ES2256920T3 - Amplificacion y deteccion de vih-1 y/o vih-2. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A METODOS Y EQUIPAMIENTOS DE ENSAYO PARA LA AMPLIFICACION Y DETECCION DE ACIDOS NUCLEICOS PROCEDENTES DEL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA (VIH) DE TIPO 1 Y/O DE TIPO 2. DICHOS METODOS EMPLEAN SISTEMAS DE CEBADORES MULTIPLES PARA AMPLIFICAR TODOS LOS SUBTIPOS DEL VIH-1, INCLUYENDO LOS AISLADOS DEL GRUPO M Y DEL GRUPO O, Y TODOS LOS SUBTIPOS DEL VIH-2.

Description

Amplificación y detección de VIH-1 y/o VIH-2.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos y a equipos de análisis para la amplificación y la detección del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). En concreto, la presente invención se refiere a procedimientos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction) que usan múltiples conjuntos de cebadores para amplificar todos los subtipos del VIH-1, incluyendo aislados del grupo M y el grupo O, y todos los subtipos del VIH-2.

2. Información sobre los antecedentes

Se han realizado progresos en la ampliación de nuestro conocimiento sobre el síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y su agente causante, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Se han identificado dos grupos de virus de inmunodeficiencia humana, el VIH-1 y el VIH-2. El VIH-1 y el VIH-2 están genéticamente relacionados, pero sin embargo, son distintos. Tanto el VIH-1 como el VIH-2 muestran una considerable variabilidad genética entres sus diferentes aislados. De hecho, se han identificado diez subtipos de VIH-1 (comprendiendo el grupo M de los subtipos de A a I, y el grupo O, el subtipo O). Aunque las secuencias de consenso para el VIH-1 y el VIH-2 han sido generadas a partir de las secuencias de nucleótidos publicadas de varios aislados del VIH-1 y del VIH-2, es imposible encontrar regiones sustanciales de conservación absoluta de secuencias entre todos los aislados del VIH-1 o todos los aislados del VIH-2. Además de la variabilidad genética encontrada entre los aislados del VIH, muchas regiones de nucleótidos del VIH están tan altamente conservadas entre el VIH y virus no relacionados como lo están dentro de las familias del VIH1- y VIH-2. Todos estos hechos juntos dificultan extremadamente el diseño de cebadores y sondas de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que detectarían de forma eficaz todos los subtipos del grupo M y del grupo O del VIH-1, y todos los subtipos del VIH-2, sin detectar equivocadamente virus no relacionados. El documento EP0727497, por ejemplo, introduce un procedimiento de PCR por multiplexión con cebadores que permiten exclusivamente la amplificación del ácido nucleico pol de todos los subtipos conocidos del VIH-1. Lo que no se puede extraer de dicha técnica anterior son las combinaciones de cebadores que amplifican ácidos nucleicos tanto del VIH-1 como del VIH-2 en una reacción. El documento EP0630973 introduce un procedimiento de PCR por multiplexión para algunas cepas del VIH-1 y del VIH-2 en el que los cebadores usados derivan de diferentes localizaciones genómicas.

Uno de los retos a los que se enfrentan aquéllos que intentan desarrollar sistemas de amplificación para detectar todos los subtipos conocidos del VIH-1 y del VIH-2 es el desarrollo de conjuntos de cebadores de oligonucleótido que actúen adecuadamente cuando se usen conjuntamente bajo un único grupo de condiciones de amplificación (tales como condiciones salinas, temperaturas y tiempos de amplificación). La identificación de cebadores y de sondas de detección que sean compatibles en términos de interacciones cebador-cebador y cebador-sonda es un reto todavía mayor. Por lo tanto, en el caso de la amplificación y la detección del VIH-1 y/o VIH-2, todavía existe la necesidad de etapas que maximicen la probabilidad de detectar subtipos o aislados altamente divergentes bajo condiciones no ideales.

Resumen de la invención

La presente invención supera los problemas anteriormente señalados y proporciona un procedimiento necesario de amplificación y detección de aislados del VIH-1 y/o del VIH-2 altamente divergentes. Por lo tanto, un objeto de la presente invención consiste en proporcionar procedimientos y equipos de análisis para la detección de todos los subtipos del VIH-1 y/o del VIH-2 conocidos.

Otros objetos y ventajas diversos de la presente invención resultarán evidentes a partir de la descripción detallada de la invención.

En una realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para amplificar ácidos nucleicos del VIH-1. El procedimiento comprende poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene ácidos nucleicos del VIH-1 con cuatro nucleósidos trifosfato distintos, una polimerasa de ADN termoestable y al menos cuatro oligonucleótidos, en condiciones tales que el ácido nucleico diana del VIH-1 sea amplificado. Los cuatro oligonucleótidos son seleccionados entre los conjuntos:

(a)

SEQ ID Nº: 1, 3, 7 y 8;

(b)

SEQ ID Nº: 1, 4, 7 y 8;

(c)

SEQ ID Nº: 2, 3, 7 y 8; y

(d)

SEQ ID Nº: 2, 4, 7 y 8.

En otra realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para amplificar VIH-2 que comprende poner en contacto una muestra con cuatro nucleósidos trifosfato distintos, una polimerasa de ADN termoestable y al menos cuatro oligonucleótidos, en condiciones tales que el ácido nucleico diana del VIH-2 sea amplificado. Los cuatro oligonucleótidos son seleccionados entre los conjuntos:

(a)

SEQ ID Nº: 11, 12, 14 y 16;

(b)

SEQ ID Nº: 11, 12, 15 y 16;

(c)

SEQ ID Nº: 11, 12, 18 y 20;

(d)

SEQ ID Nº: 11, 12, 19 y 20;

(e)

SEQ ID Nº: 14, 16, 18 y 20;

(f)

SEQ ID Nº: 14, 16, 19 y 20;

(g)

SEQ ID Nº: 15, 16, 18 y 20; y

(h)

SEQ ID Nº: 15, 16, 19 y 20.

En otra realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para amplificar conjuntamente ácido nucleido diana del VIH-1 y del VIH-2. Una muestra que se sospecha que contiene cualquier ácido nucleico del VIH es puesta en contacto con cuatro nucleósidos trifosfato distintos, una polimerasa de ADN termoestable y al menos un par de cebadores seleccionados entre las SEQ ID Nº: 1, 2, 3, 4, 7 y 8, y al menos un par de cebadores seleccionados entre las SEQ ID Nº: 11, 12, 14, 15, 16, 18, 19 y 20, en condiciones tal que los ácidos nucleicos diana del VIH-1 y VIH-2 sean amplificados.

Descripción detallada de la invención

El desarrollo de un sistema de amplificación conjunta para el VIH-1 y el VIH-2 que pueda detectar sensible y específicamente todos los subtipos de VIH-1 y VIH-2 supone un enorme reto por varias razones: (1) la diversidad a nivel de secuencias de ácidos nucleicos entre los aislados individuales, (2) la necesidad de minimizar las interacciones de cebador-cebador entre al menos 8-10 cebadores, pues la formación de productos secundarios reducirá la sensibilidad del análisis y, posiblemente, la especificidad, (3) la necesidad de detectar específicamente los productos amplificados, que idealmente debería realizarse mediante la hibridación de oligonucleótidos con una sonda interna a los cebadores de amplificación y (4) la necesidad de controlar tanto la presencia de inhibidores en los especimenes preparados del paciente como también la recuperación ineficaz del ácido nucleico diana a partir de la preparación muestra. Los solicitantes han superado estos obstáculos y llegado a la presente invención referida a la amplificación y/o la detección de ácidos nucleicos del VIH-1 y VIH-2.

En la presente invención, los conjuntos de cebadores que han sido desarrollados para el VIH-1 y el VIH-2 son compatibles entre sí y, por lo tanto, pueden der combinados para realizar un análisis complejo de amplificación conjunta que pueda detectar todos los aislados secuenciados del VIH-1 y el VIH-2. Con los procedimientos de la presente invención, los expertos en la técnica son capaces de amplificar y detectar sensible y específicamente ácidos nucleicos diana tanto del VIH-1 como del VIH-2 con un grado alto de fiabilidad. Esta amplificación y detección pueden ser llevadas a cabo de un modo multiplexado y en presencia de un control positivo interno (CPI) que señalice los resultados de falsos negativos debidos a problemas en la preparación, la amplificación y/o la detección de las muestras.

La presente invención se refiere a procedimientos para amplificar ácidos nucleicos del VIH-1 y/o del VIH-2. Se ha identificado que los conjuntos de cebadores de oligonucleótido, cuando se usan en diversas combinaciones, amplifican sensible y específicamente ácidos nucleicos diana de todos los aislados conocidos del VIH-1 y/o del VIH-2. Para amplificar los ácidos nucleicos diana del VIH-1 según la presente invención, los conjuntos de cebadores son seleccionados entre los siguientes oligonucleótidos:

VIH-1

Cebadores de la región LTR:

1

Cebadores de la región POL:

2

En los procedimientos de la presente invención, el ácido nucleico diana del VIH-1 es amplificado poniendo en contacto una muestra biológica que se sospecha que contiene ácidos nucleicos del VIH con un conjunto de cebadores que comprende al menos cuatro oligonucleótidos. Los conjuntos de cebadores adecuados para ser usados en la presente invención incluyen, pero no se limitan a:

(a)

SEQ ID Nº: 1, 3, 7 y 8;

(b)

SEQ ID Nº: 1, 4, 7 y 8;

(c)

SEQ ID Nº: 2, 3, 7 y 8; y

(d)

SEQ ID Nº: 2, 4, 7 y 8.

Los cuatro oligonucleótidos de estos conjuntos de cebadores, pueden ser usados solos o en combinación con otros cebadores del VIH-1 o del VIH-2. Por ejemplo, la SEQ ID Nº: 2 de oligonucleótidos podría ser usada en conexión con los conjuntos de cebadores (a) o (b) anteriores. Los conjuntos de cebadores preferidos son:

(a)

SEQ ID Nº: 1, 2, 3, 7 y 8;

(b)

SEQ ID Nº: 1, 2, 4, 7 y 8;

(c)

SEQ ID Nº: 2, 3, 4, 7 y 8; y

(d)

SEQ ID Nº: 1, 3, 4, 7 y 8; y

(e)

SEQ ID Nº: 1, 2, 3, 4, 7 y 8.

El más preferido es el conjunto de cebadores que contiene oligonucleótidos correspondientes a las SEQ ID Nº: 2, 3, 4, 7 y 8. Cualquiera de estos conjuntos de cebadores puede ser usado para amplificar ácido nucleico de todos los subtipos conocidos del VIH-1, incluyendo el grupo M y el grupo O.

Además de con el conjunto o los conjuntos de cebadores, la muestra biológica también es puesta en contacto con reactivos de la PCR, tales como cuatro nucleósidos trifosfato diferentes y una polimerasa de ADN termoestable, en condiciones tales que cualquier ácido nucleico del VIH-1 que esté presente en la muestra será amplificado.

Para amplificar ácido nucleico diana del VIH-2 según la presente invención, los conjuntos de cebadores son seleccionadas entre los siguientes oligonucleótidos:

VIH-2

Cebadores de la región ENV:

3

Cebadores de la región LTR:

4

\newpage

Cebadores de la región POL:

5

En los procedimientos de la presente invención, el ácido nucleico diana del VIH-2 es amplificado poniendo en contacto una muestra biológica que se sospecha que contiene ácido nucleico del VIH-2 con un conjunto de cebadores que comprende al menos cuatro oligonucleótidos. Los conjuntos de cebadores adecuados para ser usados en la presente invención incluyen, pero no se limitan a,:

(a)

SEQ ID Nº: 11, 12, 14 y 16;

(b)

SEQ ID Nº: 11, 12, 15 y 16;

(c)

SEQ ID Nº: 11, 12, 18 y 20;

(d)

SEQ ID Nº: 11, 12, 19 y 20;

(e)

SEQ ID Nº: 14, 16, 18 y 20;

(f)

SEQ ID Nº: 14, 16, 19 y 20;

(g)

SEQ ID Nº: 15, 16, 18 y 20;

(h)

SEQ ID Nº: 15, 16, 19 y 20.

Se prefiere el conjunto de cebadores que contiene oligonucleótidos correspondientes a las SEQ ID Nº: 11, 12, 14 y 16. Se puede usar cualquiera de estos conjuntos de cebadores para amplificar ácido nucleico de todos los subtipos conocidos del VIH-2.

Además de con el conjunto o los conjuntos de cebadores, la muestra biológica también es puesta en contacto con reactivos de la PCR, tales como cuatro nucleósidos trifosfato diferentes y polimerasa de ADN termoestable, en condiciones tales que cualquier ácido nucleico diana del VIH-2 que esté presente en la muestra sea amplificado.

Para amplificar tanto VIH-1 como VIH-2, se pone en contacto una muestra biológica con un conjunto de cebadores del VIH-1 de la presente invención junto con un conjunto de cebadores del VIH-2 de la presente invención. Preferiblemente, la muestra biológica es puesta en contacto con oligonucleótidos correspondientes a las SEQ ID Nº: 2, 3, 4, 7, 8, 11, 12, 14 y 16. El uso de tal conjunto de cebadores puede amplificar ácido nucleico diana de cualquier subtipo conocido del VIH-1 y/o del VIH-2 que esté presente en la muestra.

Los procedimientos de la presente invención utilizan, en algunos casos, más de dos cebadores para amplificar las secuencias de ácidos nucleico diana que traslapan una región de sonda común tal como un conjunto de cebadores que incluye las SEQ ID Nº: 2, 3 y 4. Esto maximiza la sensibilidad y la robustez de la cepa del sistema de amplificación. Esta novedosa característica aumenta la sensibilidad de la cepa del sistema de análisis y permite la combinación de cebadores cada uno con sus respectivas ventajas, tal que se logra una mayor eficacia de amplificación y una mayor homología de secuencias entre los aislados, aumentado, en efecto, la sensibilidad y la robustez del sistema de amplificación.

Una vez que la diana del VIH-1 y/o del VIH-2 es amplificada usando el conjunto o los conjuntos de cebadores de la presente invención, se puede detectar la presencia o la ausencia de la diana de VIH amplificada usando procedimientos de detección conocidos. Por ejemplo, se puede detectar el ácido nucleico diana amplificado usando una o más sondas de oligonucleótido específicas del ácido nucleico diana del VIH-1 o del VIH-2 amplificado. Los expertos en la técnica pueden identificar fácilmente las sondas de oligonucleótido que serían adecuadas para detectar el ácido nucleico diana del VIH-1 y/o del VIH-2 amplificado en función de los conjuntos de cebadores usados. Las sondas de oligonucleótido adecuadas para ser usadas en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, los siguiente oligonucleótidos:

VIH-1

Sondas de la región LTR:

6

\newpage

Sondas de la región POL:

7

VIH-2

Sondas de la región POL:

8

Preferiblemente, las dianas del VIH-1 y del VIH-2 amplificados son detectadas usando sondas correspondientes a las SEQ ID Nº: 5, 6, 9 y 10, con cualquiera de las siguiente combinaciones: SEQ ID Nº: 21 y 22.

La presente invención usa sondas de solapamiento múltiple para detectar todos los aislados conocidos cuando se sondea en regiones que tienen un grado bajo de conservación secuencial con respecto a las regiones de cebadores. Esto permite que los cebadores de amplificación sean diseñados en regiones que no estén separadas por una región de sonda altamente conservada o altamente específica, normalmente requerida para la detección específica de secuencias del producto de amplificación. En algunas situaciones, tales como con el VIH-1, las se necesitan múltiples sondas para detectar todos los aislados conocidos con una sensibilidad elevada.

Los principios y las condiciones generales para la amplificación y la detección de ácidos nucleicos usando la PCR son bastante conocidos, proporcionándose información detallada de los mismos en numerosas referencias, incluyendo las patentes estadounidenses nº: 4.683.195 (Mullis et al.), 4.683.202 (Mullis) y 4.965.188 (Mullis et al.), todas ellas incorporadas en la presente memoria por referencia. De este modo, en vista de las enseñanzas de la técnica y de las enseñanzas específicas proporcionadas en la presente memoria, cualquier experto en la técnica no debería tener problemas en poner en práctica la presente invención destinada a detectar todos los subtipos conocidos del VIH-1 y del VIH-2.

El término "muestra biológica" incluye, pero no se limita a, material celular o vírico, cabello, fluidos corporales o material celular que contiene ácidos nucleicos que puedan ser detectados.

El término "oligonucleótido" se refiere a una molécula compuesta de uno o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, tales como cebadores, sondas y fragmentos de ácidos nucleico por detectar.

El término "cebador" se refiere a un oligonucleótido, bien natural o producido sintéticamente, que es capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis cuando se coloca en condiciones en las que se induce la síntesis de un producto de extensión de cebadores complementario a una cadena de ácido nucleico (es decir, un molde), incluyendo tales condiciones la presencia de otros reactivos de la PCR, así como una temperatura y un pH adecuados.

Es preferible que el cebador sea monocatenario para conseguir la máxima eficacia en la amplificación, pero, si se desea, puede contener una región bicatenaria. Debe ser lo suficientemente largo como para cebar la síntesis de los productos de extensión en presencia de la polimerasa de ADN. El tamaño exacto de cada cebador variará en función del uso destinado para el mismo, de la concentración y de la secuencia del cebador, de la complejidad de la secuencia diana, de la temperatura de al reacción y de la fuente del cebador. Generalmente, los cebadores usados en esta invención tendrán de 12 a 60 nucleótidos, y preferiblemente, tienen de 16 a 40 nucleótidos. Más preferiblemente, cada cebador tiene de 18 a 35 nucleótidos.

Los cebadores útiles en la presente memoria pueden ser preparados usando técnicas y equipos conocidos, incluyendo, por ejemplo, un sintetizador de ADN ABI (disponible en Applied Biosystems) o un sintetizador Biosearch serie 8600 o serie 8800 (disponible en Milligen-Biosearch, Inc.). Los procedimientos para usar este equipo son conocidos y están descritos, por ejemplo, en la patente estadounidense nº: 4.965.188 (Gelfand et al.,), incorporada en la presente memoria por referencia. Los cebadores naturales aislados de fuentes biológicas también pueden ser útiles (tales como digestos de la endonucleasa de restricción). Generalmente, se usa un conjunto de al menos dos cebadores por cada ácido nucleico diana. De este modo, se puede usar una pluralidad de conjuntos de cebadores simultáneamente para amplificar una pluralidad de ácidos nucleicos diana.

Como se usa en la presente memoria, una "sonda" es un oligonucleótido que es sustancialmente complementario a una secuencia de ácido nucleico del ácido nucleico diana y que se usa para la detección y la captura del ácido nucleico diana amplificado.

En la presente invención, se proporcionan cebadores y sondas con especificidad secuencial. Será evidente para los expertos en la técnica que es posible preparar otros cebadores y sondas con especificidad secuencial mediante, por ejemplo, la adición de nucleótidos bien al extremo 5' o al 3', cuyos nucleótidos son complementarios o no complementarios a la secuencia diana. Tales composiciones pertenecen al alcance de la invención.

Los cebadores y/o las sondas usadas en la presente invención pueden estar opcionalmente marcadas. Mediante el uso de procedimientos conocidos en la técnica, los cebadores y/o las sondas pueden ser marcados con un ligando de unión específica (tal como la biotina), una enzima (tal como la glucosa oxidara, peroxidasas, uricasa y alcalino fosfatasa), radioisótopos, reactivos de densidad electrónica, cromogenes, fluorogenes, restos fosforescentes o ferritina. Preferiblemente, la etiqueta es un ligando de unión específica. Más preferiblemente, la etiqueta es biotina o un derivado de la misma, estreptavidina o un derivado de la misma, o un hapteno.

El término "Reactivo de la PCR" se refiere a cualquiera de los reactivos considerados esenciales para la PCR, concretamente, un conjunto de cebadores por cada ácido nucleico diana, una polimerasa de ADN, un cofactor de la polimerasa de ADN y uno o más desoxirribonucleótido-5'-trifosfatos (dNTP). Más abajo se describen otros reactivos y materiales opcionales usados en la PCR. Estos reactivos pueden ser proporcionados individualmente, como parte de un equipo de análisis, o en las cámaras de reactivos de los dispositivos de análisis.

La polimerasa de ADN es una enzima que añadirá moléculas de desoxinucleósido monofosfato al extremo hidroxilo-3' del cebador en un complejo de cebador y molde, pero esta adición se hace de una manera dependiente del molde. Generalmente, la síntesis de los productos de extensión avanza en el sentido de 5' a 3' de la cadena recién sintetizada hasta que la síntesis es finalizada. Las polimerasas de ADN útiles incluyen, por ejemplo, polimerasa I de ADN de E. coli, polimerasa de ADN de T4, polimerasa Klenow, transcriptasa inversa y otras conocidas en la técnica. Es preferible que la polimerasa de ADN sea termoestable, lo que significa que es estable al calor y, de forma preferente, activa a temperaturas superiores, especialmente a las temperaturas elevadas que se usan para el cebado específico y la extensión de cadenas de ADN. Más concretamente, las polimerasas de ADN termoestables no son sustancialmente inactivas a las temperaturas elevadas usadas en las reacciones en cadena de la polimerasa como se describe en la presente memoria. Tales temperaturas variarán en función de una serie de condiciones de reacción, incluyendo el pH, la composición de los nucleótidos, la longitud de los cebadores, la concentración de sales y otras condiciones conocidas en la técnica.

En la técnica, se ha informado acerca de un número de polimerasas de ADN termoestables, incluyendo las mencionadas detalladamente en las patentes estadounidenses nº: 4.965.188 (Gelfand et al.) y nº: 4.889.818 (Gelfand et al.), ambas incorporadas en la presente memoria por referencia. Las polimerasas particularmente útiles son aquéllas obtenidas de diversas especies de bacterias Thermus, tales como Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus filiformis y Thermus flavus. También se obtienen otras polimerasas termoestables útiles de diversas fuentes microbianas incluyendo Thermococcus literalis, Pyrococcus furiosus, Thermotoga sp. y aquéllas descritas en el documento WO-A-89/06691 (publicado el 27 de julio de 1989). Algunas de las polimerasas termoestables útiles se encuentran comercialmente disponibles, tales como, AmpliTaq®, Tth y UlTma® de Perkin Elmer, Pfu de Stratagene, y Vent y Deep-Vent de New England Biolabs. También se conocen una serie de técnicas para aislar polimerasas naturales de organismos y para producir enzimas transformadas por ingeniería genética usando técnicas recombinantes.

El cofactor de polimerasa de ADN se refiere a un compuesto no proteico del que la enzima depende para tener actividad. De ese modo, la enzima es catalíticamente inactiva sin la presencia del cofactor. Hay una serie de materiales que son conocidos cofactores incluyendo, pero no limitándose a, sales de manganeso y magnesio, tales como cloruros, sulfatos, acetatos y sales de ácidos grasos. Los cloruros y los sulfatos de magnesio son los preferidos.

Además, para la PCR son necesarios dos o más desoxirribonucleósido-5'-trifosfatos, talles como dos o más dATP, dCTP, dGTP, dTTP y dUTP. También son útiles los análogos tales como el dITP y el 7-deaza-dGTP. Es preferible que los cuatro trifosfatos comunes (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) se usen conjuntamente.

Los reactivos de la PCR descritos en la presente memoria son proporcionados y usados en la PCR a concentraciones adecuadas para proporcionar la amplificación del ácido nucleico diana. Las cantidades mínimas de los cebadores, de polimerasa de ADN, de cofactores y de desoxirribonucleósido-5'-trifosfatos necesarias para la amplificación, así como los intervalos adecuados de cada una son conocidos en la técnica. La cantidad mínima de polimerasa de ADN es generalmente de al menos aproximadamente 0,5 unidades/100 \mul de solución, prefiriéndose de aproximadamente 2 a aproximadamente 25 unidades/100 \mul de solución, y prefiriéndose más de aproximadamente 7 a aproximadamente 20 unidades/100 \mul de solución. Para determinados sistemas de amplificación, pueden ser útiles otras cantidades. Una "unidad" se define en la presente memoria como la cantidad de actividad enzimática requerida para incorporar 10 mmoles de los nucleótidos totales (dNTP) a una cadena extendida de ácido nucleico en 30 minutos a 74ºC. La cantidad mínima de cada cebador usada en la amplificación es de al menos aproximadamente 0,075 \mumolar, prefiriéndose de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 2 \mumolar, pero también se conocen otras cantidades en la técnica. El cofactor se encuentra generalmente presente en una cantidad de aproximadamente 2 a aproximadamente 15 mmolar. La cantidad de cada dNTP es generalmente de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 3,5 mmolar.

Los reactivos de la PCR pueden ser suministrados individualmente, o en diversas combinaciones, o todos en una solución tamponada con un pH en el intervalo de aproximadamente 7 a aproximadamente 9, usando cualquier tampón adecuado, muchos de los cuales son conocidos en la técnica.

Otros reactivos que pueden ser usados en la PCR incluyen, por ejemplo, anticuerpos específicos para la polimerasa de ADN termoestable. Los anticuerpos pueden ser usados para inhibir la polimerasa antes de la amplificación. Los anticuerpos útiles para la presente invención son específicos de la polimerasa de ADN termoestable, inhiben la actividad enzimática de la polimerasa de ADN a temperaturas menores de aproximadamente 50ºC y son desactivados a temperaturas superiores. Los anticuerpos útiles incluyen, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales y fragmentos de anticuerpo. Es preferible que el anticuerpo sea monoclonal. Los anticuerpos útiles en la presente invención pueden ser preparados usando procedimientos conocidos tales como los descritos en Harlow et al., "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, NY (1988).

En la patente estadounidense nº: 5.338.671 (Scalice et al.), se describen anticuerpos monoclonales representativos, estando el contenido de la misma incorporado en la presente memoria por referencia. Dos de tales anticuerpos monoclonales son fácilmente obtenidos por cualquier experto en la técnica que use los procedimientos convencionales, así como materiales iniciales que incluyan líneas celulares de hibridoma HB bien 11126 o 11127, que se encuentran depositadas en la ATCC (American Type Culture Collection) (Rockville, MD). El anticuerpo monoclonal está presente en una proporción molar con respecto a la polimerasa de ADN de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 500:1.

Los ácidos nucleicos amplificados pueden ser detectados mediante una serie de procedimientos conocidos, tales como los descritos en la patente estadounidense nº: 4.965.188 (Gelfand et al.). Por ejemplo, los ácidos nucleicos amplificados pueden ser detectados usando una transferencia southern, las técnicas de transferencia por puntos o la detección de captura de oligonucleótidos no isotópicos con una sonda marcada. Alternativamente, se puede llevar a cabo la amplificación usando cebadores que estén apropiadamente marcados, y los productos de extensión de cebadores amplificados pueden ser detectados usando los procedimientos y los equipos para la detección de
etiquetas.

En una realización preferida, el ácido nucleico diana amplificado es detectado usando una sonda de oligonucleótido que está marcada para la detección, y que puede ser directa o indirectamente hibridada con la diana amplificada. La sonda puede ser soluble o estar unida a un soporte sólido. En otra realización preferida, uno o más de los cebadores usados para amplificar el ácido nucleico diana está marcado, por ejemplo, con un resto de unión específica. El producto de extensión del cebador resultante al que se ha incorporado el cebador marcado puede ser capturado con una sonda. La detección de la diana amplificada hibridada con la sonda puede conseguirse mediante la detección de la presencia de la sonda marcada o de la diana amplificada marcada usando un equipo de detección adecuado y los procedimientos que son conocidos en la técnica. Hay ciertas etiquetas que pueden ser visibles a simple vista sin el uso de un equipo de detección.

En otra realización preferida más, uno o más de los cebadores usados para amplificar el ácido nucleico diana son marcados con biotina y los ácidos nucleicos diana amplificados biotinilados son hibridados con sondas unidas a un soporte sólido. Las dianas unidas son entonces detectadas poniéndolas en contacto con un conjugado de estreptavidina-peroxidasa en presencia de un oxidante, tal como peróxido de hidrógeno, y una composición formadora de colorante adecuada. Por ejemplo, los reactivos que proporcionan colorante útiles incluyen la tetrametibencidina y derivados de la misma, y colorantes leuco, tales como colorantes leuco de triarilimidazol como los descritos en la patente estadounidense nº: 4.089.747 (Bruschi).

Como se usa en la presente memoria, cuando hace referencia al tiempo, el término "aproximadamente" se refiere a +/- el 10% del límite de tiempo. Cuando se usa en referencia a temperaturas, el término "aproximadamente" se refiere a +/- 5ºC.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar ciertas realizaciones de la presente invención, y no deben interpretarse como restricciones de la misma.

Ejemplos Materiales y procedimientos

Se preparó polimerasa de ADN recombinante de Thermus aquaticus usando procedimientos conocidos tales como los descritos en el documento EP-A-0 482 714, y con una actividad de aproximadamente250.000 unidades/mg de proteína.

Los cebadores y las sondas usados en los siguientes ejemplos fueron preparados usando materiales iniciales y procedimientos conocidos, usando un sintetizador de ADN de tres columnas modelo 380B de Applied Biosystems, empleando la química estándar de la fosforamidita y el protocolo de ciclo rápido a escala molar de 1 \mu ABI. Se adquirieron nucleósido-3'-fosforamiditas y soportes de vidrio poroso controlado derivados de nucleósidos en Applied Biosystems. Los cebadores tenían las secuencias anteriormente identificadas. Estaban funcionalizados en el extremo 5' con dos espaciadores de aminotetraetilenglicol según la patente estadounidense 4.962.029, seguidos de una única fosforamidita de biotina Dupont comercialmente disponible. Las sondas estaban funcionalizadas en el extremo 3' con dos espaciadores de tetraetilenglicol seguidos de un único grupo ligador de aminodiol según la patente estadounidense nº: 4.914.210. Todas las purificaciones fueron llevadas a cabo usando una columna de purificación de ácidos nucleicos. Los desoxirribonucleótidos (dNTP) fueron obtenidos en Sigma Chemical Co.

En algunos experimentos, se usaron cebadores fosforotioatados. Los cebadores fosforotioatados con enlaces de fosforotioato en la última y penúltima posición con respecto al grupo hidroxilo-3' fueron preparados mediante química de H-fosfato según el procedimiento de la patente estadounidense nº: 5.003.087, también descrito en el boletín técnico anexo del Cat nº: 40-4036-xx, Clen Research, Sterling, Virginia.

Se usó una solución de conjugado de estreptavidina-peroxidasa que comprendía un conjugado comercialmente disponible (Sigma Chemical Co.) de estreptavidina y peroxidasa de rábano picante, caseína (0,5%) y mertiolato (0,5%) en una solución salina tamponada de fosfato (fosfato de sodio 24 mmolar y cloruro de sodio 75 mmolar). Se añadió 4'-hidroxiacetanilida 10 mmolar como estabilizador del conjugado.

La diana de control positivo interno (CPI) fue preparada como sigue. Se generó la secuencia de CPI como una diana sintética monocatenaria mediante la síntesis de oligonucleótidos de fosforamidita. Luego fue amplificada con cebadores de oligonucleótido que contenían sitios de restricción 5' y clonadas direccionalmente en vectores de plásmido pBluescript II KS(-). Se cultivaron cultivos a gran escala de E. coli que contenía el plásmido bajo una selección de ampicilina como se describió anteriormente (Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Cold Harbour Press, 1989). Posteriormente se purificó ADN de plásmido sobre columnas Qiagen usando los reactivos apropiados del vendedor y siguiendo el procedimiento del vendedor. Se volvió a suspender el plásmido purificado resultante en un tampón de TE (Tris 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 Mm, pH 8,0) y se determinó la concentración espectrofotométricamente (Sambrook et al., 1989). El plásmido fue posteriormente digerido con la enzima de restricción ScaI para linealizar el plásmido a la vez que se mantenía una secuencia diana intacta. Se llevaron a cabo diluciones en serie de todas las dianas en tampón de TE con 10 mg/ml de ADN de timo de ternero sometido a ultrasonidos (Sigma).

La dispersión de colorante leuco contenía agarosa (0,5%), colorante leuco de 4,5-bis(4-dimetilaminofenil)-2-(4-hidroxi-3-metoxifenil)imidazol (250 \mumolar), ácido dietilenotriamina pentaacético (100 \mumolar), 3'-cloro-4'-hidroxiacetanilida (5 mmolar), polivinilpirrolidona (112 mmolar) y fosfato de sodio, monobásico, 1-hidrato (10 mmolar) y peróxido de hidrógeno (H_{2}O_{2}) (8,82 mmolar).

La solución de lavado (pH 7,4) contenía cloruro de sodio (373 mmolar), sal de disodio de ácido (etilenodinitrilo)tetraacético (2,5 mmolar), sulfato de decil sodio (38 mmolar) y ácido etilceritio salicílico, sal de sodio (25 \mumolar) en un tampón 1-hidrato monobásico de fosfato de sodio (25 mmolar).

La mezcla de la reacción en cadena de la polimerasa (75 \mul) contenía tampón de tris(hidroximetil)aminometano (10-18 mmolar, pH 8), EDTA (0-0,75 mmolar), cloruro de potasio (50 mmolar), cloruro de magnesio (4 mmolar), dATP, dCTP, dGTP y dTTP (0,3 mM cada uno), los cebadores expuestos (0,4 \mumolar cada uno, a no ser que se indique lo contrario), gelatina tipo IV (100 mg/mL), polimerasa Taq (16 unidades/100 \mul) y glicerol (9,5%). Se usó un exceso molar de cincuenta veces más (con respecto a la polimerasa) de TP1-12.2 y un exceso de 5 veces más de TP4-9.2.

Para formar reactivos de captura, las sondas fueron unidas mediante enlace covalente a partículas poliméricas (diámetro medio de 1 \mum) preparadas, usando técnicas convencionales de polimerización de emulsiones, a partir de ácido poli[estireno-co-3-(p-vinilbenciltio)propiónico] (proporción en peso de 95:5 a 98:2, diámetro medio de 1 \mum). Se lavó una suspensión de las partículas en agua con un tampón de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (0,1 molar, pH 6), y se suspendió hasta obtener aproximadamente un 10% de sólidos. Se mezcló una muestra (3,3 ml) de las partículas lavadas, diluida hasta obtener sólidos al 3,33% en el tampón (0,1 molar), con clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (2,1 ml de 84 mg/ml de agua) y la sonda (983 \mul de agua nanopura con 44,44 OD / ml). Se calentó la suspensión resultante a 50ºC en un baño de agua durante aproximadamente dos horas con un mezclado y un centrifugado intermitentes. Las partículas fueron luego lavadas tres veces con tampón de tris(hidroximetil)aminometano (0,01 molar, pH 8) que contenía sal de disodio de ácido (etilenodinitrilo)tetraacético (0,0001 molar) y se volvieron a suspender en el mismo hasta obtener sólidos al 4%.

Al diluir con tampón hasta obtener sólidos al 0,25%, los reactivos de captura (1-2 \mul) fueron aplicados a y secados en las regiones definidas de las membranas microporosas (membrana de polamida LOPRODYNE®, tamaño medio de poro de 1,2 \mum, de Pall Corp.) de los pozos de análisis de los dispositivos desechables de análisis SURECELL® (disponibles en Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc.), que se describen detalladamente en el documento US-A-4948.561 (Hinckley et al).

También se obtuvieron otros reactivos y materiales bien de fuentes comerciales o mediante su preparación usando materiales iniciales fácilmente disponibles y procedimientos convencionales.

Experimentos Selección de los cebadores

Los solicitantes comenzaron el desarrollo de su sistema de amplificación por PCR para el HIV-1 y el HIV-2 mediante la identificación de regiones de secuencias altamente conservadas del VIH-1. Los cebadores fueron diseñados para las regiones conservadas utilizando los siguientes criterios: (1) la longitud de los productos no podía superar los 200 nucleótidos, pues los productos más pequeños se amplifican con mayor eficacia y son menos sensibles a las reducciones de la concentración efectiva de polimerasa, al tiempo de apareamiento/extensión o al tamaño medio del material de muestra preparado; (2) los conjuntos de cebadores deben tener una región de sonda funcional entre ellos para una detección específica del producto amplificado; (3) los apareamientos erróneos cercanos al extremo 3' del cebador serían mucho menos preferibles que los apareamientos erróneos cercanos al extremo 5'; y (4) los cebadores necesitarían cumplir los criterios establecidos para el desarrollo de cebadores en términos de estabilidad en el extremo 3', longitud, contenido de GC e interacciones con otros cebadores y otras sondas potenciales.

Inicialmente, se seleccionaron los 11 siguientes cebadores para el análisis:

9

Muchos de estos cebadores son idénticos a 1 ó 2 del resto de los cebadores a excepción de las secuencias del extremo 5' del cebador, el extremo 3' del cebador o ambos extremos. Las SEQ ID Nº: 1 y Nº: 23 representan una región de cebador directo de la región LTR del genoma del VIH-1, mientras que las SEQ ID Nº: 24 y 2 representan otra región de cebador directo LTR. Las SEQ ID Nº: 25, 3 y 26 representan una región de cebador inverso LTR mientras que la SEQ ID Nº: 4 representa una segunda región. La SEQ ID Nº: 7 fue el único cebador directo diseñado para la región POL del genoma del VIH-1, mientras que las SEQ ID Nº: 27 y 8 son los cebadores inversos que deberían poder complementar a la SEQ ID Nº: 7.

Estos cebadores fueron analizados mediante la amplificación de bien 0 ó 15 copias de la diana de VIH-1 por 75 ml de reacción mediante la PCR durante 40 ciclos en el termociclador PE9600, seguida de la detección por electroforesis en gel. El ADN de la diana de VIH-1 fue preparado como sigue. Se propagaron células 8ES (Folks T. M., et al., J. Exp. Med. 164: 280, 1986), que contenían una única copia de un genoma del VIH deficiente en polimerasa incorporada en el cromosoma huésped, en un medio de RPMI al 90% con suero bovino fetal al 10%. El ADN fue preparado a partir de 2,5 x 10^{9} células/1 litro de cultivo mediante la digestión típica de la proteinasa K en presencia de SDS seguida de una extracción con fenol/cloroformo y una precipitación con etanol. El extracto resultante fue distribuido en bandas sobre cloruro de cesio, dializado, extraído, precipitado con etanol y vuelto a suspender en Tris 10 mM/EDTA 1 mM (pH 8,0) para su análisis. El contenido de ADN fue calculado mediante la medida de la densidad óptica a A_{260}. Todas las reacciones fueron llevadas a cabo como se describe anteriormente, a excepción de que se añadieron 3 mg de ADN de timo de ternero por cada 75 \mul de reacción. Se ejecutaron las reacciones por duplicado para cada una de las 16 posibles combinaciones de LTR y las 2 posibles combinaciones de POL. En la tabla 1, se muestran los resultados del gel. Las reacciones de control que no contenían diana de VIH-1 mostraron una banda de producto secundario visible para la combinación de SEQ ID Nº: 23/4 con una temperatura de apareamiento/extensión de 68ºC, convirtiendo a esta combinación en un conjunto de cebadores menos preferible. Aparte de este producto secundario, se observaron productos secundarios esencialmente no visibles a cualquier temperatura de apareamiento/extensión.

Los cebadores seleccionados fueron además comparados en cuanto a la intensidad de la banda de gel a ambas temperaturas de apareamiento/extensión. Se observó poca diferencia en la intensidad de la banda de gel entre las combinaciones que contenían las SEQ ID Nº: 1 ó 23. Las SEQ ID Nº: 24 y 2 actuaron de forma equivalente entre sí cuando se combinaron con diferentes cebadores inversos. De los 3 cebadores inversos solapantes, las SEQ ID Nº: 3 y 26 tuvieron un mayor rendimiento que la SEQ ID Nº: 25, especialmente con temperaturas de apareamiento/extensión de 70ºC. Todas las combinaciones que incluían la SEQ ID Nº: 4 se amplificaron bien a ambas temperaturas de apareamiento/extensión. La SEQ ID Nº: 27 tuvo un rendimiento muy pobre en comparación con la SEQ ID Nº: 8 (ambas en combinación con la SEQ ID Nº: 1); por lo tanto, no se realizó un análisis posterior con la SEQ ID Nº: 27.

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TABLA 1 Detección de los conjuntos potenciales de cebadores del VIH-1

	Intensidad del producto de copia 10	Diana cero
Combinación de cebadores SEQ ID Nº:	68ºC	70ºC	Productos secundarios
1/25	++	+	(-)
1/3	++	++	(-)

TABLA 1 (continuación)

	Intensidad del producto de copia 10	Diana cero
Combinación de cebadores SEQ ID Nº:	68ºC	70ºC	Productos secundarios
1/26	++	++	(-)
1/4	++	++	(-)
23/25	++	++	(-)
23/3	++	++	(-)
23/26	++	++	(-)
23/4	++	++	W
24/25	+	W+	(-)
24/3	++	+	(-)
24/26	++	+	(-)
24/4	++	++	(-)
2/25	+	W	(-)
2/3	++	+	(-)
2/26	++	+	(-)
2/4	++	++	(-)
7/27	W-	(-)	(-)
7/8	+	W-	(-)
Intensidad de la banda de gel: ++>+>W+>W>W->(-)

El siguiente experimento fue una reacción de co-amplificación del conjunto de cebadores de SEQ ID Nº: 7/8 y con todos los conjuntos posibles de cebadores de LTR individualmente. Esta co-amplificación fue llevada a cabo en presencia de un control positivo interno (CPI). La amplificación fue llevada a cabo usando el analizador de PCR de Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, un procesador automático de la PCR descrito en la patente estadounidense nº: 5.089.233. La diana de VIH fue amplificada durante 40 ciclos usando tres perfiles térmicos diferentes:

(1)

desnaturalización a 95ºC durante 15 segundos y apareamiento/extensión a 68ºC durante 30 segundos;

(2)

desnaturalización a 95ºC durante 15 segundos y apareamiento/extensión a 66ºC durante 30 segundos; y

(3)

desnaturalización a 96ºC durante 5 segundos y apareamiento/extensión a 68ºC durante 40 segundos.

El producto amplificado fue detectado como se describe anteriormente.

El perfil 1 fue considerado como la condición del estado de la técnica, el segundo perfil fue usado para determinar qué combinaciones de cebadores eran propensas a formar productos secundarios, y el tercer perfil constituyó un intento por fortalecer la amplificación (aumentando el tiempo de apareamiento / extensión) sin aumentar la duración total de los ciclos. Todas las reacciones fueron ejecutadas con 10 copias de cada VIH y dianas de CPI por 75 \mul de reacción.

La amplificación fue más robusta con el tercer perfil de amplificación, especialmente con los conjuntos de cebadores que generan productos más largos (> 150 nucleótidos). Los resultados también demostraron que todas las SEQ ID Nº: 23, 24 y 4 tienen propensión a formar productos secundarios. Por lo tanto, se rechazaron las SEQ ID Nº: 23 y 24. Se siguieron llevando a cabo otros experimentos con las SEQ ID Nº: 1, 2 y 3.

A continuación, se analizó la sensibilidad absoluta de los dos sistemas de co-amplificación del VIH-1 (SEQ ID Nº: 1/3 ó 2/3 co-amplificados con las SEQ ID Nº: 7/8). Se ejecutaron reacciones para 40 o 45 ciclos (96ºC durante 5 segundos; 68ºC durante 40 segundos bien con o sin la diana de CPI y los cebadores). Se ejecutaron niveles de diana de VIH de 10; 5; 2,5; 1; 0,5 y 0 por duplicado para todas las condiciones analizadas.

Mientras que el sistema que contenía las SEQ ID Nº: 2/3 tuvo menos productos secundarios formados durante la amplificación (especialmente a 45 ciclos), ambos sistemas parecieron ser capaces de detectar sistemáticamente hasta 2,5 copias de la diana de VIH-1. En presencia del CPI, los sistemas de co-amplificación de las SEQ ID Nº: 1/3 amplificaron uno o ambos productos de VIH en 2 de las 4 reproducciones en 1 copia y en 1 de las 4 reproducciones en 0,5 copias. En las mismas condiciones, los sistemas de co-amplificación de las SEQ ID Nº: 2/3 amplificaron uno o ambos productos de VIH e 3 de las 4 reproducciones en 1 copia y en 4 de las 4 reproducciones en 0,5 copias. Todas las reacciones de control que no contenían secuencias diana ejecutadas en este experimento fueron visualmente negativas.

De acuerdo con los mismos criterios explicados resumidamente para el VIH-1, se seleccionaron cebadores de VIH-2 para su análisis. Un criterio adicional considerado al diseñar los cebadores de VIH-2 fue la minimización de las interacciones potenciales con los cebadores candidatos tanto para VIH-1 como para VIH-2. El conjunto inicial de cebadores de VIH-2 analizado se encuentra enumerado a continuación:

10

Para preparar ADN de VIH-2, células 10E8 infectadas con VIH-2, cepa Hut78 NIH-Z, fueron tratadas con SDS y proteinasa K seguidos por una extracción con fenol / cloroformo y una precipitación con etanol. El extracto resultante se volvió a suspender en Tris 10 mM / EDTA 1 mM, pH 8,0, para su análisis.

Se examinaron cebadores de VIH-2 individuales en cuanto a su capacidad para formar productos secundarios con las SEQ ID Nº: 1, 2, 3, 26, 4, 7 y 8 de cebadores de VIH-1 bajo perfiles de amplificación separados:

(1)

40 ciclos con una temperatura de apareamiento/extensión de 68ºC; y

(2)

5 ciclos con una temperatura de apareamiento/extensión de 62ºC seguidos por 35 ciclos con una temperatura de apareamiento/extensión de 68ºC.

El segundo perfil fue seleccionado para análisis con el fin de determinar qué conjuntos de cebadores podían minimizar la formación de productos secundarios en condiciones que minimizaran los efectos de los apareamientos erróneos de las dianas. Todos los cebadores que formaron fuertes productos secundarios con las SEQ ID Nº: 7 y 8 utilizando la condición 1 fueron inmediatamente rechazados, pues estos cebadores apenas son requeridos para el ensayo de co-amplificación. Los dos únicos cebadores que fueron rechazados debido a este criterio fueron los de las SEQ ID Nº: 30 y 31. El resto de los cebadores fueron siendo descartados en base a una variedad de criterios. Se eligió la SEQ ID Nº: 20 frente a la SEQ ID Nº: 34 debido a un nivel mucho menor de productos secundarios formados por la SEQ ID Nº: 20 con cebadores de VIH-1. Se seleccionaron las SEQ ID Nº: 11 y 12 frente a las SEQ ID Nº: 28 y 29 porque las primeras produjeron menos productos secundarios y se ajustaron mejor a los criterios establecidos. Las SEQ ID Nº: 32 y 33 fueron rechazadas debido a la relativa pobreza de la amplificación bien con la SEQ ID Nº: 20 ó 34 bajo la condición 2 de amplificación. El resto de los conjuntos de cebadores de VIH-2 (SEQ ID Nº: 11/12, 14/16, 15/16, 18/20 y 19/20) se amplifican sumamente bien y proporcionan bandas de gel muy visibles en 10 copias de diana de VIH-2 por reacción en un sistema que incluye los siguientes cebadores: SEQ ID Nº: 2, 3, 7 y 8 (0,4 \mum de cada uno); CPI-F1 (0,2 \mum) e CPI-R1 (0,2 \mum). Hay muy poca formación de productos secundarios mediante cualquiera de estos sistemas de amplificación cuando se emplea la condición de amplificación 1 de antes. Hay una formación significativa de productos secundarios cuando se emplea la condición de amplificación 2, pero los productos específicos todavía son muy visibles sobre un gel.

Selección de las sondas

Cuando se manejan genomas tan divergentes tales como el VIH-1 y el VIH-2, suele ser difícil identificar tres regiones que estén lo suficientemente conservadas como para tener en cuenta la amplificación de cada región con dos cebadores y la detección de cada región con una única sonda de oligonucleótido. En los sistemas en los que la longitud de los productos necesita ser minimizada, este problema se agrava hasta el punto de imposibilitar la tarea, a no ser que se reduzca el rigor del sondeo hasta un punto en el que la especificidad de la sonda pueda verse comprometida. Para evitar este problema, los solicitantes han desarrollado un sistema en el que se utilizan múltiples sondas para permitir la detección de todas las variantes secuenciales conocidas sin comprometer la especificidad del
análisis.

Con el fin de sondear el producto formado por las SEQ ID Nº: 2 y 3, se debe introducir una sonda en una región con una longitud de sólo 34 nucleótidos. La secuencia más conservada de esta región es la secuencia de la sonda SEQ ID Nº: 5.

Sonda:

11

Esta secuencia está altamente conservada en la mayoría de los aislados de VIH-1, con la diferencia en uno o menos nucleótidos entre la sonda y esta región de la secuencia de los aislados; sin embargo, hay varias secuencias divergentes que tienen de 2 a 5 mutaciones en esta región. Para maximizar la capacidad de detectar secuencias en el futuro que hayan divergido más de estas secuencias, se diseñó una sonda adicional, SEQ ID Nº: 6.

Sonda:

12

En el caso de POL de VIH-1, las dos sondas utilizadas fueron modificadas para minimizar el número más elevado y la gravedad de las mutaciones encontradas, y para maximizar la fuerza de los enlaces que forman. Al hacer esto, las dos sondas diseñadas no son idénticas a ninguna secuencia de aislado conocida. Al usar dos sondas, el número máximo de mutaciones encontrado con cualquier aislado conocido fue reducido de 5 a 3. Además, la mayoría de las mutaciones restantes están colocadas cerca de uno de los extremos de las sondas, reduciendo así su efecto sobre la hibridación. Las secuencias de las sondas POL del VIH-1 se muestran a continuación:

13

La situación anteriormente mencionada es similar para las secuencias seleccionadas en el sistema POL del VIH-2 en tanto en cuento que se usaron 2 sondas. Sin embargo, esta situación es algo distinta en tanto en cuanto las regiones complementarias a las dos sondas son solapantes pero no idénticas en posición. Esto se debe al hecho de que la secuencia es lo suficientemente divergente entre los dos subtipos de VIH-2 como para que uno deba modificar la posición de la sonda con el fin de alcanzar la estabilidad térmica requerida para cada sonda. Con estas dos sondas, todas las secuencias de VIH-2 conocidas no se diferencian en más de 2 nucleótidos en relación con su sonda de VIH-2 específica del subtipo. Las dos secuencias de sonda POL de VIH-2 son mostradas a continuación:

14

\newpage

El sistema de co-amplificación anteriormente descrito fue probado sobre muestras de VIH-1 y VIH-2. Las sondas de detección usadas para la detección colorimétrica fueron las siguientes:

Productos LTR del VIH-1:

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15

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Productos POL del VIH-1:

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16

\vskip1.000000\baselineskip

Productos POL del VIH-2:

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17

\vskip1.000000\baselineskip

Productos LTR del VIH-2:

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18

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Productos ENV del VIH-2:

\vskip1.000000\baselineskip

19

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Se analizaron cinco aislados del VIH-1 amplificados en cultivo incluyendo aislados fototípicos del grupo M y el grupo O. Todos los sistemas de co-amplificación analizados incluyeron el conjunto de cebadores de SEQ ID Nº: 7/8 y un conjunto de cebadores de control positivo interno, así como uno de los cuatro conjuntos de cebadores LTR de VIH-1: SEQ ID Nº: 1/3, 1/4, 2/3 y 2/4. Todos los conjuntos de cebadores específicos del VIH-1 detectaron todos los aislados analizados. Las diluciones en serie de los ADN diana demostraron que los conjuntos de cebadores de SEQ ID Nº: 2/3 y 2/4 eran los conjuntos de cebadores LTR más sensibles. El conjunto de cebadores de SEQ ID Nº: 2/4 pareció el más sensible para los aislados de grupo O altamente divergentes.

También se analizaron dos aislados diferentes del VIH-2 amplificados en cultivo para evaluar el rendimiento de diversos conjuntos de cebadores del VIH-2. Todas las reacciones incluyeron las SEQ ID Nº: 11/12 y los conjuntos de cebadores CPI-F1/R1, así como uno de los conjuntos de cebadores del VIH-2 específicos de POL o de LTR de SEQ ID Nº: 18/20, 19/20, 14/16 y 15/16. Todos los conjuntos de cebadores resultaron en la amplificación de ambas dianas a los niveles de diana más elevados que fueron probados. La dilución de diana de VIH-2 sugirió que el conjunto de cebadores LTR fue el más sensible.

La sensibilidad de la cepa de diversos sistemas de co-amplificación también fue evaluada analizando 15 aislados de grupo O del VIH-1 amplificados en cultivo, 17 pellas celulares congeladas procedentes de pacientes africanos infectados por el VIH-1 (que deberían contener un nivel alto de heterogeneidad secuencial) y 12 aislados del VIH-2 amplificados en cultivo. Los 15 aislados del grupo O fueron detectados por el conjunto de cebadores de SEQ ID Nº: 7/8 y por los conjuntos de cebadores LTR de SEQ ID Nº: 1/4, 2/3 y 2/4; sin embargo, 3 de los aislados fueron perdidos por el conjunto de cebadores de SEQ ID Nº: 1/3. En el caso del sistema LTR, varios de los aislados del grupo O fueron positivos con sólo una de las dos sondas LTR, la sonda que es la más homóloga a los aislados de los grupos O y U, y al virus VIHI-CPZgab de los chimpancés. Estos resultados demuestran la mejora observada a través del uso de dos sondas de detección para una única diana. En el caso de las pellas celulares de pacientes africanos anteriormente descritas, los tres sistemas de VIH-1 (SEQ ID Nº: 2/3, 2/4 y 7/8) dieron positivo; sin embargo, el sistema de SEQ ID Nº: 2/3 pareció ser el sistema más sensible de este experimento, mientras que el conjunto de SEQ ID Nº: 7/8 pareció ser el menos sensible, detectando sólo 1 de los 2 replicados al nivel más alto del ADN de la diana
analizado.

Uno de los 12 aislados del VIH-2 amplificado en cultivo dio negativo para todos los conjuntos de cebadores analizados. Esta muestra también fue negativa con el conjunto de cebadores de control usado en laboratorio, lo que sugiere que puede que no hubiera ADN del VIH-2 en la muestra (se sabe que algunos aislados del VIH-2 no se cultivan bien). El resto de los 11 aislados dieron positivo con el conjunto de cebadores ENV y ambos conjuntos de cebadores LTR. Por el contrario, los conjuntos de SEQ ID Nº: 18/20 y 19/20 perdieron 2 de los 11 y 1 de los 11 aislados.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: BACKUS, JOHN W

\hskip3.9cm

ATWOOD, SUSAN M

\hskip3.9cm

CASEY, ANN E

\hskip3.9cm

RASMUSSEN, ERIC B

\hskip3.9cm

CUMMINS, THOMAS J

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: AMPLIFICACIÓN Y DETECCIÓN DEL VIH-1 Y/O DEL VIH-2

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 34

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN POSTAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: JOHNSON & JOHNSON

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: ONE JOHNSON & JOHNSON PLAZA

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: NEW BRUNSWICK

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: NEW JERSEY

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 08933

\vskip0.500000\baselineskip

(v)

FORMATO DE LECTURA INFORMÁTICO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC compatible de IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS / MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn versión 1.0, versión 1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO / AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: OGDEN, STASIA L

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 36.228

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE LA CAUSA / REFERENCIA: CDS-137/SLO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE CONTACTO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 908-524-2819

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FAX: 908-524-2808

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACCAGATCT GAGCCTGGGA GCT

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGCTTAAGC CTCAATAAAG CTTGCCTTGA

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº: 3

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGTCTGAGG GATCTCTAGT TACCAGAGT

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº: 4

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTTCGGGCG CCACTGCTAG AGA

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº: 5

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAACAGACGG GCACACACTA CT

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº: 6

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAACAGACGG GCACACACTA CT

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº: 7

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCGGGGTTTAT TACAGGGACA GCAGAGA

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº: 8

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTGTATTAC TACTGCCCCT TCACCTTTCC A

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº: 9

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTTTGCTG GTCCTTTCCA AAGTGGG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº:10

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTTGTGCCG GTCCTTTCCA AATTGGG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº: 11

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGGGATAGT GCAGCAACAG CAACA

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº: 12

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCAGACGGT CAGTCGCAAC A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº: 13

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGACGTGGT CAAGAGACAA CAAGAA

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº: 14

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGGTTCT CTCCAGCACT AGCA

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº:15

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGCCCTGGG AGGTTCTCTC CA

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº: 16

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGACTAGGA GAGATGGGAA CACACA

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº: 17

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCACGCTTGC TTGCTTAAAG ACCTC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº: 18

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAGACACAGG GGCTGACGAC TCAATAGT

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº: 19

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACAGGGGCT GACGACTCAA TAGTAGCA

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº: 20

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCAAAAATG TTGATTGGGG TATCTCCTGT CATTA

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº: 21

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCAAAAATAG TAGGGGGAAT AGGGGGATTC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº: 22

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACCCCAAAA ATAGTAGGTG GGATAGGAGG G

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº: 23

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACCAGATCT GAGCCTGGGA GCTC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº: 24

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGCTTAAGC CTCAATAAAG CTTGCCTTGA G

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº: 25

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTCTGAGGG ATCTCTAGTT ACCAGAGT

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº: 26

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGTCTGAGG GATCTCTAGT TACCAG

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº: 27

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTATTACTAC TGCCCCTTCA CCTTTCCA

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº: 28

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGGATAGTG CAGCAACAGC AACAG

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº: 29

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCCAGACGG TCAGTCGCAA CA

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº: 30

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCTGGGAGG TTCTCTCCAG CA

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº: 31

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGTTCGGGC GCCAACCTGC TA

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº: 32

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGCACCTCA ATTCTCTCTT TGGAAAAGAC CAGTA

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº:33

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCACCTCAAT TCTCTCTTTG GAAAAGACCA GTA

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº:34

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCAAAAATG TTGATTGGGG TATCTCCTGT CA

\hfill

32

Claims (14)

1. Un procedimiento para amplificar ácidos nucleicos del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) que comprende poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene ácido nucleico del VIH-1 con cuatro nucleósidos trifosfato diferentes, una polimerasa de ADN termoestable y al menos cuatro oligonucleótidos, en condiciones tales que dicho ácido nucleico del VIH-1 sea amplificado,

en el que cuatro oligonucleótidos de dichos al menos cuatro oligonucleótidos son seleccionados entre los conjuntos:

(a)

SEQ ID Nº: 1, 3, 7 y 8;

(b)

SEQ ID Nº: 1, 4, 7 y 8;

(c)

SEQ ID Nº: 2, 3, 7 y 8; y

(d)

SEQ ID Nº: 2, 4, 7 y 8.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que cinco oligonucleótidos de dichos al menos cuatro oligonucleótidos son seleccionados entre los conjuntos:

(a)

SEQ ID Nº: 1, 2, 3, 7 y 8;

(b)

SEQ ID Nº: 1, 2, 4, 7 y 8;

(c)

SEQ ID Nº: 2, 3, 4, 7 y 8;

(d)

SEQ ID Nº: 1, 3, 4, 7 y 8; y

(e)

SEQ ID Nº: 1, 2, 3, 4, 7 y 8.

3. El procedimiento según la reivindicación 2, en el que dichos cinco oligonucleótidos son de SEQ ID Nº: 2, 3, 4, 7 y 8.

4. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que seis oligonucleótidos de los dichos al menos cuatro oligonucleótidos son de SEQ ID Nº: 1, 2, 3, 4, 7 y 8.

5. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha polimerasa de ADN termoestable se selecciona entre los conjuntos: polimerasa de Thermus aquaticus, polimerasa de Thermus thermophilus y polimerasa de Thermococcus litoralis.

6. Un procedimiento para amplificar y detectar ácido nucleico del VIH-1 que comprende:

(i) poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene ácido nucleico del VIH-1 con cuatro nucleósidos trifosfato diferentes, una polimerasa de ADN termoestable y al menos cuatro oligonucleótidos, en condiciones tales que dicho ácido nucleico del VIH-1 sea amplificado,

en el que cuatro oligonucleótidos de dichos al menos cuatro oligonucleótidos se seleccionen entre los conjuntos:

(a)

SEQ ID Nº: 1, 3, 7 y 8;

(b)

SEQ ID Nº: 1, 4, 7 y 8;

(c)

SEQ ID Nº: 2, 3, 7 y 8; y

(d)

SEQ ID Nº: 2, 4, 7 y 8;

(ii) desnaturalizar dicho ácido nucleico del VIH-1 amplificado para formar ácidos nucleicos monocatenarios; y

(iii) detectar la presencia o la ausencia de dicho ácido nucleico del VIH-1 amplificado.

7. El procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicha detección es llevada a cabo usando al menos dos sondas de oligonucleótido seleccionadas entre los conjuntos:

(a)

SEQ ID Nº: 5 y 9;

(b)

SEQ ID Nº: 5 y 10;

(c)

SEQ ID Nº: 6 y 9; y

(d)

SEQ ID Nº: 6 y 10.

8. El procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicha detección es llevada a cabo usando cuatro sondas de oligonucleótido correspondientes a las SEQ ID Nº: 5, 6, 9 y 10.

9. El procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicha detección es llevada a cabo usando una sonda que está marcada o es capaz de ser marcada con una enzima.

10. Un equipo de diagnóstico útil para la amplificación de ácido nucleico del VIH-1, comprendiendo dicho equipo:

(j) oligonucleótidos correspondientes a las SEQ ID Nº: 1, 2, 3, 4, 7 y 8; y

(ii) una polimerasa de ADN termoestable.

11. El equipo de diagnóstico según la reivindicación 10, que comprende además oligonucleótidos correspondientes a las SEQ ID Nº: 5, 6, 9 y 10.

12. Un procedimiento para amplificar ácidos nucleicos del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 2 (VIH-2) que comprende poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene ácido nucleico del VIH-2 con cuatro nucleósidos trifosfato diferentes, una polimerasa de ADN termoestable y al menos cuatro oligonucleótidos, en condiciones tales que dicho ácido nucleico del VIH-2 sea amplificado,

en el que cuatro oligonucleótidos de dichos al menos cuatro oligonucleótidos son seleccionados entre los conjuntos:

(a)

SEQ ID Nº: 11, 12, 14 y 16;

(b)

SEQ ID Nº: 11, 12, 15 y 16;

(c)

SEQ ID Nº: 11, 12, 18 y 20;

(d)

SEQ ID Nº: 11, 12, 19 y 20;

(e)

SEQ ID Nº: 14, 16, 18 y 20;

(f)

SEQ ID Nº: 14, 16, 19 y 20;

(g)

SEQ ID Nº: 15, 16, 18 y 20; y

(h)

SEQ ID Nº: 15, 16, 19 y 20.

13. Una composición que comprende uno o más de los siguientes pares de oligonucleótidos:

(a)

SEQ ID Nº: 5 y 6;

(b)

SEQ ID Nº: 9 y 10; y

(c)

SEQ ID Nº: 21 y 22.

14. Un procedimiento para amplificar conjuntamente ácido nucleico del VIH-1 y del VIH-2 que comprende poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene ácido nucleico del VIH-1 o del VIH-2 con cuatro nucleósidos trifosfato diferentes, una polimerasa de ADN termoestable, las SEQ ID Nº: 7 y 8, al menos un par de cebadores seleccionados entre SEQ ID Nº: 1, 2, 3 y 4; y al menos un par de cebadores seleccionado entre las SEQ ID Nº: 11, 12, 14, 15, 16, 18, 19 y 20, en condiciones tales que dicho ácido nucleico del VIH-1 o del VIH-2 sea amplificado.