CN104694666A - 一种检测乙肝病毒联合变异预测肝癌发生的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学生物检测技术领域，具体涉及一种检测乙型肝炎病毒变异的试剂盒，尤其是检测乙型肝炎病毒突变（A1C和G1899A）的试剂盒。本发明人通过研究发现，乙肝病毒BCP区的G1899A和A1C突变能够很好的将HCC患者与非肝癌的乙肝患者区分开来，OR值分别高达4.44和15.4，95%可信区间分别为2.91-6.76，6.15-38.56。因此，检测乙肝感染者的这两个关键位点的联合突变，能够预测肝癌的发生，并对患者进行早期筛检和诊断。

Description

一种检测乙肝病毒联合变异预测肝癌发生的试剂盒

技术领域

本发明涉及医学生物检测技术领域，具体涉及一种检测乙型肝炎病毒变异的试剂盒，尤其是检测乙型肝炎病毒突变（A1C和G1899A）的试剂盒。

背景技术

原发性肝癌是世界上第六大常见的恶性肿瘤，全球每年约有63万新发肝癌病例，其中55%来自中国。肝癌预后极差，年死亡人数约为60万，在各类肿瘤死亡原因中排名第三。乙肝相关肝癌的中位生存时间约为16个月，五年生存率介于15%-26%之间。目前肝癌治疗手段主要有手术切除、肝移植及介入治疗，但术后复发率高，改善预后效果不明显。肝癌预后差的主要原因是大多数患者就诊时已发展为肝癌中晚期，失去了最佳的治疗时期。研究证明，早期诊断和治疗肝癌能够显著改善预后，患者五年生存率可达64.8%。

在中国，大多数肝癌发生于乙肝病毒感染导致的慢性肝炎及肝硬化基础上，缺乏明显的早期症状及敏感的早期筛查手段是导致早期肝癌漏诊、误诊的主要原因。目前临床诊断肝癌的金标准仍为活检病理，但由于其是有创性检查，且可能导致肝癌转移，故不能反复进行。B超作为一种方便、低廉、无创的检查手段，诊断中晚期肝癌的敏感性、特异性及准确度都较高，适合大规模人群筛查，但B超发现早期肝癌的能力有限，不易与肝硬化结节区别，而且很大程度上取决于肿瘤生长部位及检查者的经验，故限制了其在早期肝癌诊断中的应用。普通CT因为扫描时间长、扫描层较厚且易受呼吸运动影响等，易出现假阳性或假阴性。多层螺旋CT（MSCT）扫描速度快、层面薄，提高了小病灶的检出率，同时可清楚显示肝癌的血供情况，但费用较昂贵，不适于大规模人群筛查。血管造影对小肝癌检出率高，但其有创性及高费用限制了筛查价值。血清学检查因其快速、简便、费用低、无痛苦等优势而成为大规模筛查的主要工具，现临床诊断肝癌主要依靠AFP（>400ng/ml），其诊断乙肝后肝癌的敏感性约为70-75%。由于AFP表达量与肝癌大小成正相关，故常难以检出早期微小肝癌。AFP在急性肝炎、肝破裂、肝外伤及生殖系统肿瘤中均可升高，故其诊断特异性也不尽人意。其他血清标志物如Des-γ-carboxy prothrombin(DCP)（异常凝血酶原）、α-L-Fucosidase（α-岩藻糖苷酶）以及γ-GT（γ谷氨酰转肽酶）等虽有一定的参考价值，但敏感性及特异性均较低。因此，我们迫切需要找到一种新的高度敏感和特异的早期诊断标志。

目前常用的突变检测方法为基因直接测序，但该方法费时、费力，敏感性低，达不到早期快速诊断的目的。因而，需要一种快速检测的方法用于流行病学现场调查和实验室快速检测。

反向杂交线性探针（reverse hybridization line probe assay）技术具有特异性强、灵敏度高、快速且成本低等优点，其特点是针对靶基因的突变部位设定多个可能的探针，利用探针与模板的特异性结合，然后通过显色进行结果观察，简便实用，特异性高，灵敏度强。反应在杂交炉内可完成，不仅节约仪器成本，而且操作方法更简单，适于基层单位及现场快速检测。

发明内容

本发明的目的是提供乙型肝炎病毒突变位点（A1C、G1899A）在制备肝癌早期诊断试剂盒中的应用，并提供了一种检测乙肝病毒联合变异预测肝癌发生的试剂盒。

本发明人发现，在乙型肝炎病毒特定的区域某些特定位点的突变与乙型肝炎病毒阳性肝病，尤其是肝细胞癌的发生具有重要联系。本发明人通过研究发现，乙肝病毒BCP区的G1899A和A1C突变能够很好的将HCC患者与非肝癌的乙肝患者区分开来，OR值分别高达4.44和15.4，95%可信区间分别为2.91-6.76，6.15-38.56。因此，检测乙肝感染者的这两个关键位点的联合突变，能够预测肝癌的发生，并对患者进行早期筛检和诊断。

本发明的第一方面，是提供了一种乙型肝炎病毒突变位点在制备肝癌早期诊断试剂盒中的应用，所述的乙型肝炎病毒突变位点是乙肝病毒BCP区的A1C和G1899A联合突变，具体是A1C的第一位碱基从A变成C,G1899A的第1899位碱基从G变成A。

本发明的第二方面，是提供了一种检测乙肝病毒联合变异预测肝癌发生的试剂盒，所述的乙肝病毒联合变异是指乙肝病毒BCP区的A1C和G1899A联合发生突变，所述的试剂盒的组成包括：

1.PCR引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ

将P1和P2等量混合组成PCR引物Ⅰ，为含G1899A位点区域巢式PCR第一轮引物；

P3和P4等量混合组成PCR引物Ⅱ，为G1899A位点区域巢式PCR第二轮引物；

P5和P6等量混合组成PCR引物Ⅲ，为含A1C位点区域巢式PCR第一轮引物；

P7和P8等量混合组成PCR引物Ⅳ，为含A1C位点区域巢式PCR第二轮引物；

P1至P8序列如表1所示，其中P3和P7的5’端使用生物素标记；

表1引物序列

2.杂交膜

杂交膜上固定的探针序列如表2所示；

表2探针序列

注：加框的碱基是指突变位点的碱基的探针序列是不一样的，其余位点探

针序列一样。

3.预杂交液；

4.杂交液；

5.抗体；

6.洗脱液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ；

7.缓冲液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ；

8.显色液；

9.终止液。

上述的一种检测乙肝病毒联合变异预测肝癌发生的试剂盒，具体为：

所述的PCR引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ中，P1至P8每一条引物的浓度为5μM；P1和P2等量混合；P3和P4等量混合；P5和P6等量混合；P7和P8等量混合。可根据检测样本数量的不同，按需要的引物量进行混合。

所述的杂交膜，各探针的浓度为5mmol/L，用量为4μl；

较佳地，将各探针加尾，便于探针固定到尼龙膜上，40μl反应体系如下：

37℃水浴2h，最后使用0.2mmol/L EDTA终止反应；

所述的洗脱液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ如下：

20×SSC

3mmol/L Nacl

0.3mol/L柠檬酸三钠

洗脱液Ⅰ：6×SSC，0.5%SDS；

洗脱液Ⅱ：5×SSC，0.1%SDS；

洗脱液Ⅲ：1×SSC，0.1%SDS；

洗脱液Ⅳ：0.1×SSC,0.1%SDS。

所述的预杂交液如下：5×SSC，0.5%Triton X100；

所述的缓冲液Ⅰ如下：0.15mol/L Nacl，100mmol/L Tris，pH7.5；

所述的缓冲液Ⅱ如下：0.15mol/L Nacl，0.1mol/L Tris，3%牛血清白蛋白（BSA），pH7.5；

所述的缓冲液Ⅲ如下：0.1mol/L Nacl，0.1mol/L Tris，3%牛血清白蛋白（BSA），50mmol/L Mgcl₂，pH9.5；

所述的抗体：碱性磷酸酶交联的链亲和素生物素抗体；

所述的显色液：NBT/BCIP混合显色液；

所述的终止液：0.2mmol/L EDTA。

本发明的第三方面，是提供了一种利用上述试剂盒检测乙肝病毒联合变异的检测方法，该检测方法包括下列步骤：

（A）提取乙肝病毒DNA，使用引物Ⅰ和Ⅱ分别进行巢式PCR扩增；

（B）将杂交膜放入100ml洗脱液Ⅰ中，68℃漂洗30min；

（C）68℃加入预杂交液，预杂交60min，放置在摇床上轻轻摇动；

（D）将扩增的PCR产物煮沸10min，冰浴5min，使DNA变性；

（E）将变性的PCR产物与杂交液放入杂交管中，与杂交膜68℃杂交120min；

（F）用50ml洗脱液Ⅱ于68℃漂洗2次，每次漂洗时间5min；

（G）用50ml洗脱液Ⅲ于37℃漂洗2次，每次漂洗时间5min；

（H）用50ml洗脱液Ⅳ于室温漂洗2次，每次漂洗时间5min；

（I）缓冲液Ⅱ中42℃封闭40min；

（J）10min缓冲液Ⅰ中加入抗体10μl，37℃摇床上摇动30min；

（K）缓冲液Ⅰ中室温漂洗2次，每次15min；

（L）缓冲液Ⅲ中室温漂洗2次，每次15min；

（M）10ml缓冲液Ⅲ中加入0.1ml显色液，避光显色10～30min；

（N）最后用终止液终止反应；

（O）结果判定：显色结果为兰色的结果判定阳性，和阴性对照比较无显色的为阴性。

本发明针对靶基因的突变部位设定多个探针，利用探针与模板的特异性结合，然后通过显色进行观察结果，简便实用，特异性高，灵敏度强。适于基层单位及现场快速检测。

附图说明

图1是乙型肝炎病毒PCR扩增G1899A位点区域电泳图；

图2是乙型肝炎病毒PCR扩增PreS区（是含A1C位点）电泳图。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。

实施例1：本发明的试剂盒

试剂盒组成成分的具体制备步骤如下：

1.PCR引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的制备：

人工合成引物P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7，P8，详细的序列见表1，注意P3和P7因为5’端使用生物素标记。合成后的引物稀释成5μM，上游引物和下游引物等量混合后的引物浓度为10μM,将P1和P2等量混合组成引物Ⅰ，P3和P4等量混合组成引物Ⅱ，P5和P6等量混合组成引物Ⅲ，P7和P8等量混合组成引物Ⅳ。

2.杂交膜的制备：

（1）针对突变位点设计多种特异探针，探针序列根据突变位点核苷酸的多态性，设计针对可能的各种探针，然后人工合成探针，具体探针序列见表2。

(2)探针加尾，便于探针固定到尼龙膜上。

40μl反应体系：

反应体系中，TdT为核酸转移酶，37℃水浴2h，最后使用0.2mmol/LEDTA终止反应；

(3)探针固定，将尼龙膜剪裁成1×20的长条，打印数字。将加尾的探针稀释成5pmol/L,使用点样仪将探针均匀固定到尼龙膜上，每孔点样1ul，

紫外线（UV）照射5min，80℃烘烤2h。

3.试剂盒中液体的配制,体系中的浓度均为配制后的终浓度：

（1）洗脱液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ

20×SSC

3mmol/L NaCl

0.3mol/L柠檬酸三钠

洗脱液Ⅰ：6×SSC，0.5%SDS；

洗脱液Ⅱ：5×SSC，0.1%SDS；

洗脱液Ⅲ：1×SSC，0.1%SDS；

洗脱液Ⅳ：0.1×SSC,0.1%SDS。

（2）预杂交液

5×SSC

0.5%Triton X100

（3）缓冲液Ⅰ组成：

0.15mol/L Nacl

100mmol/L Tris

pH7.5

（4）缓冲液Ⅱ组成：

0.15mol/L Nacl

0.1mol/L Tris

3%牛血清白蛋白（BSA）

pH7.5

（5）缓冲液Ⅲ组成：

0.1mol/L Nacl

0.1mol/L Tris

3%牛血清白蛋白（BSA）

50mmol/L Mgcl₂

pH9.5

（6）抗体：碱性磷酸酶交联的链亲和素生物素抗体；

（7）显色液：NBT/BCIP混合显色液；

（8）终止液：0.2mmol/L EDTA。

实施例2：样品中DNA的提取和PCR扩增

（1）乙型肝炎病人和肝癌患者血清样本中提取DNA，“煮沸法”抽提DNA的方法如下：

1)取200ul血清加入1.5ml离心管，加入400ul PEG，充分振荡混匀，1300rpm/min离心10min；

2)去掉上清，加入80ul裂解液，充分振荡混匀，直至管底沉淀混匀；

3)沸水中煮沸10min；

4)1300rpm/min离心10min，去除沉淀，上清作为模板备用；

（2）巢式PCR扩增，G1899A位点区域第一轮PCR反应50ul体系：

扩增条件：94℃3min，94℃1min，54℃1min,72℃1min,72℃10min，30个循环。

（3）巢式PCR扩增，G1899A位点区域第二轮PCR反应50ul体系：

扩增条件：94℃3min，94℃1min，55℃1min,72℃1min,72℃10min，30个循环。将扩增PCR产物电泳，1.5%琼脂糖电泳，溴化乙锭显色，显色结果为兰色的结果判定阳性，和阴性对照比较无显色的为阴性（见图1）。

（4）巢式PCR扩增，A1C位点区域第一轮PCR反应50ul体系：

扩增条件：94℃3min，94℃1min，51℃1min,72℃1min,72℃10min，30个循环。

（5）巢式PCR扩增，A1C位点区域第二轮PCR反应50ul体系：

扩增条件：94℃3min，94℃1min，52℃1min,72℃1min,72℃10min，30个循环。将扩增PCR产物电泳，1.5%琼脂糖电泳，溴化乙锭显色，显色结果为兰色的结果判定阳性，和阴性对照比较无显色的为阴性（见图2）。

实施例3：乙型肝炎病毒突变的检测

选择新鲜收集的乙型肝炎感染患者血清，按照实例2方法抽提DNA，PCR扩增产物用于该试剂盒检测，同时将PCR产物进行测序，比较试剂盒检测和测序结果。具体检测步骤如下：

（1）将探针固定到尼龙膜上，使用加尾的探针点到尼龙膜上，紫外线（UV）照射5min，80℃烘烤2h；

（2）制备的杂交膜放入100ml6×SSC/0.5%SDS洗脱液中，68℃漂洗30min；

（3）68℃加入预杂交液，预杂交60min，放置在摇床上轻轻摇动；

（4）将扩增的PCR产物煮沸10min，冰浴5min，使DNA变性；

（5）将变性的PCR产物与杂交液放入杂交管中，与点有探针的尼龙膜68℃杂交120min；

（6）用50ml2×SSC/0.1%SDS于68℃漂洗2次，每次漂洗时间5min；

（7）用50ml1×SSC/0.1%SDS于37℃漂洗2次，每次漂洗时间5min；

（8）用50ml0.1×SSC/0.1%SDS于室温漂洗2次，每次漂洗时间5min；

（9）杂交后显色：缓冲液Ⅱ中42℃封闭40min；

（10）10min缓冲液Ⅰ中加入碱性磷酸酶交联的链亲和素抗体10μl，37℃摇床上摇动30min；

（11）缓冲液Ⅰ中室温漂洗2次，每次15min；

（12）缓冲液Ⅲ中室温漂洗2次，每次15min；

（13）10ml缓冲液Ⅲ中加入0.1ml NBT/BCIP混合液，避光显色10～30min；

（14）最后用0.2mmol/L的EDTA终止反应。

（15）结果判定：显色结果为兰色的结果判定阳性。和阴性对照比较无显色的为阴性。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (8)

1.一种乙型肝炎病毒突变位点在制备肝癌早期诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述的乙型肝炎病毒突变位点是乙肝病毒BCP区的A1C和G1899A联合突变，其中A1C的第一位碱基从A突变成C，G1899A的第1899位碱基从G突变成A。

2.一种检测乙肝病毒联合变异预测肝癌发生的试剂盒，其特征在于，所述的乙肝病毒联合变异是指乙肝病毒BCP区的A1C和G1899A联合发生突变，所述的试剂盒的组成包括：

（A）  PCR引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ

将P1和P2等量混合组成PCR引物Ⅰ，为含G1899A位点区域巢式PCR第一轮引物；

P3和P4等量混合组成PCR引物Ⅱ，为G1899A位点区域巢式PCR第二轮引物；

P5和P6等量混合组成PCR引物Ⅲ，为含A1C位点区域巢式PCR第一轮引物；

P7和P8等量混合组成PCR引物Ⅳ，为含A1C位点区域巢式PCR第二轮引物；

P1至P8序列如表1所示，其中P3和P7的5’端使用生物素标记；

各引物序列如下：

编号  引物序列

（B）  杂交膜

杂交膜上固定的探针序列如下：

（C）  预杂交液；

（D）  杂交液；

（E）  抗体；

（F）  洗脱液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ；

（G）  缓冲液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ；

（H）  显色液；

（I）  终止液。

3.根据权利要求2所述的一种检测乙肝病毒联合变异预测肝癌发生的试剂盒，其特征在于，所述的PCR引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ中，P1至P8每一条引物的浓度为5μM；P1和P2等量混合；P3和P4等量混合；P5和P6等量混合；P7和P8等量混合。

4.根据权利要求2所述的一种检测乙肝病毒联合变异预测肝癌发生的试剂盒，其特征在于，所述的杂交膜，各探针的浓度为5mmol/L，用量为4μl。

5.根据权利要求2所述的一种检测乙肝病毒联合变异预测肝癌发生的试剂盒，其特征在于，将各探针加尾，便于探针固定到尼龙膜上，40μl反应体系如下：

6.根据权利要求2所述的一种检测乙肝病毒联合变异预测肝癌发生的试剂盒，其特征在于，所述的洗脱液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ如下：

20×SSC

3mmol/L Nacl

0.3mol/L柠檬酸三钠

洗脱液Ⅰ：6×SSC，0.5%SDS；

洗脱液Ⅱ：5×SSC，0.1%SDS；

洗脱液Ⅲ：1×SSC，0.1%SDS；

洗脱液Ⅳ：0.1×SSC,0.1%SDS。

7.根据权利要求2所述的一种检测乙肝病毒联合变异预测肝癌发生的试剂盒，其特征在于，所述的预杂交液如下：5×SSC，0.5%Triton X100；

所述的缓冲液Ⅰ如下：0.15mol/L Nacl，100mmol/L Tris，pH7.5；

所述的缓冲液Ⅱ如下：0.15mol/L Nacl，0.1mol/L Tris，3%牛血清白蛋白，pH7.5；

所述的缓冲液Ⅲ如下：0.1mol/L Nacl，0.1mol/L Tris，3%牛血清白蛋白，50mmol/L Mgcl₂，pH9.5；

所述的抗体：碱性磷酸酶交联的链亲和素生物素抗体；

所述的显色液：NBT/BCIP混合显色液；

所述的终止液：0.2mmol/L EDTA。

8.一种利用如权利要求1所述的试剂盒检测乙肝病毒联合变异的检测方法，其特征在于，该检测方法包括下列步骤：

（A）提取乙肝病毒DNA，使用引物Ⅰ和Ⅱ分别进行巢式PCR扩增；

（B）将杂交膜放入100ml洗脱液Ⅰ中，68℃漂洗30min；

（C）68℃加入预杂交液，预杂交60min，放置在摇床上轻轻摇动；

（D）将扩增的PCR产物煮沸10min，冰浴5min，使DNA变性；

（E）将变性的PCR产物与杂交液放入杂交管中，与杂交膜68℃杂交120min；

（F）用50ml洗脱液Ⅱ于68℃漂洗2次，每次漂洗时间5min；

（G）用50ml洗脱液Ⅲ于37℃漂洗2次，每次漂洗时间5min；

（H）用50ml洗脱液Ⅳ于室温漂洗2次，每次漂洗时间5min；

（I）缓冲液Ⅱ中42℃封闭40min；

（J）10min缓冲液Ⅰ中加入抗体10μl，37℃摇床上摇动30min；

（K）缓冲液Ⅰ中室温漂洗2次，每次15min；

（L）缓冲液Ⅲ中室温漂洗2次，每次15min；

（M）10ml缓冲液Ⅲ中加入0.1ml显色液，避光显色10～30min；

（N）最后用终止液终止反应；

（O）结果判定：显色结果为兰色的结果判定阳性，和阴性对照比较无显色的为阴性。