CN109022620A - 一种用于检测人巨细胞病毒的试剂盒 - Google Patents

一种用于检测人巨细胞病毒的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测人巨细胞病毒的试剂盒，包括用于人巨细胞病毒DNA检测的特异性PCR引物和荧光探针、DNA内标检测的特异性引物和探针、PCR反应缓冲液、酶混合液、DNA内标、阴性质控品、强阳性质控品、弱阳性质控品和定量参考品A、B、C、D；其序列号见SEQ ID No.1~6。本发明的优点在于操作简单快捷，能在20min内完成人巨细胞病毒DNA的定量检测；灵敏度高，最低检出限为34.5IU/ml；特异性好，本发明根据内重复序列µl65设计1对引物，与其他病原体无交叉干扰，具有较高的特异性；本发明试剂盒可溯源至世界卫生组织（WHO）标准单位IU/mL，定量结果具有可追溯性，对于人巨细胞病毒核酸相关疾病的临床快速检测具有很高的参考价值，适于推广应用。

Description

一种用于检测人巨细胞病毒的试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测领域，尤其是涉及一种用于检测人巨细胞病毒的试剂盒。
背景技术
人巨细胞病毒（HCMV）属于疱疹病毒科β亚科，含线状双链DNA分子，长度为220-240kb，在形态、基因结构上与其他疱疹病毒类似。HCMV是世界范围内引发先天性感染最常见的一种病毒，在活产儿中感染率为0.2%-2.0%，是风疹病毒感染的2倍。其感染人群遍布全球，且多数人是在幼年或青年时期获得感染，随着年龄的增长，抗体的阳性率亦增高，男、女性无明显差异，提示HCMV的感染甚为普遍，且常引起多系统疾病，胎儿肝脏受累较常见，除此之外还可以侵犯呼吸、神经、血液系统及致胎儿畸形，严重危及胎儿生命。
临床上，针对HCMV的检测、诊断方法主要有：病毒分离培养、病毒抗原的检测、血清学标志物检测和HCMV DNA检测。其中HCMV 病毒培养的时间太长，不适用于临床应用；病毒抗原检测的标本必须在8 h 内进行处理，并且在病毒拷贝数低的情况下，可能检测不出pp65 抗原；免疫抑制剂的使用和“窗口期”的问题使血清学检测缺乏敏感性。采用实时荧光PCR 技术检测HCMV DNA，具有灵敏度高、特异性好和操作简便等优势，虽然目前已有公司将PCR技术应用于HCMV DNA检测，但各厂家定量单位均未溯源至世界卫生组织（WHO）标准单位IU/mL，且灵敏度较低（400 Copies/mL），导致出现临床病患漏检，而且各厂家定量结果无可比性、无溯源性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可溯源至世界卫生组织（WHO）标准单位IU/mL且操作简单，灵敏度高，特异性好，检测结果快速的用于检测人巨细胞病毒的试剂盒。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的用于检测人巨细胞病毒的试剂盒，包括用于人巨细胞病毒DNA检测的特异性PCR引物和荧光探针、DNA内标检测的特异性引物和探针、PCR反应缓冲液、酶混合液、DNA内标、阴性质控品、强阳性质控品、弱阳性质控品和定量参考品A、B、C、D；其中
所述用于人巨细胞病毒DNA检测的特异性PCR引物包括引物1和引物2，所述引物1和引物2的序列为：
引物1：5’- AACTGCCTCACCCACCTGC -3’（SEQ ID No.1），
引物2：5’- AACGATGGAGGACGACCAACAC -3’（SEQ ID No.2）；
所述用于DNA内标检测的特异性引物包括引物3和引物4，所述引物3和引物4的序列为：
引物3：5’- GAAGGCTCATGGCAAGAAAG -3’（SEQ ID No.3），
引物4：5’- CTCACTCAGTGTGGCAAAGG -3’（SEQ ID No.4）；
所述用于人巨细胞病毒DNA检测的探针为探针1，其序列为：
探针1：FAM- AAACACCATCTTTCCGGAGGTGCGGT –BHQ1（SEQ ID No.5），
所述用于DNA内标检测的探针为探针2，其序列为：
探针2：ROX- CTTGAGGTTGTCCAGGTGAGCCAG–BHQ2（SEQ ID No.6）。
所述PCR反应缓冲液包括pH7.0-pH9.0 20-100mM三(羟甲基)甲基甘氨酸溶液和50-200mM乙酸钾。
所述酶混合液包括双功能DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基化酶和dUTP。利用UNG酶可以降解含dU的DNA链的特点，在PCR体系中添加了UNG酶和dUTP，可以预防前次PCR产物的污染，防止样本检测假阳性。
所述DNA内标为人工构建的质粒。
所述阴性质控品为无菌生理盐水。
所述强阳性质控品和弱阳性质控品均为含人巨细胞病毒DNA片段的质粒，其中强阳性质控品浓度经溯源为4.0E+04 IU/ml，弱阳性质控品浓度经溯源为4.0E+02IU/ml。
所述定量参考品A、B、C、D为含人巨细胞病毒DNA片段的质粒，其中定量参考品A、B、C、D的浓度经溯源为1.0E+05 IU/ml、1.0E+04 IU/ml、1.0E+03 IU/ml、1.0E+02 IU/ml。
本发明试剂盒的检测方法如下：
（1）样本前处理：取1ml尿液加等体积样本浓缩液D，涡旋均匀后，12000rpm离心5min，弃上清；加入600ul生理盐水，涡旋混匀，备用。
（2）样本制备：提取阴性对照，阳性对照，定量参考品A、B、C、D以及待检测样品中的DNA；
（3）聚合酶链式反应：在200µl PCR管配制反应体系：PCR反应液1 20µl，PCR反应液2 10µl，模板DNA 40~60µl。
其中PCR反应液1中含有上述的4条特异性引物（SEQ ID No.1~4）和2条特异性探针（SEQ ID No.5~6），引物SEQ ID No.1~4的浓度为0.3~0.9uM，探针SEQ ID No.5~6的浓度为0.1~0.3uM；5-10U的rTth DNA聚合酶，0.5-1U的UNG酶，0.2-0.5 mM dATP、0.2-0.5 mMdGTP、0.2-0.5 mM dCTP、0.2-0.5 mM dUTP和0.1%叠氮化钠；
反应液2中含有1-3mM Mn(OAc)2和0.1%叠氮化钠；
（4）结果判断：阴性质控应FAM通道No Ct，ROX通道Ct值≤40.0，强阳性质控品检测浓度应在1.26E+04-1.26E+05IU/mL范围内，弱阳性质控品检测浓度应在1.26E+02-1.26E+03IU/mL范围内，在满足以上3个条件下，荧光定量PCR仪即可根据4个浓度梯度定量参考品绘制的校准曲线自动生成待测样本的检测浓度结果。
本发明的优点在于操作简单快捷，能在20min内完成人巨细胞病毒DNA的定量检测；灵敏度高，最低检出限为34.5IU/ml；特异性好，本发明根据内重复序列µl65设计1对引物，与其他病原体无交叉干扰，具有较高的特异性；本发明试剂盒可溯源至世界卫生组织（WHO）标准单位IU/mL，定量结果具有可追溯性，对于人巨细胞病毒核酸相关疾病的临床快速检测具有很高的参考价值，适于推广应用。
附图说明
图1是本发明试剂盒对20份最低检出限样本进行检测的扩增曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明，以便于本领域技术人员的理解。
实施例1 制备检测人巨细胞病毒的试剂盒
本发明试剂盒的组成：
（1）20ul反应液1：50mM三(羟甲基)甲基甘氨酸(pH8.0)，100mM乙酸钾，0.6uM引物1，0.6uM引物2，0.3uM引物3，0.3uM引物4，0.25uM探针1，0.25uM探针2，10U Taq酶，0.5U UNG，0.3mMdATP，0.3mMdGTP，0.3mMdCTP，0.3mMdUTP，0.1%叠氮化钠；
4条特异性引物和2条特异性探针的序列分别为：
引物1：5’- AACTGCCTCACCCACCTGC -3’（SEQ ID No.1）；
引物2：5’- AACGATGGAGGACGACCAACAC -3’（SEQ ID No.2）；
引物3：5’- GAAGGCTCATGGCAAGAAAG -3’（SEQ ID No.3）；
引物4：5’- CTCACTCAGTGTGGCAAAGG -3’（SEQ ID No.4）；
探针1：FAM- AAACACCATCTTTCCGGAGGTGCGGT –BHQ1（SEQ ID No.5）；
探针2：ROX- CTTGAGGTTGTCCAGGTGAGCCAG–BHQ2（SEQ ID No.6）。
（2）10ul反应液2：包括1.5mM Mn(OAc)2和0.1%叠氮化钠。
（3）1ml尿液浓缩液：基础液为NaCL溶液，1ml，包含PEG混合液，浓度30%；
（4）DNA内标：为人工构建的质粒，浓度为1.0E+04-1.0E+05copies/ml；
（5）600ul阴性质控品：基础液是无菌生理盐水，600µl；
（6）600µl强阳性质控品：基础液是TE，600µl，包含浓度经溯源为4.0E+04 IU/ml的人巨细胞病毒DNA片段的质粒；
（7）600µl弱阳性质控品：基础液是TE，600µl，包含浓度经溯源为4.0E+02 IU/ml人巨细胞病毒DNA片段的质粒；
（8）600µl标准品A、B、C、D：基础液均是TE，600µl，包含浓度经溯源为1.0E+05 IU/ml、1.0E+04 IU/ml、1.00E+03 IU/ml、1.00E+02 IU/ml的人巨细胞病毒DNA片段的质粒。
实施例2 人巨细胞病毒核酸提取、扩增方法
采用实施例1制备的试剂盒用于检测临床尿液样本中的人巨细胞DNA的操作步骤是：
（1）样本提取
1、取1ml尿液加等体积样本浓缩液D，涡旋均匀后，12000rpm离心5min，弃上清；加入600µl生理盐水，涡旋混匀，备用。
2、同时取600 µl阴性质控品、强阳性质控品、弱阳性质控品、标准品A、B、C、D和待测样本，分别添加20µl DNA内标，配合郑州安图生物工程股份有限公司磁珠法核酸提取试剂提取各样本中核酸DNA，备用。
（2）试剂准备
根据待测样本、阴性质控品、强阳性质控品、弱阳性质控品、标准品A、B、C、D的数量，按比例（PCR 反应液1 20µl/人份+PCR反应液2 10µl/人份）取相应量的PCR 反应液1、PCR 反应液2，充分混匀成PCR-MIX混合液，再分别加入提取的待测样本、阴性质控品、强阳性质控品、弱阳性质控品、标准品A、B、C、D核酸产物各50µl，盖上管盖（去除气泡后），瞬时离心10秒。
（3）荧光PCR反应
1、将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称。
2、荧光检测通道选择：选择FAM通道检测HCMV靶标；选择CY5通道检测内标；参比荧光设置为none。
3、荧光PCR反应条件如下表1：
表1
（4）结果分析/结果判断
反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析（也可手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线进行分析）。其中阴性质控品应ROX显示Ct值≤40，FAM显示No Ct；强阳性质控品的浓度值应在1.26E+04-1.26E+05IU/mL范围内，弱阳性质控检测浓度应在1.26E+02-1.26E+03IU/mL范围内；以校准品A~D作标准曲线，其|R|应≥0.98。在以上条件下，待测样品的结果解释如下：
实施例3 本发明试剂盒的灵敏度实验
采用阴性尿液稀释HCMV阳性临床样本（量值可溯源到WHO）至34.5IU，采用实施例1制备的试剂盒，检测20份样本，得到的扩增曲线如图1所示。从图1中可以看出，本发明试剂盒对20份34.5IU/mL的阳性临床样本进行检测，20份全检出，证明本发明试剂盒的检测限可以达到34.5IU/mL，其灵敏度很高。
序列表
<110> 郑州安图生物工程股份有限公司
<120> 一种用于检测人巨细胞病毒的试剂盒
<141> 2018-08-10
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
AACTGCCTCACCCACCTGC 19
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
AACGATGGAGGACGACCAACAC 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
GAAGGCTCATGGCAAGAAAG 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
CTCACTCAGTGTGGCAAAGG 20
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
AAACACCATCTTTCCGGAGGTGCGGT 26
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
CTTGAGGTTGTCCAGGTGAGCCAG 24

Claims (7)

1.一种用于检测人巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于：包括用于人巨细胞病毒DNA检测的特异性PCR引物和荧光探针、DNA内标检测的特异性引物和探针、PCR反应缓冲液、酶混合液、DNA内标、阴性质控品、强阳性质控品、弱阳性质控品和定量参考品A、B、C、D；其中
所述用于人巨细胞病毒DNA检测的特异性PCR引物包括引物1和引物2，所述引物1和引物2的序列为：
引物1：5’- AACTGCCTCACCCACCTGC -3’，
引物2：5’- AACGATGGAGGACGACCAACAC -3’；
所述用于DNA内标检测的特异性引物包括引物3和引物4，所述引物3和引物4的序列为：
引物3：5’- GAAGGCTCATGGCAAGAAAG -3’，
引物4：5’- CTCACTCAGTGTGGCAAAGG -3’；
所述用于人巨细胞病毒DNA检测的探针为探针1，其序列为：
探针1：FAM- AAACACCATCTTTCCGGAGGTGCGGT –BHQ1，
所述用于DNA内标检测的探针为探针2，其序列为：
探针2：ROX- CTTGAGGTTGTCCAGGTGAGCCAG–BHQ2。
2.根据权利要求1所述的用于检测人巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于：所述PCR反应缓冲液包括pH7.0-pH9.0 20-100mM三(羟甲基)甲基甘氨酸溶液和50-200mM乙酸钾。
3.根据权利要求1所述的用于检测人巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于：所述酶混合液包括双功能DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基化酶和dUTP。
4.根据权利要求1所述的用于检测人巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于：所述DNA内标为人工构建的质粒。
5.根据权利要求1所述的用于检测人巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于：所述阴性质控品为无菌生理盐水。
6.根据权利要求1所述的用于检测人巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于：所述强阳性质控品和弱阳性质控品均为含人巨细胞病毒DNA片段的质粒，其中强阳性质控品浓度经溯源为4.0E+04 IU/ml，弱阳性质控品浓度经溯源为4.0E+02IU/ml。
7.根据权利要求1所述的用于检测人巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于：所述定量参考品A、B、C、D为含人巨细胞病毒DNA片段的质粒，其中定量参考品A、B、C、D的浓度经溯源为1.0E+05 IU/ml、1.0E+04 IU/ml、1.0E+03 IU/ml、1.0E+02 IU/ml。
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