CN107119148B

CN107119148B - 检测hiv-1 2-ltr dna的pcr引物组、探针及其试剂盒和检测方法

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Publication number: CN107119148B
Application number: CN201710324569.7A
Authority: CN
Inventors: 王法; 张晓玮; 彭春梅; 邓可基; 乐小炎; 张嘉; 李家导; 陈观芝; 林敏深; 林若琳; 石壮壮; 罗园香; 莫静嫣; 李海茵; 张新; 王星; 吴彩虹
Original assignee: Guangzhou Supbio Bio Technology And Science Co ltd
Current assignee: Guangzhou Supbio Bio Technology And Science Co ltd
Priority date: 2017-05-09
Filing date: 2017-05-09
Publication date: 2020-07-31
Anticipated expiration: 2037-05-09
Also published as: CN107119148A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及病毒检测领域，更具体涉及一种检测人类免疫缺陷病毒1型2‑LTR DNA的PCR引物组、探针及其试剂盒和检测方法。本发明提供的检测引物组包括SEQ ID NO：1‑6所示的核苷酸序列；检测探针包括SEQ ID NO：7‑8所示的核苷酸序列。本发明所提供的检测引物组，与传统的实时荧光定量PCR不同，本发明通过引入3对共6条实时荧光定量PCR引物，采用多个循环，并提高引物退火温度，使本发明提供的HIV‑1 2‑LTR DNA PCR检测方法达到极高的灵敏度及特异性，其中最低检出限可达每个PCR中检测2拷贝/百万细胞。同时，本发明还在PCR反应中加入细胞定量反应体系，即可在同一个PCR反应中同时对HIV‑1 2‑LTR DNA及细胞数进行定量(常规方法需要另外对细胞量进行计数)。

Description

检测HIV-1 2-LTR DNA的PCR引物组、探针及其试剂盒和检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及病毒检测领域，更具体涉及一种检测人类免疫缺陷病毒1型2-LTR DNA的PCR引物组、探针及其试剂盒和检测方法。

背景技术

人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒(Lentivirus)，属反转录病毒的一种。1983年，人类免疫缺陷病毒在美国首次发现。该病毒破坏人体的免疫能力，导致免疫系统失去抵抗力，从而导致各种疾病及癌症得以在人体内生存，发展到最后，导致艾滋病。据不完全统计，全球估计有3590至4430万人与人类免疫缺陷病毒相伴生存，其中430至640万人属于新发感染病例，另外，有280至350万人死于艾滋病。

近年来，联合抗逆转录病毒疗法(cART)或者高效抗反转录病毒治疗(HAART)能有效阻断人类免疫缺席病毒(HIV)感染患者体内的病毒复制，使血浆中病毒载量，低于一般检测的检出限。最近有报告的结果表明，一些患者体内的病毒可能会继续复制，但其病毒水平过低无法检测到。同时发现，当治疗中断时会出现血浆病毒载量快速反弹的情况(Butler，S.L.，Hansen，M.S.，and Bushman，F.D.(2001).A quantitative assay for HIV DNAintegration in vivo.Nat Med 7，631-634.)。

人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)储存库的持续存在主要是由于HIV-1DNA导致的。在HIV的整个生命周期里，DNA的存在形式包括：线性非整合DNA、环状非整合DNA(1-LTR，2-LTR)、整合的前病毒等。其在细胞核内的含量为：线性非整合DNA＞整合前病毒＞1-LTR＞2-LTR。一般感染HIV-1 3-4h后，可检测到HIV-1 DNA，再过1h，整合DNA开始累积，但仅占总HIV-1 DNA的10％，大约8-12h之后，线性非整合DNA含量达到最高峰，此时环状非整合DNA(1-LTR，2-LTR)可被检测到，1-LTR和2-LTR仅占总HIV-1 DNA的10％和1％(Butler，S.L.，Hansen，M.S.，and Bushman，F.D.(2001).A quantitative assay for HIV DNAintegration in vivo.Nat Med 7，631-634.Kim，S.Y.，Bym，R.，Groopman，J.，andBaltimore，D.(1989).Temporal aspects of DNA and RNA synthesis during humanimmunodeficiency virus infection：evidence for differential gene expression.JVirol63，3708-3713.Vandegraaff，N.，Kumar，R.，Burrell，C.J.，and Li，P(2001).Kinetics of human immunodeficiency virus type 1(HIV)DNA integration inacutely infected cells as determined using a novel assay for detection ofintegrated HIV DNA.J Virol 75，11253-11260.)。

近年来的研究表明，2-LTR的含量的高低与HIV感染宿主细胞的过程密切相关，是极其重要的生物标志物(Bukrinsky M，Stanwick T，Dempsey M，Stevenson M：Quiescent Tlymphocytes as an inducible virus reservoir in HIV-1infection.Science 1991，254：423-427.Shoemaker C，Goff S，Gilboa E，Paskind M，Mitra SW，Baltimore D：Structure of a cloned circular Moloney murine leukemia virus DNA moleculecontaining an inverted segment：implications for retrovirus integration.ProcNatl Acad Sci USA 1980，77：3932-3936.Zheng Y，Ao Z，Wang B，Danappa Jayappa K，YaoX：Host protein Ku70binds and protects HIV-1 integrase from proteasomaldegradation and is required for HIV raplication.J Biol Chem 2011，286：17722-17735.Kilzer JM，Stracker T，Beitzel B，Meek K，Weitzman M，Bushman FD：Roles ofhost cell factors in circularization of retroviral dna.Virology 2003，314：460-467.Bukrinsky MI，Sharova N，Dempsey MP，Stanwick TL，Bukrinskaya AG，Haggerty S，Stevenson M：Active nuclear import of human immunodeficiency virus type1preintegration complexes.Proc Natl Acad Sci USA 1992，89：6580-6584.)。

HIV-1 2-LTR仅存在于宿主细胞核中，因此它已经成为病毒入核的重要标志，其由线性DNA的长末端重复序列(LTR)的非同源性末端接合而成。以2-LTR为检测指标的原因是：HIV-1病毒没有维护2-LTR的机制，因此其很容易被降解掉，这意味着感染是近期的。尽管其含量较低，由于其LTR-LTR的连接的独特性质，可以比较容易的被实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，QPCR)检测到，而且特异性极高(Bukrinsky MI，SharovaN，Dempsey MP，Stanwick TL，Bukrinskaya AG，Haggerty S，Stevenson M：Active nuclearimport of human immunodeficiency virus type 1preintegration complexes.ProcNatl Acad Sci USA 1992，89：6580-6584.Butler S，Hansen M，Bushman F：Aquantitative assay for HIV DNA integration in vivo.Nat Med 2001，7：631-634)。短期的体外实验表明2-LTR是稳定的，而体内的分析则证明其性质是不稳定的，这支持了2-LTR作为检测ART治疗后残留的病毒的一种生物标志物，同时也可以被用于作为标志新感染细胞的一个有效替代品(Sharkey ME，Teo I，Greenough T，Sharova N，Luzuriaga K，Sullivan JL，Bucy RP，Kostrikis LG，Haase A，Veryard C，et al：Persistence ofepisomal HIV-1infection intermediates in patients on highly active anti-retroviral therapy.Nat Med 2000，6：76-81.Sharkey M，Triques K，Kuritzkes DR，Stevenson M：In vivo evidence for instability of episomal humanimmunodeficiency virus type 1 cDNA.JVirol 2005，79：5203-5210.)。有实验证明，在抗逆转录病毒治疗(ART)中断前与治疗后中断的反弹的序列相同，均来自于游离的HIV DNA，而非前病毒DNA，强调了2-LTR作为标记的动态特征(Sharkey M，Babic DZ，Greenough T，Gulick R，Kuritzkes DR，Stevenson M：Episomal viral cDNAs identify a reservoirthat fuels viral rebound after treatment interruption and that contributes totreatment failure.PLoS Pathog 2011.7：e1001303)。

综上所述，现有的关于HIV的检测主要包括HIV抗体、HIV核酸、CD4+T淋巴细胞、HIV基因型耐药检测等。HIV核酸定量(病毒载量)检测和CD4+T淋巴细胞计数是判断疾病进展、临床用药、疗效和预后的两项重要指标。目前，针对HIV的核酸定量以RNA为主。也就是说在血浆病毒水平低于检出限的条件下，试图去描述在有效抑制的情况下HIV-1病毒复制程度，确定一个准确的动态过程，以现有的检测方法是无法实现的。因此需要发展出一种HIV-12-LTR DNA的定量检测产品，实现对HIV-1的高灵敏和高特异性定量检测。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了高灵敏和高特异性的引物组和检测探针，构建了高敏感的HIV-1 2-LTR DNA PCR检测试剂盒及检测方法，其最低检测限可达每个反应可检测2拷贝HIV-1 2-LTR DNA/百万细胞。

一个方面，本发明提供了一种检测人类免疫缺陷病毒1型2-LTR DNA的检测引物组和检测探针。

所述的检测引物组由以下6条引物序列或以下6条引物序列的互补序列组成：

引物1：5’-TGGCTAACTAGGGAACCCACT-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

引物2：5’-AGACAAGATATCCTTGATCTGT-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

引物3：5’-AACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCC-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

引物4：5’-CCACAGATCAAGGATATCTTGTC-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

引物5：5’-CTCAGATCCTGCATATAAGC-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

引物6：5’-CAAGGCTACTTCCCTGATTA-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

所述的检测探针选自探针1和探针2中的至少一种；

所述的探针1的序列为SEQ ID NO：7(5’-AAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGC-3’)所示的核苷酸序列或其互补的核苷酸序列；探针1的核苷酸序列的5’端标记有荧光基团，所述的荧光基团选自FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的一种；探针1的核苷酸序列的3’端标记有淬灭基团，所述的淬灭基团选自TAMRA、MGB和BHQ中的一种；

所述的探针2的序列为SEQ ID NO：8(5’-ACACTACTTGAAGCACTCAAGGCAAGC-3’)所示的核苷酸序列或其互补的核苷酸序列；探针2的核苷酸序列的5’端标记有荧光基团，所述的荧光基团选自FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的一种；探针2的核苷酸序列的3’端标记有淬灭基团，所述的淬灭基团选自TAMRA、MGB和BHQ中的一种；

如果同时采用上述探针1和探针2作为检测探针，则探针1和探针2应具有相同的荧光基团和相同的淬灭基团。

上述检测引物组和检测探针是根据HIV-1 2-LTR DNA序列特点设计完成的，可用于实时荧光定量PCR(QPCR)技术，实现对HIV-1 2-LTR DNA的检测。

再一个方面，本发明提供了一种用于检测人类免疫缺陷病毒1型2-LTR DNA的试剂盒，所述的试剂盒包括本发明所述的检测引物组和检测探针。

在一个优选的实施方案中，所述的试剂盒还包括细胞定量引物组和细胞定量探针。

其中，所述的细胞定量引物组由以下4条引物序列或以下4条引物序列的互补序列组成：

引物7：5’-GGGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；

引物8：5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACG-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；

引物9：5’-CACACTGTGCCCATCTACGA-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示；

引物10：5’-CGCTCGGTGAGGATCTT C-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。

其中，所述的细胞定量探针的核苷酸序列为5’-TGCCCTCCCCCATGCCATCCT-3’(SEQID NO：13)；细胞定量探针的核苷酸序列的5’端标记有荧光基团，所述的荧光基团选自FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的一种，细胞定量探针的荧光基团应当不同于检测探针的荧光基团；细胞定量探针的核苷酸序列的3’端标记有淬灭基团，所述的淬灭基团选自TAMRA、MGB和BHQ中的一种。

本发明提供的细胞定量引物组的扩增产物被称为细胞定量扩增序列，细胞定量引物组和细胞定量探针可直接加入检测引物组和检测探针的QPCR反应体系中，即可在同一管PCR反应中同时完成对待测样品中的HIV-1 2-LTR DNA和细胞数的定量。在HIV-1的常规检测方法中，通常需要另外对待测样品中的细胞数进行计数。

在一个优选的实施方案中，所述的试剂盒还包括酶系和PCR反应试剂。

其中，所述的酶系为等体积混合的Taq DNA聚合酶与尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)。

其中，所述的PCR反应试剂包括：①pH 8.5的Tris-硫酸，储存浓度为1M，②柠檬酸钠，储存浓度为100mM，③(NH₄)₂SO₄，储存浓度为1M，④MgSO₄，储存浓度为1M，⑤十二烷基聚乙二醇醚(Brij-35)，储存浓度为3％，⑥乙酰化牛血清白蛋白，储存浓度为30mg/mL，⑦dNTP，储存浓度为10mM。

在一个优选的实施方案中，所述的试剂盒还包括：强阳性质控品、弱阳性质控品、阴性对照品和阳性定量参考品；

在一个优选的实施方案中，所述的强阳性质控品为含有HIV-1 2-LTR DNA序列和细胞定量扩增序列的质粒，且其中HIV-1 2-LTR DNA基因的浓度为0.05～0.5拷贝/每个细胞。

在一个优选的实施方案中，所述的弱阳性质控品为含有HIV-1 2-LTR DNA序列和细胞定量扩增序列的质粒，且其中HIV-1 2-LTR DNA基因的浓度为0.0005～0.005拷贝/每个细胞。

其中，所述的阴性对照品为生理盐水。

其中所述的阳性定量参照品为已知浓度的携带HIV-1 2-LTR DNA序列的质粒或携带该质粒的细胞。

本发明所述的Brij-35的浓度百分数是体积百分数。

再一个方面，本发明提供了一种快速鉴定和定量检测人类免疫缺陷病毒1型2-LTRDNA的PCR检测方法，所述的PCR检测方法包括以下步骤：

(1)提取扩增模板：提取待测样品中的全部DNA作为扩增模板；

(2)实时荧光定量PCR反应：

实时荧光定量PCR反应体系为，总体积为50μL：

其中，PCR反应液包括：pH 8.5的Tris-硫酸50～70mM、柠檬酸钠2～4mM、(NH₄)₂SO₄1～2mM、MgSO₄ 6～8mM、Brij-35 0.10％、乙酰化牛血清白蛋白0.1mg/mL、dNTP 0.5～2mM、检测引物组200～600nM、检测探针100～300nM、细胞定量引物组200～600nM、细胞定量探针100～300nM；

实时荧光定量PCR反应程序为：

第一步：37℃5min；第二步：95℃10min；第三步：95℃15s，62～65℃15s，72℃20s，5～8个循环；第四步：95℃15s，60～65℃15s，72℃20s，共5～8个循环；第五步：95℃15s，60℃1min，40个循环；60℃时采集荧光；

(3)结果判断：实时荧光定量PCR结束后，观察其扩增曲线，通过标准曲线计算HIV-1 2-LTR DNA的含量。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明解决了HIV-1病毒在低水平情况下无法实现定量检出的技术问题。

(2)本发明提供的检测引物组和检测探针或检测试剂盒，配合本发明提供的特定的实时荧光定量PCR反应程序，可以实现对低至2拷贝的HIV-1 2-LTR DNA/百万细胞的检出，即本发明对HIV-1 2-LTR DNA的最低检测限可达到2拷贝HIV-1 2-LTR DNA/百万细胞，远远高出现有技术。

(3)本发明提供的细胞定量引物组和细胞定量探针，可以实现在同一管PCR反应中同时完成对待测样品中的HIV-1 2-LTR DNA和细胞数的定量，比现有技术更加高效便捷。

(4)本发明所提供的检测引物组，与传统的实时荧光定量PCR不同，本发明通过引入3对共6条实时荧光定量PCR引物，采用多个循环，并提高引物退火温度，使本发明提供的HIV-1 2-LTR DNAPCR检测方法达到极高的灵敏度及特异性，其中最低检出限可达每个PCR中检测2拷贝/百万细胞。同时，本发明还在PCR反应中加入细胞定量反应体系，即可在同一个PCR反应中同时对HIV-1 2-LTR DNA及细胞数进行定量(常规方法需要另外对细胞量进行计数)。

(5)本发明提供的HIV-1 2-LTR DNA PCR检测试剂盒及其检测方法由于高敏感等特性，其临床应用广泛，可用于：①HIV-1感染早期检测；②监测个体中正在进行的病毒复制的动态情况，以进一步判断疾病进展，指导用药。抗病毒药物治疗疗效评估、病情复发控制。

附图说明

图1为实施例5中的标准曲线扩增图。

图2为实验例1中的实验1的检测结果图。

图3为实验例1中的实验2的检测结果图。

图4为实验例2中的实验1的检测结果图。

图5为实验例2中的实验2的定量标准曲线的线性回归曲线图。

具体实施方式

以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。

除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学试验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂盒生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1检测人类免疫缺陷病毒1型2-LTR DNA的检测引物组和检测探针

检测引物组包括：引物1：5’-TGGCTAACTAGGGAACCCACT-3’；

引物2：5’-AGACAAGATATCCTTGATCTGT-3’；

引物3：5’-AACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCC-3’；

引物4：5’-CCACAGATCAAGGATATCTTGTC-3’；

引物5：5’-CTCAGATCCTGCATATAAGC-3’；

和引物6：5’-CAAGGCTACTTCCCTGATTA-3’。

检测探针包括：

探针1：其序列5’-AAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGC-3’，探针1的核苷酸序列的5’端标记有FAM荧光基团，探针1的核苷酸序列的3’端标记有TAMRA淬灭基团。

实施例2检测人类免疫缺陷病毒1型2-LTR DNA的检测引物组和检测探针

检测引物组包括：

引物1：5’-TGGCTAACTAGGGAACCCACT-3’；

引物2：5’-AGACAAGATATCCTTGATCTGT-3’；

引物3：5’-AACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCC-3’；

引物4：5’-CCACAGATCAAGGATATCTTGTC-3’；

引物5：5’-CTCAGATCCTGCATATAAGC-3’；

和引物6：5’-CAAGGCTACTTCCCTGATTA-3’。

检测探针包括：

探针2：其序列为5’-ACACTACTTGAAGCACTCAAGGCAAGC-3’，探针2的核苷酸序列的5’端标记有HEX荧光基团，探针2的核苷酸序列的3’端标记有淬灭基团MGB。

实施例3检测人类免疫缺陷病毒1型2-LTR DNA的检测引物组和检测探针

检测引物组包括：

引物1：5’-TGGCTAACTAGGGAACCCACT-3’；

引物2：5’-AGACAAGATATCCTTGATCTGT-3’；

引物3：5’-AACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCC-3’；

引物4：5’-CCACAGATCAAGGATATCTTGTC-3’；

引物5：5’-CTCAGATCCTGCATATAAGC-3’；

和引物6：5’-CAAGGCTACTTCCCTGATTA-3’。

检测探针包括：

探针1：其序列为5’-AAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGC-3’，探针1的核苷酸序列的5’端标记有FAM荧光基团，探针1的核苷酸序列的3’端标记有TAMRA淬灭基团；

和探针2：其序列为5’-ACACTACTTGAAGCACTCAAGGCAAGC-3’，探针2的核苷酸序列的5’端标记有FAM荧光基团，探针2的核苷酸序列的3’端标记有淬灭基团TAMRA。

实施例4用于检测人类免疫缺陷病毒1型2-LTR DNA的试剂盒

该试剂盒包括：

(1)实施例1中的检测引物组和检测探针；

(2)细胞定量引物组和细胞定量探针：

细胞定量引物组包括：

引物7：5’-GGGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG-3’；

引物8：5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACG-3’；

引物9：5’-CACACTGTGCCCATCTACGA-3’；

引物10：5’-CGCTCGGTGAGGATCTT C-3’；

细胞定量探针的核苷酸序列为5’-TGCCCTCCCCCATGCCATCCT-3’，其核苷酸序列的5’端标记有荧光基团VIC，其核苷酸序列的3’端标记有淬灭基团MGB；

(3)酶系：等体积混合的Taq DNA聚合酶和尿嘧啶-N-糖基化酶；

(4)PCR反应试剂：①pH 8.5的Tris-硫酸，储存浓度为1M；②柠檬酸钠，储存浓度为100mM；③(NH₄)₂SO₄，储存浓度为1M；④MgSO₄，储存浓度为1M；⑤十二烷基聚乙二醇醚，储存浓度为3％；⑥乙酰化牛血清白蛋白，储存浓度为30mg/mL；⑦dNTP，储存浓度为10mM；

(5)阴性对照品：生理盐水；

(6)弱阳性质控品：为含有HIV-1 2-LTR DNA基因序列和细胞定量扩增基因序列的质粒，且其中HIV-1 2-LTR DNA基因的浓度为0.0005～0.005拷贝/每个细胞；

(7)强阳性质控品：为含有HIV-1 2-LTR DNA序列和细胞定量扩增序列的质粒，且其中HIV-1 2-LTR DNA基因的浓度为0.05～0.5拷贝/每个细胞；

(8)阳性定量参考品：浓度范围为2拷贝HIV-1 2-LTRDNA/百万细胞到1×10⁵拷贝HIV-1 2-LTR DNA/百万细胞的HIV阳性的外周血单个核细胞(PBMC-HIV⁺)。

实施例5

快速鉴定和定量检测人类免疫缺陷病毒1型2-LTR DNA的PCR检测方法及其应用

1、样本：取待测全血样本，采用QIAamp DNA Blood Mini Kit(购自Qiagen公司，货号51104)提取全血样本中的DNA作为后续PCR模板。

2、检测试剂盒：采用实施例4提供的试剂盒。

3、检测方法：

(1)设置实验组、对照组和标准曲线组：

A、实验组：待测全血样本；B、阴性对照组：即实施例4中的阴性对照品；C、弱阳性对照组：即实施例4中的弱阳性质控品；D、强阳性对照组：即实施例4中的强阳性质控品；E、标准曲线组：即实施例4中的阳性定量参考品；

(2)实时荧光定量PCR反应：

A、配制PCR反应液：PCR反应液包括：pH 8.5的Tris-硫酸70mM、柠檬酸钠4mM、(NH₄)₂SO₄ 2mM、MgSO₄ 8mM、Brij-350.10％、乙酰化牛血清白蛋白0.1mg/mL、dNTP 2mM、检测引物组600nM、检测探针300nM、细胞定量引物组600nM、细胞定量探针300nM；其中引物1-6的浓度均为100nM，探针1的浓度为300nM，引物7-10的浓度均为150nM；

B、实时荧光定量PCR反应体系：

将实验组、阴性对照组、弱阳性对照组、强阳性对照组、强阳性对照组和标准曲线组分别按以下添加量配制PCR反应体系；

总体积为50μL：

PCR反应液 29.2tL

酶系 0.8μL

实验组、对照组或标准曲线组 20μL；

C、实时荧光定量PCR反应程序：

(3)结果判断：实时荧光定量PCR结束后，观察其扩增曲线，通过标准曲线计算HIV-1 2-LTR DNA的含量；

(4)质量控制：

在整个检测过程中，需保证各样品满足以下质量要求：①阴性质控品：HIV-1 2-LTR DNA扩增曲线无CT值显示；②弱阳性参考品：检测值介于0.0005～0.05copies/cell；③强阳性参考品：检测值介于0.5～5copies/cell；④阳性定量参考品：检测均为阳性，Ct值＜30，且2条标准曲线线性相关系数0.98≤r≤1。

本实施例的标准曲线扩增图如图1所示。

另外，当采用检测引物组中的任意四条引物进行检测实验，或采用常规PCR一种循环模式的PCR方式，或采用常规PCR在用的引物退火温度均不能获得正确的检测结果。

实验例1特异性实验

实验1、采用本发明实施例5的方法，对100例HIV-1阴性标本或健康人群标本进行检测，阴性标本包括为EB病毒、水痘-带状疱疹病毒、1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒、HBV、6型单纯疱疹病毒、甲型肝炎病毒、黄热病病毒、细胞巨化病毒、人类T细胞白血病病毒1型和2型、丙型肝炎病毒、大肠杆菌提取的核酸以及柯萨奇病毒B3等，结果显示均为阴性(准确率100％)。检测结果如图2所示，其中蓝色为HIV-1DNA扩增，均为阴性；绿色为细胞定量扩增。以上结果证明本发明方法具有很好的特异性。

实验2、对50例HIV-1 2-LTR DNA阴性质粒标本的检测，其中包括质粒LTR/PNL4-3(仅整合HIV的非2-LTR序列)、LTR/ACH2(仅整合HIV的非2-LTR序列)、PNL4-3(仅整合HIV的非2-LTR序列)、ACH2(仅整合HIV的非2-LTR序列)，各样本质粒浓度分别为E8、E6、E4、E2，结果均显示为阴性(准确率100％)。检测结果如图3所示，蓝色为HIV-1 2-LTR DNA扩增，均为阴性；绿色为细胞定量扩增。以上结果证明本发明方法具有很好的特异性。

另外，当采用检测引物组中的任意四条引物进行检测实验，或采用常规PCR一种循环模式的PCR方式，或采用常规PCR在用的引物退火温度对HIV-1阳或阴性样本或HIV-1 2-LTR DNA阳或阴性质粒进行检测时，会出现明显的假阴性或假阴性检测结果，说明采用常规的引物数目或常规PCR方式并不能达到本发明的超高特异性。

实验例2灵敏度及线性范围实验

实验1、用于检测人类免疫缺陷病毒1型2-LTR DNA的试剂盒和检测方法的灵敏度分析

将HIV阳性性PBMC细胞稀释至浓度为每1×10⁶个细胞中含10个2-LTR DNA(相当于每个PCR反应中检测2个拷贝HIV-1 2-LTR DNA)，采用本发明实施例5的检测方法对HIV-12-LTR DNA进行检测。检测结果如图4所示，通过多次重复检测，本发明的最低检出限(每个PCR反应中检测2个拷贝HIV-1 2-LTRDNA/百万细胞)检出率可达90％。

实验2、用于检测人类免疫缺陷病毒1型2-LTR DNA的试剂盒和检测方法的线性范围

将HIV阳性PBMC细胞稀释至浓度为每百万个细胞中含1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²和10个2-LTR DNA，采用本发明实施例5的检测方法对HIV-1 2-LTR DNA进行检测，取其检测值及均值进行结果计算和判断。进行数据经可用性检查和多项回归分析，并经精密度检验后，确定在检测范围内，本试剂结果为线性。最终结果显示2-LTR DNA检测的线性覆盖范围为0.0001～1拷贝/cell，HIV-1 2-LTR DNA定量标准曲线的线性回归曲线图如图5所示，R²＝0.999。

实验3本发明检测方法与常规荧光PCR的比较

将将HIV阳性PBMC细胞样本稀释至每百万细胞中分别含200、100、50、20、10和5个2-LTR DNA，用本发明实施例5所述的核酸提取方法提取核酸后，分别采用本发明实施例5所用的引物组和PCR检测方法以及常规的PCR引物和常规的荧光PCR方法检测。结果显示常规荧光PCR方法检测的阳性率分别为：100％、90％、50％、25％、10％和0％；本发明方法检测阳性率分别为：100％、100％、100％、90％、95％、95％。且常规的荧光PCR方法的最低检出限只能到50拷贝/百万细胞，线性范围也只能到2～10拷贝/细胞。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110>广州海力特生物科技有限公司

<120>检测HIV-1 2-LTR DNA的PCR引物组、探针及其试剂盒和检测方法

<130> 20170314

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

tggctaacta gggaacccac t 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

agacaagata tccttgatct gt 22

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

aactagggaa cccactgctt aagcc 25

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 4

ccacagatca aggatatctt gtc 23

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 5

ctcagatcct gcatataagc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 6

caaggctact tccctgatta 20

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 7

aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgc 28

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 8

acactacttg aagcactcaa ggcaagc 27

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 9

gggtcaccca cactgtgccc atctacg 27

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 10

tcacccacac tgtgcccatc tacg 24

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 11

cacactgtgc ccatctacga 20

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 12

cgctcggtga ggatcttc 18

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 13

tgccctcccc catgccatcc t 21

Claims

1.一种检测人类免疫缺陷病毒1型2-LTR DNA的检测引物组和检测探针，其特征在于：所述的检测引物组由以下6条引物序列或以下6条引物序列的互补序列组成：

所述的检测引物组由以下6条引物序列：引物1：其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；引物2：其序列为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；引物3：其序列为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；引物4：其序列为SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；引物5：其序列为SEQ IDNO：5所示的核苷酸序列；引物6：其序列为SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；

所述的检测探针包括探针1和探针2；

所述的探针1的序列为SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，探针1的核苷酸序列的5’端标记有FAM荧光基团，探针1的核苷酸序列的3’端标记有TAMRA淬灭基团；所述的探针2的序列为SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列，探针2的核苷酸序列的5’端标记有FAM荧光基团，探针2的核苷酸序列的3’端标记有淬灭基团TAMRA。

2.如权利要求1所述的检测引物组和检测探针，其特征在于：所述的检测引物组和检测探针用于实时荧光定量PCR技术，实现对HIV-1 2-LTRDNA的检测。

3.一种用于检测人类免疫缺陷病毒1型2-LTR DNA的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括权利要求1所述的检测引物组和检测探针。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括：细胞定量引物组和细胞定量探针；

所述的细胞定量引物组由以下4条引物序列或以下4条引物序列的互补序列组成：引物7：其序列为SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列；引物8：其序列为SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列；引物9：其序列为SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列；引物10：其序列为SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列；所述的细胞定量探针的序列为SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列；细胞定量探针的核苷酸序列的5’端标记有荧光基团，所述的荧光基团选自FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的一种，细胞定量探针的荧光基团应当不同于检测探针的荧光基团；细胞定量探针的核苷酸序列的3’端标记有淬灭基团，所述的淬灭基团选自TAMRA、MGB和BHQ中的一种；所述的细胞定量探针的荧光基团应当不同于检测探针的荧光基团。

5.如权利要求3-4任意一项所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括酶系和PCR反应试剂；

所述的酶系为等体积混合的Taq DNA聚合酶与尿嘧啶-N-糖基化酶；

所述的PCR反应试剂包括：①pH 8.5的Tris-硫酸，储存浓度为1M；②柠檬酸钠，储存浓度为100mM；③(NH₄)₂SO₄，储存浓度为1M；④MgSO₄，储存浓度为1M；⑤十二烷基聚乙二醇醚Brij-35，储存浓度为3％；⑥乙酰化牛血清白蛋白，储存浓度为30mg/mL；⑦dNTP，储存浓度为10mM。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括：强阳性质控品、弱阳性质控品、阴性对照品和阳性定量参考品。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：

所述的强阳性质控品为含有HIV-1 2-LTR DNA序列的质粒，且其中HIV-1 2-LTR DNA基因的浓度为0.05～0.5拷贝/每个细胞；所述的弱阳性质控品为含有HIV-1 2-LTR DNA序列的质粒，且其中HIV-1 2-LTR DNA基因的浓度为0.0005～0.005拷贝/每个细胞；所述的阴性对照品为生理盐水；所述的阳性定量参照品为已知浓度的携带HIV-1 2-LTR DNA序列的质粒或携带该质粒的细胞。

8.一种不以疾病诊断为目的的检测人类免疫缺陷病毒1型2-LTR DNA的PCR检测方法，所述的PCR检测方法包括以下步骤：

(1)提取扩增模板：提取待测样品中的全部DNA作为扩增模板；

(2)实时荧光定量PCR反应：

实时荧光定量PCR反应体系为，总体积为50μL：

其中，PCR反应液包括：pH8.5的Tris-硫酸50～70mM、柠檬酸钠2～4mM、(NH₄)₂SO₄ 1～2mM、MgSO₄ 6～8mM、十二烷基聚乙二醇醚Brij-35 0.10％、乙酰化牛血清白蛋白0.1mg/mL、dNTP 0.5～2mM、检测引物组200～600nM、检测探针100～300nM、细胞定量引物组200～600nM、细胞定量探针100 ～300nM；

实时荧光定量PCR反应程序为：

9.如权利要求8所述的PCR检测方法，其特征在于：所述的PCR反应液包括：pH 8.5的Tris-硫酸70mM、柠檬酸钠4mM、(NH₄)₂SO₄ 2mM、MgSO₄ 8mM、十二烷基聚乙二醇醚Brij-350.10％、乙酰化牛血清白蛋白0.1mg/mL、dNTP 2mM、检测引物组600nM、检测探针300nM、细胞定量引物组600nM、细胞定量探针300nM。