CN106282329A

CN106282329A - 一种幽门螺杆菌gyrA基因突变检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN106282329A
Application number: CN201510359685.3A
Authority: CN
Inventors: 盛海辉; 郜恒骏; 姚健; 张小燕; 张淼
Original assignee: SHANGHAI OUTDO BIOTECH CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI OUTDO BIOTECH CO Ltd
Priority date: 2015-06-26
Filing date: 2015-06-26
Publication date: 2017-01-04

Abstract

本发明公开了一种幽门螺杆菌gyrA基因突变检测试剂盒及其检测方法，本发明以一个聚合酶链式反应，反应体系中包含特异性的上游引物和下游引物以及按特定方法处理的一组探针，通过实时荧光定量检测来判断突变的存在与否。本发明方法具有特异性强、敏感性高、操作简单快速、分型准确、结果易判读等优势，可用于临床上幽门螺杆菌gyrA基因突变的检测，协助医生选用合适抗生素。

Description

一种幽门螺杆菌gyrA基因突变检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于医学分子生物学领域，具体涉及幽门螺杆菌gyrA基因突变检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

自1983年幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，Hp)首次被发现以来，其根除治疗已成为全球临床治疗的一个难题，据统计全世界人群中幽门螺旋杆菌感染率达50％，我国的感染率高达60％-90％。幽门螺旋杆菌感染可导致多种疾病，如慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌和胃黏膜相关淋巴组织组织(mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma，MALT)淋巴瘤，另外幽门螺旋杆菌感染还是心血管疾病、不明原因的缺铁性贫血和慢性特发性血小板减少性紫癜的独立危险因素。因此，对于这类疾病的患者，根除幽门螺旋杆菌刻不容缓。

目前全球推荐的幽门螺旋杆菌根除的一线标准治疗方案是质子泵抑制剂联合两种抗生素的三联疗法，常用的抗生素主要是甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林、喹诺酮、呋喃唑酮、四环素。但治疗现状不容乐观，随着时间的变迁，幽门螺旋杆菌的根除失败率逐年增高，由最初的大于90％的根除率到近期的70％左右甚至有些低于60％。而现有的资料表明，幽门螺旋杆菌的耐药性是导致根除失败的主要原因。中华医学会消化病学分会H.pylori学组和H.pylori科研协作组于2005年3月～2006年5月完成了一项涉及全国16个省市的流行病学调查和耐药原因分析显示，我国幽门螺旋杆菌对抗生素的耐药率为：甲硝唑50％～100％(平均73.3％)，克拉霉素0～40％(平均23.9％)，阿莫西林0～2.7％，喹诺酮类0～26.6％，呋喃唑酮0～45.9％。分析其原因主要在于幽门螺旋杆菌培养周期长且难培养，难以在临床实践中常规开展幽门螺旋杆菌的药敏试验，进而无法指导临床医生合理应用抗生素。

幽门螺旋杆菌抗生素耐药机制较为复杂，主要与抗生素作用靶点相关基因突变有关，同时外排泵和孔道蛋白等改变亦会影响抗生素敏感性。幽门螺旋杆菌喹诺酮类抗生素耐药主要与gyrA基因87和91密码子突变有关，并且携带两个或以上突变的菌株耐药性一般高于单个突变菌株，其它gyrA基因突变和gyrB基因突变单独并不导致耐药，但可增强87和91密码子突变的耐药作用。检测分析患者幽门螺杆菌gyrA耐药突变位点，能够在短时间内迅速的得到患者喹诺酮类抗生素耐药情况，有助于临床医师采取正确的治疗手段，提高幽门螺杆菌的根除率。

用于gyrA基因突变检测的方法很多，包括如测序、焦磷酸测序(Pyrosequencing)、变性高效液相色谱法(HDPLC)、高分辨率溶解曲线技术(HRM)、限制性片段长度多态性分析法(RFLP)等。其中测序为突变检测的金标准。该方法存在以下缺点：敏感性较低，如果突变基因的含量占基因组DNA总量的10％以下时，则用直接测序法检测不到突变样本的存在；费时，操作过程复杂，对操作人员要求高；非闭管操作，涉及到PCR扩增后的操作，因此易被污染；测序结果的判读主观性强；通量低。因此直接测序法难以在临床普遍开展。本试剂盒采用引物增敏的扩增阻碍突变系统(amplification refractorymutation system，ARMS)结合荧光PCR技术针对gyrA基因突变区特异性扩增相应突变模板DNA。检测敏感性高，与突变检测“金标准”直接测序的结果符合率≥95％。此外本方法还具有快速，操作简单，闭管反应污染少等优点，适于在临床中普遍开展。

基于上述内容，本方法用于用于幽门螺杆菌gyrA基因87和91密码子突变的检测，检测结果可用于指导幽门螺杆菌的根除治疗。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种幽门螺杆菌gyrA基因突变检测试剂盒，能有效地检测幽门螺杆菌gyrA基因耐药突变，使临床医生能获知患者幽门螺杆菌喹诺酮类抗生素耐药情况，有助于临床医生采取正确的治疗手段，提高幽门螺杆菌的根除率。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了一种幽门螺杆菌gyrA突变检测试剂盒，包括基因扩增试剂、引物和探针，所述探针与待测的gyrA突变的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交。本方法结合了PCR的高度灵敏度和荧光探针的高精确性等有点，具有操作简单，结果直观和无污染的特点。

本方法设计一种使用特异性探针的检测方法，本方法在同一个PCR反应中进行gyrA耐药突变的检测，利用荧光定量PCR仪和荧光探针的简便性和高灵敏度读取结果，判读所检测的样本中是否存在gyrA基因87和91密码子突变。

为达到上述目的，采取的技术方案：

1.使用商业化的试剂盒对组织中的DNA进行提取和纯化；该步骤中，对DNA的提取和纯化使用DNA聚合酶，具体地为Taq DNA聚合酶，所述Taq DNA聚合酶为无核酸外切酶活性；具体包括5’核酸外切酶活性和3’核酸外切酶活性；

2.根据本方法的特点设计引物和探针，其中探针的处理方法如表1所示；

在该步骤中，所述引物包括正向引物、反向引物；具体的，所述引物为SEQ ID NO：1～2he 6～7所示序列的核苷酸链或其互补链；

所述探针包括通用探针、分型探针和内参探针，其中，所述通用探针为SEQ ID NO：3所示序列的核苷酸链或其互补链；所述分型探针为SEQ ID NO：4和5所示序列的核苷酸链或其互补链；

所述通用探针3’端使用BHQ标记；所述分型探针5’端使用FAM或TET标记，3’端最后一个核苷酸进行磷酸化处理；所述内参探针3’端使用BHQ标记，5’端使用FAM或TET标记；

所述探针全部处于引物的内部，并且无重叠的序列。所使用的分型探针位于通用探针下游第1个核苷酸位置开始；

表1

11.3.PCR反应条件为：95℃预变性10分钟，95℃15秒，58℃40秒，扩增反应40循环，在60℃40秒阶段收集荧光；PCR扩增的过程中PCR循环时的退火温度应该低于引物的Tm值；

12.4.根据△Ct值对样本中是否存在gyrA基因87和91密码子突变进行判断；在该步骤中，对有效扩增的情况下，样品检测结果可信，否则试验需要重复；在检测中的阳性对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：△Ct值(受检标本Ct值-内参Ct值)≤12为阳性。

附图说明

图1为荧光定量PCR扩增曲线图

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

检测疑似具有gyrA基因87和91密码子突变的胃粘膜组织样本、粪便或培养的幽门螺杆菌样本。

1.设计合成如表1的引物探针。其中RnaseP为内参基因。

表1

2.DNA提取：使用商业化的试剂盒对组织中的DNA进行提取和纯化。

3.扩增

3.1PCR扩增体系

按照以下方法配置PCR反应液。

组份	体积
		2×PCR Buffer	10ul
gyrA引物	1ul
		16S rDNA引物	1ul
内参探针	0.5ul
		通用探针	1ul
87密码子探针	0.5ul
		91密码子探针	0.5ul
Taq酶	1ul
		H2O	5ul
DNA模板	4.5ul
		共计	25ul

3.2PCR扩增程序

按照以下方法进行PCR扩增

PCR反应条件为：95℃预变性10分钟，95℃15秒，58℃40秒，扩增反应40循环，在60℃40秒阶段收集荧光。

4.结果分析

参照附图，根据△Ct值(受检标本Ct值-内参Ct值)判断样本中是否存在gyrA基因87和91密码子突变。△Ct值≤12为阳性。例如，内参和阳性对照扩增曲线Ct值较小，用于监控检测体系。如内参和阳性对照扩增曲线均正常，而受检样本无gyrA基因扩增曲线，，则表明样本中无gyrA基因87和91密码子突变。附图中，受检样本出现gyrA基因扩增曲线(△Ct值＝10)，则表明样本中存在gyrA基因87和91密码子突变。如内参或阳性对照无扩增曲线，需排除操作、试剂盒或样本问题后，重新进行实验。

本发明不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所作出的种种变换，均落在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种幽门螺杆菌gyrA基因突变检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括基因扩增试剂、引物和探针，所述探针与待测的gyrA突变的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交。

2.一种幽门螺杆菌gyrA基因突变检测方法，其特征在于：用于鉴定gyrA基因87和91密码子，其具体步骤如下：(1)、设计引物和探针；(2)、利用如权利要求1所述的试剂盒对组织中的DNA进行提取和纯化；(3)、进行PCR扩增，首先配置PCR反应液，其次，进行PCR扩增；其中，PCR反应条件为：95℃预变性10分钟，95℃15秒，58℃40秒，扩增反应40循环，在60℃40秒阶段收集荧光；(4)、根据△Ct值对样本中是否存在gyrA基因87和91密码子突变进行判断。

3.根据权利要求2所述的一种幽门螺杆菌gyrA基因突变检测方法，其特征在于：在步骤1中，所述引物包括正向引物、反向引物；具体的，所述引物为SEQ ID NO：1～2he 6～7所示序列的核苷酸链或其互补链。

4.根据权利要求2所述的一种幽门螺杆菌gyrA基因突变检测方法，其特征在于：在步骤1中，所述探针包括通用探针、分型探针和内参探针，其中，所述通用探针为SEQ ID NO：3所示序列的核苷酸链或其互补链；所述分型探针为SEQ ID NO：4和5所示序列的核苷酸链或其互补链。

5.根据权利要求4所述的一种幽门螺杆菌gyrA基因突变检测方法，其特征在于：所述通用探针3’端使用BHQ标记；所述分型探针5’端使用FAM或TET标记，3’端最后一个核苷酸进行磷酸化处理；所述内参探针3’端使用BHQ标记，5’端使用FAM或TET标记。

6.根据权利要求2所述的一种幽门螺杆菌gyrA基因突变检测方法，其特征在于：所述探针全部处于引物的内部，并且无重叠的序列；所述分型探针设置于通用探针下游第1个核苷酸位置开始。

7.根据权利要求2所述的一种幽门螺杆菌gyrA基因突变检测方法，其特征在于：在步骤2中，对DNA的提取和纯化使用DNA聚合酶，具体地为Taq DNA聚合酶，所述Taq DNA聚合酶为无核酸外切酶活性；具体包括5’核酸外切酶活性和3’核酸外切酶活性。

8.根据权利要求2所述的一种幽门螺杆菌gyrA基因突变检测方法，其特征在于：在步骤3中，所述PCR反应液包括10ul的2×PCR Buffer、1ul的gyrA引物、1ul的16S rDNA引物、0.5ul的内参探针、1ul的通用探针、0.5ul的87密码子探针、0.5ul的91密码子探针、1ul的Taq酶、5ul的H2O、4.5ul的DNA模板。

9.根据权利要求2所述的一种幽门螺杆菌gyrA基因突变检测方法，其特征在于：在步骤3中，PCR扩增的过程中PCR循环时的退火温度应该低于引物的Tm值。

10.根据权利要求2所述的一种幽门螺杆菌gyrA基因突变检测方法，其特征在于：在步骤4中，对有效扩增的情况下，样品检测结果可信，否则试验需要重复；在检测中的阳性对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：△Ct值(受检标本Ct值-内参Ct值)≤12为阳性。