CN104911277B - 一种检测干血斑标本中人类免疫缺陷病毒1型的试剂盒及其检测方法 - Google Patents
一种检测干血斑标本中人类免疫缺陷病毒1型的试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测干血斑标本中HIV‑1的试剂盒及其检测方法，该试剂盒对干血斑样品检测简单高效，含有高敏感度的引物组和探针，设计多重循环并提到引物退火温度，有极高灵敏度和特异性，使干血斑中HIV‑1检测灵敏度达到血浆病毒载量检测灵敏度水平。本发明加入细胞定量体系，可以检测单个细胞内HIV‑1前病毒载量，基本不受干血斑制作差异影响，有助于不同试验中结果对比分析。本发明的试剂盒中还加入制备简单、稳定，溯源可靠的定量标准品，可解决目前HIV‑1 DNA定量溯源性问题。本发明对标本收集、运输及保存要求低，检测灵敏，可利于在HIV‑1感染早期检测、新生儿或高危人群HIV‑1感染筛查中推广。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测领域，涉及一种检测干血斑标本中人类免疫缺陷病毒1型的试剂盒及其检测方法。
背景技术
艾滋病即获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)，是一种慢性致死性传染病，由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)引起，分为人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）和人类免疫缺陷病毒2型（HIV-2），HIV-1是目前全球包括中国在内流行的主要毒株， HIV-2型目前只在西非流行。HIV感染后导致人体免疫机能缺陷，从而发生机会性感染和肿瘤等一系列临床综合征，病死率几乎达100%。艾滋病至今尚无确切有效的治疗药物，HIV 感染的早期发现、早期诊断是防止艾滋病流行的重要手段，也是艾滋病预防控制工作的重要组成部分。
实验室检测是诊断HIV 感染的主要依据，根据检测水平的不同，可分为蛋白水平、细胞水平和基因水平的检测。主要包括抗体和抗原检测、病毒分离和病毒核酸检测等。提高HIV 检测的敏感性，缩短窗口期是HIV 早期诊断的主要研究目的。
蛋白水平检测主要包括HIV 抗原检测及其机体针对抗原产生的特异性抗体，是HIV感染诊断中最常用方法，可分为初筛实验和确认实验，分别以ELISA和Western blot方法为代表，主要有“窗口期”长（14天至2个月）及容易受干扰物影响出现假阳性等缺点。
细胞水平检测主要以细胞分离培养和CD4+淋巴细胞计数为主，前者能够直接检测病毒，专一性很强，有高度的特异性，不会出现假阳性，且可以获得样品中原始病毒株，可进一步进行耐药性和生物学特性研究。但是其敏感性较低，周期长，费用高，需要在P3 实验室进行，易造成实验室感染，故临床应用较少。后者作为直接测定免疫功能的方法，可以用于检测HIV 感染进展状况、判断预后，了解机体免疫状态进行疾病分期，监测抗病毒治疗效果等，但由于昂贵仪器及大量标本要求，无法对HIV早期感染进行检测，从而极少在HIV筛查中应用。
病毒核酸检测，目前以病毒载量（RNA）检测为主，利用分子生物学技术检测HIV 病毒核酸，不仅可以定性地检测样本中是否含有HIV 病原体，辅助早期诊断HIV 感染，缩短窗口期；还可以对样本中病毒进行定量，即检测病毒载量，用于病程监控、指导治疗方案及疗效判定和预测疾病进展等。目前国内外已上市的病毒载量检测试剂盒检出限在20~200拷贝/mL之间，低于500拷贝/mL定量不稳定，另外标本收集及保存要求较高，RNA容易降解，而且不同实验室和不同方法间病毒载量测定值变异很大，病毒载量绝对值不能直接比较。HIV在感染细胞时通过逆转录作用形成大量前病毒DNA，部分整合到细胞基因组中，稳定不易降解。因此近年来，研究人员开发HIV前病毒DNA检测方法来替代病毒载量检测，据文章报道的HIV-1 DNA最低检出限在10拷贝/百万细胞以上。
此外，目前HIV检测方法所用的标本主要来自HIV感染者或病人的血浆或全血。但是这种些样本在采集、分离、保存和运输过程中不可避免地会遇到一些难题，如一些实验室条件欠完善地区并不能及时地将采集的全血分离、冻存。此外，受生物危险品运输限制，全血或血浆需专人冷链运输。为了解决上述问题，医护人员采用美国食品和药品管理局(FDA)批准的国际通用903#滤纸，制备成干血斑样本，为筛查工作带来很多便利，如：可常温保存运输，常温下可保存3个月以上，无病毒感染等。由于干血斑标本采样量少（50~75μL全血），使其检测灵敏度比血浆或全血标本检测灵敏度低10倍左右，一定程度上影响干血斑在HIV筛查应用。
发明内容
为了解决上述问题，本发明通过开发一种简单高效的干血斑提取试剂，以及究筛选出高灵敏和高特异性的引物序列和检测探针，并设置特定的PCR反应程序和条件，构建了高敏感干血斑标本中HIV-1 DNA PCR检测试剂盒及检测方法。
本发明的目的在于提供一种检测干血斑标本中人类免疫缺陷病毒1型的试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种检测干血斑标本中人类免疫缺陷病毒1型的方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种检测干血斑标本中人类免疫缺陷病毒1型的试剂盒，包含有核酸提取液和PCR反应液，所述的PCR反应液中含有PCR引物组和检测探针；
所述引物组选自引物组1、引物组2和引物组3中的至少一组，其中：
引物组1由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成；
引物组2由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11组成；
引物组3由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14组成；
所述探针情况如下：
当试剂盒中含有引物组1时，该试剂盒至少含有探针SEQ ID NO:15或其核苷酸互补序列；
当试剂盒中含有引物组2时，该试剂盒中含有探针SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或者该些序列的核苷酸互补序列中的至少一条探针；
当试剂盒中含有引物组3时，该试剂盒含有探针SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQID NO:21、SEQ ID NO:22或者该些序列的核苷酸互补序列中的至少一条探针。
进一步的，上述核酸提取液含有：10~50mM Tris-HCl （pH8.0）、30~50mM KCl、5~10% Chelex 100、0.5~1%Triton X-100、0.5~1% NP-40和10~50mM 辛酸钠 。
进一步的，上述探针序列5’端标记的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5、TET中一种，探针序列3’端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ中一种。
进一步的，上试剂盒还包含细胞定量引物组和细胞定量探针；
所述细胞定量引物组由SEQ ID NO:23 、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ IDNO:26组成；
所述探针为含SEQ ID NO:27或者为其核苷酸互补序列；
细胞定量探针序列所标记的荧光基团可从FAM、HEX、VIC、CY5、TET选择，但不同于权利要求3所述探针的荧光基团。
进一步的，上试剂盒还含有：阴性对照、阳性定量参考品和含有Taq酶与UNG酶的酶系。
进一步的，上述的阳性定量参考品为8E5或Ach2细胞株基因组，用于同时对HIV-1DNA及细胞数定量。
一种干血斑标本中人类免疫缺陷病毒1型的检测方法，包括以下步骤：
1）干血斑核酸提取：
用打孔器将干血斑打孔，将打孔的样品置于离心管中；加入灭菌水，剧烈震荡3~5秒，室温放置30分钟后震荡3~5秒；12000rpm离心1.5~2.5分钟，去上清液，留足够上清液盖没沉淀；加入核酸提取液100μL，震荡3~5秒，放置于56℃震荡孵育25~30分钟；于95~100℃孵育5~10分钟；12000rpm离心3~5分钟，转移上清到新离心管中作为DNA模板；
2）PCR反应体系：
PCR反应液 29.2μL；
酶系 0.8μL；
DNA模板 20μL；
3）PCR反应程序：
以ABI7500为例，第一步：37℃ 5分钟；第二步： 95 ℃ 10 分钟；第三步： 95 ℃15 秒， 62~68 ℃ 15 秒，72℃ 20秒， 5~8 个循环；第四步： 95 ℃ 15 秒， 62~65 ℃ 15秒，72℃ 20秒， 5~8 个循环；第五步：95℃ 15秒，60℃ 1分钟，40个循环；60 ℃时采集荧光；
4）结果分析：
反应结束后自动保存结果，对HIV-1 DNA的扩增曲线和相应细胞扩增的曲线进行分别分析；点击Analyze进行分析，使Std Curve窗口下的标准曲线图达到最佳，即Correlation数值介于-1.0~-0.98，然后到Plate窗口下记录定量结果；
细胞中HIV-1 DNA含量结果计算：
同一份标本中，用2条标准曲线定量的HIV-1 DNA定量值除以细胞定量值，得出标本中每个细胞中HIV-1 DNA含量。
进一步的，在上述整个检测过程中，需保证各样品满足以下质量要求：
①阴性对照：HIV DNA扩增曲线无CT值显示；
②阳性定量参考品的结果均为阳性，Ct值＜30，且2条标准曲线线性相关系数0.98≤ r ≤1；
以上要求需要在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
本发明的有益效果是：
1）本发明的干血斑标本中人类免疫缺陷病毒1型PCR检测试剂盒灵敏度可达到血浆或全血标本检测灵敏度，但更方便标本收集、存储、运输；
2）本发明技术开发干血斑标本中人类免疫缺陷病毒1型PCR检测试剂盒及其检测方法的检测方法可以同时对HIV-1 DNA及细胞数定量；
3）本发明技术开发的干血斑标本中人类免疫缺陷病毒1型PCR检测试剂盒及其检测方法可广泛应用于HIV-1感染早期检测、新生儿或高危人群HIV-1感染筛查。
4）为提高干血斑标本中HIV-1检测灵敏度，本发明提供了一种干血斑标本中HIV-1DNA检测方法，其包含了一种快速简单、高效的干血斑核酸提取试剂，及高敏感的HIV-1 DNA荧光PCR检测方法，使本发明的干血斑标本HIV-1 DNA检测灵敏度能达到血浆或全血标本检测灵敏度。本方法对传统荧光探针PCR进行创新，通过加入3对PCR引物，采用多个循环，并提高引物退火温度，使本发明的HIV-1 DNA PCR检测方法达到极高的灵敏度及特异性。
5）本发明PCR体系中加入细胞定量体系，可以检测单个细胞内HIV前病毒载量，基本不受干血斑制作差异影响，有助于不同试验中结果对比分析，有利于干血斑中HIV检测定量标准建立。再者，本发明方法采用8E5或Ach2细胞株梯度浓度基因组作为定量标准品，由于每个8E5或Ach2细胞中均只整合了一个HIV-1 DNA，因此可通过OD值测定定量标准品中8E5或Ach2基因组细胞数，即可得到定量标准品对应HIV-1 DNA拷贝数，解决了HIV-1 DNA定量溯源性问题，而且制备方法稳定可靠。
6）本发明方法灵敏可靠，操作简单，可广泛应用于HIV-1筛查及疾病进展监控。
附图说明
图1 为本发明试剂标准曲线扩增图；
图2为定量标准线性回归曲线；
图3 为实施例4的特异性实验图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此
实施例1：检测干血斑标本中人类免疫缺陷病毒1型的PCR引物组
本发明前期通过引物设计原则并结合实际情况，设计出大量检测人类免疫缺陷病毒1型DNA的PCR引物，然后通过大量实验研究筛选出高灵敏和高特异性的引物序列和检测探针，最终选取检测人类免疫缺陷病毒1型DNA效果最佳的PCR引物组，其中包括3组，其核苷酸序列分别如下所示：
引物组1：
SEQ ID NO:1:TCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCT ；
SEQ ID NO:2：TGCGCGCTTCAAGCCGAGTCCTGCGT；
SEQ ID NO:3：AGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCT；
SEQ ID NO:4：AGCAAGCCGAGTCCTGCGTCGAGA ；
SEQ ID NO:5：AGCCTCAATAAAGCTTGCCT ；
SEQ ID NO:6：CCGCCACTGCTAGAGATTTTCCA；
对应引物组1的检测探针为：SEQ ID NO:15：TCTGGTAACTAGAGATCCCT或者为该序列的核苷酸互补序列。
引物组2：
SEQ ID NO:2：TGCGCGCTTCAAGCCGAGTCCTGCGT；
SEQ ID NO:7：GGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCT ；
SEQ ID NO:8：GGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGC；
SEQ ID NO:9：TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA；
SEQ ID NO:10：AAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA ；
SEQ ID NO:11：AGGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAG；
对应引物组2的检测探针选自以下探针序列中的至少一种：
SEQ ID NO:16：TTCAAGTAGTGTGTGCCC ；
SEQ ID NO:17：AGTAGTGTGTGCCCGTCT；
SEQ ID NO:18：TAGTGTGTGCCCGTCTGT；
或者为该些序列的核苷酸互补序列；
引物组3：
SEQ ID NO:4：AGCAAGCCGAGTCCTGCGTCGAGA；
SEQ ID NO:6：CCGCCACTGCTAGAGATTTTCCA；
SEQ ID NO:10：AAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA；
SEQ ID NO:12：ACCAGATCTGAGCCTGGGAGCT ；
SEQ ID NO:13：GCTAACTAGGGAACCCACTGCT；
SEQ ID NO:14：TTCGGGCGCCACTGCTA；
对应引物组3的检测探针选自以下探针序列中的至少一种：
SEQ ID NO:19：TGTTGTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGA ；
SEQ ID NO:20：TGTTGTGTGTGACTCTGGTAACTA；
SEQ ID NO:21：TGTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGA；
SEQ ID NO:22：TGTTGTGTGTGACTCTGGTAACTAG；
或者为该些序列的核苷酸互补序列。
实施例2：检测干血斑标本中人类免疫缺陷病毒1型的PCR检测试剂盒
检测人类免疫缺陷病毒1型的PCR检测试剂盒包括以下成份：
1）含有实施例1中所述的引物组；
2）含有检测探针：
当试剂盒中含有引物组1时，该试剂盒就还含有探针SEQ ID NO:15或其核苷酸互补序列；
当试剂盒中含有引物组2时，该试剂盒中就还含有探针SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或者该些序列的核苷酸互补序列中的至少一条探针；
当试剂盒中含有引物组3时，该试剂盒中就还含有探针SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或者该些序列的核苷酸互补序列中的至少一条探针。
探针序列5’端标记的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5、TET中任意一种，探针序列3’端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ中任意一种。
3）细胞定量引物组和细胞定量探针，其序列分别为：
细胞定量引物组序列为：
SEQ ID NO:23：CGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG；
SEQ ID NO:24：GGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG；
SEQ ID NO:25：CCACACTGTGCCCATCTACGA；
SEQ ID NO:26：GCGCTCGGTGAGGATCTT C；
细胞定量探针序列为：
SEQ ID NO:27：ATGCCCTCCCCCATGCCATCCT或者为其核苷酸互补序列；
细胞定量探针序列所标记的荧光基团可从FAM、HEX、VIC、CY5、TET选择，但不同于2）中所述探针的标记荧光基团。
4）PCR反应液：含有15~25mM Tris-HCl (pH8.0)，15~25mM KCl，2.5~5mM (NH4)SO4，2~5mM MgCl2，0.5~2mM dNTP/UTP Mix，200~600Nm HIV-1 DNA引物组，100~300nM HIV-1DNA探针，200~600nM细胞定量引物组，100~300nM细胞定量探针。
5）含Taq酶与UNG酶的酶系；阴性对照；阳性定量参考品。其中，阴性质控品为生理盐水。
6）核酸提取液：核酸提取液中含有10~50mM Tris-HCl （pH8.0）、50mM KCl、5~10%Chelex 100、0.5~1%Triton X-100、0.5~1% NP-40和10~50mM 辛酸钠 。
实施例3：干血斑标本中人类免疫缺陷病毒1型的检测方法
利用实施例2建立的检测试剂盒，对待检测样品进行检测，步骤如下：
1）干血斑核酸提取：
用打孔器将干血斑打孔，制备直径为3mm圆形纸片，保存于1.5mL离心管中；加入1mL灭菌水，剧烈震荡数秒（3~5秒），室温放置30分钟后震荡数秒（3~5秒）；12000rpm离心2分钟，去上清液，留足够上清液盖没沉淀；加入核酸提取液100μL，震荡数秒（3~5秒），放置于56℃震荡孵育30分钟；于100℃孵育5~10分钟；12000rpm离心3~5分钟，转移上清到新离心管中作为DNA模板；
2）PCR反应体系：
PCR反应液 29.2μL；
酶系 0.8μL；
DNA模板 20μL；
3）PCR反应程序：
以ABI7500为例，第一步：37℃ 5分钟；第二步： 95 ℃ 10 分钟；第三步： 95 ℃15 秒， 62~68 ℃ 15 秒，72℃ 20秒， 5~8 个循环；第四步： 95 ℃ 15 秒， 62~65 ℃ 15秒，72℃ 20秒， 5~8 个循环；第五步：95℃ 15秒，60℃ 1分钟，40个循环；60 ℃时采集荧光；
4）结果分析：
反应结束后自动保存结果，对HIV DNA的曲线和相应细胞扩增的曲线进行分别分析；根据分析后图像调节Baseline 的Start值、End值以及Threshold的Value值（用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在1-10，Stop值可以在5-20，调整阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击Analyze进行分析，使Std Curve窗口下的标准曲线图达到最佳，即Correlation数值介于-1.0~-0.98。然后到Plate窗口下记录定量结果。
细胞中HIV DNA含量结果计算：
同一份标本中，用2条标准曲线定量的HIV DNA定量值（单位：copies/μL）除以细胞定量结果（单位：cells/μL），得出标本中每个细胞中HIV DNA含量（单位：copies/cell）。
在整个检测过程中，需保证各样品满足以下质量要求：
①阴性对照：HIV DNA扩增曲线无CT值显示；
②定量参考品（FAM通道和VIC通道）的结果均为阳性，Ct值＜30，且2条标准曲线线性相关系数0.98 ≤ r ≤ 1。
以上要求需要在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
标准曲线扩增如图1所示。红色为HIV-1 DNA定量标准曲线扩增；绿色为细胞定量标准曲线扩增。图2为定量标准线性回归曲线。
实施例4：特异性实验
用上述实施例所述的试剂盒和检测方法，对HIV-1阴性标本或健康人群标本进行检测，阴性标本包括为HBV、1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、EB病毒、细胞巨化病毒、6型单纯疱疹病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、黄热病病毒、人类T细胞白血病病毒1型和2型、柯萨奇病毒B3以及大肠杆菌提取的核酸进行检测，结果显示为阴性（100%）（如图3所示，红色为HIV-1 DNA扩增，均为阴性；绿色为细胞定量扩增）。以上结果证明本发明PCR方法具有很好的特异性。
实施例5：干血斑提取效果
本实施例为，采用本发明的试剂盒对干血斑进行核酸提取，检测核酸的提取效果，并与现有相关进口试剂盒作对比。
在同一份全血标本，取50μL滴在滤纸上制作成干血斑，每份标本制作10个干血斑；同样地取另外2份标本，分别制作10个干血斑。每份标本所制作的10个干血斑中，其中5个用于本发明方法提取，另外5个用于德国Qiagen公司的QIAamp DNA Blood mini kit中干血斑提取方法提取，洗脱体积用100μL。取各提取后的DNA溶液测OD值，分别得到本发明方法提取的3个标本DNA平均浓度分别为：15.6±3.2ng/μL、12.7±2.2ng/μL、11.8±2.0ng/μL；而Qiagen提取试剂盒提取的DNA浓度为：12.4±2.0ng/μL、13.3±1.7ng/μL、10.6±1.2ng/μL；其A260/280平均值分别为1.31、1.42、1.37和1.78、1.76、1.81。由此看出，虽然本发明方法DNA纯度未达到Qiagen纯化提取方法，但DNA提取量与Qiagen方法相当。
实施例6：临床标本检测
通过临床标本检测，研究在不同血浆病毒载量标本下本发明方法的检测阳性率。
据文章报告的结果，目前干血斑标本中检测HIV-1病毒载量的方法在病毒载量范围在：小于1000拷贝/mL、1000~3000拷贝/mL和大于3000拷贝/mL的检测阳性率分别在50~65%、80~90%和100%。在本次临床标本检测试验中，我们对226份全血标本（在分离血清前，各取50uL制备成干血斑），同时进行病毒载量检测及本发明的干血斑HIV-1 DNA PCR检测。结果见下表1：
表1本发明方法对临床标本的检测阳性率
由表1可以看出，本发明方法与病毒载量检测方法检测符合率达到98.67%，而且在低病毒载量检测阳性率也与病毒载量检测方法相当。
<110> 广州海力特生物科技有限公司
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tgttgtgtgt gactctggta actag 25
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 23
cggggtcacc cacactgtgc ccatctacg 29
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 24
ggtcacccac actgtgccca tctacg 26
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 25
ccacactgtg cccatctacg a 21
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 26
gcgctcggtg aggatcttc 19
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工探针
<400> 27
atgccctccc ccatgccatc ct 22
Claims (8)
1.一种检测干血斑标本中人类免疫缺陷病毒1型的试剂盒，包含有核酸提取液和PCR反应液，其特征在于：所述的PCR反应液中含有PCR引物组和检测探针；
所述引物组选自引物组1、或者引物组2、或者引物组3，其中：
引物组1由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQID NO:6组成；
引物组2由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11组成；
引物组3由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14组成；
所述探针情况如下：
当试剂盒中含有引物组1时，该试剂盒至少含有探针SEQ ID NO:15或其核苷酸互补序列；
当试剂盒中含有引物组2时，该试剂盒中含有探针SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18或者该些序列的核苷酸互补序列中的至少一条探针；
当试剂盒中含有引物组3时，该试剂盒含有探针SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22或者该些序列的核苷酸互补序列中的至少一条探针。
2.根据权利要求1所述的一种检测干血斑标本中人类免疫缺陷病毒1型的试剂盒，其特征在于：所述核酸提取液含有：10～50mM Tris-HCl pH8.0、30～50mM KCl、5～10％Chelex100、0.5～1％Triton X-100、0.5～1％NP-40和10～50mM辛酸钠。
3.根据权利要求1所述的一种检测干血斑标本中人类免疫缺陷病毒1型的试剂盒，其特征在于：所述探针序列5’端标记的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5、TET中一种，探针序列3’端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ中一种。
4.根据权利要求1所述的一种检测干血斑标本中人类免疫缺陷病毒1型的试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包含细胞定量引物组和细胞定量探针；
所述细胞定量引物组由SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26组成；
所述探针为含SEQ ID NO:27或者为其核苷酸互补序列；
细胞定量探针序列所标记的荧光基团可从FAM、HEX、VIC、CY5、TET选择，但不同于权利要求3所述探针的荧光基团。
5.根据权利要求1所述的一种检测干血斑标本中人类免疫缺陷病毒1型的试剂盒，其特征在于：该试剂盒还含有：阴性对照、阳性定量参考品和含有Taq酶与UNG酶的酶系。
6.根据权利要求1所述的一种检测干血斑标本中人类免疫缺陷病毒1型的试剂盒，其特征在于：所述的阳性定量参考品为8E5或Ach2细胞株基因组，用于同时对HIV-1 DNA及细胞数定量。
7.一种干血斑标本中人类免疫缺陷病毒1型的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)干血斑核酸提取：
用打孔器将干血斑打孔，将打孔的样品置于离心管中；加入灭菌水，剧烈震荡3～5秒，室温放置30分钟后震荡3～5秒；12000rpm离心1.5～2.5分钟，去上清液，留足够上清液盖没沉淀；加入核酸提取液100μL，震荡3～5秒，放置于56℃震荡孵育25～30分钟；于95～100℃孵育5～10分钟；12000rpm离心3～5分钟，转移上清到新离心管中作为DNA模板；
2)PCR反应体系：
PCR反应液 29.2μL；
酶系 0.8μL；
DNA模板 20μL；
3)PCR反应程序：
以ABI7500为例，第一步：37℃5分钟；第二步：95℃10分钟；第三步：95℃15秒，62～68℃15秒，72℃20秒，5～8个循环；第四步：95℃15秒，62～65℃15秒，72℃20秒，5～8个循环；第五步：95℃15秒，60℃1分钟，40个循环；60℃时采集荧光；
4)结果分析：
反应结束后自动保存结果，对HIV-1 DNA的扩增曲线和相应细胞扩增的曲线进行分别分析；点击Analyze进行分析，使Std Curve窗口下的标准曲线图达到最佳，即Correlation数值介于-1.0～-0.98，然后到Plate窗口下记录定量结果；
细胞中HIV-1 DNA含量结果计算：
同一份标本中，用2条标准曲线定量的HIV-1 DNA定量值除以细胞定量值，得出标本中每个细胞中HIV-1 DNA含量；
所述PCR反应液为权利要求1中所述的PCR反应液；
所述方法用于非疾病的诊断或治疗。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：在整个检测过程中，需保证各样品满足以下质量要求：
①阴性对照：HIV DNA扩增曲线无CT值显示；
②阳性定量参考品的结果均为阳性，Ct值＜30，且2条标准曲线线性相关系数0.98≤r≤1；
以上要求需要在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
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