CN112626277A

CN112626277A - 乙型肝炎病毒突变位点t176c在制备预测肝癌复发的试剂盒中的应用

Info

Publication number: CN112626277A
Application number: CN202110061041.1A
Authority: CN
Inventors: 蒲蕊; 殷建华; 陈曦; 吴婷; 张宏伟; 曹广文
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2021-01-18
Filing date: 2021-01-18
Publication date: 2021-04-09
Anticipated expiration: 2041-01-18
Also published as: CN112626277B

Abstract

本发明涉及医学生物检测技术领域，具体是乙型肝炎病毒突变位点T176C在制备预测肝癌复发的试剂盒中的应用。本发明还提供一种预测肝癌复发的试剂盒。本发明优点在于：本发明发现在乙型肝炎病毒特定的区域某些特定位点的突变与乙型肝炎病毒阳性肝病，尤其是肝细胞癌的复发具有重要联系。检测乙肝感染者的T176C关键位点突变，并联合临床甲胎蛋白水平，能够提前发现肝癌的复发，并对患者进行早期干预治疗和及时的随访复查。

Description

乙型肝炎病毒突变位点T176C在制备预测肝癌复发的试剂盒中的应用

技术领域

本发明涉及医学生物检测技术领域，具体地说，是乙型肝炎病毒突变位点(T176C)在制备预测肝癌复发的试剂盒中的应用。

背景技术

原发性肝癌是世界上第六大常见的恶性肿瘤，全球每年约有84万新发肝癌病例，其中约78万例死亡，我国每年约38.3万人死于HCC。确诊时，70％以上患者已经失去了外科手术的机会。肝癌预后极差，虽然肝癌手术切除技术层次不断提高，但由于术后复发率较高的原因，患者的生存时间和生活质量仍旧受到很大的限制。研究表明，接受肝移植术的肝癌患者，其5年内的复发率约为25％，而单纯性肝切除患者术后复发率更是高达70％因此，术前有效预判肝癌术后复发，对患者治疗方案的调整或预后的判断有着重要的参考价值。。

目前认为：肿瘤大小、血管浸润、肝功能和术前营养状态等因素均与肝癌术后复发有关，但是临床上还没有一种很有效的手段能对肝癌的术后复发转移进行比较准确的预测，肿瘤标志物、腹部CT、腹部MRI等传统检查仍是监测术后复发转移的主要手段，但这些检查结果的滞后性使其不能对术后复发转移进行及时的预测。彩色多普勒超声，它可以无创性的评估肝脏血流情况，重复性较高，但是该方法很大程度上取决于检查者的经验，故限制了其在肝癌诊断和随访观察中的应用。多层螺旋CT(MSCT)扫描速度快、层面薄，提高了小病灶的检出率，同时可清楚显示肝癌的血供情况，但费用较昂贵。微血管侵犯在肝癌术后复发的危险因素中扮演着重要角色，微血管侵犯阳性的肝癌患者，其术后复发率高出阴性者4.4倍之多。现临床对肝癌患者微血管侵犯的诊断主要依靠活检或术后病理学穿刺检查，因其属于有创性操作，在实际应用中受到一定范围的限制。血清学检查因其快速、简便、费用低、无痛苦等优势而成为大规模筛查的主要工具，现临床诊断肝癌主要依靠AFP(>400ng/ml)，AFP是肝脏在胎儿发育过程中产生的一种主要血浆蛋白，在原发性肝癌患者中可升高，AFP水平升高与肿瘤复发和预后不良有关。在实际诊断中，患者瘤体体积＜3cm³时，患者体内AFP含量会出现明显减低，导致假阴性结果。有部分肝硬化患者体内AFP水平会呈现持续升高状态，但是并没有肝癌迹象；而约有20％的晚期肝癌患者，AFP不高反而降低，因此AFP单一检验结果，并不能完全作为诊断肝癌的标准。寻找准确、方便的检查方法发现肝癌切除术后复发是临床亟需解决的问题，我们迫切需要找到一种新的高敏感度和特异度的诊断标志。

全世界有约超过30亿人感染乙型肝炎病毒，乙型肝炎病毒突变是肝硬化和肝细胞癌的重要危险因素之一，随着感染的持续，病毒的突变率逐渐增加。目前常用的突变检测方法为基因直接测序，但该方法费时、费力，达不到快速诊断的目的。因而，需要一种准确的检测的方法用于及早发现肝癌复发和实验室快速检测。

Taq-man探针荧光定量PCR技术具有特异性强、灵敏度高、快速且成本低等优点，其特点是针对靶基因的突变部位设定探针，利用探针与模板的特异性结合，然后通过显色进行结果观察，简便实用，特异性高，灵敏度强。整个检测使用RT-PCR仪即可完成，操作方法更简单，结果准确性高。

发明内容

本发明的目的在于提供乙型肝炎病毒突变位点(T176C)在制备预测肝癌复发的试剂盒中的应用，并提供了一种预测肝癌复发的试剂盒。

本发明的第一方面，提供乙型肝炎病毒突变位点T176C作为预测和诊断肝癌复发标志物的应用。

本发明的第二方面，提供乙型肝炎病毒突变位点T176C在制备预测肝癌复发的试剂或试剂盒中的应用。

进一步的，所述的试剂或试剂盒为检测乙肝感染者的乙肝病毒PreS区T176C突变的试剂或试剂盒。

更进一步的，所述的乙肝病毒PreS区T176C突变是乙型肝炎病毒的第176位碱基从T突变成C。本发明发现血清中T176C突变与肝癌复发显著关联。C型突变的患者发生肝癌复发的危险性是T型患者的1.85倍，95％可信区间为1.16-2.93，二者的差异具有统计学意义p＝0.01。

进一步的，所述的试剂盒包含检测乙肝感染者的乙肝病毒PreS区T176C突变的试剂。

本发明的第三方面，提供检测乙型肝炎病毒突变位点T176C的试剂在制备预测肝癌复发的试剂盒中的应用。

进一步的，所述的检测乙肝感染者的乙肝病毒区的PreS区T176C突变的试剂，选自：对T176C突变具有检测特异性的PCR引物系统。

进一步的，所述的对T176C突变具有检测特异性的PCR引物系统包括PCR引物I和探针II：

PCR引物I：由P1和P2等量混合组成，为含T176C位点区域RT-PCR引物；

探针II：由P3和P4等量混合组成，为T176C位点区域Taq-man探针；

表1引物序列

表2探针序列

注：加框的碱基是指突变位点的碱基的探针序列是不一样的，其余位点探针序列一样。

本发明的第四方面，提供检测乙型肝炎病毒突变位点T176C和AFP(甲胎蛋白)的试剂在制备预测肝癌复发的试剂盒中的应用。

本发明发现使用T176C突变联合AFP指标能够很好的将HCC复发患者与非复发患者区分开来，AUC＝0.78，灵敏度＝0.64，特异度＝0.80。检测乙肝感染者的T176C关键位点的突变，并联合临床AFP水平，能够提前预测并及时发现肝癌患者的复发情况，并对患者进行早期干预治疗和及时的随访复查。

本发明的第五方面，提供一种预测肝癌复发的试剂盒，所述的试剂盒中包含检测乙肝感染者的乙肝病毒PreS区T176C突变的试剂。

进一步的，所述的检测乙肝感染者的乙肝病毒PreS区T176C突变的试剂，具体为：

引物P1、P2的浓度为10μM，探针P3和P4的浓度为10μM。可根据检测样本数量的不同，按需要的引物量进行混合。10μl反应体系如下：

将上述反应体系加入96孔板中，放入RT-PCR仪进行扩增。

本发明的第六方面，提供一种预测肝癌复发的试剂盒，所述的试剂盒中包含检测乙肝感染者的乙肝病毒PreS区T176C突变的试剂，和检测血清AFP水平的试剂。

本发明的第七方面，提供一种利用如上所述的试剂盒进行肝癌复发检测的方法，包括以下步骤：

(A)提取乙肝病毒DNA，使用引物I、探针II和Premix EX Taq酶进行RT-PCR扩增；

(B)RT-PCR扩增的程序为：第一步：95℃，10sec；第二步：45个循环(95℃，10sec；60℃，30sec)；第三步：40℃，1sec。

(C)结果判定：使用仪器自带程序Endpoint Genotyping进行分析，结果为蓝色的结果判定C，绿色的结果判定T。

本发明针对靶基因的突变部位设定2个探针，利用探针与模板的特异性结合，然后通过Endpoint Genotyping进行观察结果，简便实用，检测时间短，特异性高，灵敏度强。

本发明优点在于：

1、本发明发现，在乙型肝炎病毒特定的区域某些特定位点的突变与乙型肝炎病毒阳性肝病，尤其是肝细胞癌的复发具有重要联系。

2、本发明通过研究发现，乙肝病毒PreS区的T176C突变能够很好的识别肝癌复发和非复发患者(HR＝1.85，95％CI＝1.16-2.93，p＝0.01)。

3、T176C突变联合AFP指标能够很好的将HCC复发患者与非复发患者区分开来，AUC＝0.78，灵敏度＝0.64，特异度＝0.80。而单纯依靠AFP水平(≤20或>20ng/ml)时，AUC＝0.73，灵敏度＝0.75，特异度＝0.70。因此，检测乙肝感染者的这T176C关键位点的突变，并联合临床AFP水平，能够发现肝癌的复发，并对患者进行早期干预治疗和及时的随访复查。

附图说明

图1是乙型肝炎病毒RT-PCR对PreS区(T176C位点)分型图。

图2是仅使用AFP检测肝癌复发的AUC曲线图。

图3是仅使用T176C检测肝癌复发的AUC曲线图。

图4是使用T176C联合AFP检测肝癌复发的AUC曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1：乙肝病毒PreS区的T176C突变能够很好的识别肝癌复发和非复发患者

本发明从NCBI的SRA数据库(Sequence Read Archive database)中下载了SRP062885、SRP069212、SRP099053、SRP174991和SRP256409五个肝癌病人的RNA-Seq数据集中的癌组织样本，通过GSVA软件对MsigDB数据库(Molecular Signature Database)中的基因项进行打分，进行相关性分析，筛选了与肝癌复发相关的HBV病毒preS1、preS2和S区域的突变。

本发明募集了海军军医大学第三附属医院的103例肝癌病人，采集了他们的血清与癌组织样本，建立队列人群，针对HBV病毒的preS1、preS2和S区域进行了设计引物和探针进行检测验证。通过Cox与Kaplan-Meier生存分析，我们在血清中成功测定了T176C突变频率为38.83％，发现血清中T176C突变与肝癌复发显著关联。C型突变的患者发生肝癌复发的危险性是T型患者的1.85倍，95％可信区间为1.16-2.93，二者的差异具有统计学意义p＝0.01。

试剂盒组成成分的具体制备步骤如下：

PCR引物Ⅰ、探针Ⅰ制备：人工合成引物P1，P2，探针P3，P4，详细的序列见表1和表2。合成后的引物和探针稀释成10μM，将P1和P2等量混合组成引物Ⅰ，探针P3和P4等量混合组成探针Ⅰ。

实施例2：样品中DNA的提取和乙型肝炎病毒突变的检测

(1)乙型肝炎病人和肝癌患者血清样本中提取DNA，“煮沸法”抽提DNA的方法如下：

1)取200ul血清加入1.5ml离心管，加入400ul PEG，充分振荡混匀，1300rpm/min离心10min；

2)去掉上清，加入80ul裂解液，充分振荡混匀，直至管底沉淀混匀；

3)沸水中煮沸10min；

4)1300rpm/min离心10min，去除沉淀，上清作为模板备用。

(2)RT-PCR扩增，T176C位点区域10μl体系：

扩增条件：第一步：95℃，10sec；第二步：45个循环(95℃，10sec；60℃，30sec)；第三步：40℃，1sec。

(3)结果判定：使用仪器自带程序Endpoint Genotyping进行分析，结果为蓝色的结果判定T，绿色的结果判定C。

实验结果：实验发现，该试剂盒能够准确区分PreS区的T176C突变(蓝色和绿色)(见图1)。C型突变的患者发生肝癌复发的危险性是T型患者的1.85倍，95％可信区间为1.16-2.93，二者的差异具有统计学意义p＝0.01。

实施例3：T176C突变联合AFP指标能够很好的将HCC复发患者与非复发患者区分开来，AUC＝0.78，灵敏度＝0.64,特异度＝0.80。

本发明将AFP与T176C纳入了Cox预后模型，针对病人的模型打分，使用R软件平台的pROC软件包绘制ROC曲线，并且计算曲线下面积AUC。

发现使用T176C突变联合AFP指标能够很好的将HCC复发患者与非复发患者区分开来，AUC＝0.78，灵敏度＝0.64，特异度＝0.80(图4)。说明通过这两个指标的联合，该模型的准确性为78％，能够发现肝癌复发病人的能力为0.64，非复发病人的能力为0.80。

对比例1：

单纯依靠AFP水平(≤20或>20ng/ml)时，AUC＝0.73，灵敏度＝0.75，特异度＝0.70(图2)。说明仅通过AFP水平建立模型的准确性为73.0％，能够发现肝癌复发病人的能力为0.75，非复发病人的能力为0.70。

单纯依靠T176C突变时，AUC＝0.63，灵敏度＝0.47，特异度＝0.80(图3)。说明仅通过T176C突变建立模型的准确性为63％，能够发现肝癌复发病人的能力为0.47，非复发病人的能力为0.80。

实验结果表明，检测乙肝感染者的T176C关键位点的突变，并联合临床AFP水平，能够及时发现肝癌患者的复发情况，并对患者进行早期干预治疗和及时的随访复查。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

序列表

<110> 中国人民解放军海军军医大学

<120> 乙型肝炎病毒突变位点T176C在制备预测肝癌复发的试剂盒中的应用

<130> /

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

caccgaacat ggagaacaca a 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

gaaaaacccc gcctgtaaca 20

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

atcaggattc ctaggac 17

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

atcaggactc ctaggacc 18

Claims

1.乙型肝炎病毒突变位点T176C在制备预测肝癌复发的试剂或试剂盒中的应用。

2.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒突变位点T176C在制备预测肝癌复发的试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的试剂或试剂盒为检测乙肝感染者的乙肝病毒PreS区T176C突变的试剂或试剂盒；所述的乙肝病毒PreS区T176C突变是乙型肝炎病毒的第176位碱基从T突变成C。

3.检测乙型肝炎病毒突变位点T176C的试剂在制备预测肝癌复发的试剂盒中的应用。

4.根据权利要求3所述的检测乙型肝炎病毒突变位点T176C的试剂在制备预测肝癌复发的试剂盒中的应用，其特征在于，所述的检测乙肝感染者的乙肝病毒区的PreS区T176C突变的试剂，选自：对T176C突变具有检测特异性的PCR引物系统。

5.根据权利要求4所述的检测乙型肝炎病毒突变位点T176C的试剂在制备预测肝癌复发的试剂盒中的应用，其特征在于，所述的对T176C突变具有检测特异性的PCR引物系统包括PCR引物I和探针II：

PCR引物I：由核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的P1和P2等量混合组成；

探针II：由核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的P3和P4等量混合组成。

6.检测乙型肝炎病毒突变位点T176C和甲胎蛋白的试剂在制备预测肝癌复发的试剂盒中的应用。

7.一种预测肝癌复发的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含检测乙肝感染者的乙肝病毒PreS区T176C突变的试剂。

8.一种预测肝癌复发的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含检测乙肝感染者的乙肝病毒PreS区T176C突变的试剂，和检测血清甲胎蛋白水平的试剂。