CN110184350A - 用于预测乙肝患者肝癌易感性的引物、探针及试剂盒 - Google Patents
用于预测乙肝患者肝癌易感性的引物、探针及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于预测乙肝患者肝癌易感性的引物、探针及试剂盒,属于体外核酸检测领域,用于预测乙肝患者肝癌易感性的试剂盒包括检测G1896A、A1762T和G1764A三个突变位点的引物和探针。本发明提供的引物、探针,检测结果与测序结果准确率高达100%;可同时检测位点的野生型、突变型,结果准确可靠;本发明检测的HBV基因组DNA浓度检测下限为100IU/mL,能够满足市场上低病毒浓度的基因检测需求;本发明提供的试剂盒不受样本例数的限制,可分配检测样本例数、样本例数少时无需攒样、出具实验结果快速便捷。
Description
技术领域
本发明属于体外核酸检测领域,具体涉及一种用于预测乙肝患者肝癌易感性的引物、探针及试剂盒。
背景技术
乙型肝炎病毒HBV感染是导致肝癌发生的重要因素之一,乙型肝炎病毒(HBV)感染导致的肝癌占60%以上。乙肝患者慢性感染5年后,有10-20%的患者将发展为肝硬化,6-15%的慢性肝硬化患者和乙肝患者会发展为肝癌。肝癌是严重危害中国人生命健康的最主要癌症之一,是亟需解决的重大公共卫生问题。
临床上乙型肝炎E抗原(HBeAg)转印以及乙型肝炎E抗体(HBeAb)阳性常被认为是已产生抗病毒抗体,病毒的复制得到抑制,肝损伤和肝癌的发生风险降低,甚至可作为治疗的终止指标。但近年来研究表明HBeAg阴性患者发生肝癌的比例逐年增加,主要原因是虽然HBeAg为阴性但是病毒仍在复制,肝损伤仍在继续。
HBV基因组有四个基因区,分别为S,C,P,X区。C基因区包括preC(前C)区和C(core)区。C基因区突变导致HBeAg表达异常,最常见的突变为C区核心启动子(BCP)区的1762T和1764A的双突变,该突变导致前C区mRNA转录减少导致HBeAg合成分泌量降低。有研究表明preC区1896A的突变也会造成HBeAg的合成抑制甚至合成终止。有大量的研究表明肝癌患者中1896A的突变率为52%,1762T和1764A突变率为66%,具有显著的高突变率,HBV基因组的突变和乙肝患者发生肝癌相关。因此,检测HBV基因组突变有助于医生给予乙肝患者更精准的医疗建议。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷,本发明所要解决的技术问题是:提供一种通过检测HBV基因组上的G1896A突变、A1762T和G1764A的双突变情况联合预测乙肝患者发生肝癌的风险的引物、探针及试剂盒。
为了解决上述技术问题,本发明采用的技术方案为:用于预测乙肝患者肝癌易感性的引物和探针,包括检测G1896A、A1762T和G1764A三个突变位点的引物和探针:
检测G1896A的引物和探针的序列如SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:5和SEQ ID No:6所示;
检测A1762T和G1764A的引物和探针的序列如SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ IDNo:7、SEQ ID No:8、SEQ ID No:9和SEQ ID No:10所示。
本发明还提供了一种用于预测乙肝患者肝癌易感性的试剂盒,包括上述的用于预测乙肝患者肝癌易感性的引物和探针。
本发明的有益效果在于:本发明提供的引物、探针优点在于:检测结果与测序结果准确率高达100%;可同时检测位点的野生型、突变型;相比使用ΔCt值法的判断结果更易判断,结果可以通过分型软件准确分型,还可以通过荧光定量PCR曲线进行确认复核,结果准确可靠;本发明检测的HBV基因组DNA浓度检测下限为100IU/mL,能够满足市场上低病毒浓度的基因检测需求;本发明提供的试剂盒不受样本例数的限制,可分配检测样本例数、样本例数少时无需攒样、出具实验结果快速便捷。本发明在利用实时荧光PCR探针技术高灵敏度和高特异性的优点基础上,优选特异性好的引物及探针序列组成试剂盒,提高突变位点检测特异性。
附图说明
图1所示为本发明的具体实施方式的FAM通道HBV 1896G野生型扩增曲线图;
图2所示为本发明的具体实施方式的HEX通道HBV 1896A突变型扩增曲线图;
图3所示为本发明的具体实施方式的FAM通道HBV 1762A和1764G野生型扩增曲线图;
图4所示为本发明的具体实施方式的HEX通道HBV 1762T和1764A双突变型扩增曲线图;
图5所示为本发明的具体实施方式的CY5通道HBV 1764A单突变型扩增曲线图;
图6所示为本发明的具体实施方式的ROX通道HBV 1762T单突变型扩增曲线图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果,以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明最关键的构思在于:使用实时荧光定量PCR技术,在常规PCR的基础上加入相应的荧光探针来实现易感位点分型的功能,通过检测HBV基因组上的G1896A突变、A1762T和G1764A的双突变情况联合预测乙肝患者发生肝癌的风险。
请参照表1(引物)和表2(探针),本发明的用于预测乙肝患者肝癌易感性的引物和探针,包括检测G1896A、A1762T和G1764A三个突变位点的引物和探针:
检测G1896A的引物和探针的序列如SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:5和SEQ ID No:6所示;
检测A1762T和G1764A的引物和探针的序列如SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ IDNo:7、SEQ ID No:8、SEQ ID No:9和SEQ ID No:10所示。
表1
名称 | 序列(5’-3’) | 碱基数 | |
SEQ ID No:1 | 1896-F1 | CCTACTGTTCAAGCCTCCAAGC | 22 |
SEQ ID No:2 | 1896-R1 | GCTCCAAATTCTTTATACGGGTC | 23 |
SEQ ID No:3 | 1762-F | GTCAACGACCGACCTTGAGG | 20 |
SEQ ID No:4 | 1762-R | GTTGCATGGTGCTGGTGAAC | 20 |
表2
其中,上述探针3’端使用MGB修饰或者不修饰,5’端的修饰可以为FAM、HEX、CY3、CY5,荧光基团不限。
用于预测乙肝患者肝癌易感性的试剂盒,包括上述的用于预测乙肝患者肝癌易感性的引物和探针。
从上述描述可知,本发明的有益效果在于:本发明提供的引物、探针优点在于:检测结果与测序结果准确率高达100%;可同时检测位点的野生型、突变型;相比使用ΔCt值法的判断结果更易判断,结果可以通过分型软件准确分型,还可以通过荧光定量PCR曲线进行确认复核,结果准确可靠;本发明检测的HBV基因组DNA浓度检测下限为100IU/mL,能够满足市场上低病毒浓度的基因检测需求;本发明提供的试剂盒不受样本例数的限制,可分配检测样本例数、样本例数少时无需攒样、出具实验结果快速便捷。本发明在利用实时荧光PCR探针技术高灵敏度和高特异性的优点基础上,优选特异性好的引物及探针序列组成试剂盒,提高突变位点检测特异性。
进一步的,用于预测乙肝患者肝癌易感性的试剂盒,包括PCR反应液1和PCR反应液2;
所述PCR反应液1包括检测G1896A的引物和探针;
所述PCR反应液2包括检测A1762T和G1764A的引物和探针。
从上述描述可知,通过对引物和探针进行分组,有效改善了不同引物之间的相互干扰,提高了检测的灵敏度。
进一步的,每个PCR反应液还包括Taq酶、dNTP、UNG酶和Mg2+。
从上述描述可知,引入UNG酶防污染系统,能更加准确、稳定的对样品进行分型检测。
进一步的,用于预测乙肝患者肝癌易感性的试剂盒,还包括阳性质控品1、阳性质控品2、阳性质控品3、阳性质控品4和阴性质控品;
所述阳性质控品1为已灭活的HBV1896A型的血清样本,浓度为1000IU/mL;
所述阳性质控品2为已灭活的HBV1762T、1764A型的血清样本,浓度为1000IU/mL;
所述阳性质控品3为已灭活的HBV1762T、1764G型的血清样本,浓度为1000IU/mL;
所述阳性质控品4为已灭活的HBV1762A、1764A型的血清样本,浓度为1000IU/mL;
所述阴性质控品为灭菌纯化水。
从上述描述可知,通过设置阳性质控品和阴性质控品,可提高检测的准确性。
实施例一:
用于预测乙肝患者肝癌易感性的试剂盒,包含表3所示的成分;
表3
序号 | 组分 | 成分 | 数量 | 规格 |
1 | PCR反应液1 | 引物、探针、Taq酶、dNTP、UNG酶、水 | 1 | 960μl/管 |
2 | PCR反应液2 | 引物、探针、Taq酶、dNTP、UNG酶、水 | 1 | 960μl/管 |
3 | 阳性质控品1 | 已灭活的HBV1896A型的血清样本 | 1 | 1.6mL/管 |
4 | 阳性质控品2 | 已灭活的HBV1762T、1764A型的血清样本 | 1 | 1.6mL/管 |
5 | 阳性质控品3 | 已灭活的HBV1762T、1764G型的血清样本 | 1 | 1.6mL/管 |
6 | 阳性质控品4 | 已灭活的HBV1762A、1764A型的血清样本 | 1 | 1.6mL/管 |
7 | 阴性质控品 | 灭菌纯化水 | 1 | 1.6mL/管 |
其中,所述PCR反应液1包括检测G1896A的引物和探针;
所述PCR反应液2包括检测A1762T和G1764A的引物和探针;
所述检测G1896A的引物和探针的序列如SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:5和SEQ ID No:6所示;
所述检测A1762T和G1764A的引物和探针的序列如SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQID No:7、SEQ ID No:8、SEQ ID No:9和SEQ ID No:10所示。
实施例二:
1、样本DNA提取
使用商业化病毒基因组提取试剂盒提取样本DNA,阳性质控品需参与提取制备HBV基因组DNA。
2、PCR反应体系配制及加样
根据样本例数制备PCR反应体系份数n(n=样本例数+阳性对照×4+阴性对照),每管荧光定量PCR管分装PCR反应体系20μLDNA模板(DNA样本、阴性对照、阳性对照)10μL,充分混合后短暂离心后,准备上机。
使用实施例一的试剂盒,按表4配制PCR反应体系1-2各n管。
表4
3、PCR扩增检测
将上述荧光定量PCR管,放入荧光PCR仪中,程序设置如表5所示:
表5
荧光信号收集在阶段3 60℃45s(*标记),收集的荧光信号为探针标记的荧光可以为(FAM、JOE、CY5、ROX)。
4、结果分析
荧光扩增曲线进行分型:按照表6对检测样本进行基因型别分析,且阴性质控品、阳性质控品检测结果均正常,否则实验失败。
当1896G-P2、1896A-P2、1762-CT-P1、1762-TA-P1、1762-TT-P1、1762-CA-P2探针5’端分别修饰FAM、HEX、FAM、HEX、CY5、ROX荧光基团时,样本检测实验结果判读如下:
表6
HBV G1896A扩增曲线判读结果如图1-2所示;
HBV A1762T和G1764A扩增曲线判读结果如图3-6所示。
实施例三:
使用实施例二的方法对18例样本进行检测,检测结果图表7所示,与测序结果比较,一致性100%。
表7
综上所述,本发明提供的引物、探针优点在于:利用MGB修饰提高检测特异性,检测结果与测序结果准确率高达100%;可同时检测位点的野生型、突变型;相比使用ΔCt值法的判断结果更易判断,结果可以通过分型软件准确分型,还可以通过荧光定量PCR曲线进行确认复核,结果准确可靠;本发明检测的HBV基因组DNA浓度检测下限为100IU/mL,能够满足市场上低病毒浓度的基因检测需求;不受样本例数的限制,可分配检测样本例数、样本例数少时无需攒样、出具实验结果快速便捷;本发明的试剂盒引入UNG酶防污染系统,能更加准确、稳定的对样品进行分型检测。本发明在利用实时荧光PCR探针技术高灵敏度和高特异性的优点基础上,优选特异性好的引物及探针序列组成试剂盒,提高突变位点检测特异性。
以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换,或直接或间接运用在相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 阿吉安(福州)基因医学检验实验室有限公司
<120> 用于预测乙肝患者肝癌易感性的引物、探针及试剂盒
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
agtacaaaga tcattaacct 20
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tacaaagacc tttaacct 18
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
agtacaaaga tctttaacct 20
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tacaaagacc attaacct 18
Claims (5)
1.用于预测乙肝患者肝癌易感性的引物和探针,其特征在于,包括检测G1896A、A1762T和G1764A三个突变位点的引物和探针:
检测G1896A的引物和探针的序列如SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:5和SEQ IDNo:6所示;
检测A1762T和G1764A的引物和探针的序列如SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:7、SEQ ID No:8、SEQ ID No:9和SEQ ID No:10所示。
2.用于预测乙肝患者肝癌易感性的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1所述的用于预测乙肝患者肝癌易感性的引物和探针。
3.根据权利要求2所述的用于预测乙肝患者肝癌易感性的试剂盒,其特征在于,包括PCR反应液1和PCR反应液2;
所述PCR反应液1包括检测G1896A的引物和探针;
所述PCR反应液2包括检测A1762T和G1764A的引物和探针。
4.根据权利要求2所述的用于预测乙肝患者肝癌易感性的试剂盒,其特征在于,每个PCR反应液还包括Taq酶、dNTP、UNG酶和Mg2+。
5.根据权利要求2所述的用于预测乙肝患者肝癌易感性的试剂盒,其特征在于,还包括阳性质控品1、阳性质控品2、阳性质控品3、阳性质控品4和阴性质控品;
所述阳性质控品1为已灭活的HBV1896A型的血清样本;
所述阳性质控品2为已灭活的HBV1762T、1764A型的血清样本;
所述阳性质控品3为已灭活的HBV1762T、1764G型的血清样本;
所述阳性质控品4为已灭活的HBV1762A、1764A型的血清样本
所述阴性质控品为灭菌纯化水。
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