CN104531865A - 一种检测结核分枝杆菌耐药基因的试剂盒及其应用 - Google Patents

一种检测结核分枝杆菌耐药基因的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测结核分枝杆菌耐药基因的试剂盒及其应用。本发明公开一组检测或辅助检测样品中结核分枝杆菌的基因是否发生耐药性突变的探针，该组探针包含序列为如下(1)-(20)任意所示序列的探针中的至少一个：(1)SEQ ID No.13所示的序列；(2)SEQ ID No.14所示的序列；(3)SEQ ID No.15所示的序列；(4)SEQ ID No.16所示的序列。本发明通过高效灵敏的多重实时荧光PCR技术，在较短的时间内检测待测样品中结核分枝杆菌的七个耐药基因的突变情况，结果灵敏度高、特异性较好，分析过程简便。

Description

一种检测结核分枝杆菌耐药基因的试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种检测结核分枝杆菌耐药基因的试剂盒及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
结核病是单一致病菌感染导致死亡率最高的感染性疾病。目前，全球约有1/3的人感染了结核杆菌，每年死于结核病的人数达到300万。我国是全球22个结核病流行严重的国家之一，位居全球第2位。第五次全国结核病流行病学抽样调查显示，全国15岁及以上人群肺结核的患病率为459/10万，肺结核患者耐多药率为6.8％。结核病与艾滋病等疾病伴发以及多药耐药等现象致使我国结核病的防控形势严峻。
结核分枝杆菌耐药性的机制大致有三种类型：即降低细胞膜的通透性和外排泵机制，产生降解或灭活酶类，药物靶位的改变。结核杆菌无法通过质粒的介导从其他细菌获得耐药性，因此染色体介导的耐药性是MTB(结核分枝杆菌)产生耐药的主要基础。目前对MTB耐药分子机制的研究主要集中在药物的作用靶位及其相关基因的突变上。
利福平作用于结核杆菌DNA依赖的RNA聚合酶亚基β亚单位(RNA polymerase Bsubunit，rpoB)，从而抑制mRNA的转录。结核分枝杆菌对利福平耐药是结核病化疗失败的主要原因，当rpoB高度保守核心区域(RRDR)发生突变时利福平不能与RNA聚合酶β亚单位结合，抑制转录。主要的突变集中在编码27个氨基酸的81个碱基范围内(Hillemann D et a1.Use 0f the Genotype MTBDR assay for rapid detection ofrifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis complexisolates[J].J.Clin.Mierobiol，2005，43：3699-3703.)。其中，以531TCG→TTG、526CAC→GAC、CAC→TAC、CAC→CGC和CAC→CTC的突变最为常见(崔振玲等.基因芯片检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药性研究[J].中华结核与呼吸杂志，2004，7(27)：439-441.)，除上述两位点外，511、516、533、522位点也有突变。
结核分枝杆菌对抗结核化疗药物异烟肼(INH)的耐药机制较为复杂，约92％的INH耐药菌与katG，inhA和ahpC三个基因突变有关。其中katG和inhA基因是主要的耐药基因。katG的丢失或突变导致其编码的过氧化氢-过氧化物酶活性丧失或下降，而inhA基因突变减弱了异烟肼对分枝杆菌酸生物合成的抑制作用。katG基因常见突变发生在315位点上即315AGC→AAC或者AGC→ACC，inhA基因的突变位点为-15C→T。
最近的研究表明结核分枝杆菌耐乙胺丁醇与阿拉伯糖基转移酶的编码基因。embABC操纵子突变或emb蛋白表达增高有关，该操纵子由embC、embA和embB三个基因组成，其中embB基因(尤其是306位密码子)突变是耐乙胺丁醇产生的主要分子机制。约47％-65％的耐EMB菌株与embB基因突变有关(Ramaswamy S et a1.Moleculargenetic analysis of nucleotide polymorphisms associated with ethambutolresistance in human isolates of Mycobacterium Tuberculosis[J].AntimicrobAnents Chemother.2000，44(2)：32.)，常见突变位点为306ATG→ATA或ATG→GTG。
链霉素是抗结核治疗中常用的氨基糖苷类抗生素，链霉素主要作用于结核分枝杆菌的核糖体，诱导遗传密码的错误，抑制mRNA转译的开始，干扰转译过程中的校对，从而抑制蛋白质合成(Honore N，Cole S T.Streptomycin resistance inmycobactefia[J].Anlimiorob Agents Chemother，1994，38(2):238.)。最近研究认为链霉素耐药是由于其核糖体S12蛋白编码基因rpsL或16SrRNA编码基因rr8突变所致，80％耐链霉素结核分枝杆菌临床分离株可见rpsL突变(李国利.结核分枝杆菌耐药分子机制及耐药基因检测方法研究进展[J].中国医师杂志，2002，4(4)：338-340.)。rpsL基因最常见的是43位密码子AAG→AGG的突变和88位密码子AAG→AGG的突变。
氟喹诺酮类药物的作用靶位是细菌的DNA旋转酶，阻抑DNA的复制，最终导致菌体死亡。喹诺酮类耐药结核菌中，突变大多发生在gyrA基因保守区67-106位的密码子区。常见94位GAC→GGC的突变位点，90位GCG→GTG的突变位点。
卡那霉素(Kanamycin，KAN)和阿米卡星(Amikacin，AMK)是氨基糖苷类抗生素，它们结合到细菌核糖体30S亚基的16S rRNA，干扰甲酰甲硫氨酰tRNA(.formyl-methionyl-tRNA)与30S rRNA的连接，阻断细菌蛋白质的合成，从而达到抑菌的作用。
卷曲霉素(Capreomycin,CAP)为多肽复合物，对结核分枝杆菌起抑制作用，但作用机制尚不明确，可能与抑制细菌蛋白合成有关。
耐阿米卡星(AK)、卡那霉素的结核杆菌中，16S rRNA基因突变率为67.4％，最常见的突变型是1401(A→G)的单碱基置换(60.5％)。少数分离株为1402(C→T或A)，1484(G→T),这些突变主要发生于高水平耐药株，还有32.6％的耐卡那霉素分离株未发现16S rRNA基因突变，可能还存在其他耐药机制。
卷曲霉素耐药与相关基因突变关系密切，包括16S rRNA基因和tlyA基因，但是，最主要的耐药基因是16S rRNA基因，大约78-80％的卷曲霉素耐药性与该基因的突变相关，特别是1401(A→G)的单碱基置换，突变率约为72％,但此突变型仅造成卷曲霉素低度耐药，1402(C→T)和1484(G→T)的突变率较低，约为5-6％，但它们可导致菌株对卷曲霉素高度耐药。
结核分枝杆菌的临床检测一直以来主要依靠药物药敏试验，但传统的在固体培养基上进行的药物敏感试验周期长、敏感性低，严重影响了患者的早期诊断和治疗。
因此，建立一种操作简便、快速的检测耐药基因多点突变方法对指导结核病的治疗和控制具有极其重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测结核分枝杆菌耐药基因的试剂盒及其应用。
本发明提供一组检测或辅助检测样品中结核分枝杆菌的基因是否发生耐药性突变的探针，该组探针包含序列为如下(1)-(20)任意所示序列的探针中的至少一个：
(1)SEQ ID No.13所示的序列；
(2)SEQ ID No.14所示的序列；
(3)SEQ ID No.15所示的序列；
(4)SEQ ID No.16所示的序列；
(5)SEQ ID No.17所示的序列；
(6)SEQ ID No.18所示的序列；
(7)SEQ ID No.19所示的序列；
(8)SEQ ID No.20所示的序列；
(9)SEQ ID No.21所示的序列；
(10)SEQ ID No.22所示的序列；
(11)SEQ ID No.23所示的序列；
(12)SEQ ID No.24所示的序列；
(13)SEQ ID No.25所示的序列；
(14)SEQ ID No.26所示的序列；
(15)SEQ ID No.27所示的序列；
(16)SEQ ID No.28所示的序列；
(17)SEQ ID No.29所示的序列；
(18)SEQ ID No.30所示的序列；
(19)SEQ ID No.31所示的序列；
(20)SEQ ID No.32所示的序列；
所述基因为rpoB基因、katG基因、inhA基因、rpsL基因、embB基因、gyrA基因和/或rrs基因。
所述基因为rpoB基因、katG基因、inhA基因、rpsL基因、embB基因、gyrA基因和/或rrs基因。
上述任一所述的探针中，所述rpoB基因为耐利福平的基因；
所述katG或inhA基因为耐异烟肼的基因；
所述rpsL基因为耐链霉素的基因；
所述embB基因为耐乙胺丁醇的基因；
所述gyrA基因为耐氟喹诺酮类的基因；
所述rrs基因为耐卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素基因；
所述突变为所述rpoB基因的rpoB 526CAC→GAC、rpoB 526CAC→TAC、rpoB531TCG→TGG、rpoB 516GAC→GTC、rpoB 511CTG→CCG、rpoB 526CAC→CTC、rpoB533CTG→CCG和/或rpoB 526CAC→CGC突变；
和/或，所述突变为所述katG基因的katG 315AGC→AAC和/或katG 315AGC→ACC突变；
和/或，所述突变为所述inhA基因的inhA-15C→A突变；
和/或，所述突变为所述rpsL基因的rpsL 88AAG→AGG和/或rpsL 43AAG→AGG突变；
和/或，所述突变为所述embB基因的embB 306ATG→ATA和/或embB 306ATG→GTG突变；
和/或，所述突变为所述gyrA基因的gyrA 90GCG→GTG和/或gyrA 94GAC→GGC突变；
和/或，所述突变为所述rrs基因的rrs 1401A→G、rrs 1402C→T和/或rrs1484G→T突变；
所述突变除inhA-15C→A、rrs 1401A→G、rrs 1402C→T、rrs 1484G→T突变外均是从左到右依次由基因名称、突变所在的氨基酸位点、发生碱基突变的氨基酸的密码子变化组成，比如rpoB 526CAC→GAC表示rpoB基因编码的蛋白自N端起第526位氨基酸的密码子发生CAC→GAC的突变；
所述inhA-15C→A表示inhA基因第-15位碱基发生C→A的突变，所述第-15位是以起始密码子为第0位，在其上游的第15位；
所述检测rrs基因的突变探针中，名称中的数字代表发生突变的碱基的位置，随后的碱基表示碱基的突变情况，如rrs 1401A→G表示rrs基因的自5’末端起第1401位碱基发生了A→G的突变；
所述探针的序列为SEQ ID No.13所示的序列、SEQ ID No.14所示的序列、SEQ IDNo.15所示的序列、SEQ ID No.16所示的序列、SEQ ID No.17所示的序列、SEQ ID No.18所示的序列、SEQ ID No.19所示的序列、SEQ ID No.20所示的序列时，该探针为检测结核分枝杆菌rpoB基因的耐药性突变位点的探针；
所述探针的序列为SEQ ID No.13所示的序列的探针为检测rpoB基因编码的蛋白自N端起第526位氨基酸的密码子是否存在CAC→GAC突变的探针；
所述探针的序列为SEQ ID No.14所示的序列的探针为检测rpoB基因编码的蛋白自N端起第526位氨基酸的密码子是否存在CAC→TAC突变的探针；
所述探针的序列为SEQ ID No.15所示的序列的探针为检测rpoB基因编码的蛋白自N端起第531位氨基酸的密码子是否存在TCG→TGG突变的探针；
所述探针的序列为SEQ ID No.16所示的序列的探针为检测rpoB基因编码的蛋白自N端起第516位氨基酸的密码子是否存在GAC→GTC突变的探针；
所述探针的序列为SEQ ID No.17所示的序列的探针为检测rpoB基因编码的蛋白自N端起第511位氨基酸的密码子是否存在CTG→CCG突变的探针；
所述探针的序列为SEQ ID No.18所示的序列的探针为检测rpoB基因编码的蛋白自N端起第526位氨基酸的密码子是否存在CAC→CTC突变的探针；
所述探针的序列为SEQ ID No.19所示的序列的探针为检测rpoB基因编码的蛋白自N端起第533位氨基酸的密码子是否存在CTG→CCG突变的探针；
所述探针的序列为SEQ ID No.20所示的序列的探针为检测rpoB基因编码的蛋白自N端起第526位氨基酸的密码子是否存在CAC→CGC突变的探针；
所述探针的序列为SEQ ID No.21所示的序列、SEQ ID No.22所示的序列时，该探针为检测结核分枝杆菌katG基因耐药性突变位点的探针；
所述探针的序列为SEQ ID No.21所示的序列的探针为检测katG基因编码的蛋白自N端起第315位氨基酸的密码子是否存在AGC→AAC突变的探针；
所述探针的序列为SEQ ID No.22所示的序列的探针为检测katG基因编码的蛋白自N端起第315位氨基酸的密码子是否存在AGC→ACC突变的探针；
所述探针的序列为SEQ ID No.23所示的序列时，该探针为检测结核分枝杆菌inhA基因耐药性突变位点的探针；
所述探针的序列为SEQ ID No.23所示的序列的探针为检测inhA基因第-15位碱基是否存在C→A突变的探针，第-15位为以起始密码子为第0位，在其上游的第15位；
所述探针的序列为SEQ ID No.24所示的序列、SEQ ID No.25所示的序列时，该探针为检测结核分枝杆菌rpsL基因耐药性突变位点的探针；
所述探针的序列为SEQ ID No.24所示的序列的探针为检测rpsL基因编码的蛋白自N端起第88位氨基酸的密码子是否存在AAG→AGG突变的探针；
所述探针的序列为SEQ ID No.25所示的序列的探针为检测rpsL基因编码的蛋白自N端起第43位氨基酸的密码子是否存在AAG→AGG突变的探针；
所述探针的序列为SEQ ID No.26所示的序列、SEQ ID No.27所示的序列时，该探针为检测结核分枝杆菌embB基因耐药性突变位点的探针；
所述探针的序列为SEQ ID No.26所示的序列的探针为检测embB基因编码的蛋白自N端起第306位氨基酸的密码子是否存在ATG→ATA突变的探针；
所述探针的序列为SEQ ID No.27所示的序列的探针为检测embB基因编码的蛋白自N端起第306位氨基酸的密码子是否存在ATG→GTG突变的探针；
所述探针的序列为SEQ ID No.28所示的序列、SEQ ID No.29所示的序列时，该探针为检测结核分枝杆菌gyrA基因耐药性突变位点的探针；
所述探针的序列为SEQ ID No.28所示的序列的探针为检测gyrA基因编码的蛋白自N端起第90位氨基酸的密码子是否存在GCG→GTG突变的探针；
所述探针的序列为SEQ ID No.29所示的序列的探针为检测gyrA基因编码的蛋白自N端起第94位氨基酸的密码子是否存在GAC→GGC突变的探针；
所述探针的序列为SEQ ID No.30所示的序列、SEQ ID No.31所示的序列、SEQ IDNo.32所示的序列时，该探针为检测结核分枝杆菌rrs基因耐药性突变位点的探针；
所述探针的序列为SEQ ID No.30所示的序列的探针为检测rrs基因自5’末端起第1401位碱基是否存在A→G突变的探针；
所述探针的序列为SEQ ID No.31所示的序列的探针为检测rrs基因自5’末端起第1402位碱基是否存在C→T突变的探针；
所述探针的序列为SEQ ID No.32所示的序列的探针为检测rrs基因自5’末端起第1484位碱基是否存在G→T突变的探针；
上述任一所述的探针中，所述探针由序列为如下(1)-(20)所示序列的探针组成：
(1)SEQ ID No.13所示的序列；
(2)SEQ ID No.14所示的序列；
(3)SEQ ID No.15所示的序列；
(4)SEQ ID No.16所示的序列；
(5)SEQ ID No.17所示的序列；
(6)SEQ ID No.18所示的序列；
(7)SEQ ID No.19所示的序列；
(8)SEQ ID No.20所示的序列；
(9)SEQ ID No.21所示的序列；
(10)SEQ ID No.22所示的序列；
(11)SEQ ID No.23所示的序列；
(12)SEQ ID No.24所示的序列；
(13)SEQ ID No.25所示的序列；
(14)SEQ ID No.26所示的序列；
(15)SEQ ID No.27所示的序列；
(16)SEQ ID No.28所示的序列；
(17)SEQ ID No.29所示的序列；
(18)SEQ ID No.30所示的序列；
(19)SEQ ID No.31所示的序列；
(20)SEQ ID No.32所示的序列。
上述任一所述的探针中，所述探针为TaqMan MGB探针；
所述探针的序列为SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.20、SEQ ID No.15所示的序列的探针与所述探针的序列为SEQ ID No.21、SEQ ID No.22所示的序列的探针所带有的荧光报告基团不为同一种；
所述探针的序列为SEQ ID No.17、SEQ ID No.19、SEQ ID No.18、SEQ ID No.13所示的序列的探针与所述探针的序列为SEQ ID No.23所示的序列的探针所带有的荧光报告基团不为同一种；
所述探针的序列为SEQ ID No.27、SEQ ID No.26所示的序列的探针与所述探针的序列为SEQ ID No.28、SEQ ID No.29所示的序列的探针所带有的荧光报告基团不为同一种。
上述任一所述的探针中，所述荧光报告基团为FAM或VIC；
所述探针的所述3'端按照5'-3'方向依次带有所述非荧光淬灭基团及小沟结合物；
所述探针的所述非荧光淬灭基团均为BHQ1。
一种检测或辅助检测样品中结核分枝杆菌的基因是否发生耐药性突变的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒包含上述任一所述的探针；
所述基因为rpoB基因、katG基因、inhA基因、rpsL基因、embB基因、gyrA基因和/或rrs基因；
所述rpoB基因为耐利福平的基因；
所述katG或inhA基因为耐异烟肼的基因；
所述rpsL基因为耐链霉素的基因；
所述embB基因为耐乙胺丁醇的基因；
所述gyrA基因为耐氟喹诺酮类的基因；
所述rrs基因为耐卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素基因；
所述突变为所述rpoB基因的rpoB 526CAC→GAC、rpoB 526CAC→TAC、rpoB531TCG→TGG、rpoB 516GAC→GTC、rpoB 511CTG→CCG、rpoB 526CAC→CTC、rpoB533CTG→CCG和/或rpoB 526CAC→CGC突变；
和/或，所述突变为所述katG基因的katG 315AGC→AAC和/或katG 315AGC→ACC突变；
和/或，所述突变为所述inhA基因的inhA-15C→A突变；
和/或，所述突变为所述rpsL基因的rpsL 88AAG→AGG和/或rpsL 43AAG→AGG突变；
和/或，所述突变为所述embB基因的embB 306ATG→ATA和/或embB 306ATG→GTG突变；
和/或，所述突变为所述gyrA基因的gyrA 90GCG→GTG和/或gyrA 94GAC→GGC突变；
和/或，所述突变为所述rrs基因的rrs 1401A→G、rrs 1402C→T和/或rrs1484G→T突变；
所述突变除inhA-15C→A、rrs 1401A→G、rrs 1402C→T、rrs 1484G→T突变外均是从左到右依次由基因名称、突变所在的氨基酸位点、发生碱基突变的氨基酸的密码子变化组成，比如rpoB 526CAC→GAC表示rpoB基因编码的蛋白自N端起第526位氨基酸的密码子发生CAC→GAC的突变；
所述inhA-15C→A表示inhA基因第-15位碱基发生C→A的突变，所述第-15位是以起始密码子为第0位，在其上游的第15位；
所述检测rrs基因的突变探针中，名称中的数字代表发生突变的碱基的位置，随后的碱基表示碱基的突变情况，如rrs 1401A→G表示rrs基因的自5’末端起第1401位碱基发生了A→G的突变。
上述试剂盒中，所述试剂盒还包含如下(1)-(7)所示的引物对：
(1)SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子组成的引物对；
(2)SEQ ID No.3所示的DNA分子和SEQ ID No.4所示的DNA分子组成的引物对；
(3)SEQ ID No.5所示的DNA分子和SEQ ID No.6所示的DNA分子组成的引物对；
(4)SEQ ID No.7所示的DNA分子和SEQ ID No.8所示的DNA分子组成的引物对；
(5)SEQ ID No.9所示的DNA分子和SEQ ID No.10所示的DNA分子组成的引物对；
(6)SEQ ID No.11所示的DNA分子和SEQ ID No.12所示的DNA分子组成的引物对；
(7)SEQ ID No.33所示的DNA分子和SEQ ID No.34所示的DNA分子组成的引物对；
所述SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子组成的引物对为扩增所述rpoB基因片段的引物对；
所述SEQ ID No.3所示的DNA分子和SEQ ID No.4所示的DNA分子组成的引物对为扩增所述katG基因片段的引物对；
所述SEQ ID No.5所示的DNA分子和SEQ ID No.6所示的DNA分子组成的引物对为扩增所述inhA基因片段的引物对；
所述SEQ ID No.7所示的DNA分子和SEQ ID No.8所示的DNA分子组成的引物对为扩增所述rpsL基因片段的引物对；
所述SEQ ID No.9所示的DNA分子和SEQ ID No.10所示的DNA分子组成的引物对为扩增所述embB基因片段的引物对；
所述SEQ ID No.11所示的DNA分子和SEQ ID No.12所示的DNA分子组成的引物对为扩增所述gyrA基因片段的引物对；
所述SEQ ID No.33所示的DNA分子和SEQ ID No.34所示的DNA分子组成的引物对为扩增所述rrs基因片段的引物对。
一种检测或辅助检测样品中结核分枝杆菌是否发生耐药性突变的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：
(1)同时建立如下实时荧光定量PCR体系：
实时荧光定量PCR反应体系1：是以样品的基因组DNA为模板，以SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示的DNA分子为引物，以具有SEQ IDNo.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.20、SEQ ID No.15、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22所示的序列的探针为探针；所述序列为SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.20、SEQ ID No.15所示的序列的探针其5’端带有A种荧光报告基团，所述序列为SEQ ID No.22、SEQ ID No.21所示的序列的探针其5’端带有B种荧光报告基团；
实时荧光定量PCR反应体系2：是以样品的基因组DNA为模板，以SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示的DNA分子为引物，以序列为SEQ IDNo.17、SEQ ID No.19、SEQ ID No.18、SEQ ID No.13、SEQ ID No.23所示的序列的探针为探针；所述序列为SEQ ID No.17、SEQ ID No.19、SEQ ID No.18、SEQID No.13所示的序列的探针其5’端带有C种荧光报告基团，所述序列为SEQ ID No.23所示的序列的探针其5’端带有D种荧光报告基团；
实时荧光定量PCR反应体系3：是以样品的基因组DNA为模板，以SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12所示的DNA分子为引物，以序列为SEQID No.27、SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29所示的序列的探针为探针；所述序列为SEQ ID No.28、SEQ ID No.29所示的序列的探针其5’端带有E种荧光报告基团，所述序列为SEQ ID No.27、SEQ ID No.26所示的序列的探针其5’端带有F种荧光报告基团；
实时荧光定量PCR反应体系4：是以样品的基因组DNA为模板，以SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示的DNA分子为引物，以序列为SEQ ID No.25、SEQ ID No.24所示的序列的探针为探针；所述序列为SEQ ID No.25、SEQ ID No.24所示的序列的探针其5’端带有G种荧光报告基团；
实时荧光定量PCR反应体系5：是以样品的基因组DNA为模板，以SEQ ID No.33、SEQ ID No.34所示的DNA分子为引物，以序列为SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQID No.32所示的序列的探针为探针；所述序列为SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32所示的序列的探针其5’端带有H种荧光报告基团；
所述探针的3’端带有非荧光淬灭基团及小沟结合物；
所述实时荧光定量PCR反应体系1检测rpoB和katG基因的突变；
所述实时荧光定量PCR反应体系2检测rpoB和inhA基因的突变；
所述实时荧光定量PCR反应体系3检测embB和gyrA基因的突变；
所述实时荧光定量PCR反应体系4检测rpsL基因的突变；
所述实时荧光定量PCR反应体系5检测rrs基因的突变；
(2)将(1)所述的实时荧光定量PCR反应体系1-5分别进行实时荧光定量PCR扩增，得到各个体系的扩增曲线，分别为曲线1-5；
(3)如果曲线1中有A种荧光报告基团的荧光扩增曲线，且Ct值小于40，则样品中结核分枝杆菌的rpoB基因存在点突变，如果曲线1中有B种荧光报告基团的荧光扩增曲线，且Ct值小于40，则样品中结核分枝杆菌的katG基因存在点突变；
如果曲线2中有C种荧光报告基团的荧光扩增曲线，且Ct值小于40，则样品中结核分枝杆菌的rpoB基因存在点突变，如果曲线2中有D种荧光报告基团的荧光扩增曲线，且Ct值小于40，则样品中结核分枝杆菌的inhA基因存在点突变；
如果曲线3中有E种荧光报告基团的荧光扩增曲线，且Ct值小于40，则样品中结核分枝杆菌的gyrA基因存在点突变，如果曲线3中有F种荧光报告基团的荧光扩增曲线，且Ct值小于40，则样品中结核分枝杆菌的embB基因存在点突变；
如果曲线4中有荧光报告基团的荧光扩增曲线，且Ct值小于40，则样品中结核分枝杆菌的rpsL基因存在点突变；
如果曲线5中有荧光报告基团的荧光扩增曲线，且Ct值小于40，则样品中结核分枝杆菌的rrs基因存在点突变；
所述A、C、E、G、H种荧光报告基团可以为同一种荧光报告基团，具体为FAM；
所述B、D、F种荧光报告基团可以为同一种荧光报告基团，具体为VIC；
所述序列为SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32所示的序列的探针其5’端带有的荧光报告基团具体为FAM。
上述方法中，所述探针的所述3'端按照5'-3'方向依次带有所述非荧光淬灭基团及小沟结合物；
所述探针的所述非荧光淬灭基团均为BHQ1。
上述任一所述的方法中，所述实时荧光定量PCR反应体系还含有实时荧光定量PCR扩增缓冲液、荧光染料、dNTP/dUTP混合物，DNA聚合酶，尿嘧啶DNA糖基酶；
所述实时荧光定量PCR扩增的程序如下：50℃2min；95℃10min；95℃15sec，63℃1min，40个循环；
所述63℃1min为荧光采集步骤。
上述任一所述的探针、上述任一所述的试剂盒在制备检测或辅助检测样品中结核分枝杆菌的基因是否发生耐药性突变的产品中的应用也属于本发明的保护范围；
所述耐药基因为rpoB基因、katG基因、inhA基因、rpsL基因、embB基因、gyrA基因和/或rrs基因；
所述rpoB基因为耐利福平的基因；
所述katG或inhA基因为耐异烟肼的基因；
所述rpsL基因为耐链霉素的基因；
所述embB基因为耐乙胺丁醇的基因；
所述gyrA基因为耐氟喹诺酮类的基因；
所述rrs基因为耐卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素的基因；
所述突变为所述rpoB基因的rpoB 526CAC→GAC、rpoB 526CAC→TAC、rpoB531TCG→TGG、rpoB 516GAC→GTC、rpoB 511CTG→CCG、rpoB 526CAC→CTC、rpoB533CTG→CCG和/或rpoB 526CAC→CGC突变；
和/或，所述突变为所述katG基因的katG 315AGC→AAC和/或katG 315AGC→ACC突变；
和/或，所述突变为所述inhA基因的inhA-15C→A突变；
和/或，所述突变为所述rpsL基因的rpsL 88AAG→AGG和/或rpsL 43AAG→AGG突变；
和/或，所述突变为所述embB基因的embB 306ATG→ATA和/或embB 306ATG→GTG突变；
和/或，所述突变为所述gyrA基因的gyrA 90GCG→GTG和/或gyrA 94GAC→GGC突变；
和/或，所述突变为所述rrs基因的rrs 1401A→G、rrs 1402C→T和/或rrs1484G→T突变；
所述突变除inhA-15C→A、rrs 1401A→G、rrs 1402C→T、rrs 1484G→T突变外均是从左到右依次由基因名称、突变所在的氨基酸位点、发生碱基突变的氨基酸的密码子变化组成，比如rpoB 526CAC→GAC表示rpoB基因编码的蛋白自N端起第526位氨基酸的密码子发生CAC→GAC的突变；
所述inhA-15C→A表示inhA基因第-15位碱基发生C→A的突变，所述第-15位是以起始密码子为第0位，在其上游的第15位；
所述检测rrs基因的突变探针中，名称中的数字代表发生突变的碱基的位置，随后的碱基表示碱基的突变情况，如rrs 1401A→G表示rrs基因的自5’末端起第1401位碱基发生了A→G的突变。
本发明通过高效灵敏的多重实时荧光PCR技术，在较短的时间内检测待测样品中结核分枝杆菌的七个耐药基因的突变情况，结果灵敏度高、特异性较好，分析过程简便。利用本发明提供的引物、探针以及检测方法，从样本的处理到判读检测结果仅需2个小时左右时间，适用于临床标本的快速检测和大样本的普查。
附图说明
图1为体系1中加入的模板为含有rpoB 526CAC→TAC或rpoB 516GAC→GTC或rpoB 526CAC→CGC或rpoB 531TCG→TGG或katG 315AGC→AAC或katG 315AGC→ACC突变型基因组DNA的实时荧光定量PCR结果。
图2为体系2中加入的模板为含有rpoB 511CTG→CCG或rpoB 526CAC→CTC或rpoB 526CAC→GAC或rpoB 533CTG→CCG或inhA-15C→A突变型基因组DNA的实时荧光定量PCR结果。
图3为体系3中加入的模板为含有embB 306ATG→ATA或embB 306ATG→GTG或gyrA90GCG→GTG或gyrA 94GAC→GGC突变型基因组DNA的实时荧光定量PCR结果。
图4为体系4中加入的模板为含有rpsL 43AAG→AGG或rpsL 88AAG→AGG突变型基因组DNA的实时荧光定量PCR结果。
图5为体系5中加入的模板为含有rrs 1401A→G或rrs 1402C→T或rrs 1484G→T突变型基因组DNA的实时荧光定量PCR结果。
图6为加入H37RV基因组DNA的各个体系的实时荧光定量PCR结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
含有rpoB 511CTG→CCG或rpoB 533CTG→CCG或rpoB 516GAC→GTC或rpoB526CAC→CTC或rpoB 526CAC→CGC或rpoB 526CAC→TAC或rpoB 526CAC→GAC或rpoB531TCG→TGG或katG 315AGC→AAC或katG 315AGC→ACC或inhA-15C→A或rpsL43AAG→AGG或rpsL 88AAG→AGG或embB306ATG→ATA或embB306ATG→GTG或gyrA90GCG→GTG或gyrA94GAC→GGC或rrs 1401A→G或rrs 1402C→T或rrs 1484G→T突变位点基因组DNA或H37RV基因组DNA是从中国疾病预防控制中心提供的临床菌株中提取得到的。
5×ColorlessFlexi Buffer购自Promega，货号为M500X。
Rox reference dye(50×)购自英潍捷基(上海)贸易有限公司，货号为12223012。
dNTP/dUTP mixture购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号为DB2236。
Hot Start Polymerase购自Promega，货号为M500X。
Magnesium Chloride Solution购自Promega，货号为M500X。
Uracil-DNA Glycosylase购自Thermofisher Scientific，货号为EN0362。
下述实施例中的探针的非荧光淬灭基团具体为BHQ1。
实施例1、检测结核分枝杆菌耐药基因突变的引物和探针
一、引物设计与合成
所要检测的结核分枝杆菌耐药基因为：耐利福平(rpoB)、耐异烟肼(katG和/或inhA)、耐链霉素(rpsL)、耐乙胺丁醇(embB)和耐氟喹诺酮类(gyrA)基因。
为了有效的扩增样品中的目的基因，从NCBI数据库中调取结核分枝杆菌H37RV基因组序列，针对GenBank Accession Number为NC_000962第759807-763325位核苷酸的rpoB基因/GenBank Accession Number为NC_000962第2153889-2156111位核苷酸的katG基因/GenBank Accession Number为NC_000962第1674202-1675011位核苷酸的inhA基因/GenBank Accession Number为NC_000962第781560-781934位核苷酸的rpsL基因/GenBank Accession Number为NC_000962第4246514-4249810位核苷酸的embB基因/GenBank Accession Number为NC_000962第7302-9818位核苷酸的gyrA基因/GenBank Accession Number为NC_000962第1471846-1473382位核苷酸的rrs基因的突变区域，根据引物设计原则，设计并合成实时荧光PCR所需要的正反向引物。
引物序列如表1所示。
表1 各个基因的正反向引物
(表1中，采用各对引物PCR扩增得到的片段均是对应基因的一个片段)
二、探针的合成与标记
针对rpoB基因/katG基因/inhA基因/rpsL基因/embB基因/gyrA基因/rrs基因的与耐药相关的高频突变位点进行探针设计，根据Taqman-MGB探针的设计原则进行设计，探针合成时5′端根据耐药种类不同标记不同荧光报告基团，3′端按照5'-3'方向依次标记非荧光淬灭基团及小沟结合物(MGB，minor groove binder)。
探针序列如表2所示。
表2 探针序列
(表2中，inhA-15C→A表示inhA基因起始密码子的上游第15位碱基发生C→A的突变，以起始密码子为第0位。rrs基因的突变探针中，名称中的数字代表发生突变的碱基的位置，随后的碱基表示碱基的突变情况，如rrs 1401A→G表示rrs基因的自5’末端起第1401位碱基发生了A→G的突变。其余突变探针中，名称中的数字代表对应氨基酸在基因编码的氨基酸序列的自N端起的位数，随后的密码子表示编码该氨基酸的密码子的突变情况，如rpoB 526CAC→GAC表示rpoB基因编码的蛋白自N末端起第526位的氨基酸的密码子由CAC突变为GAC。)
实施例2、实时荧光定量PCR检测结核分枝杆菌耐药基因多突变位点
一、PCR扩增所用模板为含有rpoB 511CTG→CCG或rpoB 533CTG→CCG或rpoB516GAC→GTC或rpoB 526CAC→CTC或rpoB 526CAC→CGC或rpoB 526CAC→TAC或rpoB526CAC→GAC或rpoB 531TCG→TGG或katG 315AGC→AAC或katG 315AGC→ACC或inhA-15C→A或rpsL 43AAG→AGG或rpsL 88AAG→AGG或embB 306ATG→ATA或embB306ATG→GTG或gyrA 90GCG→GTG或gyrA 94GAC→GGC或rrs 1401A→G或rrs 1402C→T或rrs 1484G→T突变位点基因组DNA(即突变型基因组)或H37RV基因组DNA(即野生型基因组)。
上述突变型基因组和野生型基因组均经核酸测序，测序结果证实，用作模板的上述突变型基因组和野生型基因组为含有目标突变碱基或野生型基因组的DNA。
二、实时荧光定量PCR扩增
(一)PCR反应体系由5个子反应体系组成，5个子反应体系除了模板、引物和探针不同外其他试剂均相同。
1、体系1检测rpoB和katG基因的突变，涉及的上下游引物分别为：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4，涉及的突变探针的序列分别为：SEQID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.20、SEQ ID No.15、SEQ ID No.22、SEQ IDNo.21；
序列为SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.20、SEQ ID No.15的探针5’端带有荧光报告基团FAM，3’端按照5'-3'方向依次带有非荧光淬灭基团NFQ及小沟结合物MGB。
序列为SEQ ID No.21、SEQ ID No.22的探针5’端带有荧光报告基团VIC，3’端按照5'-3'方向依次带有非荧光淬灭基团NFQ及小沟结合物MGB。
体系1加入模板为含有rpoB 526CAC→TAC或rpoB 516GAC→GTC或rpoB 526CAC→CGC或rpoB 531TCG→TGG或katG 315AGC→AAC或katG 315AGC→ACC突变型基因组DNA。
突变型基因组DNA的浓度均为100copies/μL。
2、体系2检测rpoB和inhA基因的突变，涉及的上下游引物分别为：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6，涉及的突变探针的序列分别为：SEQID No.17、SEQ ID No.19、SEQ ID No.18、SEQ ID No.13、SEQ ID No.23；
序列为SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.13的探针5’端带有荧光报告基团FAM，3’端按照5'-3'方向依次带有非荧光淬灭基团NFQ及小沟结合物MGB。
序列为SEQ ID No.23的探针5’端带有荧光报告基团VIC，3’端按照5'-3'方向依次带有非荧光淬灭基团NFQ及小沟结合物MGB。
体系2加入模板为含有rpoB 511CTG→CCG或rpoB 526CAC→CTC或rpoB533CTG→CCG或rpoB 526CAC→GAC或inhA-15C→A突变型基因组DNA。
突变型基因组DNA的浓度均为100copies/μL。
3、体系3检测embB和gyrA基因的突变，涉及的上下游引物分别为：SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12，涉及的突变探针的序列分别为：SEQ ID No.27、SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29；
序列为SEQ ID No.28、SEQ ID No.29的探针5’端带有荧光报告基团FAM，3'端按照5'-3'方向依次带有非荧光淬灭基团NFQ及小沟结合物MGB。
序列为SEQ ID No.26、SEQ ID No.27的探针5’端带有荧光报告基团VIC，3'端按照5'-3'方向依次带有非荧光淬灭基团NFQ及小沟结合物MGB。
体系3加入模板为含有embB 306ATG→ATA或embB 306ATG→GTG或gyrA90GCG→GTG或gyrA 94GAC→GGC突变型基因组DNA。
突变型基因组DNA的浓度均为100copies/μL。
4、体系4检测rpsL基因的突变，涉及的上下游引物分别为：SEQ ID No.7、SEQID No.8，涉及的突变探针的序列分别为：SEQ ID No.25、SEQ ID No.24；
序列为SEQ ID No.25、SEQ ID No.24的探针5’端带有荧光报告基团FAM，3'端按照5'-3'方向依次带有非荧光淬灭基团NFQ及小沟结合物MGB。
体系4加入模板为含有rpsL 88AAG→AGG或rpsL 43AAG→AGG突变型基因组DNA。
突变型基因组DNA的浓度均为100copies/μL。
5、体系5检测rrs基因的突变，涉及的上下游引物分别为：SEQ ID No.33、SEQ IDNo.34，涉及的突变探针的序列分别为：SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32；
序列为SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32的探针5’端带有荧光报告基团FAM，3'端按照5'-3'方向依次带有非荧光淬灭基团NFQ及小沟结合物MGB。
体系5加入模板为含有rrs 1401A→G或rrs 1402C→T或rrs 1484G→T突变型基因组DNA。
突变型基因组DNA的浓度均为100copies/μL
上述各体系中各引物和探针在PCR反应体系中的终浓度均为0.1μM。
(二)PCR反应体系
5×ColorlessFlexi Buffer 6μL，Rox reference dye(50×)0.3μL，dNTP/dUTP mixture终浓度为0.2μM，Hot Start Polymerase终浓度为0.05U/μL，Magnesium Chloride Solution终浓度为0.2μM，Uracil-DNA Glycosylase终浓度为0.0025U/μL，模板5μL，引物、探针、ddH2O补足体系至30μL。
(三)5个反应体系均在ABI7500荧光定量PCR仪上进行。
PCR反应程序如下：
50℃2min；95℃10min；95℃15sec，63℃1min，40个循环。其中63℃1min为荧光采集步骤。
三、检测结果分析
(一)判断标准
体系1：如出现FAM扩增曲线，且Ct值小于40，则说明模板DNA中rpoB基因存在点突变，如出现VIC扩增曲线，且Ct值小于40，则说明模板DNA中katG基因存在点突变。
体系2：如出现FAM扩增曲线，且Ct值小于40，则说明模板DNA中rpoB基因存在点突变，如出现VIC扩增曲线，且Ct值小于40，则说明模板DNA中inhA基因存在点突变。
体系3：如出现FAM扩增曲线，且Ct值小于40，则说明模板DNA中gyrA基因存在点突变，如出现VIC扩增曲线，且Ct值小于40，则说明模板DNA中embB基因存在点突变。
体系4：如出现FAM扩增曲线，且Ct值小于40，说明结核分枝杆菌的rpsL基因存在点突变。
体系5：如出现FAM扩增曲线，且Ct值小于40，则说明模板DNA中rrs基因存在点突变。
(二)实时荧光定量PCR结果如下：
1、体系1加入含有rpoB 526CAC→TAC或rpoB 516GAC→GTC或rpoB 526CAC→CGC或rpoB 531TCG→TGG突变型基因组DNA作为模板，PCR结果出现FAM荧光扩增信号，加入含有katG 315AGC→AAC或katG 315AGC→ACC突变型基因组DNA作为模板，PCR结果出现VIC荧光扩增信号，且Ct值均小于40，结果如图1所示；
2、体系2加入含有rpoB 511CTG→CCG或rpoB 526CAC→CTC或rpoB 526CAC→GAC或rpoB 533CTG→CCG突变型基因组DNA作为模板，PCR结果出现FAM荧光扩增信号，加入含有inhA-15C→A突变型基因组DNA作为模板，PCR结果出现VIC荧光扩增信号，且Ct值均小于40，结果如图2所示；
3、体系3加入含有gyrA 90GCG→GTG或gyrA 94GAC→GGC突变型基因组DNA作为模板，PCR结果出现FAM荧光扩增信号，加入含有embB 306ATG→ATA或embB 306ATG→GTG突变型基因组DNA作为模板，PCR结果出现VIC荧光扩增信号，且Ct值均小于40，结果如图3所示；
4、体系4加入含有rpsL 88AAG→AGG或rpsL 43AAG→AGG突变基因组DNA作为模板，PCR结果出现FAM荧光扩增信号，且Ct值均小于40，结果如图4所示；
5、体系5加入为含有rrs 1401A→G或rrs 1402C→T或rrs 1484G→T突变基因组DNA作为模板，PCR结果出现FAM荧光扩增信号，且Ct值均小于40，结果如图5所示；
在体系1、2、3、4、5中分别加入H37RV基因组作为模板(H37RV基因组DNA浓度为102-108copies/μL)，进行上述实验，PCR结果无FAM和VIC荧光扩增信号，结果均如图6所示。
实验结果表明，利用本发明的方法可在同一个反应条件和多个反应体系下同时完成对结核分枝杆菌耐药基因多突变位点的检测，结果可读性好，分析、检测过程简单、高效。

Claims (9)

1.一组检测或辅助检测样品中结核分枝杆菌的基因是否发生耐药性突变的探针，该组探针包含序列为如下(1)-(20)任意所示序列的探针中的至少一个：
(1)SEQ ID No.13所示的序列；
(2)SEQ ID No.14所示的序列；
(3)SEQ ID No.15所示的序列；
(4)SEQ ID No.16所示的序列；
(5)SEQ ID No.17所示的序列；
(6)SEQ ID No.18所示的序列；
(7)SEQ ID No.19所示的序列；
(8)SEQ ID No.20所示的序列；
(9)SEQ ID No.21所示的序列；
(10)SEQ ID No.22所示的序列；
(11)SEQ ID No.23所示的序列；
(12)SEQ ID No.24所示的序列；
(13)SEQ ID No.25所示的序列；
(14)SEQ ID No.26所示的序列；
(15)SEQ ID No.27所示的序列；
(16)SEQ ID No.28所示的序列；
(17)SEQ ID No.29所示的序列；
(18)SEQ ID No.30所示的序列；
(19)SEQ ID No.31所示的序列；
(20)SEQ ID No.32所示的序列；
所述基因为rpoB基因、katG基因、inhA基因、rpsL基因、embB基因、gyrA基因和/或rrs基因。
2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于：所述探针由序列为如下(1)-(20)所示序列的探针组成：
(1)SEQ ID No.13所示的序列；
(2)SEQ ID No.14所示的序列；
(3)SEQ ID No.15所示的序列；
(4)SEQ ID No.16所示的序列；
(5)SEQ ID No.17所示的序列；
(6)SEQ ID No.18所示的序列；
(7)SEQ ID No.19所示的序列；
(8)SEQ ID No.20所示的序列；
(9)SEQ ID No.21所示的序列；
(10)SEQ ID No.22所示的序列；
(11)SEQ ID No.23所示的序列；
(12)SEQ ID No.24所示的序列；
(13)SEQ ID No.25所示的序列；
(14)SEQ ID No.26所示的序列；
(15)SEQ ID No.27所示的序列；
(16)SEQ ID No.28所示的序列；
(17)SEQ ID No.29所示的序列；
(18)SEQ ID No.30所示的序列；
(19)SEQ ID No.31所示的序列；
(20)SEQ ID No.32所示的序列。
3.根据权利要求1或2所述的探针，其特征在于：所述探针为TaqMan MGB探针；
所述探针的5’端带有荧光报告基团，3’端带有非荧光淬灭基团及小沟结合物；
所述探针的序列为SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.20、SEQ ID No.15所示的序列的探针与所述探针的序列为SEQ ID No.21、SEQ ID No.22所示的序列的探针所带有的荧光报告基团不为同一种；
所述探针的序列为SEQ ID No.17、SEQ ID No.19、SEQ ID No.18、SEQ ID No.13所示的序列的探针与所述探针的序列为SEQ ID No.23所示的序列的探针所带有的荧光报告基团不为同一种；
所述探针的序列为SEQ ID No.27、SEQ ID No.26所示的序列的探针与所述探针的序列为SEQ ID No.28、SEQ ID No.29所示的序列的探针所带有的荧光报告基团不为同一种。
4.根据权利要求1-3任一所述的探针，其特征在于：所述荧光报告基团为FAM或VIC；
所述探针的所述3'端按照5'-3'方向依次带有所述非荧光淬灭基团及小沟结合物；
所述探针的所述非荧光淬灭基团均为BHQ1。
5.一种检测或辅助检测样品中结核分枝杆菌的基因是否发生耐药性突变的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1-4任一所述的探针；
所述基因为rpoB基因、katG基因、inhA基因、rpsL基因、embB基因、gyrA基因和/或rrs基因。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含如下(1)-(7)所示的引物对：
(1)SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子组成的引物对；
(2)SEQ ID No.3所示的DNA分子和SEQ ID No.4所示的DNA分子组成的引物对；
(3)SEQ ID No.5所示的DNA分子和SEQ ID No.6所示的DNA分子组成的引物对；
(4)SEQ ID No.7所示的DNA分子和SEQ ID No.8所示的DNA分子组成的引物对；
(5)SEQ ID No.9所示的DNA分子和SEQ ID No.10所示的DNA分子组成的引物对；
(6)SEQ ID No.11所示的DNA分子和SEQ ID No.12所示的DNA分子组成的引物对；
(7)SEQ ID No.33所示的DNA分子和SEQ ID No.34所示的DNA分子组成的引物对。
7.一种检测或辅助检测样品结核分枝杆菌的基因是否发生耐药性突变的方法，包括如下步骤：
(1)同时建立如下实时荧光定量PCR体系：
实时荧光定量PCR反应体系1：是以样品的基因组DNA为模板，以SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示的DNA分子为引物，以具有SEQ IDNo.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.20、SEQ ID No.15、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22所示的序列的探针为探针；所述序列为SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.20、SEQ ID No.15所示的序列的探针其5’端带有A种荧光报告基团，所述序列为SEQ ID No.22、SEQ ID No.21所示的序列的探针其5’端带有B种荧光报告基团；
实时荧光定量PCR反应体系2：是以样品的基因组DNA为模板，以SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示的DNA分子为引物，以序列为SEQ IDNo.17、SEQ ID No.19、SEQ ID No.18、SEQ ID No.13、SEQ ID No.23所示的序列的探针为探针；所述序列为SEQ ID No.17、SEQ ID No.19、SEQ ID No.18、SEQID No.13所示的序列的探针其5’端带有C种荧光报告基团，所述序列为SEQ ID No.23所示的序列的探针其5’端带有D种荧光报告基团；
实时荧光定量PCR反应体系3：是以样品的基因组DNA为模板，以SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12所示的DNA分子为引物，以序列为SEQID No.27、SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29所示的序列的探针为探针；所述序列为SEQ ID No.28、SEQ ID No.29所示的序列的探针其5’端带有E种荧光报告基团，所述序列为SEQ ID No.27、SEQ ID No.26所示的序列的探针其5’端带有F种荧光报告基团；
实时荧光定量PCR反应体系4：是以样品的基因组DNA为模板，以SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示的DNA分子为引物，以序列为SEQ ID No.25、SEQ ID No.24所示的序列的探针为探针；所述序列为SEQ ID No.25、SEQ ID No.24所示的序列的探针其5’端带有G种荧光报告基团；
实时荧光定量PCR反应体系5：是以样品的基因组DNA为模板，以SEQ ID No.33、SEQ ID No.34所示的DNA分子为引物，以序列为SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32所示的序列的探针为探针，所述序列为SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32所示的序列的探针其5’端带有荧光报告基团；
所述探针的3’端带有非荧光淬灭基团及小沟结合物；
所述实时荧光定量PCR反应体系1检测rpoB和katG基因的突变；
所述实时荧光定量PCR反应体系2检测rpoB和inhA基因的突变；
所述实时荧光定量PCR反应体系3检测embB和gyrA基因的突变；
所述实时荧光定量PCR反应体系4检测rpsL基因的突变；
所述实时荧光定量PCR反应体系5检测rrs基因的突变；
(2)将(1)所述的实时荧光定量PCR反应体系1-5分别进行实时荧光定量PCR扩增，得到各个体系的扩增曲线，分别为曲线1-5；
(3)如果曲线1中有A种荧光报告基团的荧光扩增曲线，且Ct值小于40，则样品中结核分枝杆菌的rpoB基因存在点突变，如果曲线1中有B种荧光报告基团的荧光扩增曲线，且Ct值小于40，则样品中结核分枝杆菌的katG基因存在点突变；
如果曲线2中有C种荧光报告基团的荧光扩增曲线，且Ct值小于40，则样品中结核分枝杆菌的rpoB基因存在点突变，如果曲线2中有D种荧光报告基团的荧光扩增曲线，且Ct值小于40，则样品中结核分枝杆菌的inhA基因存在点突变；
如果曲线3中有E种荧光报告基团的荧光扩增曲线，且Ct值小于40，则样品中结核分枝杆菌的gyrA基因存在点突变，如果曲线3中有F种荧光报告基团的荧光扩增曲线，且Ct值小于40，则样品中结核分枝杆菌的embB基因存在点突变；
如果曲线4中有G种荧光报告基团的荧光扩增曲线，且Ct值小于40，则样品中结核分枝杆菌的rpsL基因存在点突变；
如果曲线5中有H种荧光报告基团的荧光扩增曲线，且Ct值小于40，则样品中结核分枝杆菌的rrs基因存在点突变；
所述A、C、E、G、H种荧光报告基团可以为同一种荧光报告基团，具体为FAM；
所述B、D、F种荧光报告基团可以为同一种荧光报告基团，具体为VIC；
所述序列为SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32所示的序列的探针其5’端带有的荧光报告基团具体为FAM。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述探针的所述3'端按照5'-3'方向依次带有所述非荧光淬灭基团及小沟结合物；
所述探针的所述非荧光淬灭基团均为BHQ1。
9.权利要求1-4任一所述的探针、权利要求5或6所述的试剂盒在制备检测或辅助检测样品中结核分枝杆菌的基因是否发生耐药性突变的产品中的应用；
所述耐药基因为rpoB基因、katG基因、inhA基因、rpsL基因、embB基因、gyrA基因和/或rrs基因。
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