapaz de ter sua cadeia estendida por uma polimerase. Ela pode ou não possuir uma

porção inibidora da reprodução.

Uma molécula de ácido nucléico é "hibridizável" em uma outra molécula de ácido nucléico, tal como cDNA, DNA genômico ou RNA, quando uma forma de fita única da molécula de ácido nucléico pode combinar-se com a outra molécula de ácido nucléico sob condições apropriadas de temperatura e resistência iônica da solução. As condições de hibridização e lavagem são bem conhecidas e exemplificadas em Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1989), particularmente seu Capítulo 11 e Tabela 11.1 (integralmente incorporados ao presente como referência). As condições de temperatura e resistência iônica determinam a "estringência" da hibridização. Para seleção preliminar de ácidos nucléicos homólogos, condições de hibridização sob baixa estringência, correspondentes a uma temperatura de fusão (Tm) de 55 0C, podem ser utilizadas, tais como 5X SSC, 0,1% SDS, 0,25% leite e nenhuma formamida; ou 30% formamida, 5X SSC, 0,5% SDS. Condições de hibridização sob estringência moderada correspondem a uma Tm mais alta, tal como 40% de formamida, com 5X ou 6X SSC. A hibridização necessita que os dois ácidos nucléicos contenham seqüências complementares, embora, dependendo da estringência da hibridização, sejam possíveis falhas de coincidência entre bases. A estringência apropriada para hibridização de ácidos nucléicos depende do comprimento dos ácidos nucléicos e do grau de complementação, variáveis bem conhecidas na técnica. Quanto maior o grau de similaridade ou homologia entre duas seqüências de nucleotídeos, maior o valor de Tm para híbridos de ácidos nucléicos que contenham essas seqüências. A estabilidade relativa (correspondente a Tm mais alta) de hibridizações de ácido nucléico é reduzida na ordem a seguir: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Para híbridos com mais de cem nucleotídeos de comprimento, foram derivadas equações para o cálculo de Tm (vide Sambrook et al, acima, 9.50-9.51). Para hibridizações com ácidos nucléicos mais curtos, ou seja, oligonucleotídeos, a posição de falhas de coincidência torna-se mais importante e o comprimento do oligonucleotídeo determina a sua especificidade (vide Sambrook et al, acima, 11.7-11.8). Em uma realização, o comprimento de um ácido nucléico hibridizável é de pelo menos cerca de dez nucleotídeos. Preferencialmente, um comprimento mínimo para um ácido nucléico hibridizável é de pelo menos cerca de quinze nucleotídeos; de maior preferência, pelo menos cerca de vinte nucleotídeos; e, de preferência superior, o comprimento é de pelo menos trinta nucleotídeos. Além disso, os técnicos no assunto reconhecerão que a temperatura e a concentração de sais da solução de lavagem podem ser ajustadas conforme o necessário, de acordo com fatores tais como o comprimento da sonda.

"Gene" indica um fragmento de ácido nucléico que expressa uma proteína específica, incluindo seqüências reguladoras anteriores (seqüências não codificadoras 5') e posteriores (seqüências não codificadoras 3') à seqüência de codificação. "Gene nativo" designa um gene conforme encontrado na natureza com as suas próprias seqüências reguladoras. "Gene quimérico" indica qualquer gene que não seja um gene nativo, que compreende as seqüências reguladoras e de codificação que não são encontradas juntas na natureza. Consequentemente, um gene quimérico pode compreender seqüências reguladoras e seqüências de codificação que são derivadas de diferentes fontes ou seqüências reguladoras e seqüências de codificação derivadas da mesma fonte, mas dispostas de forma diferente da encontrada na natureza. "Gene endógeno" indica um gene nativo no seu local natural no genoma de um organismo. Gene "exógeno" designa um gene normalmente não encontrado no organismo hospedeiro, mas que é introduzido no organismo hospedeiro por meio de transferência genética. Genes exógenos podem compreender genes nativos inseridos em um organismo não nativo ou genes quiméricos. Um "transgene" é um gene que foi introduzido no genoma por meio de um procedimento de transformação.

A expressão "ligado operativamente" indica a associação de seqüências de ácido nucléico sobre um único fragmento de ácido nucléico, de tal forma que a função de um seja afetada pelo outro. Um promotor, por exemplo, é ligado operativamente com uma seqüência de codificação quando é capaz de efetuar a expressão daquela seqüência de codificação (ou seja, a seqüência de codificação encontra-se sob o controle de transcrição do promotor). Seqüências de codificação podem ser ligadas operativamente a seqüências reguladoras em orientação com ou sem sentido. O termo "expressão", da forma utilizada no presente, refere-se à

transcrição e acúmulo estável de RNA com (mRNA) ou sem sentido derivado do fragmento de ácido nucléico de acordo com a presente invenção. A expressão pode também designar a tradução de mRNA em um polipeptídeo.

Os termos "plasmídeo", "vetor" e "conjunto" designam um elemento cromossômico adicional que freqüentemente conduz genes que não são parte do metabolismo central da célula e, normalmente, encontram-se na forma de moléculas de DNA com fita dupla circulares. Esses elementos podem ser seqüências de reprodução autônoma, seqüências de integração de genomas, seqüências de nucleotídeos ou fagos, lineares ou circulares, de um DNA ou RNA de fita simples ou dupla, derivados de qualquer fonte, em que uma série de seqüências de nucleotídeos se uniu ou recombinou em uma só construção que é capaz de introduzir um fragmento promotor e seqüência de DNA para um produto genético selecionado junto com uma seqüência não traduzida 3' apropriada para uma célula. "Conjunto de transformação" indica um vetor específico que contém um gene exógeno e que possui elementos além do gene exógeno que facilitam a transformação de uma célula hospedeira específica. "Conjunto de expressão" designa um vetor específico que contém um gene exógeno e que possui elementos além do gene exógeno que permitem maior expressão daquele gene em um hospedeiro exógeno.

A expressão "software de análise de seqüências" designa qualquer algoritmo de computador ou programa de software que seja útil para a análise de seqüências de nucleotídeos ou aminoácidos. "Software de análise de seqüências" pode ser disponível comercialmente ou desenvolvido independentemente. Software de análise de seqüências típico incluirá, mas sem limitar-se à suíte GCG de programas (Pacote Wisconsin Versão 9.0, Genetics Computer Group (GCG)1 Madison Wl), BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990), DNASTAR (DNASTAR, Inc., Madison Wl) e software Vector NTI® versão 7.0. Dentro do contexto do presente pedido, compreender-se-á que, ao utilizar-se software de análise de seqüências para análise, os resultados da análise serão baseados nos "valores padrão" do programa indicado, a menos que especificado em contrário. Da forma utilizada no presente, "valores padrão" indicará qualquer conjunto de valores ou parâmetros carregado originalmente com o software durante a sua primeira inicialização.

Os métodos padrão de clonagem molecular e DNA recombinante utilizados nos Exemplos são bem conhecidos na técnica e descritos por Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor1 Nova Iorque (1989) (a seguir, Maniatis); e por Ausubel, F. M. et al, Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Assoc. e Wiley-Interscience (1987). Genoma do Vírus da Necrose Hipodérmica ε Hematopoiética Infecciosa

O vírus da necrose hipodérmica e hematopoiética infecciosa (IHHNV) é um patógeno importante do camarão com uma alta taxa de mortalidade e ampla faixa de hospedeiros. O genoma completo de IHHNV foi sequenciado (Bonami et al, J. Gen. Virology 71 (Pt 11): 657-2664 (1990); GenBank AF218266). O genoma consiste de DNA de fita única que contém 4076 bases e três quadros de leitura aberta (ORFs).

Seqüências de primers de diagnóstico de IHHNV

São descritas no presente seqüências de primers de diagnóstico úteis em uma série de formatos de teste para detecção altamente sensível de IHHNV. Estes primers são dirigidos a regiões do genoma de IHHNV não utilizadas anteriormente para detecção de IHHNV.

Seqüências de primers foram identificadas empiricamente utilizando uma série de ferramentas de análise de seqüências in silica (ou seja, computadorizadas). Neste processo, foi montado um banco de dados contendo todas as seqüências de IHHNV conhecidas. Estas seqüências foram alinhadas em primeiro lugar e analisadas em seguida para determinar locais de primers utilizando software Vector NTI® (InforMax Inc., Bethesda MD) com base em homologia com outras seqüências de IHHNV, um comprimento de amplicon especificado, concentração de sais, Tm (temperatura de fusão), teor de C+G e liberdade de grampos de cabelo e parâmetros de estrutura secundária. Possíveis primers foram selecionados em seguida em comparação com seqüências do GenBank. Os primers estabelecidos como contendo menos de cinco bases de homologia com outras seqüências genéticas não desejadas foram selecionados para determinar a investigação experimental de eficiência de amplificação por PCR e formação mínima de primers e dímeros. Os primers que exibem alta eficiência de amplificação e formação mínima de primers e dímeros foram selecionados para testes com um quadro de DNA isolado de camarão infectado com vários patógenos de camarão e DNA de camarão certificado como sendo livre de doenças. Os primers que amplificam todas as linhagens de IHHNV e não exibem reação a DNA de camarão infectado com patógenos não de IHHNV e a DNA isolado de diferentes espécies de camarão livre de doenças certificado foram selecionados como primers úteis.

As seqüências de primers consideradas úteis na detecção de IHHNV e sua localização no genoma de IHHNV são fornecidas na Tabela 1. Estes primers podem ser sintetizados utilizando química de fosforamidita padrão ou podem ser adquiridos de empresas tais como a Sigma Genosys (The Woodlands, TX).

Tabela 1

Seqüências de Primers de Diagnóstico de IHHNV

Primer, direção SEQ ID N0 Local do Genoma IHHNV (GenBank AF218266) IHHNV1F, Frontal 1 662-705 IHHNV1R, Reverso 2 779-800 IHHNV2F, Frontal 3 1062-1086 IHHNV2R, Reverso 4 1137-1161 IHHNV3F, Frontal 5 1749-1773 IHHNV3R, Reverso 6 1832-1856 IHHNV4F, Frontal 7 3417-3440 IHHNV4R, Reverso 8 3508-3532

Métodos de teste As seqüências de primer descritas no presente podem ser

utilizadas em uma série de formatos de teste para detecção e quantificação de IHHNV. Os dois formatos mais convenientes dependem de métodos de hibridização de ácido nucléico ou métodos de amplificação dirigida por primers tais como PCR. MÉTODOS DE TESTE DE AMPLIFICAÇÃO DIRIGIDA POR PRIMERS

Em uma realização, as seqüências de primers de diagnóstico de IHHNV atuais podem ser utilizadas em amplificação de ácido nucléico dirigida por primers para detecção da presença de IHHNV. Diversos métodos de amplificação de ácidos nucléicos dirigidos por primer são bem conhecidos na técnica e apropriados para uso com os primers descritos no presente. Esses métodos de amplificação de ácidos nucléicos incluem métodos de ciclização térmica (tais como reação em cadeia de polimerase (PCR) e reação em cadeia de Iigase (LCR)), bem como métodos isotérmicos e amplificação de

deslocamento de fitas (SDA).

Métodos de LCR são bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Tabor et al, Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A., 82: 1074-1078 (1985)). Tipicamente, composições de reprodução de ácido nucléico de LCR compreendem, por exemplo, uma Iigase termoestável (tal como Iigase de T.

aquaticus), dois conjuntos de primers de oligonucleotídeos adjacentes (em que um membro de cada conjunto é complementar a cada uma das fitas alvo), tampão de Tris-HCI, KCI, EDTA, NAD, ditiotreitol e DNA de esperma de salmão.

Os métodos de SDA também são bem conhecidos na técnica.

Uma discussão em profundidade da metodologia de SDA é fornecida por Walker et al (Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 89: 392 (1992)). Tipicamente em SDA, são utilizados dois primers de oligonucleotídeos, em que cada qual contém regiões complementares a apenas uma das fitas no alvo. Após desnaturação por calor, os fragmentos alvo com fita única unem-se aos primers

correspondentes que estão presentes em excesso. Os dois primers contêm seqüências de reconhecimento de enzimas de restrição assimétricas localizadas a 5' das seqüências de união alvo. Cada complexo de alvo de primer realiza um ciclo ao longo de etapas de marcação, polimerização e deslocamento na presença de uma enzima de restrição, uma polimerase de DNA1 três trifosfatos de deoxinucleotídeos (dNTPs) e um α-tio trifosfato de

deoxinucleotídeo (dNTP[aS]).

O método preferido de detecção de IHHNV utilizando as seqüências de primers de diagnóstico descritas no presente é PCR1 que é descrito por Mullis et al na Patente Norteamericana n° 4.683.202 e na Patente Norteamericana n° 4.683.195, que são ambas incorporadas especificamente ao presente como referência. Em métodos PCR1 as seqüências de primer de diagnóstico de IHHNV descritas no presente e as suas seqüências complementares completas são utilizadas em pares que são capazes de servir de primer de uma reação de amplificação de ácido nucléico que amplifica uma região no genoma de IHHNV. Podem ser utilizadas diversas combinações das seqüências de primer de diagnóstico de IHHNV e seus complementos. Pares de primers apropriados incluem, mas sem limitar-se a SEQ ID N0 1 e 2, SEQ ID N0 3 e 4, SEQ ID N0 5 e 6, SEQ ID N0 7 e 8 e SEQ ID N0 1 e 4.

Geralmente, os dois primers são misturados com o DNA de amostra, uma mistura de quatro trifosfatos de deoxinucleotídeos (ou seja, d ATP, dCTP, dTTP e dGTP), uma polimerase de DNA termoestável, tal como polimerase de DNA Taq, em uma solução de tampão. Esta mistura é ciclizada termicamente em seguida, utilizando um instrumento ciclizador térmico para amplificar a região alvo desejada. Ciclizadores térmicos são disponíveis comercialmente por meio de muitas fontes (tais como Applied Biosystems (Foster City, CA); Brinkmann (Westbur, NY); MJ Research (Waltham, MA); e Stratagene (La Jollal CA)). Geralmente, ciclização térmica por PCR inclui uma etapa de

desnaturação inicial sob alta temperatura, seguida por uma série repetitiva de ciclos de temperatura projetados para permitir a desnaturação de modelos, combinação de primers e extensão dos primers combinados pela polimerase. Geralmente, as amostras são aquecidas inicialmente por cerca de dois a dez minutos sob uma temperatura de cerca de 95 0C para desnaturar a amostra de DNA com fita dupla. Em seguida, no início de cada ciclo, as amostras são desnaturadas por cerca de dez a sessenta segundos, dependendo das amostras e do tipo de instrumento utilizado. Após a desnaturação, os primers são mantidos em combinação com o DNA alvo sob uma temperatura mais baixa, de cerca de 40 0C a cerca de 60 0C por cerca de vinte a sessenta segundos. A extensão dos primers pela polimerase freqüentemente é conduzida sob uma temperatura que varia de cerca de 60 0C a cerca de 72 0C. O período de tempo utilizado para extensão dependerá do tamanho do amplicon e do tipo de enzima utilizada para amplificação, sendo facilmente determinado por meio de experimentação rotineira. Além disso, a etapa de combinação pode ser combinada com a etapa de extensão, resultando em ciclização em duas etapas. Ciclização térmica pode também incluir alterações de temperatura adicionais em testes de PCR. A quantidade de ciclos utilizada no teste depende de muitos fatores, que incluem os primers utilizados, a quantidade de DNA de amostra presente e as condições de ciclização térmica. A quantidade de ciclos a serem utilizados em qualquer teste pode ser facilmente determinada pelos técnicos no assunto utilizando experimentação rotineira. Opcionalmente, uma etapa de extensão final pode ser adicionada após o término da ciclização térmica para garantir a síntese de todos os produtos de amplificação.

Após a amplificação, a seqüência de nucleotídeos amplificada pode ser ligada a um vetor apropriado seguido por transformação de um organismo hospedeiro apropriado com o mencionado vetor. Desta forma, garante-se um fornecimento mais facilmente disponível da seqüência amplificada. Alternativamente, após a amplificação, a seqüência amplificada ou uma parte dela pode ser sintetizada quimicamente para uso como uma sonda de nucleotídeo para uso em um teste de hibridização, conforme descrito abaixo. Em qualquer situação, a seqüência de DNA da região variável pode ser estabelecida utilizando métodos tais como o método dideóxi (Sanger, F. et al, Proc. Nati Acad. Sei. 74: 5463-5467 (1977)). A seqüência obtida é utilizada 5 para orientar a seleção da sonda para o organismo e a(s) sequência(s) mais apropriada(s) é (são) selecionada(s).

A fim de detectar a presença de IHHNV em uma amostra suspeita de conter IHHNV (ou seja, camarão ou outros crustáceos) utilizando um método de amplificação de ácido nucléico dirigido por primers, DNA da amostra 10 deve ser fornecido em uma forma que seja capaz de ser amplificada. Tipicamente, o DNA deve ser livre dos materiais de amostra e de células e pode ser tratado para eliminar proteínas e outros componentes celulares. O DNA pode ser obtido de qualquer tecido, fluido ou material de amostra apropriado, incluindo, mas sem limitar-se a tecido de camarão (tal como 15 guelras, pleópodes, hemolinfas, músculos, cauda, pedúnculos dos olhos, estômago, patas e tecido conectivo), fluidos de lavagem e amostras de água de açudes. As amostras podem ser suspeitas de conter IHHNV por qualquer número de razões, que incluem a proximidade de um contaminante conhecido ou de outra forma, ou podem ser apenas suspeitas de contaminação em 20 virtude da presença comum de IHHNV na indústria comercial de camarão. Desta forma, uma amostra suspeita de conter IHHNV pode ser qualquer amostra de DNA descrita acima.

Métodos de fornecimento de DNA que é apropriado para amplificação a partir de tecidos são bem conhecidos na técnica. DNA pode ser 25 extraído de uma amostra, por exemplo, por meio de homogeneização do material de amostra ou tecido em tampão de Tris-HCI, centrifugação para remover resíduos sólidos e utilização do fluido sobrenadante resultante na reação de PCR1 conforme descrito por Nunan et al (Mar. Biotechnol. 2 (4): 319- 328 (2000)). Alternativamente, podem ser utilizados os métodos de isolamento de DNA viral de síndrome das manchas brancas de vários tecidos descritos por Yoganandhan et al (Aquaculture Research 34 (12): 1093-1097 (2003)) e Kou et al (Patente Norteamericana n° 6.190.862). O DNA pode também ser fornecido 5 em uma forma que seja apropriada para amplificação utilizando um kit de isolamento de DNA disponível comercialmente, tal como o Mini Kit de DNA QIAamp (Qiagen, Valencia CA) ou o Reagente de Isolamento de DNA Genômico DNAzol® (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati OH).

O DNA é amplificado em seguida com pelo menos um par de 10 seqüências de primers de diagnóstico descritas no presente utilizando um método de amplificação de ácido nucléico, conforme descrito acima. Uma combinação de diferentes pares de seqüências de primers de diagnóstico pode também ser utilizada. A presença do produto de amplificação, detectado conforme descrito abaixo, confirma a presença de IHHNV na amostra. Em uma 15 realização, PCR é utilizado para amplificar o DNA.

Em métodos de amplificação de ácido nucléico, resultados de teste podem ser mal interpretados devido a falhas de reagentes, erros de procedimento e mau funcionamento de instrumentos. Além disso, surgem problemas devido à presença de substâncias inibidoras nos materiais de 20 amostra ou degradação do DNA ou RNA da amostra durante o processamento de amostras e recuperação de ácido nucléico. Para superar estes problemas, podem ser realizados testes de controle internos em combinação com o teste de IHHNV para alertar os usuários para estes tipos de erros e auxiliar na quantificação de resultados de teste.

Podem ser utilizados dois tipos de testes de controle interno. Uma

abordagem é baseada na coamplificação de um “controle de modelo interno” (ITC), que é adicionado à mistura de reagentes de amplificação de ácido nucléico antes da reação. Uma segunda abordagem é baseada na coamplificação de um “controle de amostra interno” (ISC) contido na amostra. Nos dois casos, a seqüência do DNA ou RNA de controle interno é diferente do DNAde IHHNV.

O controle de amostra interno pode ser uma seqüência genética de DNA ou RNA conservada ou consistentemente presente em materiais de amostra (tais como tecido de camarão e hemolinfa). Os primers utilizados para amplificar o RNA ou DNA alvo de ISC são selecionados de forma a não amplificarem DNA de IHHNV e os primers de teste de IHHNV são selecionados de forma a não amplificarem os DNA ou RNA alvos de controle de amostra interno. Desta forma, o ISC e IHHNV alvos amplificam-se independentemente. No teste, os ISC e IHHNV alvos são processados utilizando os mesmos reagentes e condições. Além disso, os dois modelos alvo são amplificados utilizando os mesmos reagentes e condições de reação. Como o modelo de ISC e primers estão presentes na amostra de teste, produto ISC deverá ser gerado durante a amplificação. Caso não seja formado produto ISC, esta é uma indicação de que a química de teste não funcionou corretamente e os resultados de teste de IHHNV são incorretos e não serão confiáveis. Caso ocorra a formação correta de produto ISC, isso indica que a química de teste funcionou corretamente e considera-se que o processamento de amostras de IHHNV e reações de teste funcionam corretamente, de forma que o teste de IHHNV possa ser interpretado mais precisamente.

Primers de ISC podem ser selecionados a partir de seqüências genéticas de genes que codificam proteínas estruturais, enzimas metabólicas ou produtos ribossômicos da espécie hospedeira de patógenos que são 25 sujeitos a infecções por IHHNV. Os primers de ISC podem ser, por exemplo, seqüências genéticas derivadas do gene actina de camarão ou genes ribossômicos 18S, 23S ou 5S de camarão ou outros genes constitutivos. Exemplos apropriados de pares de primers de ISC incluem, mas sem limitar-se a SEQ ID N0 13, 14 e SEQ ID N0 15, 16, derivados do gene actina 1 de Penaeus monodon (GenBank AF100986), conforme exibido na Tabela 2.

Tabela 2

Seqüências de Primers de Controle de Amostra Interno (ISC)

Primer, direção SEQ ID N0 Local do gene de actina 1 (GenBankAFI 00986) Actina F2, frontal 13 391-411 Actina R2, reverso 14 608-629 Actina F3, frontal 15 326-346 Actina R3, reverso 16 553-574 Em uma realização, pelo menos um par de primers de ISC é

incluído na mistura de reagentes de amplificação de ácido nucléico, a fim de gerar um produto controle de amostra interno na reação de amplificação. Em uma realização, o pelo menos um par de primers de ISC é selecionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID N0 13, 14 e SEQ ID N0 15, 16.

Além disso, pode-se convenientemente utilizar um controle de

modelo interno (ITC) com os primers de teste de IHHNV para auxiliar na quantificação da resposta de teste. As necessidades de primer para o ITC são similares às dos primers de ISC, com exceção de que o modelo de ITC e os primers são adicionados à mistura de reagente de amplificação. Os primers de 15 ITC são selecionados de forma a não amplificarem DNA ou RNA genômico das espécies de teste, tais como camarão, que são sujeitas a IHHNV. O modelo de ITC é adicionado em uma concentração conhecida, de forma que o número de cópias por reação seja conhecido. Como o modelo de ITC é incluído na mistura de reagentes de amplificação, o produto ITC é gerado durante a amplificação. 20 A quantidade de produto ITC variará de uma reação para outra dependendo da eficiência de amplificação da reação e outras variáveis. Como estas mesmas variáveis também afetam a amplificação de DNA de IHHNV, a quantidade de produto IHHNV gerada será proporcional à quantidade do produto ITC gerado na reação. O número de cópias do modelo de IHHNV no teste pode ser inferido, portanto, a partir da proporcionalidade entre o ITC adicionado originalmente, do produto de ITC formado e do produto IHHNV formado. A 5 formação de produto relativa pode ser determinada em unidades de CT ao utilizar-se sondas internas marcadas ou pelo derivado das curvas de fusão na temperatura de fusão correspondente dos produtos.

As seqüências de primers de ITC podem ser projetadas racionalmente ou derivadas de seqüências genéticas de espécies não de teste tais como outros vírus ou genes de plantas e animais que não estão presentes nas amostras de teste. Desta forma, materiais de amostra não contêm outro DNA ou RNA que poderá ser amplificado pelos primers de ITC.

Em uma realização, pelo menos um controle de modelo interno e pelo menos um par de primers de ITC são incluídos na mistura de reagentes de amplificação de ácido nucléico a fim de gerar pelo menos um produto de ITC na reação de amplificação.

Uma série de métodos de detecção, que são bem conhecidos na técnica, pode ser utilizada nos métodos descritos no presente. Estes métodos de detecção incluem, mas sem limitar-se a eletroforese de gel não 20 desnaturante padrão (tal como acrilamida ou agarose), eletroforese de gel de gradiente de desnaturação, eletroforese de gel de gradiente de temperatura, eletroforese capilar e detecção por fluorescência.

Os métodos de detecção por fluorescência fornecem detecção rápida e sensível de produtos de amplificação. A detecção por fluorescência 25 também fornece a capacidade de detecção em tempo real, em que a formação de produtos de amplificação é monitorada durante o processo de ciclização térmica. Além disso, a quantidade do alvo inicial pode ser determinada utilizando detecção por fluorescência. A detecção por fluorescência pode ser realizada por meio da adição de um agente fluorescente de união de ácido nucléico à mistura de reação antes ou depois do processo de ciclização térmica. Preferencialmente, o agente fluorescente de união de ácido nucléico é uma tintura intercalante que é capaz de inserção não covalente entre pares de bases empilhados na hélice dupla de ácido nucléico. Agentes fluorescentes de união de ácidos nucléicos não intercalantes, entretanto, também são apropriados. Exemplos não limitadores de agentes fluorescentes de união de ácidos nucléicos úteis nos métodos de acordo com a presente invenção são brometo de etídio e SYBR® Verde I (disponível por meio da Molecular Probes; Eugene OR). A adição do agente fluorescente de união de ácido nucléico à mistura de reação antes da ciclização térmica permite o monitoramento da formação de produtos de amplificação em tempo real, conforme descrito por Higuchi (Patente Norteamericana n° 5.994.056). Ciclizadores térmicos capazes de medição de fluorescência em tempo real são disponíveis comercialmente por meio de empresas tais como a Applied Biosystems (Foster City CA), MJ Research (Waltham MA) e Stratagene (La Jolla CA). Após a amplificação, pode-se determinar a confirmação do produto de amplificação determinando-se a temperatura de fusão do produto, utilizando-se métodos conhecidos na técnica, tais como por meio de geração de uma curva de fusão utilizando medição por fluorescência.

A detecção por fluorescência de produtos de amplificação pode também ser realizada utilizando outros métodos conhecidos na técnica, tais como uma sonda marcada de forma fluorescente. A sonda compreende uma seqüência complementar para pelo menos uma parte do produto de 25 amplificação. Exemplos não limitadores destas sondas incluem sondas TaqMan® (Applied Biosystems) e Molecular Beacons (Goel et al, J. Appi Microbiol. 99 (3): 435-442 (2005)). Seqüências genéticas de construção de sondas marcadas de forma fluorescente para uso com os primers de IHHNV descritos no presente podem ser selecionadas, por exemplo, por meio de análise dos genes de IHHNV e amplicons de teste, utilizando software de análise disponível comercialmente tal como Primer Express® v2.0 (Applied BioSystems Inc., Foster City, Califórnia), conforme descrito em detalhes no 5 Exemplo 11 abaixo. As seqüências de sondas são selecionadas de forma que se enquadrem dentro das extremidades próximas dos amplicons de teste de IHHNV específicos. Seqüências de sondas apropriadas incluem, mas sem limitar-se às seqüências descritas em SEQ ID N0 17 e 18. As sondas podem ser marcadas de forma fluorescente utilizando métodos conhecidos na técnica, 10 tais como os descritos abaixo para a marcação de sondas de hibridização. Para detecção fluorescente em tempo real, as sondas podem receber marcação dupla. A extremidade 5’ da sonda pode ser marcada, por exemplo, com um fluoroforo, tal como 6FAM® (Applied BioSystems), e a extremidade 3’ pode ser marcada com uma tintura resfriadora, tal como 6- 15 carboxitetrametilrodamina (TAMRA). No caso de uma sonda de união de ranhuras menor, a extremidade 3’ pode ser marcada com uma tintura resfriadora e um complexo aglutinante de ranhura menor. Sondas marcadas de forma fluorescente podem ser obtidas por meio de fontes comerciais tais como a Applied BioSystems.

Em uma realização, a presente invenção fornece um método de

determinação da quantidade de IHHNV em uma amostra. Nesta realização, DNA é fornecido a partir de uma amostra suspeita de conter IHHNV, conforme descrito acima. O DNA é amplificado com pelo menos um par dos primers de oligonucleotídeos descritos no presente por meio de ciclização térmica entre 25 pelo menos uma temperatura de desnaturação e uma temperatura de extensão na presença de um agente fluorescente de união de ácido ou uma sonda marcada de forma fluorescente. A quantidade de fluorescência gerada pelo agente fluorescente de união de ácido nucléico ou a sonda marcada de forma fluorescente é medida durante ciclização térmica. A partir das medições de fluorescência, é determinado um número limite de ciclos no qual a quantidade de fluorescência gerada pelo agente fluorescente de união de ácido nucléico ou a sonda marcada de forma fluorescente atinge um valor limite fixo acima de um 5 valor de linha base. O número de limite de ciclo é denominado no presente o valor ou número CT. O número CT pode ser determinado manualmente ou determinado automaticamente pelo instrumento. Para determinar o número CT, a fluorescência de linha base é determinada para cada amostra durante os ciclos de amplificação iniciais. Emprega-se em seguida um algoritmo 10 matemático para estabelecer qual alteração estatisticamente significativa da fluorescência seria necessária para que o sinal de fluorescência fique acima do fundo. O número de ciclos em que a fluorescência excede este limite é denominado número CT. Tipicamente, quanto mais DNA presente na amostra no início da ciclização térmica, menor quantidade de ciclos levará para atingir o 15 valor limite. Portanto, o número CT é inversamente proporcional à quantidade inicial de IHHNV na amostra. Após determinar-se o número CT para a amostra de IHHNV, a quantidade de IHNNV originalmente presente na amostra pode ser calculada por meio de comparação do número de limite de ciclos determinado para o IHHNV na amostra com uma curva padrão do número 20 limite de ciclos com o logaritmo da concentração de modelo determinada utilizando soluções padrão com concentração conhecida, como é bem conhecido na técnica.

Métodos de hibridizacão de ácido nucléico Os componentes básicos de um teste de hibridização de ácido nucléico para IHHNV incluem uma sonda de DNA, uma amostra suspeita de conter IHHNV e um método de hibridização específico. As sondas de acordo com a presente invenção são seqüências de ácido nucléico de fita simples que são complementares às seqüências de ácido nucléico a serem detectadas e são nelas “hibridizáveis”. Tipicamente em métodos de hibridização, o comprimento da sonda pode variar de até cinco bases a várias quilobases e dependerá do teste específico a ser realizado. Apenas uma parte da molécula de sonda necessita ser complementar á seqüência de ácido nucléico a ser 5 detectada. Além disso, a complementaridade entre a sonda e a seqüência alvo não necessita ser perfeita. A hibridização ocorre entre moléculas imperfeitamente complementares, com o resultado de que uma certa fração das bases na região hibridizada não é emparelhada com a base complementar apropriada.

As sondas de DNA descritas no presente são derivadas das

seqüências de primer de diagnóstico de IHHNV descritas acima. Da forma utilizada no presente, a expressão “derivado de seqüências de primer de diagnóstico de IHHNV” indica que as sondas de DNA podem ser as seqüências de primer de diagnóstico de IHHNV, as seqüências de produto de amplificação 15 obtidas a partir dele utilizando um método de amplificação de ácido nucléico, partes das seqüências de primer de diagnóstico de IHHNV ou as seqüências de produto de amplificação, ou as seqüências complementares completas de qualquer das seqüências mencionadas acima. O termo “parte”, da forma utilizada acima, designa qualquer parte das seqüências de primer de 20 diagnóstico de IHHNV ou os produtos de amplificação obtidos a partir delas que seja menor que a seqüência completa. Preferencialmente, o comprimento ou a parte para uso como sonda é pelo menos de cerca de quinze bases, de maior preferência pelo menos cerca de vinte bases. Exemplos não limitadores de sondas de DNA derivadas das seqüências de primer de diagnóstico de 25 IHHNV incluem as seqüências de primer de diagnóstico de IHHNV fornecidas como SEQ ID N0 1 a 8, as seqüências de produto de amplificação fornecidas como SEQ ID N0 9, 10, 11 e 12 e as seqüências complementares completas de SEQ ID N0 1 a 12. *

A sonda pode ser marcada para facilitar a detecção. Métodos de ligação de marcas a sondas de ácido nucléico são bem conhecidos na técnica. A sonda pode ser marcada, por exemplo, durante a síntese por meio de incorporação de nucleotídeos marcados. Alternativamente, a marcação de 5 sondas pode ser realizada por meio de movimentação do corte ou marcação final. A marca pode compreender um fluoroforo para detecção por fluorescência, ou um ligante, tal como biotina, que é detectado utilizando uma molécula de união marcada por enzima que se une ao ligante (tal como estreptavidina marcada por enzima) após a hibridização.

A fim de detectar a presença de IHHNV em uma amostra suspeita

de conter IHHNV, tal como camarão ou outros crustáceos, DNA é fornecido a partir da amostra, conforme descrito acima. O DNA de amostra é disponibilizado para contato da sonda antes que possa ocorrer qualquer hibridização da sonda e molécula alvo. O DNA deve ser, portanto, livre da 15 célula e colocado sob as condições apropriadas antes que possa ocorrer a hibridização. Além disso, em algumas realizações, pode ser desejável purificar o DNA para eliminar proteínas, lipídios e outros componentes celulares. Diversos métodos de purificação de ácido nucléico, tais como extração com fenol e clorofórmio, são conhecidos dos técnicos no assunto (Maniatis, acima). 20 Além disso, são disponíveis kits de fontes comerciais para extração e purificação de DNA (tais como Kit de Extração de Ácido Nucléico IsoQuick® (MicroProbe Corp., Bothell WA); e Mini Kit de DNA QIAamp (Qiagen, Valencia CA)). Purificação antes da hibridização é particularmente útil para testes de hibridização de filtros padrão.

Em uma realização, podem ser conduzidos testes de hibridização

diretamente sobre Iisatos celulares, sem a necessidade de extração dos ácidos nucléicos. Isso elimina várias etapas do processo de manipulação de amostras e acelera o teste. Para realizar estes testes sobre Iisatos de células brutas, um agente caotrópico é tipicamente adicionado aos Iisatos celulares preparados conforme descrito acima. O agente caotrópico estabiliza ácidos nucléicos por meio de inibição da atividade de nuclease. Além disso, o agente caotrópico permite a hibridização sensível e estringente de sondas de oligonucleotídeos 5 curtas em DNA à temperatura ambiente (Van Ness e Chen, NueL Acids Res. 19: 5143-5151 (1991)). Agentes caotrópicos apropriados incluem cloreto de guanidínio, tiocianato de guanidínio, tiocianato de sódio, tetracloroacetato de lítio, perclorato de sódio, tetracloroacetato de rubídio, iodeto de potássio e trifluoroacetato de césio, entre outros. Tipicamente, o agente caotrópico está 10 presente em uma concentração final de cerca de 3 M. Se desejado, pode-se adicionar formamida à mistura de hibridização, tipicamente 30 a 50% em volume.

Métodos de hibridização são bem definidos e incluem métodos de hibridização de solução (ou seja, homogênea) e fase sólida (ou seja, heterogênea). Tipicamente, o DNA da amostra é sondado (ou seja, colocado em contato sob condições que permitirão a hibridização de ácidos nucléicos) com uma sonda derivada das seqüências de primer de diagnóstico de IHHNV descritas no presente. Isso envolve o contato do DNA da amostra e da sonda na presença de um sal orgânico ou inorgânico sob condições apropriadas de temperatura e concentração. Os ácidos nucléicos de sonda e de amostra devem estar em contato por um tempo suficientemente longo para que possa ocorrer qualquer hibridização possível entre a sonda e o ácido nucléico de amostra. A concentração de sonda ou alvo na mistura determinará o tempo necessário para a ocorrência da hibridização. Quanto mais alta a concentração de alvo ou sonda, mais curto o tempo de incubação de hibridização necessário.

Podem ser empregadas várias soluções de hibridização. Tipicamente, estas podem compreender cerca de 20 a 60% em volume, preferencialmente 30%, de um solvente orgânico polar. Uma solução de hibridização comum emprega cerca de 30 a 50% em volume de formamida, cerca de 0,15 a 1 M de cloreto de sódio, cerca de 0,05 a 0,1 M de tampões, tais como citrato de sódio, Tris-HCI, PIPES ou HEPES (faixa de pH de cerca de 6 a 9), cerca de 0,05 a 0,2% de detergente, tal como dodecilsulfato de sódio (SDS), 5 0,5 a 20 mM de EDTA, FICOLL (Amersham Bioscience Inc., Piscataway NJ) (peso molecular de cerca de 300 a 500 quilodaltons), polivinilpirrolidona (peso molecular de cerca de 250 a 500 quilodaltons) e albumina de soro. Podem também ser incluídos em uma solução de hibridização típica ácidos nucléicos portadores não marcados de cerca de 0,1 a 5 mg/ml, DNA nucléico 10 fragmentado (tal como timo de bezerro ou DNA de esperma de salmão, ou RNA de levedura) e, opcionalmente, cerca de 0,5 a 2% em peso por volume de glicina. Podem também ser incluídos outros aditivos, tais como agentes de exclusão de volume que incluem uma série de agentes hidrossolúveis ou incháveis polares (tais como polietileno glicol), polímeros aniônicos (tais como 15 poliacrilato ou polimetilacrilato) e polímeros sacarídicos aniônicos (tais como sulfato de dextran).

A hibridização de ácido nucléico é adaptável a uma série de formatos de teste. Um dos mais adequados é o formato de teste de sanduíche. O teste de sanduíche é particularmente adaptável para hibridização sob 20 condições sem desnaturação. Um componente primário de um teste do tipo sanduíche é um suporte sólido. O suporte sólido possui nele absorvida ou a ele acoplada covalentemente uma sonda de captura de ácido nucléico imobilizada que não é marcada e é complementar a uma parte da seqüência de DNA de uma amostra. Sondas particularmente úteis na presente invenção são as 25 derivadas das seqüências de diagnóstico de IHHNV do presente, conforme descrito acima. O DNA capturado é detectado utilizando uma segunda sonda que é marcada, conforme descrito acima, e é complementar a uma parte diferente da seqüência de DNA da am ostra. A marca pode ser detectada utilizando métodos conhecidos na técnica (tais como fluorescência, quimioluminescência, teste de par de enzimas de união e similares).

Métodos de hibridização podem também ser utilizados em combinação com métodos de amplificação de ácido nucléico, tais como PCR.

As seqüências de diagnóstico de IHHNV do presente podem ser utilizadas, por exemplo, como sondas de detecção bloqueadas 3’ em um formato de teste homogêneo ou heterogêneo. Uma sonda gerada a partir das seqüências do presente pode ser, por exemplo, 3’ bloqueada ou não participadora e não será estendida por uma reação de amplificação de ácido nucléico, nem participará 10 dela. Além disso, a sonda incorpora uma marca que pode servir de ligante reativo que age como um ponto de ligação para a imoblilização do híbrido de analisado e sonda ou como um relator para produzir sinal detectável. Consequentemente, DNA genômico isolado de uma amostra suspeita de abrigar o IHHNV é amplificado por meio de protocolos de amplificação dirigida 15 por primer padrão na presença de um excesso da sonda de detecção bloqueada 3’ para gerar produtos de amplificação. Como a sonda é 3’ bloqueada, ela não participa nem interfere na amplificação do alvo. Após o ciclo de amplificação final, a sonda de detecção combina-se com a parte relevante do DNA amplificado e o complexo combinado é capturado em seguida sobre 20 um suporte por meio do ligante reativo.

A sonda do presente é versátil e pode ser projetada em diversas formas alternativas. A participação da extremidade 3’ da sonda em uma reação de extensão de primers pode ser bloqueada por meio da conexão de uma porção inibidora da reprodução. Porções inibidoras da reprodução típicas 25 incluem, mas sem limitar-se a dideoxinucleotídeos, 3’ deoxinucleotídeos, uma seqüência de nucleosídeos ou nucleotídeos não coincidentes, grupos 3’ fosfato e agentes químicos, tais como biotina, dinitrofenol, fluoresceína, rodamina e cadeias de carbono. O inibidor de reprodução é ligado covalentemente ao grupo 3’ hidróxi do nucleotídeo 3’ terminal da sonda não participadora durante a síntese química, utilizando química de cianoetil fosforamidita padrão. Este processo utiliza química de síntese de fase sólida na qual a extremidade 3’ é ligada covalentemente a um suporte insolúvel (vidro com poros controlados, ou 5 “CPG”), enquanto a cadeia recém sintetizada cresce sobre o terminal 5’. Dentro do contexto da presente invenção, 3-deoxirribonucleotídeos são os inibidores de reprodução preferidos. Cordicepina (3-deoxiadenosina) é a de maior preferência. Como a cordicepina será ligada à extremidade 3’ terminal da sonda, a síntese é iniciada a partir de uma cordicepina ligada covalentemente a 10 CPG, 5-dimetoxitritil-N-benzoil-3-deoxiadenosina (cordicepina), 2-succinoil- alquilamino de cadeia Ionga-CPG (Glen Research, Sterling VA). O grupo dimetoxitritila é removido e o início da síntese de cadeia começa no grupo 5’ hidroxila desprotegido da cordicepina de fase sólida. Após o término da síntese, a sonda de oligonucleotídeo é dividida do suporte sólido, deixando um 15 grupo 2’ hidroxila livre sobre a cordicepina conectada no terminal 3’. Outros reagentes podem também ser ligados ao terminal 3’ durante a síntese da sonda não participadora para servirem como inibidores da reprodução. Estes incluem, mas sem limitar-se a outros 3-deoxirribonucleotídeos, biotina, dinitrofenol, fluoresceína e digoxigenina. Suportes de CPG, derivados com 20 cada um desses reagentes, são disponíveis por meio de fontes comerciais (tais como Glen Research, Sterling VA; e CLONTECH Laboratories, Palo Alto CA).

Alternativamente, pode-se utilizar amplificação assimétrica para gerar uma fita complementar à sonda de detecção. Condições de PCR assimétricas de produção de DNA de fita simples são similares às condições 25 descritas acima para PCR; as concentrações de primer são ajustadas, entretanto, de tal forma que um primer encontre-se em excesso e o outro primer seja limitador. Contempla-se que este procedimento aumentaria a sensibilidade do método. Este aumento da sensibilidade ocorreria por meio de aumento da quantidade de fitas únicas disponíveis para união com a sonda de detecção.

Determinação do risco de infeccão e dano ao DNA ou desativação de

IHHNV

Os métodos de detecção da presença e/ou determinação da

quantidade de IHHNV em uma amostra descritos no presente podem ser utilizados para determinar a extensão de dano ao DNA ou desativação de IHHNV. Os métodos descritos no presente podem ser utilizados, por exemplo, em combinação com um tratamento químico para aprimorar a saúde e o 10 crescimento dos camarões. Especificamente, durante a produção e o crescimento, o camarão, amostras retiradas das instalações de produção ou amostras retiradas do ambiente do camarão podem ser amostradas e testadas para determinar a presença de IHHNV utilizando os métodos descritos no presente. Caso seja encontrado IHHNV, as instalações e/ou o camarão podem 15 ser tratados para matar ou controlar o vírus. Devido à alta sensibilidade do teste, IHHNV pode ser detectado precocemente, antes da devastação e da perda da safra. Desta forma, o uso dos métodos descritos no presente em combinação com intervenção química pode aumentar a eficiência e o rendimento de produção. Exemplos de tratamentos químicos incluem, mas sem 20 limitar-se a desinfetantes oxidativos tais como desinfetante Virkon® S (marca registrada da E. I. Du Pont de Nemours and Co.), ácidos peracéticos, peróxido de hidrogênio, permanganato, monopersuIfato de potássio, ácido hipocloroso, hipoclorito, iodo e similares; probióticos, imunoestimulantes, suplementos alimentares e ácidos nucléicos/proteína recombinante que evitam a união de 25 hospedeiro viral. Após o tratamento químico, o camarão ou o ambiente de produção pode ser amostrado e novamente testado para determinar se o tratamento foi bem sucedido na erradicação do vírus.

Em uma outra realização, antecipa-se que os primers descritos no presente podem ser utilizados em várias combinações para determinar a integridade e a extensão dos danos ao genoma viral resultantes de tratamento químico. O primer frontal de IHHNV1F (SEQ ID N0 1) e o primer reverso de IHHNV2R (SEQ ID N0 4), por exemplo, podem ser utilizados em combinação 5 para gerar um produto de amplificação com 480 bases. Este produto mais longo somente pode formar-se caso o genoma viral permaneça intacto e não lesionado. Comparando-se, portanto, a razão entre os produtos menores (SEQ ID N0 9 ou SEQ ID N0 10) e o produto mais longo formado durante a amplificação (ou a ausência do produto mais longo), pode-se determinar a 10 extensão da lesão ao genoma viral resultante de intervenção ou tratamento químico. Isso pode ajudar a estabelecer a eficácia de intervenção ou tratamento químico. De forma similar, SEQ ID N0 1 ou SEQ ID N0 8 podem ser utilizados em combinação com outros primers descritos no presente para questionar a integridade de segmentos mais longos do genoma de IHHNV.

KlTS DE DETECCÃQ

Em uma outra realização, a presente invenção fornece um kit de detecção de IHHNV com base em um método de amplificação de ácidos nucléicos. O kit compreende pelo menos um par de seqüências de primers de diagnóstico de IHHNV, conforme descrito acima. Além disso, o kit pode 20 compreender adicionalmente pelo menos um dos reagentes a seguir: uma polimerase de DNA termoestável, uma mistura de quatro trifosfatos de deoxinucleotídeos diferentes, um agente de fluorescência de união de ácido nucléico, pelo menos um par de primers de controle de amostras internas, pelo menos um controle de modelo interno e pelo menos um par de primers de 25 controle de modelo interno e uma sonda que compreende uma seqüência complementar a uma parte de pelo menos uma região de ácido nucléico no genoma de IHHNV que é capaz de ser amplificada com as seqüências de primers de diagnóstico de IHHNV contidas no kit. Os primers e outros reagentes do kit podem apresentar-se em diversas formas, tais como um líquido, secos ou em pastilhas, e podem estar presentes em qualquer recipiente apropriado ou em diversos recipientes, tais como ampolas, tubos e similares.

Em uma outra realização, a presente invenção fornece um kit de

detecção de IHHNV com base em um método de hibridização de teste de sanduíche. Este kit compreende um primeiro componente para a coleta de amostras de um camarão ou outro crustáceo suspeito de haver contraído o IHHNV e tampões para desembolso e Iise da amostra. Um segundo 10 componente inclui meios em forma seca ou líquida para a hibridização de ácidos nucléicos alvo e de sondas, bem como para a remoção de formas indesejáveis e não hibridizadas por meio de lavagem. Um terceiro componente inclui um suporte sólido (tal como bastão de mergulhamento, esfera e similares) sobre o qual é(são) fixada(s) (ou ao qual é(são) conjugada(s)) uma 15 ou mais sondas de ácido nucléico não marcadas que é (são) derivada(s) das seqüências de primers de diagnóstico de IHHNV isoladas descritas no presente. Um quarto componente contém uma sonda marcada que é complementar a uma segunda região diferente da mesma linhagem de DNA à qual a sonda de ácido nucléico não marcada imobilizada é hibridizada. A sonda 20 marcada pode também ser derivada das seqüências de primer de diagnóstico de IHHNV isoladas descritas no presente.

Exemplos

A presente invenção é adicionalmente definida nos Exemplos a seguir. Dever-se-á compreender que estes Exemplos, embora indiquem 25 realizações preferidas da presente invenção, são fornecidos unicamente como forma de ilustração. A partir da discussão acima e destes Exemplos, os técnicos no assunto podem determinar as características essenciais da presente invenção e, sem abandonar o seu espírito e escopo, podem realizar várias alterações e modificações da presente invenção para adaptá-la a vários usos e condições.

O significado das abreviações é o seguinte: “seg” indica segundo(s), “min” indica minuto(s), “h” indica hora(s), “d” indica dia(s), “μΙ” indica microlitro(s), “ml” indica mililitro(s), “I” indica litro(s), “μΜ” indica micromolar, “mM” indica milimolar, “nM” indica nanomolar, “M” indica molar, “mmol” indica milimol(es), “μιτιοΓ indica micromol(es), “ng” indica nanograma(s), “fg” indica fentograma(s), ‘^g” indica micrograma(s), “mg” indica miligrama(s), “g” indica grama(s), “nm” indica nanômetro(s), “mil” indica miliunidade(s), “U” indica unidade(s), “rxn” indica reação(ões), “PCR” indica reação em cadeia de polimerase, “OD” indica densidade ótica, “OD260” indica a densidade ótica medida em um comprimento de onda de 260 nm, “OD28o” indica a densidade ótica medida em um comprimento de onda de 280 nm, “OD280/260” indica a razão entre o valor OD2eo e o valor OD26o. “rpm” indica revoluções por minuto, “CT” indica o número de ciclos em que o acúmulo de fluorescência na reação excede o limite de detecção e “SPF” indica livre de patógenos específicos certificado.

Métodos gerais

Os métodos de clonagem molecular e DNA recombinante padrão 20 utilizados nos Exemplos são bem conhecidos na técnica e são descritos por Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989, porT. J. Silhavy, M. L. Bennan e L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova 25 Iorque, 1984, e por Ausubel, F. M. et al, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. e Wiley-Interscience, Nova Iorque, 1987.

A análise de seqüências de genomas e designados de primers foi realizada utilizando a Suíte de Software Vector NTI® disponível por meio da InforMax Inc. (Bethesda MD).

As enzimas e os reagentes utilizados no presente foram adquiridos dos fornecedores a seguir:

Applied Biosystems, Foster City CA; AmpIiTaq (Catálogo n°

N808-0160);

New England Biolabs1 Beverly MA: mistura de solução de deoxinucleotídeos (Catálogo n° N0447S);

Sigma Genosys, The Woodlands TX: oligonucleotídeos; Invitrogen Life Technologies, Carlsbad CA; 4% géis de Agarose E (Catálogo n° G6018-02);

Qiagen, Valencia CA: proteinase K (Catálogo n° 19131); e RNase A, livre de DNase (Catálogo n° 19101).

Além disso, kits e reagentes foram adquiridos dos fornecedores a seguir: Mistura Master de PCR Verde SYBR® (Applied Biosystems, Foster City CA; Catálogo n° 4309155); e Mini Kit DNA QIAamp (Qiagen, Valencia CA; Catálogo n° 51304).

Todas as amostras de DNA de camarão foram obtidas por meio de Donald V. Lightner, Departamento de Ciência Veterinária e Microbiologia, Universidade do Arizona, Tucson AZ 85721, Estados Unidos. Estas incluíram 20 amostras de DNA de camarão livre de doença certificado (SPF) e camarão infectado contendo bacilovírus do tipo Penaeus monodon (MBV), vírus de síndrome de Taura (TSV), vírus de síndrome de manchas brancas (WSSV), vírus da cabeça amarela de P. monodon (YHV), vírus de necrose hipodérmica e hematopoiética infecciosa (IHHNV) e vírus de mionecrose infecciosa (IMNV). 25 Modelos e primers

Seqüências de oligonucleotídeos de DNA para síntese dos modelos de IHHNV sintéticos foram preparadas a partir do genoma de DNA do Vírus da Necrose Hipodérmica e Hematopoiética Infecciosa (IHHNV) (Acesso GenBank n° AF218266; Bonami1 J. R. et al, J. Gen. Virology 71 (Pt. 11): 657- 2664 (1990)) e foram sintetizadas utilizando química de fosforamidita padrão ou adquiridas comercialmente (Sigma Genosys Company, The Woodlands TX). A concentração de DNA e o número de cópias dos modelos de alvos sintéticos e 5 amostras foram medidos espectrofotometricamente a 260 nm (OD26o)· Os modelos foram diluídos em números de cópias específicos em água purificada e foram utilizados como controles positivos e padrões para quantificação de testes. A Tabela 3 exibe os locais de genomas, identificação de seqüências e comprimentos dos alvos modelos. As seqüências dos primers úteis para 10 detecção de IHHNV são fornecidas como SEQ ID N0 1 a 8.

Tabela 3 Seqüências de Modelos

Modelo Tamanho (BP) SEQ ID N0 Localização do genoma de IHHNV (GenBank AF218266) IHHNV 1T 119 9 682-800 IHHNV 2T 100 10 1062-1161 IHHNV 3T 108 11 1749-1856 IHHNV 4T 116 12 3417-3532 Exemplos 1 a 4

Demonstração de Teste de IHHNV Utilizando Alvos Sintéticos O propósito destes Exemplos foi o de demonstrar a detecção dos

modelos sintéticos de IHHNV utilizando amplificação por PCR com os primers descritos no presente.

Modelos padrão foram preparados por meio de diluições em série por dez vezes dos modelos de IHHNV sintéticos (descritos acima) em água livre de DNase. Geralmente, as concentrações de modelos dos padrões variaram de 107 a O cópias por μΙ. Foi preparada uma mistura master adicionando-se 25 μΙ da Mistura Master de PCR Verde SYBR® (Applied Biosystems, Foster City CA; Catálogo n° 4309155) com 125 nM de cada um dos primers frontal e reverso de IHHNV, conforme exibido na Tabela 4, e água 5 livre de DNase suficiente para compor um volume final de 45 μΙ por reação. A mistura master foi mantida sobre gelo até a utilização.

Para cada reação, 5 μΙ de um padrão modelo foram adicionados em primeiro lugar à cavidade de reação de PCR e, em seguida, adicionou-se 45 μΙ da mistura master. As reações foram ciclizadas termicamente em seguida 10 por quarenta ciclos utilizando um programa de temperatura de 95 0C por quinze segundos e 60 0C por um minuto com uma etapa de desnaturação inicial de 95 0C por dez minutos. As amplificações foram conduzidas em uma placa de reação com 96 cavidades ótica MicroAmp utilizando o ciclizador térmico ABI PRISM 7900 (Applied Biosystems, Foster City CA). Durante cada ciclo, a 15 formação de produto de PCR foi detectada por meio de monitoramento do aumento da fluorescência decorrente da interação da tintura relatora Verde SYBR® com os produtos de amplificação de DNA. Após o término de PCR, foi gerada uma curva de dissociação (curva de fusão) ao longo da faixa de 60 0C a 95 0C. Os dados foram analisados utilizando o software ABI PRISM 7900 SDS. 20 Além disso, a formação de produto de PCR foi analisada por meio de eletroforese de gel de agarose utilizando 4% géis de agarose E (Invitrogen Life Technologies, Carlsbard CA; Cat. n° G6018-02) e os protocolos de fabricação de gel.

Os resultados, resumidos na Tabela 4, demonstram que o produto de amplicon com tamanho apropriado foi gerado para cada conjunto de primers mediante a presença do modelo de IHHNV apropriado. O nível de modelo mínimo detectável foi de duas a cem cópias por reação, dependendo dos primers utilizados. Amostras que não continham modelo não geraram produto detectável.

A amplificação (CT) e a formação de produtos de amplicon foram, respectivamente, inversa e diretamente proporcionais ao logaritmo da concentração de modelo inicial.

Tabela 4

Resultados da Amplificação por PCR Utilizando um Alvo Sintético

Exemplo Primer Primer Modelo, Tamanho Modelo frontal, SEQ reverso, SEQ ID N0 do produto detectável ID N0 SEQ ID N0 (bp) mínimo (cópias por reação) 1 1 2 9 119 2 a 10 2 3 4 10 100 2 a 10 3 5 6 11 108 2 a 10 4 7 8 12 116 100 a 500 Exemplos 5 a 8

Detecção e Quantificação de DNA de IHHNV de Tecido de Camarão

Infectado

O propósito destes Exemplos foi o de demonstrar a detecção e a

quantificação de IHHNV em camarão infectado utilizando um teste de PCR com os primers descritos no presente.

Nestes Exemplos, diluições em série do DNA de IHHNV modelo sintético apropriado (descrito acima) que variam de 106 a 10° cópias por reação 15 foram amplificadas utilizando as condições indicadas nos Exemplos 1 a 4. Uma curva padrão (não exibida) foi gerada utilizando os valores CT determinados a partir de cada uma das concentrações de modelo sintético por meio de plotagem dos valores CT1 com intervalos de confiança de 95%, contra o logaritmo dos números de cópias de modelo iniciais nos padrões. A inclinação dessa curva (ou seja, CT contra concentração registrada) foi utilizada em seguida para estimar as cópias de genoma viral em uma amostra desconhecida a partir dos seus valores de CT correspondentes.

Utilizou-se DNA genômico de camarão infectado com uma 5 linhagem havaiana do IHHNV. O DNA total (347 ng/μΙ) foi diluído em série em água purificada para fornecer uma série de amostras com concentração de DNA que varia de 1 ng/μΙ a 1 fg/μΙ de DNA total. Controles negativos incluíram um controle de água que não contém modelo e duas amostras de DNA de camarão (50 ng por reação) obtidas de duas linhagens de camarão não 10 infectado (SPF) (Litopenaeus vannamei e Penaeus monodon).

As amostras diluídas foram amplificadas em seguida utilizando um dos pares de primers (vide Tabela 5) e as mesmas condições de amplificação, mistura master e ciclização térmica e instrumentos indicadas nos Exemplos 1 a 4. O valor CT para cada amostra de DNA diluída foi determinado 15 em seguida a partir das reações de amplificação de PCR. As cópias de genoma viral nas amostras foram estimadas em seguida a partir do valor CT e da inclinação da plotagem de CT padrão em comparação com a plotagem de concentração de modelos de registro. Os produtos de PCR também foram analisados por meio de eletroforese de gel de agarose, conforme descrito nos 20 Exemplos 1 a 4.

Os resultados encontram-se resumidos na Tabela 5. Na tabela, o número de cópias de IHHNV por reação é fornecido como a média de três réplicas junto com o intervalo de confiança de 95%. Os resultados indicam que todos os conjuntos de primers produziram o tamanho do produto de amplicon 25 correto do DNA de camarão infectado e DNA de IHHNV detectado nas amostras de camarão infectadas. Os limites de detecção variaram de cerca de duas cópias por reação a cerca de quarenta cópias por reação do genoma viral, dependendo do par de primers utilizado. Nenhum produto de amplificação foi detectado na amostra de controle de água nem nas duas amostras de camarões SPF. Os resultados obtidos com as amostras de controle negativo demonstram que o teste não reage a DNA não viral das duas linhagens de camarão testadas.

Tabela 5

Resultados de Deteccão de DNA de IHHNV de Camarão Infectado

Exemplo Primer Primer DNA de CT Cópias de frontal SEQ reverso camarão IHHNV por ID N0 SEQ ID N0 infectado reação por reação (ng 5 7 8 1 18,9 46 ± 2 x 104 5 7 8 0,1 21,2 3,9 ±0,2 x 104 5 7 8 0,01 25,1 1,0 ± 0,1 x 103 5 7 8 0,001 30,4 51 ± 0,5 x 102 5 7 8 0,0001 34,9 4 ±0,2 x 101 5 7 8 0,00001 > 40 0 5 7 8 0,000001 >40 0 5 7 8 0 (água) > 40 0 5 7 8 0 (SPF L. >40 0 vannamei (50 ng)) 5 7 8 0 (SPF P. >40 0 Exemplo Primer Primer DNA de CT Cópias de frontal SEQ reverso camarão IHHNV por ID N0 SEQ ID N0 infectado reação por reação (ng monodon (50 ng)) 6 1 2 1 25,3 1324 ±83 6 1 2 0,1 28,7 138 ±4 6 1 2 0,01 32,2 13 ± 2 6 1 2 0,001 35,7 2 ± 1 6 1 2 0,0001 >40 0 6 1 2 0,00001 >40 0 6 1 2 0,000001 >40 0 6 1 2 0 (água) > 40 0 6 1 2 0 (SPF L > 38 0 vannamei (50 ng)) 6 1 2 0 (SPF P. > 38 0 monodon (50 ng)) 7 3 4 1 24,8 868 ± 21 7 3 4 0,1 27,9 113 ± 12 7 3 4 0,01 31,9 9 ± 2 7 3 4 0,001 35,2 1 ± 1 7 3 4 0,0001 >40 0 7 3 4 0,00001 >40 0 Exemplo Primer Primer DNA de CT Cópias de frontal SEQ reverso camarão IHHNV por ID N0 SEQ ID N0 infectado reação por reação (ng 7 3 4 0,000001 >40 0 7 3 4 0 (água) >40 0 7 3 4 0 (SPF L >40 0 vannamei (50 ng)) 7 3 4 0 (SPF P. >40 0 monodon (50 ng)) 8 5 6 1 26,6 4800 ± 280 8 5 6 0,1 30,0 433 ±3 8 5 6 0,01 33,7 35 ±4 8 5 6 0,001 36,7 5 ± 1 8 5 6 0,0001 > 40 0 8 5 6 0,00001 >40 0 8 5 6 0,000001 > 40 0 8 5 6 0 (água) >40 0 8 5 6 0 (SPF L > 38 0 vannamei (50 ng)) 8 5 6 0 (SPF P > 38 0 monodon (50 ng)) Exemplo 9

O propósito deste Exemplo foi o de demonstrar que os primers descritos no presente amplificam DNA de linhagens de IHHNV de diferentes áreas geográficas do mundo, mas não amplificam DNA nem RNA de camarão infectado com outros patógenos de camarão.

Neste Exemplo, utilizou-se DNA de camarão infectado com outros patógenos de camarão. Especificamente, amostras de DNA isoladas de camarão infectado com linhagens de IHHNV de diferentes regiões geográficas (Havaí, Filipinas, Tailândia, Panamá, México, Moçambique e Madagascar) 10 junto com vírus de camarão não de IHHNV (MBV, WSSV, YHV e IMNV) foram testadas utilizando os primers e o método de PCR descrito nos Exemplos 5 a 8.

Todas as linhagens de IHHNV foram detectadas com limites de detecção similares à linhagem descrita nos Exemplos 5 a 8. Não se observou amplificação de PCR ao testar-se as amostras de DNA de camarão não 15 infectadas por IHHNV. Estas descobertas, tomadas em conjunto, demonstram que os primers de PCR de IHHNV e os métodos descritos no presente são seletivos para IHHNV e que os primers não reagem com DNA de camarão ou outros vírus de camarão.

Exemplo 10

Deteccão de DNA de IHHNV em Combinação com um Controle de Amostra

Interna Utilizando PCR

O propósito deste Exemplo foi o de demonstrar que os primers de IHHNV descritos no presente podem ser utilizados em combinação com primers de controle de amostra interna (ISC) para gerar um produto de ISC 25 além do produto de IHHNV. Os resultados apresentados abaixo demonstram que os primers de ISC amplificam independentemente DNA de amostra e não interferem com a amplificação de DNA de IHHNV. A presença do produto ISC fornece um marcador que pode ser utilizado como uma indicação de que DNA de amostra com quantidade e qualidade suficientes havia sido recuperado para testes.

Primers de ISC foram derivados da seqüência genética de actina

1 de Penaeus monodon (GenBank: AF100986). A fim de promover a amplificação preferencial do amplicon de IHHNV, os primers de ISC foram projetados para amplificar um fragmento de DNA que era maior que os amplicons de IHHNV alvo. As seqüências de pares de primers de ISC são fornecidas como SEQ ID N0 13, 14 e SEQ ID N0 15 e 16 (vide Tabela 2).

Amostras contendo DNA de actina de camarão e IHHNV foram 10 preparadas por meio de diluições em série por dez vezes de uma preparação de DNA genômico de um camarão infectado com IHHNV (Penaeus monodon) com água livre de DNase. O teor de DNA de amostras variou de 0,1 ng a 0,1 pg por reação. DNA genômico (10 ng) de um camarão não infectado foi adicionado em seguida a cada amostra de IHHNV e a amostras de controle 15 negativo que não contêm DNA de IHHNV.

Foi preparada uma mistura de PCR master por meio da combinação de 15 μΙ por reação da Mistura Master de PCR Verde SYBR® (Applied Biosystems, Foster City CA; Catálogo n° 4309155) com um volume de soluções padrão de primer (20 μΜ para cada um dos primers de IHHNV e 10 20 μΜ para cada um dos primers de actina) suficiente para gerar uma concentração final de 125 nM para cada um dos primers frontal e reverso de IHHNV54 (SEQ ID N0 7 e 8, respectivamente) e 32 nM para cada um dos primers frontal e reverso de actina (SEQ ID N0 13 e 14). Adicionou-se água livre de DNase para compor um volume final de 25 μΙ por reação. A mistura master 25 foi mantida sobre gelo até a utilização.

Para cada reação, 5 μΙ das amostras foram adicionados em primeiro lugar aos recipientes de reação de PCR e, em seguida, foram adicionados 25 μΙ da mistura master. As reações sofreram ciclização térmica em seguida por quarenta ciclos utilizando um programa de temperatura de 95 0C por quinze segundos e 60 0C por um minuto com uma etapa de desnaturação inicial de 95 0C por cinco minutos. A amplificação foi conduzida em uma placa de reação com 96 cavidades ótica MicroAmp utilizando o ciclizador térmico ABI PRISM 7900 (Applied Biosystems, Foster City CA).

Durante cada ciclo, a formação de produto foi monitorada pelo valor de CT determinado a partir do aumento da fluorescência decorrente da interação da tintura relatora Verde SYBR® com os produtos de amplificação de DNA, conforme descrito acima. Após quarenta ciclos, foi gerada uma curva de 10 dissociação (curva de fusão) ao longo da faixa de 60 0C a 95 0C. Dados foram analisados utilizando o software ABI PRISM 7900 SDS. Além disso, a formação de produto de PCR foi analisada por meio de eletroforese de gel de agarose utilizando 4% géis de agarose E (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad CA; Cat. n° G6018-02) e os protocolos de fabricação de gel.

Os resultados obtidos utilizando os primers de ISC Actina F2

(SEQ ID N0 13) e Actina R2 (SEQ ID N0 14) são exibidos nas Figuras 1A e 1B, que demonstram a amplificação simultânea dos dois alvos modelos. O DNA de IHHNV específico gerou um produto de 116 bp com uma temperatura de fusão de 80 0C. O ISC de actina gerou um produto de 239 bp (Tm = 83,8 0C). O 20 produto de IHHNV e os produtos de controle interno de actina foram detectados por meio de análise de curva de fusão (Figura 1A) e eletroforese de gel (Figura 1B) com base nessas diferenças de temperatura de fusão e tamanho. Na ausência de alvo de IHHNV e sob várias concentrações de alvo de IHHNV, a formação do produto de ISC foi detectada como um único pico de temperatura 25 de fusão a 83,8 0C (conforme exibido na Figura 1A) e por meio de eletroforese (conforme exibido na Figura 1B). Em todas as amostras que contêm o modelo de IHHNV, o amplicon de IHHNV específico foi detectado pela temperatura de fusão (Tm = 80 0C) e por meio de eletroforese de gel. Estes resultados demonstram que o modelo de ISC de actina coamplifica-se com o modelo de IHHNV e que a amplificação por PCR e o limite de detecção do teste de PCR (0,1 pg de DNA de IHHNV) não são afetados pela presença do ISC.

Exemplo 11

Detecção em Tempo Real de DNA de IHHNV Utilizando uma Sonda Marcada

de Forma Fluorescente

Este Exemplo demonstra que os primers de IHHNV descritos no presente podem ser utilizados em combinação com sondas marcadas de forma fluorescente para detecção em tempo real e quantificação de IHHNV.

As seqüências genéticas de construção das sondas marcadas de

forma fluorescente foram selecionadas por meio de análise dos genes de IHHNV e amplicons de teste utilizando software Primer Express® v2.0, adquirido da Applied BioSystems Inc. (Foster City CA, 94404). As seqüências de sondas foram selecionadas para enquadrar-se dentro das extremidades 15 próximas dos amplicons de teste de IHHNV específicos e possuíam 50 a 110 bases de comprimento, dependendo do tamanho e da seqüência do amplicon. Deu-se preferência para as seqüências de sondas para regiões com teor de G/C de 30 a 80%, com teor de C mais alto que G e sem 5’ G. Geralmente, foram selecionadas seqüências de sondas que possuem Tm de 8 a 10 0C 20 acima da Tm correspondente dos primers de teste. Seqüências de sondas com hibridização cruzada com outras espécies não foram selecionadas para uso. As seqüências de sondas selecionadas para atender a estes critérios são relacionadas na Tabela 6.

Para detecção em tempo real, as seqüências de sondas receberam marcação dupla. Foram empregadas duas abordagens de marcação diferentes. A extremidade 5’ das sondas foi marcada com um fluoroforo (6FAM®, Applied Biosystems). A extremidade 3’ foi marcada com uma tintura de resfriamento ou, no caso de uma sonda de união de ranhura menor (MGB)1 a extremidade 3’ foi marcada com uma tintura resfriadora e um complexo aglutinante de ranhura menor. As sondas marcadas foram preparadas e adquiridas comercialmente da Applied BioSystems. Os dados apresentados abaixo foram obtidos utilizando a sonda IHHNV4PT (SEQ ID N0 5 18). Antecipa-se que a sonda IHHNV4PM (SEQ ID N0 17) pode ser utilizada de uma forma similar.

Tabela 6

Seqüências de Sondas Marcadas Fluorescentes

Sonda SEQ ID N0 GenBank n° Localização Marca 5’ Marca(s) 3’ IHHNV4PM 17 AF218266 3444-3459 FAM1 MGB2 IHHNV4PT 18 AF218266 3481-3505 FAM TAMRA3 FAM é reagente 6FAM®, Applied Biosystems.

2 MGB é MGB®, Applied Biosystems.

3 TAMRA é 6-carboxitetrametilrodamina.

Padrões de modelos foram preparados por meio de diluições em série por dez vezes dos modelos de IHHNV sintéticos (descritos acima) em água livre de DNase. Geralmente, as concentrações de modelos dos padrões 15 variaram de 107 a 0 cópias por μΙ. Foi preparada uma mistura master por meio de combinação de 25 μΙ por reação da Mistura Master Universal TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City CA; Catálogo n° 4326708) com um volume de soluções padrão de primer (20 μΜ para cada um dos primers de IHHNV) suficiente para gerar uma concentração final de 125 nM para cada um dos 20 primers frontal e reverso de IHHNV apropriados, conforme exibido na Tabela 7, um volume da solução padrão de sonda para gerar uma concentração final de 50 nM e água livre de DNase suficiente para compor um volume final de 45 μΙ por reação. A mistura master foi mantida sobre gelo até a utilização.

Para cada reação, 5 μΙ de modelo padrão e, em seguida, 45 μΙ da mistura master foram adicionados a cada recipiente de reação de PCR. As reações sofreram ciclização térmica em seguida por quarenta ciclos utilizando um programa de temperatura de 95 0C por quinze segundos e 60 0C por um minuto, com uma etapa de desnaturação inicial de 95 0C por dez minutos. As amplificações foram conduzidas em uma placa de reação com 96 cavidades 5 ótica MicroAmp utilizando o ciclizador térmico ABI PRISM 7900 (Applied Biosystems, Foster City CA). Durante cada ciclo, a formação de produto de PCR foi detectada por meio de monitoramento do aumento da fluorescência decorrente da sonda marcada de forma fluorescente.

Os dados foram analisados utilizando software ABI SDS 2.2. Além disso, a formação de produtos de PCR foi analisada por meio de eletroforese de gel de agarose utilizando 4% géis de agarose E (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad CA; Cat. n° G6018-02) e os protocolos do fabricante.

Os resultados, resumidos na Tabela 7, demonstram que o produto de amplicon com tamanho apropriado foi produzido para cada conjunto de primer e sonda na presença do modelo de IHHNV apropriado. O nível de modelo mínimo detectável foi de cinqüenta cópias por reação. Amostras que não continham modelo não geraram produto detectável.

Amplificação (CT) e a formação de produtos de amplicon foram, respectivamente, inversa e diretamente proporcionais ao logaritmo da concentração de modelo inicial.

Tabela 7

Resultados de Amplificação por PCR Utilizando um Alvo Sintético

Primer Primer Modelo, Sonda, Tamanho Modelo mínimo frontal, reverso, SEQ ID N0 SEQ ID N0 do produto detectável SEQ ID N0 SEQ ID N0 (bp) (cópias/reação) 7 8 12 18 116 50 Listagem de seqüências

<110> E.I. du Pont de Nemours and Co. Ebersole, Richard

<120> Diagnóstico de Seqüências <130> CL3542 <160> 18 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> Primer <223> <400> 1 cattctaccg tggtgcttca tagg

24

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer

<4 00> 2

ttcgtcgtcg ggatgacagt gt

22

<210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Primer <4 00> 3 gatcctaagg tctgcgtgga taacc <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <22 0> <223> Primer <400> 4 caacacttcc aagggaggtt tctga <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Seqüência Artificial 25

25 <220> <223> Primer <4 00> 5 agatacggta ttgaacggct <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Seqüência Arti: <220> <223> Primer <400> 6 25

tccgtctact gcgtcttcgt ctctt 25

<210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Primer <400> 7 gtatggcgga gaaataccaa caac <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Primer <4 00> 8 ttgtatggtg gtctgctggg tagac <210> 9 <211> 119 < 212 > DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Modelo IHHNV sintéti' 24

25

<4 00> 9

cattctaccg tggtgcttca tagggaacag acccgtttct ctactgcctc tgcaacgagt 60

gttttataga caatctcaat gtcaacggac agtgtctaca ctgtcatccc gacgacgaa 119

<210> 10 <211> 100 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Modelo IHHNV sintético <400> 10 gatcctaagg tctgcgtgga taacctggga attcgagagg gaacaggaaa cggaacaatt caacttggaa gtgaatcaga aacctccctt ggaagtgttg

<210> 11 <211> 108 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Modelo IHHNV sintético <400> 11

agatacggta ttgaacggct ttcgtatttt ggtcttggcc acgccatttt taaacgaatc atcaaatact tccaacaata cagaagagac gaagacgcag tagacgga

<210> 12 <211> 116 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Modelo IHHNV sintético <400> 12 gtatggcgga gaaataccaa caaccggacc caccttcatc ccaaaatggg gtggtcaatt

aaaatgggac aaaccatccc ttggaaacct agtctaccca gcagaccacc atacaa

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer

<400> 13

cgaaaccttc aacacacccg c

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer

<400> 14

cggtggtggt gaaggagtag cc

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Primer

<400> 15

gtcctcctta ctgaggctcc c <210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer

<400> 16

gaggtcacga ccagccaagt cg 22

<210> 17

<211> 16

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Exame de DNA marcado fluorescentemente <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Marcado com FAM

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(16)

<223> Marcado com MGB

<400> 17

acccaccttc atccca 16

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Exame de DNA marcado fluorescentemente <220>

<221> misc_feature

<222> (1) .. (1)

<223> Marcado com FAM

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(25)

<223> Marcado com TAMRA

<4 00> 18

tgggacaaac catcccttgg aaacc

25

Claims (28)

1. SEQÜÊNCIA DE PRIMERS DE DIAGNÓSTICO DE IHHNV ISOLADA, de acordo com SEQ ID N0 1 ou molécula de ácido nucléico isolada que é completamente complementar a SEQ ID N0 1.

2. SEQÜÊNCIA DE PRIMERS DE DIAGNÓSTICO DE IHHNV ISOLADA, de acordo com SEQ ID N0 2 ou molécula de ácido nucléico isolada que é completamente complementar a SEQ ID N0 2.

3. SEQÜÊNCIA DE PRIMERS DE DIAGNÓSTICO DE IHHNV ISOLADA, de acordo com SEQ ID N0 3 ou molécula de ácido nucléico isolada que é completamente complementar a SEQ ID N0 3.

4. SEQÜÊNCIA DE PRIMERS DE DIAGNÓSTICO DE IHHNV ISOLADA, de acordo com SEQ ID N0 4 ou molécula de ácido nucléico isolada que é completamente complementar a SEQ ID N0 4.

5. SEQÜÊNCIA DE PRIMERS DE DIAGNÓSTICO DE IHHNV ISOLADA, de acordo com SEQ ID N0 5 ou molécula de ácido nucléico isolada que é completamente complementar a SEQ ID N0 5.

6. SEQÜÊNCIA DE PRIMERS DE DIAGNÓSTICO DE IHHNV ISOLADA, de acordo com SEQ ID N0 6 ou molécula de ácido nucléico isolada que é completamente complementar a SEQ ID N0 6.

7. SEQÜÊNCIA DE PRIMERS DE DIAGNÓSTICO DE IHHNV ISOLADA, de acordo com SEQ ID N0 7 ou molécula de ácido nucléico isolada que é completamente complementar a SEQ ID N0 7.

8. SEQÜÊNCIA DE PRIMERS DE DIAGNÓSTICO DE IHHNV ISOLADA, de acordo com SEQ ID N0 8 ou molécula de ácido nucléico isolada que é completamente complementar a SEQ ID N0 8.

9. PAR DE DIFERENTES SEQÜÊNCIAS DE PRIMERS DE DIAGNÓSTICO DE IHHNV, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, em que o par é capaz de servir de primer de uma reação de amplificação de ácido nucléico que amplifica uma região de ácido nucléico no genoma de IHHNV.

10. PAR DE DIFERENTES SEQÜÊNCIAS DE PRIMERS DE DIAGNÓSTICO DE IHHNV, de acordo com a reivindicação 9, em que o par é selecionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID N0 1 e 2, SEQ ID N0 3 e 4, SEQ ID N0 5 e 6, SEQ ID N0 7 e 8 e SEQ ID N0 1 e 4.

11. KIT DE DETECÇÃO DE IHHNV, que compreende pelo menos um par de seqüências de primers de diagnóstico de IHHNV de acordo com a reivindicação 9.

12. KIT DE DETECÇÃO DE IHHNV, de acordo com a reivindicação 10, em que o kit compreende adicionalmente pelo menos um reagente selecionado a partir do grupo que consiste de uma polimerase termoestável, mistura de quatro trifosfatos de deoxinucleotídeos diferentes, uma molécula fluorescente de união de ácido nucléico, pelo menos um par de primers de controle de amostra interna, pelo menos um controle de modelo interno e pelo menos um par de primers de controle de modelo interno e uma sonda que compreende uma seqüência complementar a uma parte de pelo menos uma região de ácido nucléico no genoma de IHHNV que é capaz de ser amplificado com o pelo menos um par de seqüências de primers de diagnóstico de IHHNV.

13. MÉTODO DE DETECÇÃO DA PRESENÇA DE IHHNV EM AMOSTRAS, que compreende: (i) fornecimento de DNA de uma amostra suspeita de conter o IHHNV; e (ii) sondagem do DNA com uma sonda derivada da seqüência de primers de diagnóstico de IHHNV isolada de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8 sob condições de hibridização apropriadas; em que a identificação de um fragmento de ácido nucléico hibridizável confirma a presença de IHHNV.

14. MÉTODO DE DETECÇÃO DA PRESENÇA DE IHHNV EM AMOSTRAS, de acordo com a reivindicação 13, em que a sonda derivada da seqüência de primer de diagnóstico de IHHNV isolada é selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N0 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 e as suas seqüências complementares completas.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, em que a sonda contém uma parte inibidora da reprodução na extremidade 3’.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, em que a parte inibidora da reprodução é selecionada a partir do grupo que consiste de dideoxinucleotídeos, 3’ deoxinucleotídeos, uma seqüência de nucleosídeos ou nucleotídeos não coincidentes, grupos 3’ fosfato e agentes químicos.

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 16, em que o 3’ deoxinucleotídeo é cordicepina.

18. MÉTODO DE DETECÇÃO DA PRESENÇA DE IHHNV EM AMOSTRAS, que compreende: (i) fornecimento de DNA de uma amostra suspeita de conter IHHNV; e (ii) amplificação do DNA com pelo menos um par de seqüências de primers de diagnóstico de IHHNV de acordo com a reivindicação 9, de tal forma que sejam gerados produtos de amplificação; em que a presença de produtos de amplificação confirma a presença de IHHNV.

19. MÉTODO DE DETECÇÃO DA PRESENÇA DE IHHNV EM AMOSTRAS, de acordo com a reivindicação 18, em que a amplificação de (ii) é realizada utilizando a reação em cadeia de polimerase.

20. MÉTODO DE DETECÇÃO DA PRESENÇA DE IHHNV EM AMOSTRAS, de acordo com a reivindicação 18, em que a amplificação de (ii) é realizada na presença de um agente fluorescente de união de ácido nucléico ou uma sonda marcada de forma fluorescente e a presença de produtos de amplificação é confirmada utilizando detecção por fluorescência.

21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, em que a sonda marcada de forma fluorescente é selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N0 17 e 18.

22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18, em que pelo menos um par de primers de controle de amostras internas é incluído na amplificação de (ii) para gerar um produto de controle de amostra interna.

23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 22, em que o pelo menos um par de primers de controle de amostra interna é selecionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID N0 13, 14 e SEQ ID N0 15, 16.

24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18, em que pelo menos um par de primers de controle de modelo interno e pelo menos um controle de modelo interno são incluídos na amplificação de (ii) para gerar um produto de controle de modelo interno.

25. MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DA QUANTIDADE DE IHHNV EM UMA AMOSTRA, que compreende: (i) fornecimento de DNA de uma amostra suspeita de conter IHHNV; (ii) amplificação do DNA com pelo menos um par de seqüências de primers de diagnóstico de IHHNV de acordo com a reivindicação 9 por meio de ciclização térmica entre pelo menos uma temperatura de desnaturação e uma temperatura de extensão na presença de um agente fluorescente de união de ácido nucléico ou uma sonda marcada de forma fluorescente; (iii) medição da quantidade de fluorescência gerada pelo agente fluorescente de união de ácido nucléico ou pela sonda marcada de forma fluorescente durante a ciclização térmica; (iv) determinação de um número limite de ciclos em que a quantidade de fluorescência gerada pelo agente fluorescente de união de ácido nucléico ou a sonda marcada de forma fluorescente atinge um valor limite fixo acima de um valor de linha base; e (v) cálculo da quantidade de IHHNV na amostra por meio de comparação do número limite de ciclos determinado para o IHHNV na amostra com uma curva padrão do número limite de ciclos com o logaritmo da concentração de modelo determinada utilizando soluções padrão com concentração conhecida.

26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 25, em que a sonda marcada de forma fluorescente é selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N0 17 e SEQ ID N0 18.

27. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 13, 18 ou 25, em que o método é utilizado para determinar lesões de DNA ou desativação de IHHNV.

28. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 13, 18 ou 25, em que o método é utilizado em combinação com tratamento químico para melhorar a saúde e o crescimento de camarão.