CN107312832A - 一种试剂盒、试剂盒的使用方法、试剂盒的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种试剂盒、试剂盒的使用方法、试剂盒的用途，其中试剂盒中：23s rRNA PCR反应液A包括通用引物对、23S rRNA基因特异性探针、内标引物对、内标特异性探针；23s rRNA PCR反应液B包括23S rRNA基因A2142G/C突变检测特异性引物对、23S rRNA基因特异性探针、内标引物对、内标特异性探针；23s rRNA PCR反应液C包括23S rRNA基因A2143G突变检测特异性引物对、23S rRNA基因特异性探针、内标引物对、内标特异性探针，本发明运用ARMS引物区分野生型和突变型基因，具有灵敏度高、特异性强的优点，检测结果准确性高，适用于胃黏膜组织样本类型，具有检测准确，灵敏度高、特异性强、简便快速的优点，具有良好的临床标本检测能力。

Description

一种试剂盒、试剂盒的使用方法、试剂盒的用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142G/C和A2143G位点突变的试剂盒及试剂盒的使用方法和试剂盒的用途。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobaeter pylori,Hp)于1983年由澳大利亚科学家鲁宾·华伦和巴利·马歇尔首次从慢性活动性胃炎患者的胃粘膜活检组织中成功分离出来的，是目前所知能够在人胃中生存的惟一微生物种类，HP能够引起慢性胃炎、胃溃房等消化道相关疾病，是WHO癌症协会规定的原核生物中唯一的I类致癌因子。以质子泵抑制剂(protonpumpinhibitor,PPI)结合阿莫西林和克拉霉素(或者甲硝唑)的三联疗法，是国内外公认的一线抗Hp感染治疗组合。克拉霉素的抗菌机制是药物穿入菌体细胞内，与核糖体紧密结合，作用于23S rRNA V功能区的多肽转移环，抑制多肽转移酶，影响核糖体的位移过程，阻止肽链延长，从而抑制细菌的蛋白质合成。然而，由于克拉霉素的耐药率的不断上升，这种疗法的成功率正在逐渐的下降。

幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药机制有以下几种：l、rRNA甲基化酶引起克拉霉素失活；2、细胞膜渗透性下降使进入细菌的药物减少；3、克拉霉素排出增加；4、基因突变:主要为幽门螺杆菌23S rRNA的V区发生点突变，导致核糖体变构，克拉霉素的结合位点发生改变，使幽门螺杆菌与克拉霉素的亲合力减弱，不能阻止细菌的蛋白合成产生耐药。国内外学者普遍认为幽门螺杆菌对克拉霉素耐药的主要机制是23S rRNA基因突变所致，其余的机制相对作用较弱。1997年Taylor等人研究证实位于在23S rRNA基因的结构域V中编码的肽基转移酶区的第2142位(其中腺嘌呤核苷酸被胞嘧啶或被鸟嘌呤取代)，或第2143位(其中腺嘌呤被鸟嘌呤取代)的3个点突变，这些突变在此微生物中与克拉霉素抗性机理密切相关；因此认为HP 23s rRNA V区的A2142G/C、A2143G突变是引起克拉霉素耐药的主要原因。Liu等对北京65株克拉霉素耐药株研究显示：A2143G、A2142G和A2142C的突变率分别占84.6％,6.2％和1.5％；另外，Raymond等对法国138株克拉霉素耐药株研究发现:A2143G、A2142G和A2142C的突变率分别占81.9％、14.5％和3.6％。因此，检测Hp23SrDNA中A2143G、A2142G和A2142C突变，可以检测到中国90％以上的克拉霉素耐药Hp株，可以作为国内检测Hp克拉霉素耐药的靶点。

用于克拉霉素耐药检测的方法很多，包括如药物敏感性试验、DNA直接测序、限制性片段长度多态性分析(RFLP-PCR)、荧光定量PCR法等。其中药敏实验为耐药检测的金标准，但此类方法是建立在细菌培养基础上，其缺点为细菌培养时间长，培养要求较高，临床上比较难做到。目前，世界上尚没有一种商品化的用于HP克拉霉素耐药检测的试剂盒在实际应用中得到认可。

扩增阻碍突变系统(amplificat1n refractory mutat1n system，ARMS)于1989年建立，用于对已知突变基因进行检测。该法通过设计突变ARMS引物，其3’末端碱基与待检测突变型的突变碱基匹配，用于特异性扩增突变模板。ARMS的检测灵敏度依赖于ARMS引物的特异性和反应条件如酶，镁离子浓度等的优化。为了增加引物的特异性，减少引物与靶DNA有错配时的错配延伸，可通过在引物3’端的第2-3个碱基引入另外一个或者两个错配碱基，使之与模板之间形成多重错配以阻止错误延伸。ARMS-qPCR技术基于Real-time PCR平台，结合ARMS突变富集和Taqman特异性荧光检测两种技术。利用ARMS引物对突变靶序列进行PCR扩增，Taqman探针对扩增产物进行特异性位点检测，在Real-time PCR基础上鉴定特定突变。

发明内容：

本发明的目的是提供一种具有完善内标和通用系统，检测快速准确，灵敏度高的用于检测幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142G/C和A2143G位点突变的试剂盒。采用ARMS-TaqMan荧光PCR技术的幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142G/C和A2143G位点突变的试剂盒，具有完善内标和通用系统，从而实现快速、方便、灵敏、经济的检测，适合推广应用和产业化。

本发明为解决上述技术问题，提出的一种技术方案：一种试剂盒，包括23s rRNAPCR反应液A、23s rRNA PCR反应液B和23s rRNA PCR反应液C，所述23s rRNA PCR反应液A包括通用引物对、23S rRNA基因特异性探针、内标引物对、内标特异性探针；所述23s rRNAPCR反应液B包括23S rRNA基因A2142G/C突变检测特异性引物对、23S rRNA基因特异性探针、内标引物对、内标特异性探针；所述23s rRNA PCR反应液C包括23S rRNA基因A2143G突变检测特异性引物对、23S rRNA基因特异性探针、内标引物对、内标特异性探针。

上述技术方案的一种优选：所述23S rRNA基因A2142G/C位点和A2143G位点突变检测特异性引物的上游引物为ARMS引物；所述通用引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，所述通用引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述23S rRNA基因特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述23S rRNA基因A2142G突变检测特异性引物对的上游引物如SEQ ID No.4所示；所述23S rRNA基因A2142G突变检测特异性引物对的下游引物如SEQ ID No.2所示；所述23S rRNA基因A2142C突变检测特异性引物对的上游引物如SEQ ID No.5所示；所述23S rRNA基因A2142C突变检测特异性引物对的下游引物如SEQ ID No.2所示；所述23S rRNA基因A2143G突变检测特异性引物对的上游引物如SEQID No.6所示；所述23S rRNA基因A2143G突变检测特异性引物对的下游引物如SEQ ID No.2所示；所述23S rRNA基因特异性探针和所述的内标特异性探针带有不同的荧光基团；所述内标引物对的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述内标引物对的下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；所述内标特异性探针核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

上述技术方案的一种优选：上述23S rRNA基因特异性探针和所述的内标特异性探针的5’端分别标有发光基团FAM和VIC，所述的23S rRNA基因特异性探针和所述的内标特异性探针的3’端均标有淬灭基团BHQ1。

上述技术方案的一种优选：上述的试剂盒反应体系为20～50μl，所述23s rRNAPCR反应液A中，通用引物对的上、下游引物的终浓度均为0.1～0.4μΜ，23S rRNA基因特异性探针的终浓度为0.1～0.2μΜ，内标引物对的上、下游引物的终浓度均为0.1～0.4μΜ，内标特异性探针的终浓度为0.1～0.2μΜ；所述23s rRNA PCR反应液B中23S rRNA基因A2142G/C突变检测特异性引物对的上、下游引物的终浓度均为0.1～0.4μΜ，23S rRNA基因特异性探针的终浓度为0.1～0.2μΜ，内标引物对的上、下游引物的终浓度均为0.1～0.4μΜ，内标特异性探针的终浓度为0.1～0.2μΜ；所述23s rRNA PCR反应液C中23S rRNA基因A2143G突变检测特异性引物对的上、下游引物的终浓度均为0.1～0.4μΜ，23S rRNA基因特异性探针的终浓度为0.1～0.2μΜ，内标引物对的上、下游引物的终浓度均为0.1～0.4μΜ，内标特异性探针的终浓度为0.1～0.2μΜ；

上述技术方案的一种优选：上述用于检测幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142G/C和A2143G位点突变的试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照液的浓度为10ng/μl的野生型基因组DNA溶液，且阳性对照含有10％的23S rRNA基因A2143G突变和A2143G突变阳性质粒；所述的阴性对照为含有内标模板的TE缓冲液。

上述技术方案的一种优选：上述用于检测幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142G/C和A2143G位点突变的试剂盒还包括PCR反应液，所述的PCR反应液包括PCR缓冲液、0.2mM的dNTPs、1.5～3mM的MgCl2和2～5U/test的热启动Taq DNA聚合酶；所述的PCR缓冲液包括100mM的Tris-HCl(pH 8.3)和500mM的KCl；所述的0.2mM的dNTPs包括0.2mM的dATP、0.2mM的dGTP、0.2mM的dCTP和0.2mM的dUTP。

本发明还提供了一种试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

PCR反应，其中具体包括：将23s rRNA PCR反应液A、23s rRNA PCR反应液B、23srRNA PCR反应液C和23s rRNA PCR激活剂平衡至室温，混匀离心后进行加样，并将配置的各反应液分装到PCR反应管中；

加样，其中具体包括：在装有PCR反应液的反应管中用带滤芯吸嘴分别加入5μl核酸模板，盖上管盖，转移到扩增检测区；

PCR扩增检测，其中具体包括：将反应管放入荧光PCR仪进行扩增检测。

本发明还提供了一种试剂盒的用途，用于幽门螺杆菌克拉霉素药物选择。本发明具有积极的效果：

本发明的用于检测幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142G/C和A2143G位点突变的试剂盒采用ARMS-TaqMan荧光PCR技术，并引物内源性内标系统，内源性内标系统包括内标引物对，内标特异性探针，内标模板来自人源基因组DNA；同时，经反复实验确认的内标系统是不是影响质控PCR反应体系或检测PCR反应体系。内标系统的引入检测幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142G/C和A2143G位点突变的试剂盒是为保证检测结果的准确性，此步设计的优势在于：1)监测每个测试样本采集是否存在问题；2)监测每个PCR管内是否存在抑制导致的假阴性情况；3)判断是否存在扩增孔间差；或4)每个PCR管内是否存在人为加样错误导致的假阴性结果。

本发明用于检测幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142G/C和A2143G位点突变的试剂盒的开发中，使每个样本的检测在三个PCR管内平行进行实验：1)一个通用PCR反应及内标系统；2)A2142G/C突变PCR反应及内标系统；3)A2143G突变PCR反应及内标系统。这样设计的优势在于：既可以检测模板质量，又可以监测假阴性及批间情况。

本发明用于检测幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142G/C和A2143G位点突变的试剂盒，采用将扩增阻碍突变系统(Amplification Refractory Mutation System,ARMS)技术，通过优化反应体系，达到检测幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142G/C和A2143G等突变位点的突变情况。

本发明用于检测幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142G/C和A2143G位点突变的试剂盒，其检测时间为70～90分钟，实现了幽门螺杆菌23S rRNA基因突变检测的高效、低成本、高灵敏度和准确性，对其它基因突变检测试剂盒的开发具有有借鉴意义。

本发明用于检测幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142G/C和A2143G位点突变的试剂盒单次检测成本在20元左右，预计试剂盒定价在200～300元，与国外动则数千元/次的检测费用相比，能让受检者享受到实实在在的优惠。

本发明用于检测幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142G/C和A2143G位点突变的试剂盒灵敏度高、内标系统完善，与现有技术相比，更能适合产业化生产及应用。

附图说明

图1：采用本发明的幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142G/C和A2143G位点突变的试剂盒实施例1检测A2142G/C位点突变样本扩增图。

图2：采用本发明的幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142G/C和A2143G位点突变的试剂盒实施例1检测A2143G位点突变样本扩增图。

图3：采用本发明的幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142G/C和A2143G位点突变的试剂盒实施例1检测未突变样本扩增图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。文中未注明具体条件的实验方法，通过按照常规条件进行，或按照原料制造商所建议的条件进行。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。

实施例1

一、试剂盒的组成

本实施例的幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142G/C和A2143G位点突变的试剂盒，包括23s rRNA PCR反应液A、23s rRNA PCR反应液B、23s rRNA PCR反应液C、23s rRNA PCR激活剂、阳性对照和阴性对照等，如表1所示。23s rRNA PCR反应液A由10×PCR缓冲液、热启动Taq DNA聚合酶、dNTPs、通用引物对及探针和内标引物对及探针配制而成。23s rRNA PCR反应液B由10×PCR缓冲液、热启动Taq DNA聚合酶、dNTPs、A2142G/C突变检测特异性引物对及探针和内标引物对及探针配制而成。23s rRNA PCR反应液C由10×PCR缓冲液、热启动TaqDNA聚合酶、dNTPs、A2143G突变检测特异性引物对及探针和内标引物对及探针配制而成。其中10×PCR缓冲液包括100mM的Tris-HCl(pH 8.3)和500mM的KCl；dNTPs包括0.2mM的dATP、0.2mM的dGTP、0.2mM的dCTP和0.2mM的dUTP。质控品包括阳性对照和阴性对照分别分装在两个不同的管内。

阳性对照是浓度为10ng/μl的野生型基因组DNA溶液，且阳性对照含有10％的23SrRNA基因A2143G突变和A2143G突变阳性质粒。

阴性对照为含有内标模板的TE缓冲液。

应用本发明的试剂盒进行幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142G/C和A2143G位点突变检测时所采用的反应体系为20～50ul，试剂盒各组分的使用浓度及在反应体系中的终浓度见表1。

表1试剂盒组成表

通用引物对、A2142G/C特异性ARMS引物、A2143G特异性ARMS引物、23S rRNA基因特异性探针、内标特异性引物对及内标特异性探针的核苷酸序列如表2所示。

表2引物和探针特征表

如表2所示，23S rRNA基因特异性探针5’端标记有FAM荧光发光基团，3’端标记有BHQ1荧光淬灭基团。内标特异探针的核苷酸序列的5’端标记有VIC荧光发光基团，3’端标记有BHQ1荧光淬灭基团。23S rRNA基因特异性探针和内标特异探针的5’端标记不同的荧光发光基团，在同一反应体系中对同一标本进行检测。

二、试剂盒的使用方法

本实施例的幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142G/C和A2143G位点突变检测试剂盒的具体检测步骤如下：

1、DNA提取

采用广州和实生物技术有限公司的组织DNA提取试剂盒(磁珠法)提取胃黏膜组织样本1、样本2和样本3，具体的操作可参考试剂盒的产品说明书。

2、样本DNA质量检测

获得的样本DNA提取物后，通过Nano Drop2000测定浓度和OD260/OD280的比值控制样本质量，最终加入反应体系中的样本，OD260/OD280的比值在1.8～2.0之间的可获得最优反应结果，浓度为10～50ng/ul。

3、PCR反应

1)配制25ul PCR反应体系

从试剂盒中取出23s rRNA PCR反应液A、23s rRNA PCR反应液B、23s rRNA PCR反应液C和23s rRNA PCR激活剂平衡至室温，混匀离心后按照下表格进行加样，并将配置的各反应液分装到PCR反应管中(23s rRNA PCR反应液A-C反应液位置分别对应PCR反应管的幽门螺杆菌外控反应孔、2142突变检测反应孔、2143突变检测反应孔和2144突变检测反应孔)，具体如表3所示。

表3

2)加样

在装有PCR反应液的反应管中用带滤芯吸嘴分别加入5μl核酸模板，盖上管盖，转移到扩增检测区。

3)PCR扩增检测

将反应管放入荧光PCR仪进行扩增检测。循环参数设定如表4所示：

表4

4)结果获取

根据仪器软件进行分析，得到各样本的检测结果。(基线优先考虑仪器自动选择；若使用手动选择，建议选取3～15，或根据样本检测的具体情况设置基线，阈值线选在阴性对照正常扩增曲线的上方)

5)质量控制

阴性对照：三个孔位的测定结果FAM通道均为阴性(Ct＝40或无数值)，VIC通道均为阳性(22＜Ct值＜32)。

阳性对照：三个孔位的测定结果FAM通道均为阳性(22＜Ct值＜32)。

6)检验结果的解释

a)阴性对照的三个孔位的FAM通道应无扩增曲线(Ct＝40或无数值)，VIC通道应有扩增曲线且22＜Ct值＜32，否则该次实验视为无效。阳性对照的三个孔位的FAM通道应有扩增曲线且22＜Ct值＜32，否则该次实验视为无效。

b)待测样本的三个孔位的VIC通道应有扩增曲线，且Ct值应控制在20-30之间。若Ct值大于30则说明存在PCR抑制或者加入的DNA量过少，需重新提取DNA；若Ct值小于20，则说明加入过量的DNA，需减少DNA量。

c)待测样本的外控反应孔的FAM通道若无扩增曲线(Ct＝40或无数值)，说明该样本无幽门螺杆菌感染；若FAM通道有扩增曲线(Ct值＜40)，说明该样本存在幽门螺杆菌感染。

d)突变结果的判断：确定待测样本三个突变检测反应孔(2142突变检测反应孔和2143突变检测反应孔)的FAM通道Ct值与通用反应孔的FAM通道Ct值，计算ΔCt(ΔCt＝突变检测反应孔Ct值-通用反应孔Ct值)。通过比较|ΔCt|与cut-offΔCt之间的关系来判读结果，如下表所示进行判断。若该突变检测反应孔的FAM通道无扩增曲线(Ct＝40或无数值)，则判断为阴性，即无该类型突变。若该突变检测反应孔的FAM通道Ct值在0-38之间，则判断|ΔCt|：|ΔCt|大于等于cut-offΔCt时，则判断为阴性，即无该类型突变；|ΔCt|小于cut-offΔCt时，则判断为阳性，即存在该类型突变，具体如表5所示。

表5

当完成试剂盒有效性的判定和检测样本有效性的判定后，确定检测样本、阳性对照、阴性对照以及内标基因均有效的前提下，在对样本1、样本2和样本2检测时，；若A管或B管|ΔCt|＜cut-offΔCt，则判定该样本为2142或2143位点突变阳性，参见图1和图2；若样本FAM通道无扩增曲线(Ct＝40或无数值)或|ΔCt|≥cut-offΔCt时，则样本为阴性(非突变)，参见图3。三、试剂盒的用途

本实施例的幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142G/C和A2143G位点突变检测试剂盒，其应用范围包括：

通过检测幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142G/C和A2143G位点突变情况可受益的患者包括胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、胃十二指肠复合溃疡、胃息肉、胃肿瘤等患者；

通过幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142G/C和A2143G位点突变检测可指导克拉霉素用药；

通过幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142G/C和A2143G位点突变检测，以及结合PPI检测可辅助临床医生进行诊断，从而实现精确治疗。

实施例2

本实施例的用于幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142G/C和A2143G位点突变检测试剂盒其余部分与实施例1相同，不同之处在于：23S rRNA基因特异性探针5’端标记有VIC荧光发光基团，3’端标记有BHQ1荧光淬灭基团；内标特异探针的核苷酸序列的5’端标记有FAM荧光发光基团，3’端标记有BHQ1荧光淬灭基团。PCR反应时，VIC通道采集23S rRNA基因的荧光信号，FAM通道采集内标基因的荧光信号。

上述实施例仅仅是为了清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明精神所引伸的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

序 列 表

SEQUENCE LISTING

<110> 上海芯超生物科技有限公司

<120> 一种用于检测幽门螺杆菌 23S rRNA 基因 A2142G/C 和 A2143G 位点突变的试剂盒

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(17)

<400> 1

ctacccgcgg caagtcg 17

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<400> 2

tcaaagcctc ccacctatcc t 21

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(28)

<400> 3

ccgtggacct ttactacaac ttagcact 28

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<400> 4

ctacccgcgg caagtcggg 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<400> 5

ctacccgcgg caagtcggc 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<400> 6

ctacccgcgg caagactgag 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<400> 7

acccagaggt tctttgagtc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<400> 8

aggcaccgag cactttcttg 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(22)

<400> 9

cactcctgat gctgttatgg gc 22

4

Claims (8)

1.一种试剂盒，其特性在于：包括23s rRNA PCR反应液A、23s rRNA PCR反应液B和23srRNA PCR反应液C，所述23s rRNA PCR反应液A包括通用引物对、23S rRNA基因特异性探针、内标引物对、内标特异性探针；所述23s rRNA PCR反应液B包括23S rRNA基因A2142G/C突变检测特异性引物对、23S rRNA基因特异性探针、内标引物对、内标特异性探针；所述23srRNA PCR反应液C包括23S rRNA基因A2143G突变检测特异性引物对、23S rRNA基因特异性探针、内标引物对、内标特异性探针。

2.根据权利要求1所述的一种试剂盒，其特征在于：

所述23S rRNA基因A2142G/C位点和A2143G位点突变检测特异性引物的上游引物为ARMS引物；

所述通用引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述通用引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述23S rRNA基因特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述23S rRNA基因A2142G突变检测特异性引物对的上游引物如SEQ ID No.4所示；

所述23S rRNA基因A2142G突变检测特异性引物对的下游引物如SEQ ID No.2所示；

所述23S rRNA基因A2142C突变检测特异性引物对的上游引物如SEQ ID No.5所示；

所述23S rRNA基因A2142C突变检测特异性引物对的下游引物如SEQ ID No.2所示；

所述23S rRNA基因A2143G突变检测特异性引物对的上游引物如SEQ ID No.6所示；

所述23S rRNA基因A2143G突变检测特异性引物对的下游引物如SEQ ID No.2所示；

所述23S rRNA基因特异性探针和所述的内标特异性探针带有不同的荧光基团；

所述内标引物对的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述内标引物对的下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；

所述内标特异性探针核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

3.根据权利要求1所述的一种试剂盒，其特征在于：所述23S rRNA基因特异性探针和所述的内标特异性探针的5’端分别标有发光基团FAM和VIC，所述的23S rRNA基因特异性探针和所述的内标特异性探针的3’端均标有淬灭基团BHQ1。

4.根据权利要求1所述的一种试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒反应体系为20～50μl，所述23s rRNA PCR反应液A中，通用引物对的上、下游引物的终浓度均为0.1～0.4μΜ，23S rRNA基因特异性探针的终浓度为0.1～0.2μΜ，内标引物对的上、下游引物的终浓度均为0.1～0.4μΜ，内标特异性探针的终浓度为0.1～0.2μΜ；

所述23s rRNA PCR反应液B中23S rRNA基因A2142G/C突变检测特异性引物对的上、下游引物的终浓度均为0.1～0.4μΜ，23S rRNA基因特异性探针的终浓度为0.1～0.2μΜ，内标引物对的上、下游引物的终浓度均为0.1～0.4μΜ，内标特异性探针的终浓度为0.1～0.2μΜ；

所述23s rRNA PCR反应液C中23S rRNA基因A2143G突变检测特异性引物对的上、下游引物的终浓度均为0.1～0.4μΜ，23S rRNA基因特异性探针的终浓度为0.1～0.2μΜ，内标引物对的上、下游引物的终浓度均为0.1～0.4μΜ，内标特异性探针的终浓度为0.1～0.2μΜ。

5.根据权利要求1～4任一项所述的一种试剂盒，其特征在于：还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照液的浓度为10ng/μl的野生型基因组DNA溶液，且阳性对照含有10％的23S rRNA基因A2142G/C突变和A2143G突变阳性质粒；所述的阴性对照为含有内标模板的TE缓冲液。

6.根据权利要求5所述的一种试剂盒，其特征在于：还包括PCR反应液，所述的PCR反应液包括PCR缓冲液、0.2mM的dNTPs、1.5～3mM的MgCl₂和2～5U/test的热启动Taq DNA聚合酶；

所述的PCR缓冲液包括100mM的Tris-HCl和500mM的KCl，其中Tris-HCl的pH值为8.3；

所述的0.2mM的dNTPs包括0.2mM的dATP、0.2mM的dGTP、0.2mM的dCTP和0.2mM的dUTP。

7.一种试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

PCR反应，其中具体包括：将23s rRNA PCR反应液A、23s rRNA PCR反应液B、23s rRNAPCR反应液C和23s rRNA PCR激活剂平衡至室温，混匀离心后进行加样，并将配置的各反应液分装到PCR反应管中；

加样，其中具体包括：在装有PCR反应液的反应管中用带滤芯吸嘴分别加入5μl核酸模板，盖上管盖，转移到扩增检测区；

PCR扩增检测，其中具体包括：将反应管放入荧光PCR仪进行扩增检测。

8.一种试剂盒的用途，其特征在于，用于幽门螺杆菌克拉霉素药物选择。