CN103224984A

CN103224984A - 一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的引物、探针、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN103224984A
Application number: CN 201310150195
Authority: CN
Inventors: 唐景峰; 柳建银; 程弘夏; 霍然
Original assignee: WUHAN BIOTECH GENE ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: WUHAN BIOTECH GENE ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2013-04-26
Filing date: 2013-04-26
Publication date: 2013-07-31

Abstract

本发明公开了一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的引物、探针、试剂盒及方法，属于结核分枝杆菌耐药突变的检测技术领域。所述检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的引物和探针，包括检测用引物和荧光探针。所述试剂盒包括：核酸提取反应液、PCR反应液、对照试剂、核酸提取反应液、PCR反应液和对照试剂。所述试剂盒检验方法包括以下步骤：（1）制备试剂（2）样品采集及处理（3）加样（4）PCR扩增（5）结果分析及判断。所述引物和探针灵敏度高且特异性好，所述试剂盒成本低廉，所述检测方法具有不开盖同步实施、不易污染、结果更可靠、操作简便快捷并可定量等优点。

Description

一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的引物、探针、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及结核分枝杆菌耐药突变的检测技术领域，特别涉及一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的引物、探针、试剂盒及方法。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病，结核菌可侵入人体全身各种器官，但主要侵犯肺脏，成为肺结核病。根据世界卫生组织2009年的报告，目前全球有三分之一的人口感染结核分枝杆菌，每年新增病人超过900万，其中42万为多耐药结核，死亡200万，我国是世界上22个结核病高负担国家之一，患病人数仅次于印度居全球第二位，我国结核病耐药情况严重，耐药率高达27.8%，给结核病的预防和治疗构成严峻挑战，异烟肼（isoniazid，INH）是20世纪50年代开始用于临床的酰肼类化学合成药，是结核病合并治疗的一线核心药物，也是结核分枝杆菌隐性感染的首选药物。到目前为止，较多文献报道它是一种前体药物，在菌体内被katG基因编码的过氧化氢酶-过氧化物酶激活，作用于细胞壁分枝菌酸合成途径中的酶系而干扰分枝菌酸的生物合成，最终导致菌体细胞壁损伤而死亡，异烟肼耐药相关突变主要发生在KatG315位点，inhA94位点，inhA启动子区和ahpC启动子区（除-46位点）。

现有的检测结核病的方法主要为基因检测，由于结核菌耐药的产生主要是基因组DNA中抗结核药物作用靶基因突变所致，因此基因检测更为直接，基因检测法的基本过程为先扩增耐药相关基因，然后分析扩增产物，结核耐药位点分散、突变类型多样，针对该特点，近年来出现了如液相芯片法、MLPA（Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification，多重连结依赖探针扩增）以及焦磷酸测序等高通量筛查技术应用于结核耐药突变分析的报道。

在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：

对于液相芯片法、MLPA技术以及焦磷酸测序等高通量筛查技术应用于结核耐药突变，这些方法虽然检出率高，但是成本也高，而且PCR后处理步骤复杂，增加了产物污染的几率，提高了对实验室及人员的要求。

发明内容

为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明实施例提供了一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的引物、探针、试剂盒及方法。所述技术方案如下：

一方面，一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的引物和探针，包括检测用引物和荧光探针，所述检测用引物和荧光探针包括katG基因的正向引物、katG基因的野生型正向引物、katG基因的第一突变型正向引物、katG基因的第二突变型正向引物、katG基因的反向引物、katG基因的荧光探针、inhA基因的正向引物、inhA基因的野生型正向引物、inhA基因的突变型正向引物、inhA基因的反向引物和inhA基因的荧光探针，具体序列为：

所述katG基因的正向引物katG-F如序列表中SEQ ID NO:1所示；

所述katG基因的野生型正向引物katG-Fw如序列表中SEQ ID NO:2所示；

所述katG基因的第一突变型正向引物katG-Fm-1如序列表中SEQ ID NO:3所示；

所述katG基因的第二突变型正向引物katG-Fm-2如序列表中SEQ ID NO:4所示；

所述katG基因的反向引物katG-R如序列表中SEQ ID NO:5所示；

所述katG基因的荧光探针katG-P如序列表中SEQ ID NO:6所示；

所述inhA基因的正向引物inhA-F如序列表中SEQ ID NO:7所示；

所述inhA基因的野生型正向引物inhA-Fw如序列表中SEQ ID NO:8所示；

所述inhA基因的突变型正向引物inhA-Fm如序列表中SEQ ID NO:9所示；

所述inhA基因的反向引物inhA-R如序列表中SEQ ID NO:10所示；

所述inhA基因的荧光探针inhA-P如序列表中SEQ ID NO:11所示。

可选地，所述荧光探针的5’端连接有荧光基团，所述荧光基团为FAM、ROX、HEX、CY5、CY3、TET、ALEX或CAL Flour，所述荧光探针的3’端连接有淬灭基团，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2或DABCYL。

优选地，所述katG基因的荧光探针katG-P和inhA基因的荧光探针inhA-P的5’端均连接有所述荧光基团FAM，所述katG基因的荧光探针katG-P和inhA基因的荧光探针inhA-P的3’端均连接有所述淬灭基团BHQ1。

另一方面，本发明提供一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的试剂盒，所述试剂盒具有如上所述检测用引物和所述荧光探针。

进一步地，所述试剂盒还包括：核酸提取反应液、PCR反应液和对照试剂；所述核酸提取反应液为TB DNA提取液；所述PCR反应液包括TB酶混合液和INH PCR Mix A；所述对照试剂包括INH阳性对照和TB阴性对照。

进一步地，所述INH阳性对照为INH野生型质粒；所述TB阴性对照为质量分数为0.09%的生理盐水；所述TB DNA提取液包括1mM乙二胺四乙酸二钠、10mMTris和10%Triton-100。

具体地，所述INH PCR Mix A包括1×PCR Buffer、3.5mM MgCl₂、0.8mM dNTPs、0.4μMdUTP、0.8μM正向引物、0.8μM所述katG基因的正向引物、0.8μM所述katG基因的野生型正向引物、0.8μM所述katG基因的第一突变型正向引物、0.8μM所述katG基因的第二突变型正向引物、0.8μM所述katG基因的反向引物、0.2μM所述katG基因的荧光探针、0.8μM所述inhA基因的正向引物、0.8μM所述inhA基因的野生型正向引物、0.8μM所述inhA基因的突变型正向引物、0.8μM所述inhA基因的反向引物和0.2μM所述inhA基因的荧光探针。

进一步地，所述TB包括2.5U Taq酶和0.5U UNG酶。

再一方面，本发明提供一种试剂盒的检测方法，所述方法包括以下步骤：

（1）制备试剂：在室温条件下，取n×44μL所述INH PCR Mix A和n×1μL所述TB酶混合液加入第一支离心管中，振荡混匀，3000rpm离心30s得到上清液，将所述上清液分装于PCR反应管中；

（2）样品采集及处理：

取痰标本，加所述痰标本1-3倍体积的1M NaOH溶液，对所述痰标本进行15min的液化，吸出1mL经液化后的所述痰标本置于1.5mL离心管内，10000rpm离心15min得到第一滤渣，向所述第一滤渣中加800μL TE洗涤液，经13000rpm离心10min后得到第二滤渣，向所述第二滤渣中加300μL裂解液，并于99℃加热20min，再经过13500rpm离心10min得到第一上清液，将所述第一上清液移入1.5mL离心管中，所述第一上清液即为PCR扩增模板DNA，保存于-20℃；

（3）加样：向每支所述PCR反应管中加入所述PCR扩增模板DNA、TB阴性对照和INH阳性对照品5μL，进行PCR扩增，并进行扩增反应；

（4）PCR扩增：其扩增程序为：

50℃，2min；

95℃，3min；

95℃，25s；59℃，55s，10个循环；

95℃，15s；57℃，40s，40个循环；

（5）结果分析及判断：

若katG基因的长片段目标DNA的Ct>36，且inhA基因的长片段目标DNA的Ct>36，则目标DNA浓度过低，低于检测下限，需增加样本用量；

若katG基因的长片段目标DNA的Ct<36，inhA基因的长片段目标DNA的Ct<36，且katG基因的短片段目标DNA的Ct值>katG基因的长片段目标DNA的Ct值，inhA基因的短片段目标DNA的Ct值>inhA基因的长片段目标DNA的Ct值，二者之差为ΔCt；

当ΔCt>6.6，则所述样品不存在对应基因型，或所述样品的对应目标基因型<1%；

当ΔCt=0，所述样本中存在所述对应目标基因型，且所述对应目标基因型=100%；

当0<ΔCt<3.3，所述样本中存在所述对应目标基因型，且10%<所述对应目标基因型<100%；

当3.3<ΔCt<6.6，所述样本中存在所述对应目标基因型，且1%<所述对应目标基因型<10%。

可选地，提取所述结核分枝杆菌的样本DNA的方法为煮沸法、苯酚氯仿抽提法或磁珠提取法。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供的一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的引物、探针、试剂盒及方法，本发明实施例提供的引物和探针灵敏度高且特异性好，对于高GC碱基含量目标DNA检测更有利，同时，本发明提供的试剂盒成本低廉，而且，本发明提供的检测方法采用实时PCR技术的TaqMAMA法（错配扩增突变检测法）进行检测，在此过程中扩增与检测可以不开盖且同步实施，使反应过程不易被污染，其检测结果更可靠，而且该检测过程具有简便快捷并可定量的优点，为临床提供了易用性强的结核分枝杆菌异烟肼耐药检测方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的katG315位点野生型典型检测结果；

图2是本发明实施例提供的katG315位点突变型1典型检测结果；

图3是本发明实施例提供的katG315位点突变型2典型检测结果；

图4是本发明实施例提供的inhA94位点野生型典型检测结果；

图5是本发明实施例提供的inhA94位点突变型典型检测结果；

图6是本发明实施例提供的katG315位点突变率为10%的典型检测结果；

图7是本发明实施例提供的katG315位点突变率为1%的典型检测结果；

图8是本发明实施例提供的inhA94位点突变率为10%典型检测结果；

图9是本发明实施例提供的inhA94位点突变率为1%典型检测结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

本发明所用试剂均为市售试剂。

实施例1、一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的引物和探针

取痰标本，该痰标本于武汉市医疗救治中心2010年1月—2012年7月采集，共采集350例，按照《结核病诊断实验室检验规程》进行抗酸染色法和集菌培养法鉴定、并采用改良罗氏培养基分离培养得到结核分枝杆菌，再采用Bactec960药敏鉴定法对285株分离菌株进行药敏鉴定，获得62株异烟肼耐药菌株，本发明实施例即对这62株异烟肼耐药菌株进行耐药检测。

检测用引物和荧光探针：根据GenBank中结核分枝杆菌H37Rv基因组核酸序列（登录号：NC_000962）设计并合成表1中引物和探针，用于检测inhA启动子区-17～-8位点和katG基因的315位点。检测用引物和荧光探针均采用MEGA5.0、PrimerExpress3.0等设计软件辅助完成，设计好的检测用引物和荧光探针均通过BLAST进行同源性比对以保证其特异性，其检测用引物和荧光探针由上海生工生物工程有限公司合成，结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测体系检测用引物和荧光探针的序列参见表1。

表1 异烟肼耐药突变检测体系检测用引物和荧光探针序列

表中：F：forward，正向；-F表示正向引物；w：wildtype，w表示野生型，-Fw表示野生型正向引物；m：mutation，m表示突变型，-Fm表示突变型正向引物。

R：reverse，反向；-R表示反向引物。

P：probe，探针；-P表示突变探针。

可选地，荧光探针的5’端连接有荧光基团，荧光基团为FAM、ROX、HEX、CY5、CY3、TET、ALEX或CAL Flour，荧光探针的3’端连接有淬灭基团，淬灭基团为BHQ1、BHQ2或DABCYL。

优选地，katG基因的荧光探针katG-P和inhA基因的荧光探针inhA-P的5’端均连接有荧光基团FAM，katG基因的荧光探针katG-P和inhA基因的荧光探针inhA-P的3’端均连接有淬灭基团BHQ1。

本发明进行四个两重实时PCR反应，扩增相应的4个结核异烟肼耐药相关基因检测区域，即inhA启动子区（-17～-8）位点的1个野生型和1个突变型共计2种基因型，katG315密码子位点的1个野生型和2个突变型共计3个基因型，然后检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变情况。

其中，反向引物为检测全部基因型（包括野生型和突变型组成的混合基因型）和特定基因型（野生型或突变型）所共用，本发明实施例将野生型和全部突变型都视为一种基因型，设置多个单管，其中一个单管内，采用一个荧光探针和一对检测用引物检测katG基因和inhA基因的长片段目标DNA，其中katG基因的长片段目标DNA：GAGGCTGCTCCGCTGGAGCAGATGGGCTTGGGCTGGAAGAGNTCGTATGKCACCGGAACCGGTAAGGACGCGATCACCAGCGGCATCGAGGTCGTATGGACGAACACCCCGACGAAATGGGACAACAGTTTCCTCGAGATCCTGTACGGCTACGAGTGGGA，如序列中序列中SEQ ID NO:12所示，在该序列中K可以为：G或T，N可以为A、G、C或T；inhA基因的长片段目标DNA：CGGGTCAACCCGTTCGGGTTCATCGAAACGCCGTACCGCAAGGTGGTCGACGGCGTGGTTAGCGACGAGATCGTGTACCTGACCGCCGACGAGGAGGACCGCCACGTGGTGGCACAGGCCAATTCGCCGATCGATGCGGACGGTCGCTTCGTCGAGCCGCG，如序列中序列中SEQ ID NO:13所示，长片段目标DNA的扩增，可以用于判断样本浓度水平，为初步预测样本中待检测基因型的浓度水平提供参考；在其它每一单管内，只采用一种探针和一对检测用引物检测一种既定的基因型，其产物为katG基因或inhA基因的短片段目标DNA，在该引物对中，正向引物只与既定的基因型完全配对并介导PCR延伸，与非既定基因型DNA错配，则不能介导PCR延伸反应或延伸效率显著降低，两条正向引物中，其中一条用于检测混合基因型的长片段目标DNA，另一条用于检测特定基因型的katG基因或inhA基因的短片段目标DNA，用于检测混合基因型的长片段目标DNA的正向引物3’端的第二和第三两个碱基完全错配，其余完全正确配对，其中，katG基因的短片段目标DNA：ACCGGAACCGGTAAGGACGCGATCACCAGCGGCATCGAGGTCGTATGGACGAACACCCCGACGAAATGGGACAACAGTTTCCTCGAGATCCTGTACGGCTACGAGTGGGA，如序列中序列中SEQ ID NO:14所示；inhA基因的短片段目标DNA：AGGTGGTCGACGGCGTGGTTAGCGACGAGATCGTGTACCTGACCGCCGACGAGGAGGACCGCCACGTGGTGGCACAGGCCAATTCGCCGATCGATGCGGACGGTCGCTTCGTCGAGCCGCG，如序列中序列中SEQ ID NO:15所示，用于检测特定基因型的短片段，目标DNA的正向引物完全正确配对，所用荧光探针为检测混合基因型和特定基因型所共用，其中，katG基因和inhA基因分别的长片段目标DNA和短片段目标DNA为已知序列。

实施例2、一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的试剂盒

检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的试剂盒，包括：核酸提取反应液、PCR反应液、对照试剂，核酸提取反应液、PCR反应液和对照试剂，上述试剂均放置在盒体内。

具体地，核酸提取反应液为TB DNA提取液，其中，TB DNA提取液包括1mM乙二胺四乙酸二钠、10mMTris和10%Triton-100。

具体地，PCR反应液包括TB酶和INH PCR Mix A，其中，INH PCR Mix A包括1×PCRBuffer、3.5mM MgCl₂、0.8mM dNTPs、0.4μM dUTP、0.8μMkatG基因的正向引物、0.8μM katG基因的野生型正向引物、0.8μM katG基因的第一突变型正向引物、0.8μM katG基因的第二突变型正向引物、0.8μM katG基因的反向引物、0.2μM katG基因的荧光探针、0.8μM inhA基因的正向引物、0.8μM inhA基因的野生型正向引物、0.8μM inhA基因的突变型正向引物、0.8μMinhA基因的反向引物和0.2μM inhA基因的荧光探针，TB酶包括2.5U Taq酶和0.5U UNG酶。

具体地，对照试剂包括INH阳性对照和TB阴性对照，其中，INH阳性对照为INH野生型质粒，TB阴性对照为TB DNA提取液、超纯水、Tris或生理盐水，在本发明实施例的一种实施方式中，TB阴性对照为质量分数为0.09%的生理盐水，在本发明实施例的另一种实施方式中，TB DNA提取液的成分为乙二胺四乙酸二钠、Tris和Triton-100。

试剂的配制：

将所有的试剂从冰箱取出并平衡至室温，PCR反应液配液标准为：取n×44μL INH PCRMix A和n×1μL TB酶混合液加入1.5mL离心管中，振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒，配好的PCR反应液必须贮存在-20℃并在4h内使用；PCR反应液的分装，PCR反应液以每管45μL分装于PCR薄壁反应管中；将配制好的PCR反应管装入废物回收袋转移至提取间，贮存在-20℃，配好的PCR反应液必须在配制后4h内使用。

INH PCR Mix A每份44μL，每份INH PCR Mix A包括1×PCR Buffer、3.5mM MgCl₂、0.8mM dNTPs、0.4μM dUTP、0.8μMkatG基因的正向引物、0.8μM katG基因的野生型正向引物、0.8μM katG基因的第一突变型正向引物、0.8μM katG基因的第二突变型正向引物、0.8μM katG基因的反向引物、0.2μM katG基因的荧光探针、0.8μM inhA基因的正向引物、0.8μMinhA基因的野生型正向引物、0.8μM inhA基因的突变型正向引物、0.8μM inhA基因的反向引物和0.2μM inhA基因的荧光探针，在检测前加入1μL TB酶以及PCR扩增模板DNA加入量均为5μL。

实施例3、一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的方法：

结核分枝杆菌临床痰标本DNA提取（一步法）：

本发明实施例所用的结核分枝杆菌的来源为：武汉市医疗救治中心。

加痰标本1-3倍体积的1M NaOH溶液，对痰标本进行15min的液化，NaOH溶液的加量视痰标本的粘稠度而定，粘稠度低的痰标本加痰标本体积的1-2倍，粘稠度高的痰标本加痰标本体积的2-3倍，吸出1mL经液化后的痰标本置于1.5mL离心管内，10000rpm离心15min得到滤渣，向该滤渣中加800μL TE洗涤液，其中，TE洗涤液包括10mM Tris-Cl pH8.5和0.5mM EDTA，13000rpm离心10min，去上清，加300μL裂解液，其中，裂解液成分：10mMTris-Cl pH8.0、0.1%mM乙二胺四乙酸二钠和1%Triton-100，用封口膜封口，并于99℃加热20min，再经过13500rpm离心10min，将上清液移入1.5mL离心管中，该上清液即为PCR扩增模板DNA，保存于-20℃。

结合上述实施方式，在发明实施例的另一种实施方式中，当结核分枝杆菌为固体培养标本时，其DNA提取方法：用22SWG标准接种环收集2-3周菌龄的结核分枝杆菌的菌落1环并置于250μLTB DNA提取液中混合均匀，并用封口膜封口，并于99℃加热20min，再经过14000rpm离心10min得到上清液，将上清液移入1.5mL的第二支离心管中，该上清液即为PCR扩增模板DNA，该PCR扩增模板DNA保存于-20℃。

结合上述实施方式，在发明实施例的又一种实施方式中，当结核分枝杆菌为液体培养标本时，其DNA提取方法：直接吸取1mL结核分枝杆菌的菌液，10000rpm离心15min，去掉上清液得到滤渣，向滤渣中加入250μL TB DNA提取液中制成结核分枝杆菌的重悬液，并用封口膜封口，并于99℃加热20min，再经过14000rpm离心10min得到上清液，将上清液移入1.5mL的第二支离心管中，该上清液即为PCR扩增模板DNA，该PCR扩增模板DNA保存于-20℃。

用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入提取样品、TB阴性对照品和INH阳性对照品5μL，立即盖严管盖，并进行扩增反应。

反应条件：在Bio-rad CFX96实时荧光PCR仪上进行PCR，PCR反应程序为：

第一步：50℃，2min；

第二步：95℃，3min；

第三步：95℃，25s；59℃，55s，10个循环；

第四步：95℃，15s；57℃，40s，40个循环。

程序运行完毕，将PCR薄壁反应管取出放入废物回收袋，将封口封严，按照一级污染源处理。

结果分析及判断

若katG基因的长片段目标DNA的Ct>36，且inhA基因的长片段目标DNA的Ct>36，则目标DNA浓度过低，低于检测下限，需增加样本用量。

若katG基因的长片段目标DNA的Ct<36，inhA基因的长片段目标DNA的Ct<36，且katG基因的短片段目标DNA的Ct值>katG基因的长片段目标DNA的Ct值，inhA基因的短片段目标DNA的Ct值>inhA基因的长片段目标DNA的Ct值，二者之差为ΔCt。

当ΔCt>6.6，则该反应管内的样品不存在对应基因型，或该样品的对应目标基因型<1%。

当ΔCt=0，样本中存在该管对应目标基因型，对应目标基因型=100%。

当0<ΔCt<3.3，样本中存在该管对应目标基因型，10%<对应目标基因型<100%。

当3.3<ΔCt<6.6，样本中存在该管对应目标基因型，1%<对应目标基因型<10%。

上述Ct值为SLAN96P荧光定量PCR仪上所得数值，作为参考，当使用其它仪器时，Ct值可能略有变动，以当次试验阳性对照所得的Ct值为准。

Ct值以仪器自动判读所得为准，当仪器给出一个以上Ct值时，请参考阳性对照和阴性对照的峰型选择有效Ct值；当出现仪器无法自动给出Ct值的情况时，通过调整基线或直接人工判读的方法获得Ct值。

结果判读：通过长片段目标DNA检测的Ct值来判断，样本浓度是否位于可检出范围内，当katG基因的长片段目标DNA的Ct>36，且inhA基因的长片段目标DNA的Ct>36，需增加样本用量重新检测。

当ΔCt>6.6，则该反应管内不存在对应基因型，但样本存在其它类型的基因型，或该管对应目标基因型比率<1%。

当ΔCt=0，样本中存在该管对应目标基因型，对应目标基因型比率=100%，即样本为纯和型，若该管对应目标基因型为野生型，则该样本对异烟肼敏感，若该管对应目标基因型为突变型，则该样本对异烟肼耐药。根据长片段目标DNA的Ct数值可进一步判断耐药性强度。

当0<ΔCt<3.3，样本中存在该管对应目标基因型以及其它基因型，10%<对应目标基因型比率<100%，若该管对应目标基因型为野生型，则该样本中存在对异烟肼敏感的菌株，若该管对应目标基因型为突变型，则该样本中存在对异烟肼耐药的菌株。结合其它反应管中ΔCt值的表现，可综合判断样本中的基因型类型。

当3.3<ΔCt<6.6，样本中存在该管对应目标基因型，1%<对应目标基因型比率<10%，若该管对应目标基因型为野生型，则该样本中存在对异烟肼敏感的菌株，若该管对应目标基因型为突变型，则该样本中存在对异烟肼耐药的菌株。结合其它反应管中ΔCt值的表现，可综合判断样本中的基因型类型。

将本发明实施例选取的62个异烟肼耐药样本，直接将痰液标本进行耐药基因型检测，在62个异烟肼耐药样本中，采用Sanger测序法检测，7个未检出katG315位点突变，另外55个样本均检出katG315位点突变。采用本发明提供的试剂盒及其检测方法，检测到7个样本检测为野生型，准确率为100%，53个样本检测为突变型，准确率为96.3%，选择katG样本浓度为E+8和inhA样本浓度为E+7的样本，进行检测灵敏度评估，特定基因型占样本混合基因型1%-10%可稳定准确检出，检测结果参见图1至图9，具体地，图1提供的曲线为典型的S型，样品浓度为10⁷IU/mL，长片段检测Ct值约为19.25，短片段检测Ct值约为19.25；图2提供的曲线为典型的S型，样品浓度为10⁷IU/mL，长片段检测Ct值约为19.25，段片段检测Ct值约为19.25；图3提供的曲线为典型的S型，样品浓度为10⁷IU/mL，长片段检测Ct值约为19.25，短片段检测Ct值约为19.25；图4提供的曲线为典型的S型，样品浓度为10⁷IU/mL，长片段检测Ct值约为22.3，短片段检测Ct值约为22.3；图5提供的曲线为典型的S型，样品浓度为10⁷IU/mL，长片段检测Ct值约为22.3，短片段检测Ct值为约为22.3；图6提供的曲线为典型的S型，样品浓度为10⁸IU/mL，长片段检测Ct值约为15.75，短片段检测Ct值约为19.25；图7提供的曲线为典型的S型，样品浓度为10⁸IU/mL，长片段检测Ct值约为15.75，短片段检测Ct值约为22.25；图8提供的曲线为典型的S型，样品浓度为10⁸IU/mL，长片段检测Ct值约为19.25，短片段检测Ct值约为22.35；图9提供的曲线为典型的S型，样品浓度为10⁸IU/mL，长片段检测Ct值约为19.25，短片段检测Ct值约为25.75。

本发明利用PCR扩增产生大量靶序列，靶序列中的长片段目标DNA的扩增，可以用于判断样本浓度水平，为初步预测样本中待检测基因型的浓度水平提供参考，本发明实施例将野生型和全部突变型都视为一种基因型，设置多个单管，其中一个单管内，采用一个荧光探针和一对检测用引物检测长片段目标DNA；在其它每一单管内，只采用一种探针和一对检测用引物检测一种既定的基因型，其产物为短片段DNA，在该引物对中，正向引物只与既定的基因型完全配对并介导PCR延伸，与非既定基因型DNA错配，则不能介导PCR延伸反应或延伸效率显著降低。在保证样本浓度满足检测要求的前提下，通过各反应管内长、短片段Ct值的差值ΔCt可以综合判断样本中的基因型，以及各基因型的比率。根据基因型，可对样本的药敏表型进行判断，根据耐药基因型的短片段Ct值以及比率，可以判断耐药的强弱。

本发明实施例提供的一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的引物、探针、试剂盒及方法，本发明实施例提供的引物和探针灵敏度高且特异性好，对于高GC碱基含量目标DNA检测更有利，实时PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）技术将扩增和检测两步骤合一，本发明实施例提供的试剂盒采用FQ-ARMS（fluorogenic quantitative-amplificationrefractory mutation system，单管-突变扩增阻滞系统）技术原理制备检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的剂盒，该技术灵敏度高、操作方便、无产物污染，特别适用于临床疾病的突变检测，同时，该试剂盒成本低廉，本发明实施例提供的检测方法采用基于实时PCR技术的TaqMAMA法，扩增与检测可以不开盖同步实施，不易污染结果更可靠，同时具有简便快捷并可定量等优点，引入结核分枝杆菌异烟肼耐药检测，为临床提供了易用性强的耐药检测方法，而且其检测方法具有简便快捷的优点。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的引物和探针，其特征在于，包括检测用引物和荧光探针，所述检测用引物和荧光探针包括katG基因的正向引物、katG基因的野生型正向引物、katG基因的第一突变型正向引物、katG基因的第二突变型正向引物、katG基因的反向引物、katG基因的荧光探针、inhA基因的正向引物、inhA基因的野生型正向引物、inhA基因的突变型正向引物、inhA基因的反向引物和inhA基因的荧光探针，具体序列为：

所述katG基因的正向引物katG-F如序列表中SEQ ID NO:1所示；

所述katG基因的反向引物katG-R如序列表中SEQ ID NO:5所示；

所述katG基因的荧光探针katG-P如序列表中SEQ ID NO:6所示；

所述inhA基因的正向引物inhA-F如序列表中SEQ ID NO:7所示；

所述inhA基因的反向引物inhA-R如序列表中SEQ ID NO:10所示；

所述inhA基因的荧光探针inhA-P如序列表中SEQ ID NO:11所示。

2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述荧光探针的5’端连接有荧光基团，所述荧光基团为FAM、ROX、HEX、CY5、CY3、TET、ALEX或CAL Flour，所述荧光探针的3’端连接有淬灭基团，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2或DABCYL。

3.根据权利要求2所述的引物和探针，其特征在于，所述katG基因的荧光探针katG-P和inhA基因的荧光探针inhA-P的5’端均连接有所述荧光基团FAM，所述katG基因的荧光探针katG-P和inhA基因的荧光探针inhA-P的3’端均连接有所述淬灭基团BHQ1。

4.一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒具有权利要求1-3任一项所述检测用引物和所述荧光探针。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：核酸提取反应液、PCR反应液和对照试剂；所述核酸提取反应液为TB DNA提取液；所述PCR反应液包括TB酶和INH PCR Mix A；所述对照试剂包括INH阳性对照和TB阴性对照。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述INH阳性对照为INH野生型质粒；所述TB阴性对照为质量分数为0.09%的生理盐水；所述TB DNA提取液包括1mM乙二胺四乙酸二钠、10mMTris和10%Triton-100。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述INH PCR Mix A包括1×PCR Buffer、3.5mM MgCl₂、0.8mM dNTPs、0.4μM dUTP、0.8μM所述katG基因的正向引物、0.8μM所述katG基因的野生型正向引物、0.8μM所述katG基因的第一突变型正向引物、0.8μM所述katG基因的第二突变型正向引物、0.8μM所述katG基因的反向引物、0.2μM所述katG基因的荧光探针、0.8μM所述inhA基因的正向引物、0.8μM所述inhA基因的野生型正向引物、0.8μM所述inhA基因的突变型正向引物、0.8μM所述inhA基因的反向引物和0.2μM所述inhA基因的荧光探针。

8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述TB酶包括2.5U Taq酶和0.5U UNG酶。

9.一种如权利要求4-8任一项所述试剂盒的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：