CN110846439A

CN110846439A - 一种hcmv检测产品及其应用

Info

Publication number: CN110846439A
Application number: CN201911202233.9A
Authority: CN
Inventors: 曹蕾; 杨慧慧; 李越; 李婷婷; 熊磊; 邵俊斌
Original assignee: Shanghai ZJ Bio Tech Co Ltd
Current assignee: Shanghai ZJ Bio Tech Co Ltd
Priority date: 2019-11-29
Filing date: 2019-11-29
Publication date: 2020-02-28
Anticipated expiration: 2039-11-29
Also published as: CN110846439B

Abstract

本发明提供一种HCMV荧光定量PCR检测物质，其特征在于，所述物质包括特异性识别HCMV核酸的引物和探针，所述特异性识别HCMV核酸的引物包括如SEQ ID NO：1所示的HCMV核酸上游引物和如SEQ ID NO：2所示的HCMV核酸下游引物；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。本发明解决了对羊水样本中HCMV定量的问题，这也使得临床上进行先天性巨细胞病毒感染筛查成为了可能。

Description

一种HCMV检测产品及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种HCMV检测产品及其应用。

背景技术

HCMV是一种广泛存在的双链DNA病毒，主要通过性接触或直接接触受感染者的血液、尿液或唾液传播，平均潜伏期大约28-60天。妊娠期孕妇的免疫力降低，一方面可以抑制机体的炎症反应从而增加母体对胎儿抗原容受性，另一方面可能会增加孕妇和胎儿对某些传染性疾病的易感性。孕妇发生HCMV原发性感染后，宫内胎儿感染率高达30％-40％。

目前市面上HCMV检测的试剂盒种类繁多，根据检测的靶物质可分为抗体检测和核酸检测。

HCMV感染首先诱导机体产生特异性IgM抗体，随后出现IgG抗体。孕妇的HCMV原发性感染可以通过抗体检测实现，具体有以下方法：

(1)检测孕妇血清抗体水平，间隔3-4周后重复测定。诊断依据包括血清转化现象(初次血清抗体阴性的孕妇出现特异性IgG抗体)，或者IgG抗体滴度增加4倍；

(2)IgG抗体亲和力测定：亲和力指数＜30％，提示孕妇HCMV感染为近2-4个月内的原发性感染。

但对抗体的检测并不能反应当下样本中HCMV的载量，对于胎儿的先天性感染并无直接证据。HCMV可通过胎儿尿液排出到羊水中，目前认为检测到HCMV-DNA是产前胎儿HCMV宫内感染的最直接证据。

目前从国家药品监督管理局官方网站医疗器械查询处查到获得医疗器械注册证的HCVM核酸检测有15种，覆盖的样本类型包括血清、血浆、尿液、乳汁和淋巴细胞，其中多数为定量产品。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种HCVM检测产品及其应用。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种HCMV荧光定量PCR检测物质，所述物质包括特异性识别HCMV核酸的引物和探针，所述特异性识别HCMV核酸的引物包括如SEQ ID NO：1所示的HCMV核酸上游引物和如SEQ ID NO：2所示的HCMV核酸下游引物；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明第二方面提供前述HCMV荧光定量PCR检测物质用于制备HCMV检测产品的用途。

本发明第三方面提供一种HCMV荧光定量检测试剂盒，所述试剂盒包括PCR检测混合物，所述所述PCR检测混合物中包括前述HCMV荧光定量PCR检测物质。

如上所述，本发明的HCMV检测产品及其应用，具有以下有益效果：

本发明首先解决了市面上无针对羊水样本的HCMV定量检测试剂的现状，羊水样本成分复杂，含多种不明抑制剂存在。本发明使用磁珠法，成功的实现了对羊水样本的高效提取，使得对羊水样本中的HCMV进行定量成为可能。

另一方面，本发明校准品浓度溯源至WHO国际标准品，单位为国际单位IU/mL。而目前市面上的HCMV定量试剂使用单位均为copies/μL，该单位是通过测定质粒的OD值通过公式计算而来。该方法虽然有一定科学依据，但是各企业制备的质粒大小均不同，同一企业不同批质粒也有差异，且通过质粒对DNA进行定量，中间误差较大，不同企业的试剂盒定量结果不具有可比性。而本发明通过WHO国际标准品溯源定值，确保试剂盒给出的定量值稳定可靠。

综上两点，本发明解决了对羊水样本中HCMV定量的问题，这也使得临床上进行先天性巨细胞病毒感染筛查成为了可能。《先天性巨细胞病毒感染筛查与临床干预指南》中明确指出“目前认为检测到HCMV-DNA是产前胎儿HCMV宫内感染的最直接证据”。

附图说明

图1：试剂盒提取试剂预装板示意图。

图2：校准品溯源过程示意图。

图3：提取效果比较的PCR扩增图(生理盐水稀释，蓝色实线代表本发明实施例3提取试剂，红色虚线表示对比提取试剂)。

图4：提取效果比较的PCR扩增图(阴性羊水稀释，蓝色实线代表本发明实施例3提取试剂，红色虚线表示对比提取试剂)。

图5：特异性试验目的基因通道扩增图。

图6：特异性试验内标通道扩增图。

图7：样本S1扩增曲线图。

图8：样本S2扩增曲线图。

图9：样本S3扩增曲线图。

图10：样本S4扩增曲线图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

各种原料和试剂均购自商业供应商，未经进一步纯化，除非另有说明。易受潮的原料和试剂均存放于全密封瓶中，并直接使用，均未经过特殊处理。

本发明中所涉及的单位w/v，是指质量和体积的比值，其中，质量单位为g，体积单位为ml。

本发明提供的HCMV荧光定量PCR检测物质，其特征在于，所述物质包括特异性识别HCMV核酸的引物和探针，所述特异性识别HCMV核酸的引物包括如SEQ ID NO：1所示的HCMV核酸上游引物和如SEQ ID NO：2所示的HCMV核酸下游引物；所述探针的核苷酸序列如SEQID NO：3所示。

具体的：

HCMV核酸上游引物：5’-GCTCATAAGTCTGTATGTG-3’(SEQ ID NO：1)；

HCMV核酸下游引物：5’-CAGACGATATAAATATGGAGAG-3’(SEQ ID NO：2)；

HCMV探针：5’-TTCTTATACAACAGCGACA-3’(SEQ ID NO：3)。

所述探针一端标记有荧光报告基团，另一端标记有标记荧光淬灭基团。优选的，所述HCMV探针标记的荧光报告基团为FAM荧光基团，所述荧光淬灭基团为BHQ1。

本发明所述的HCMV荧光定量PCR检测物质可用于制备HCMV检测产品的用途。

所述HCMV检测产品以羊水作为检测样本来源。

所需样本用量至少为200μL。进一步的，可以为200-250ul。

所述HCMV检测产品用于HCMV的判断、治疗方案的选择、和/或预后评估。

本发明针对HCMV核酸的定量检测，采用的是Taqman荧光定量PCR原理，针对HCMV基因设计特异性引物，扩增特异性核酸序列，同时设计Taqman探针，并标记不同的荧光报告基团，位于上下游引物之间。探针其5’端标记荧光报告基团，3’端标记非荧光淬灭基团。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。因此，本发明采用的荧光定量PCR技术具有实时检测、定量分析和检测通量高等特点，且操作简便、灵敏度高、特异性好等优点。

本发明提供的HCMV荧光定量检测试剂盒，所述试剂盒包括PCR检测混合物，所述所述PCR检测混合物中包括前述HCMV荧光定量PCR检测物质。

在一种实施方式中，所述PCR检测混合物中，所述HCMV核酸上游引物和HCMV核酸下游引物的终浓度分别为0.6pmol/μL；HCMV探针的终浓度为0.08pmol/μL。

进一步的，所述HCMV荧光定量检测试剂盒中还包括内标，所述PCR检测混合物中还包括特异性识别内标的试剂及内标探针。

所述特异性识别内标的试剂包括特异性扩增内标的引物，所述特异性扩增内标的引物包括内标上游引物和内标下游引物；所述PCR检测混合物中，所述内标上游引物和内标下游引物的终浓度分别为0.08pmol/μL；内标探针的终浓度为0.16pmol/μL。

在一种实施方式中，所述内标上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，具体的：

5’-CTCTGCACCTCTCAACTG-3’。

在一种实施方式中，所述内标下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，具体的：

5’-TGGCGTTGGTTGAATGTA-3’。

在一种实施方式中，所述内标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，具体的：

5’-CGCACCAGGACTGTCAA-3’。

所述内标探针一端标记有荧光报告基团，另一端标记有标记荧光淬灭基团。优选的，内标探针标记的荧光报告基团为HEX荧光基团；所述荧光淬灭基团为BHQ1。

在一种实施方式中，所述PCR检测混合物还含有PCR MIX和H₂O。

所述PCR MIX为市售产品。例如可以为Life Technologies公司生产的产品，名称为AGPATH-ID ONE-STEP RT-PCR，货号为4387291。

在一种实施方式中，所述PCR检测混合物中：PCR MIX 15μl/test；H₂O 13μL/test。

在一种实施方式中，所述HCMV荧光定量检测系统中还包括定量校准品、PCR酶和阴性质控品中的一种或多种。

定量校准品由HCMV质粒制备获得，浓度单位为IU/mL。使用HCMV核酸的国际标准品the 1st WHO International Standard for Human Cytomegalovirus(HCMV)(NIBSC code09/162)对定量校准品进行定值溯源。

在一种实施方式中，所述HCMV质粒为含有SEQ ID NO：7序列所示目标片段的质粒，所述内标质粒为含有SEQ ID NO：8序列所示目标片段的质粒。具体的：

GCTCATAAGTCTGTATGTGACCTATATATATTATACGCTATGTACACCGAACTGTCGCTGTTGTATAAGAAGAAAAAACTCTCCATATTTATATCGTCTG(SEQ ID NO：7)。

CTCTGCACCTCTCAACTGCCGCTGTTCAGTTGACAGTCCTGGTGCGCTGGTTTGACTACATTCAACCAACGCCA(SEQ ID NO：8)。

在一种实施方式中，所述阴性质控品为DEPC-H₂O。

进一步的，所述试剂盒还包括磁珠法HCMV核酸提取用物质，所述磁珠法HCMV核酸提取用物质包括裂解液，所述裂解液至少含有以下组分，其中，以裂解液的总量为基准计，各组分的含量为：

具体的，以裂解液的总量为基准计，所述裂解液中，

异硫氰酸胍的含量可以为1-3mol/L，1-1.5mol/L，1.5-2mol/L，2-2.5mol/L，2.5-3mol/L。

十二烷基硫酸钠的含量可以为0.05-0.1％(w/v)，0.05-0.06％(w/v)，0.06-0.07％(w/v)，0.07-0.08％(w/v)，0.08-0.09％(w/v)，0.09-0.1％(w/v)。

NP40的含量可以为1-5％(w/v)，1-2％(w/v)，2-3％(w/v)，3-4％(w/v)，4-5％(w/v)。

Tris-HCl的含量可以为10-80mmol/L，10-20mmol/L，20-30mmol/L，30-40mmol/L，40-50mmol/L，50-60mmol/L，60-70mmol/L，70-80mmol/L。

EDTA的含量可以为5-15mmol/L，5-8mmol/L，8-10mmol/L，10-12mmol/L，12-15mmol/L。

β-巯基乙醇的体积百分比可以为0.1-0.5％，0.1-0.2％，0.2-0.3％，0.3-0.4％，0.4-0.5％。

其中，NP40为乙基苯基聚乙二醇。

所述溶剂可为工艺用水。

在一种实施方式中，所述裂解液至少含有以下组分，其中，以裂解液的总量为基准计，各组分的含量为：

所述裂解液可用于提取的HCMV的核酸来源于羊水样本。

所述裂解液的pH值为8.5±0.1。

磁珠法HCMV核酸提取用物质还包括磁珠、洗涤液、洗脱液、RNA助沉剂和蛋白酶K中的一项或多项。

所述RNA助剂为市售产品和蛋白酶K为市售产品，例如可以为：RNA助沉剂(Glycogen,20mgml)，蛋白酶K，天根生化科技(北京)有限公司，货号RT403。

在一种实施方式中，所述磁珠使用浓度为50-100mg/mL。

所述磁珠型号可为奥润SM1-050。

所述第一洗涤液用于洗涤掉样本中蛋白类的杂质。在一种实施方式中，在一种实施方式中，所述洗涤液包括第一洗涤液，所述第一洗涤液中至少含有以下组分，至少含有以下组分，其中，以第一洗涤液的总量为基准计，各组分的含量为：异硫氰酸胍：0.5-2mol/L，氯化钠：0.1-0.5mol/L，曲拉通X-100：0.5-1％(w/v)，无水乙醇体积百分比为30-50％，Tris-HCl：2-8mmol/L，溶剂为水。

所述第二洗涤液用于洗涤掉盐类杂质。在一种实施方式中，所述洗涤液还包括第二洗涤液，所述第二洗涤液至少含有以下组分，其中，以第二洗涤液的总量为基准计，各组分的含量为：无水乙醇：体积百分比为75％，溶剂为水。

所述洗脱液用于洗脱核酸。所述洗脱液也可以采用市售产品。在一种实施方式中，所述洗脱液至少含有以下组分，其中，以洗脱液的总量为基准计，各组分的含量为：10-80mmol/L，EDTA0.5-25mmol/L，溶剂为水。

所述第一洗涤液的pH为8.0±0.1。

所述洗脱液的pH为8.0±0.1。

使用时，裂解液与磁珠的体积比为(300-6 00)μL：20μL；。

所述裂解液与磁珠可混合后预装在96孔板中。所述96孔板选自96深孔板。

在一种实施方式中，如图1所示，所述裂解液与磁珠预装在96深孔板的A行，体积控制在500μL±50μL。

所述第一洗涤液、第二洗涤液、洗脱液可分别预装在96孔板中。

在一种实施方式中，第一洗涤液预装在96深孔板的B，C行，体积控制在600μL±50μL。

在一种实施方式中，第二洗涤液预装在96深孔板的D，E行，体积分别控制在600μL±50μL和500μL±50μL。

在一种实施方式中，所述洗脱液预装在96深孔板的H行，体积控制在50μL±5μL。

实施例1 HCMV荧光定量PCR检测物质设计和合成

在HCMV探针的5’标记FAM荧光基团，内标探针的5’标记HEX荧光基团。合成针对HCMV和内标的PCR检测的引物、探针。

HCMV：

HCMV上游引物：5’-GCTCATAAGTCTGTATGTG-3’(SEQ ID NO：1)

HCMV下游引物：5’-CAGACGATATAAATATGGAGAG-3’(SEQ ID NO：2)

HCMV探针：5’FAM-TTCTTATACAACAGCGACA-BHQ1 3’(SEQ ID NO：3)

内标：

内标上游引物:5’-CTCTGCACCTCTCAACTG-3’(SEQ ID NO：4)

内标下游引物:5’-TGGCGTTGGTTGAATGTA-3’(SEQ ID NO：5)

内标探针:5’HEX-CGCACCAGGACTGTCAA-BHQ1 3’(SEQ ID NO：6)

实施例2 HCMV荧光定量检测试剂盒校准品的定值溯源

详见图2，用Nanodrop1000测量CMV质粒原液(CMV001)三次，取平均值得到浓度ng/μL，然后利用公式得到质粒的拷贝数为1.65×10¹⁴copies/mL。

计算公式：拷贝数(copies/mL)＝(6.02×10²³copies/mol)×C(10-6g/mL)/MW

定义：C，待测样本浓度，ng/μL；

MW，待测质粒平均分子量，g/mol(道尔顿)，计算公式MW(dsDNA)＝碱基数×660道尔顿/碱基。

逐级稀释四个梯度，浓度依次为1×10⁷copies/mL、1×10⁶copies/mL、1×10⁵copies/mL、1×10⁴copies/mL。

将HCMV定量一级参考品(HCMV QC1)和the 1st WHO International Standardfor Human Cytomegalovirus(HCMV)(NIBSC code 09/162)同时用试剂盒自带提取试剂进行提取，分别提取3次。提取后的HCMV QC1、the 1st WHO International Standard forHuman Cytomegalovirus(HCMV)和准备好的四个质粒梯度作为模板，进行实时荧光PCR操作。

建立质粒Ct值与拷贝数(copies/mL)之间的标准曲线，对HCMV QC1、the 1st WHOInternational Standard for Human Cytomegalovirus(HCMV)定量分析，通过the 1stWHO International Standard for Human Cytomegalovirus(HCMV)标称值的校准，得到拷贝数(copies/mL)与国际单位(IU/mL)的换算系数，同时HCMV定量一级参考品(HCMV QC1)浓度(IU/mL)确定。

通过HCMV定量一级参考品(HCMV QC1)对试剂盒的校准品进行定值，校准品由含有HCMV的质粒制备而成。HCMV质粒原液(CMV001)的拷贝数为1.65×10¹⁴copies/mL，逐级稀释四个梯度。

将HCMV一级参考品(HCMV QC1)提取3次，提取后的HCMV QC1和准备好的四个质粒梯度作为模板，进行实时荧光PCR操作。建立质粒Ct值与拷贝数(copies/mL)之间的标准曲线，对HCMV QC1定量分析，得到拷贝数(copies/mL)与国际单位(IU/mL)的换算系数，利用换算关系计算各浓度质粒的国际单位浓度，将其稀释为7×10⁷IU/mL作为HCMV QS1，浓度7×10⁶IU/mL作为HCMV QS2，浓度7×10⁵IU/mL作为HCMV QS3，浓度7×10⁴IU/mL作为HCMV QS4。

实施例3试剂盒中磁珠法HCMV核酸提取用物质的制备

制备试剂盒中磁珠法HCMV核酸提取用物质，其中

以裂解液的总量为基准计，裂解液各组分的含量为：

以第一洗涤液的总量为基准计，第一洗涤液各组分的含量为：异硫氰酸胍：2mol/L，氯化钠：0.5mol/L，曲拉通X-100：1％(w/v)，无水乙醇：50％(v/v)，Tris-HCl：2mmol/L，溶剂为水。

以第二洗涤液的总量为基准计，第二洗涤液各组分的含量为：无水乙醇：75％(v/v)，溶剂为水。

以洗脱液的总量为基准计，洗脱液各组分的含量为：40mmol/L，EDTA 10mmol/L，溶剂为水。

如图1所示，所述裂解液与磁珠预装在96深孔板的A行，体积控制在500μL±50μL。

第一洗涤液预装在96深孔板的B，C行，体积控制在600μL±50μL。

第二洗涤液预装在96深孔板的D，E行，体积分别控制在600μL±50μL和500μL±50μL。

所述洗脱液预装在96深孔板的H行，体积控制在50μL±5μL。

实施例4 HCMV荧光定量检测试剂盒的使用方法

1.样本提取：取羊水样本500μl，提取得到50μl的核酸样本；

2.检测液配置：取HCMV PCR检测混合物30μl，与0.5μl的PCR酶混合获得PCR反应混合物，取30μl PCR反应液加入20μl待测品，获得反应总体系为50μl的PCR反应液。

所述0.5μl的PCR酶由0.34μl Taq酶5U/μl，以及0.16μl尿嘧啶-N-糖基化酶5U/μl混合制成。

配置PCR反应混合物时，取HCMV PCR检测混合物30μl，与0.5μl的PCR酶(由0.34μlTaq酶5U/μl，以及0.16μl尿嘧啶-N-糖基化酶5U/μl混合制成)混合获得PCR反应混合物，振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒，获得混合物。取前述混合物30μl置于PCR管中，然后将20μl的样本及阴性质控品的DNA模板溶液和校准品加入PCR反应管中，盖好PCR反应管盖，立即进行PCR扩增反应。

循环参数设置为：37℃2min；94℃2min；93℃×15sec和60℃×60sec交替循环45次。单点荧光检测在60℃，反应体系为50μl。

PCR反应阈值设定：阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性质控品检测荧光曲线的最高点。

PCR检测结果的质量控制：阴性质控品检测结果为：FAM通道Ct栏显示Undetermined(ABI7500)或NoCt(SLAN)，HEX通道Ct值小于36，校准品检测结果做标准曲线，相关系数≤-0.98。试验结果的判断标准如下：

表1 检测结果的解释

注1：对于高浓度阳性样本，内标通道可能会受到目的基因扩增影响而无法扩增，但不影响结果判断。

实施例5试剂盒中磁珠法HCMV核酸提取用物质提取效果

1.实验方法

1.1检测对象

取一高浓度HCMV阳性羊水样本，分别使用HCMV阴性羊水样本和生理盐水稀释三个梯度。HCMV阴性羊水样本稀释的三个浓度样本分别定义为AF-1，AF-2，AF-3，生理盐水稀释的三个浓度样本分别定义NC-1，NC-2，NC-3。

1.2样本核酸提取

使用本发明实施例3所述的试剂盒中磁珠法HCMV核酸提取用物质和对比提取试剂(市场上QIAamp圈R DNA mini Kit(QIAGEN公司)提取试剂)进行样本提取，每个提取做两个重复。对比提取试剂按照其说明书进行操作，本发明试剂盒中磁珠法HCMV核酸提取用物质操作按照实施例3中预装方法进行操作，每个样本提取两个复孔。在预装板A行中先加入1μl内标，6μL RNA助沉剂和20μL蛋白酶K，再在各孔中依次加入AF-1，AF-2，AF-3，NC-1，NC-2，NC-3和阴性质控品。深孔板放入全自动核酸提取仪，运行程序“ZJ Blood-gDNA”，程序运行完成之后，用移液枪取出H行的DNA模板溶液备用。

1.3样本检测

配置PCR反应液时，取HCMV PCR检测混合液30μl，与0.5μl的PCR酶混合获得PCR反应混合液，振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒，获得混合液。取前述混合液30μl置于PCR管中，然后将20μl的样本和阴性质控品的DNA模板溶液以及校准品加入PCR反应管中，盖好PCR反应管盖，立即进行PCR扩增反应。

荧光通道的选择如下表2。

表2 荧光通道的选择

通道机型	1	2
			ABI7500	FAM	HEX
SLAN	通道1	通道2

注：如使用ABI Prism7500实时荧光PCR仪，则需要将passive reference和quencher处均选择“none”。

2.实验结果

生理盐水稀释的羊水样本扩增曲线见图3，HCMV阴性羊水样本稀释的羊水样本扩增曲线见图4，检测结果Ct值统计见下表：

表3 提取试剂比较检测结果

根据图3，结合表3的Ct值数据，表明本发明提取试剂与对照提取试剂对于生理盐水稀释的样本提取效率无明显差异。

根据图4，结合表3的Ct值数据，表明本发明提取试剂提取羊水样本稀释的样本，效率要明显高于对比提取试剂，Ct值提前约2个Ct。

以上结果说明，对于生理盐水稀释的样本，两种提取试剂提取效率并无明显差异，但是对于羊水样本稀释的样本，本发明提取试剂的提取效果明显优于其它商品化提取试剂。说明羊水样本中的确存在抑制PCR的组分在，但本发明提取试剂能够很好地在提取步骤去除该抑制物，得到的DNA模板样本获得更优的PCR扩增效果。

实施例6 HCMV荧光定量PCR检测物质特异性分析

1.实验方法

1.1检测对象

与HCMV具有相似症状或相同样本类型的病原体：包括BKV(多瘤病毒的一种)、JCV(多瘤病毒的一种)、HSV-I(单纯疱疹病毒I型)、HSV-II(单纯疱疹病毒II型)、VZV(带状疱疹病毒)、HHV-6A(人类疱疹病毒-6A)、HBV(乙肝病毒)、HCV(丙肝病毒)、B19(人类微小病毒)、EBV(人类疱疹病毒-EB)。

1.2样本核酸提取

本次试验样本为核酸，无需再进行额外的提取步骤。

1.3样本检测

配置PCR反应液时，取HCMV PCR检测混合液30μl，与0.5μl的PCR酶混合获得PCR反应混合液，振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒，获得混合液。取前述混合液30μl置于PCR管中，然后将20μl的其它病原体样本和阴性质控品的DNA模板溶液以及校准品加入PCR反应管中，盖好PCR反应管盖，立即进行PCR扩增反应。

荧光通道的选择如下表4。

表4 荧光通道的选择

通道机型	1	2
			ABI7500	FAM	HEX
SLAN	通道1	通道2

2.实验结果

10种病原体扩增结果，目的基因通道(FAM)扩增图见图5，内标通道(HEX)扩增图见图6。检测结果Ct值如下表5：

表5：特异性试验检测结果

内标通道扩增正常，目的基因均无扩增曲线，说明本发明实施例1所述引物探针对其它特异性病原体无检出。

实施例7 HCMV荧光定量PCR检测物质灵敏度分析

1.实验方法

1.1检测对象

对1例临床获得的羊水样本,使用HCMV阴性羊水样本稀释至6个浓度，依次编号为Y1，Y2，Y3,Y4，Y5和Y6。

1.2样本核酸提取

使用实施例3提取试剂进行羊水样本的提取。在预装板A行中先加入1μl内标，6μLRNA助沉剂和20μL蛋白酶K，再在各孔中依次加入Y1，Y2，Y3,Y4，Y5，Y6和阴性质控品。深孔板放入全自动核酸提取仪，运行程序“ZJ Blood-gDNA”，程序运行完成之后，用移液枪取出H行的DNA模板溶液备用。

1.3样本检测

分别使用实施例1所述引物探针，与对照引物探针配置PCR反应液。对照引物探针的序列为：

CMV-F：5'-CACTGTCATCAGAATATATGATGTA-3'(SEQ ID NO：9)

CMV-R：5'-GCGGTTGCTACTACTTTC-3'(SEQ ID NO：10)

CMV-探针：5'-TCCTCACCATAGCCACC-3'(SEQ ID NO：11)

所述HCMV PCR检测混合液的组成为：HCMV上游引物0.6pmol/μL；HCMV下游引物0.6pmol/μL；巨细胞病毒探针0.08pmol/μL；内标上游引物0.08pmol/μL；内标下游引物0.08pmol/μL；内标探针0.16pmol/μL；PCR MIX 15μl/test；H₂O 13μL/test。(对照PCR反应液中将HCMV上游引物，HCMV下游引物和巨细胞病毒探针替换为对照引物探针，浓度不变)

取两种巨细胞病毒PCR检测混合液30μl，与0.5μl的PCR酶混合获得PCR反应混合液，振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒，获得混合液。取前述混合液30μl置于PCR管中，然后将20μl样本和阴性质控品的DNA模板溶液以及校准品加入PCR反应管中，盖好PCR反应管盖，立即进行PCR扩增反应。

荧光通道的选择见表2。

2.实验结果2

由表6数据可知，本发明专利检测稀释至Y5，Y6的样本，阳性率依旧为100％，但对照试剂的阳性率已显著下降。可见本发明试剂盒具有较好灵敏度。

表6 本发明与对照引物探针的灵敏度比较

实施例8 HCMV荧光定量检测试剂盒的应用

1.实验方法

1.1检测对象

对4例临床获得的羊水样本进行HCMV核酸的检测，该4例样本在医院已经培养法鉴定为HCMV阳性样本3份，HCMV阴性样本1份，依次编号为S1，S2，S3和S4。

1.2样本核酸提取

使用实施例3所述磁珠法HCMV核酸提取用物质进行4例羊水样本的提取。在预装板A行中先加入1μl内标，6μL RNA助沉剂和20μL蛋白酶K，再在各孔中依次加入S1，S2，S3，S4和阴性质控品。深孔板放入全自动核酸提取仪，运行程序“ZJ Blood-gDNA”，程序运行完成之后，用移液枪取出H行的DNA模板溶液备用。

1.3样本检测

配置PCR反应液时，取巨细胞病毒PCR检测混合物30μl，与0.5μl的PCR酶混合获得PCR反应混合物，振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒，获得混合物。取前述混合物30μl置于PCR管中，然后将20μl样本和阴性质控品的DNA模板溶液以及校准品加入PCR反应管中，盖好PCR反应管盖，立即进行PCR扩增反应。

荧光通道的选择见表2。

2.实验结果2

4例样本的扩增曲线见图7-图10，蓝色曲线代表FAM通道，绿色曲线代表HEX通道。检测结果的Ct值见表7。由表7数据可知，样本S1，S2和S3的检测结果均为HCMV阳性，且浓度在试剂盒定量范围限内，样本S4为巨细胞病毒阴性。检测结果与临床提供的培养法检测结果一致，可见本发明试剂盒具有较好的特异性。

表7 试剂盒样本定量检测结果

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 上海之江生物科技股份有限公司

<120> 一种HCMV检测产品及其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctcataagt ctgtatgtg 19

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cagacgatat aaatatggag ag 22

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttcttataca acagcgaca 19

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctctgcacct ctcaactg 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tggcgttggt tgaatgta 18

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgcaccagga ctgtcaa 17

<210> 7

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gctcataagt ctgtatgtga cctatatata ttatacgcta tgtacaccga actgtcgctg 60

ttgtataaga agaaaaaact ctccatattt atatcgtctg 100

<210> 8

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctctgcacct ctcaactgcc gctgttcagt tgacagtcct ggtgcgctgg tttgactaca 60

ttcaaccaac gcca 74

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cactgtcatc agaatatatg atgta 25

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcggttgcta ctactttc 18

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tcctcaccat agccacc 17

Claims

1.一种HCMV荧光定量PCR检测物质，其特征在于，所述物质包括特异性识别HCMV核酸的引物和探针，所述特异性识别HCMV核酸的引物包括如SEQ ID NO：1所示的HCMV核酸上游引物和如SEQ ID NO：2所示的HCMV核酸下游引物；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2.如权利要求1所述的HCMV荧光定量PCR检测物质，其特征在于，所述探针一端标记有荧光报告基团，另一端标记有荧光淬灭基团。

3.如权利要求1-2任一所述的HCMV荧光定量PCR检测物质用于制备HCMV检测产品的用途。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：

a.所述HCMV检测产品以羊水作为检测样本来源；

b.所需样本用量至少为200μL；

c.所述HCMV检测产品用于HCMV的判断、治疗方案的选择、和/或预后评估。

5.一种HCMV荧光定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR检测混合物，所述PCR检测混合物中包括权利要求1-2任一所述的HCMV荧光定量PCR检测物质。

6.如权利要求5所述的HCMV荧光定量检测试剂盒，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：

(1)所述PCR检测混合物中，所述HCMV核酸上游引物和HCMV核酸下游引物的终浓度分别为0.6pmol/μL；HCMV探针的终浓度为0.08pmol/μL；

(2)所述HCMV荧光定量检测试剂盒中还包括内标，所述PCR检测混合物中还包括特异性识别内标的物质及内标探针；

(3)所述HCMV荧光定量检测系统中还包括定量校准品、PCR酶和阴性质控品中的一种或多种。

7.如权利要求6所述的HCMV荧光定量检测试剂盒，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：

a.特征(2)中，所述特异性识别内标的物质包括特异性扩增内标的引物，所述特异性扩增内标的引物包括内标上游引物和内标下游引物；所述PCR检测混合物中，所述内标上游引物和内标下游引物的终浓度分别为0.08pmol/μL；内标探针的终浓度为0.16pmol/μL。

b.特征(3)中，定量校准品由HCMV质粒制备获得，浓度单位为IU/mL；

c.特征(3)中，所述阴性质控品为DEPC-H₂O。

8.如权利要求5所述的HCMV荧光定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括磁珠法HCMV核酸提取用物质，所述磁珠法HCMV核酸提取用物质包括裂解液，所述裂解液至少含有以下组分，其中，以裂解液的总量为基准计，各组分的含量为：

9.如权利要求8所述的HCMV荧光定量检测试剂盒，其特征在于，所述裂解液至少含有以下组分，其中，以裂解液的总量为基准计，各组分的含量为：

10.如权利要求8所述的HCMV荧光定量检测试剂盒，其特征在于：所述磁珠法HCMV核酸提取用物质还包括磁珠、洗涤液、洗脱液、RNA助沉剂和蛋白酶K中的一项或多项。

11.如权利要求10所述的HCMV荧光定量检测试剂盒，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：

(1)所述磁珠使用浓度为50-100mg/mL；

(2)所述洗涤液包括第一洗涤液，所述第一洗涤液中至少含有以下组分，以第一洗涤液的总量为基准计，各组分的含量为：异硫氰酸胍：0.5-2mol/L，氯化钠：0.1-0.5mol/L，曲拉通X-100：0.5-1％(w/v)，无水乙醇：体积百分比为30-50％，Tris-HCl：2-8mmol/L，溶剂为水；

(3)所述洗涤液还包括第二洗涤液，所述第二洗涤液至少含有以下组分，其中，以第二洗涤液的总量为基准计，各组分的含量为：无水乙醇：体积百分比为75％，溶剂为水；

(4)所述洗脱液至少含有以下组分，其中，以洗脱液的总量为基准计，各组分的含量为：Tris-HCl：10-80mmol/L，EDTA0.5-25mmol/L，溶剂为水；

(5)使用时，裂解液与磁珠的体积比为(300-600)μL：20μL；

(6)所述裂解液与磁珠混合后预装在96孔板中；

(7)所述第一洗涤液、第二洗涤液、洗脱液分别预装在96孔板中；

(8)所述试剂盒以羊水作为检测样本来源；

(9)所需样本用量至少为200μL。