CN101285062A - 一种从痰中提取细菌核酸的方法、试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从痰中提取细菌核酸的方法、试剂盒及其应用。本发明采用液化试剂液化痰样品，通过加入固体颗粒裂解细胞，从痰样品中提取核酸。克服了常规方法从痰样品中提取细菌核酸步骤复杂、时间长、操作繁琐以及样品量低的缺点，采用本发明方法从痰中提取核酸样品操作方便、快速、核酸样品量高、成本低，易于实现自动化。本发明的细菌核酸提取方法和试剂盒可以应用于分枝杆菌菌种鉴定和结核分枝杆菌基因位点是野生型还是突变型的检测，结合相应的菌种鉴定芯片和结核分枝杆菌基因位点野生型和突变型检测芯片，能够快速、准确、高通量地实现分枝杆菌菌种鉴定和结核杆菌基因位点野生型和突变型的检测。

Description

一种从痰中提取细菌核酸的方法、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种从痰中提取细菌核酸的方法、试剂盒及其应用。
背景技术
1882年Kock发现结核病的病原菌为结核分枝杆菌，1946年Hinshaw报告首次用链霉素(SM)治疗100例结核病人，开创了结核病诊断、治疗的新时代。经过100多年的努力，人们对结核病的发病、传播、预防、诊断、治疗及预后已有一套完整的经验。在美国及其它工业发达国家，1953年-1985年结核病以每年5.8-10％的速度下降，美国医学界曾一度乐观地认为，可以预防和治疗的结核病将成为美国历史中的一幕，不再成为公共卫生问题，并认为到2000年可以控制结核病的传播，21世纪初即可消灭结核病。
由于人们盲目乐观于结核病即将消灭，转移了结核病控制的注意力和资金；由于医生和病人对结核病认知的片面性，造成滥用药；人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、器官移植、免疫抑制剂的使用等导致免疫损害宿主(ICH)增多；以及高龄人口机体免疫力下降，使结核病的发病率再次回升，成为严重威胁人类健康的公共卫生问题。多种抗结核药物耐药菌株(MDR)的产生与传播，使结核分枝杆菌感染难以控制，再度发展为难治倾向。据世界卫生组织(WHO)提供的数据，2002年世界结核病的形势为：感染人数约20亿，新发结核病例880万，其中，新涂阳结核病例390万，发病率比2001年增长1.1％，新发病例中耐多药比例为3.2％，结核病的死亡人数达180万。由于耐药结核杆菌的流行，使结核病成为由单一微生物导致死亡的主要原因，占世界人口死亡数的7％，占可预防死亡数的26％。
非结核分枝杆菌(NTM)引发的肺部疾病越来越为人们所关注，人类对非结核分枝杆菌引发的疾病的研究与认识，随着时间的推移逐渐深入。1950年以前，非结核分枝杆菌病仅有散在的病例报告；1950-1970年，人们研究了非结核分枝杆菌病的组织学与诊断标准；1970年以后，人们提出了非结核分枝杆菌的分类与鉴定方法。但这些方法的特异性较差，难以区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。非结核分枝杆菌引起的肺部病无论在临床症状、胸部X射线病灶、PPD皮试检查、甚至抗酸染色性质上，与肺结核均很类似，因而在临床上容易出现误诊。非结核分枝杆菌引起的肺部病与肺结核的治疗方法不同，大多数非结核分枝杆菌对抗结核药物呈天然的抗药性，因而，在临床上一线抗结核药物对非结核分枝杆菌引起的肺部病疗效差，甚至造成治疗失败。应及时进行分枝杆菌菌种鉴定，及早确定是何种分枝杆菌引起的感染，以便采取相应的治疗方案。
痰液中结核杆菌检测具有重要的意义。首先，痰液中结核杆菌检测是诊断肺结核的主要依据。由于肺结核的早期症状很容易和感冒、支气管炎等上呼吸道疾病相混淆，因此疑似肺结核病除了要进行X线胸透、摄片检查外，还必须进行痰液检查，医生将根据痰液检查结果制定合理的治疗方案。其次，痰液中结核杆菌检查是治疗过程中治疗方案转换的重要依据。目前主要的治疗肺结核的方法为分阶段联合用药，即在治疗开始的强化期用4-5种药物进行治疗，以尽快杀灭大量的结核菌，控制传染源，阻断病原菌传播；然后将药物减少到2-3种进行巩固疗效。大多数病人经过2个月的强化期治疗后，病灶会明显好转，症状减轻甚至消失，但这时结核杆菌不一定被全部消灭，在结核杆菌尚未完全转阴的情况下就进入巩固期治疗，容易引起结核杆菌死灰复燃，甚至造成耐药的严重后果。因此在治疗满2个月时，检查痰液中的结核杆菌及其耐药性尤为重要。
目前常用的结核杆菌细菌学检查方法如下：
(1)痰涂片镜检法，该方法是世界范围内普遍使用的最基本的结核杆菌检查方法。其特点是简单、快速、价廉、当天出结果；但无法辨别死菌活菌，敏感性低，通常需5000-10000条菌/ml痰才能够得到阳性结果；特异性差，各种抗酸杆菌均可着色，需要通过进一步试验才能确定是否为结核杆菌。
(2)痰结核杆菌常规培养法，该方法是鉴定死菌活菌的可靠方法，被誉为“黄金标准”。其缺点是培养时间长，需2到4周才能出结果，而且敏感性低，涂片阳性标本只有约80％培养阳性；特异性差，各种分枝杆菌均可生长，需结合药物敏感性试验和分枝杆菌菌种鉴定才能确定是否为结核杆菌。
(3)药物敏感性试验，用于鉴定结核杆菌对抗菌素结核药物的敏感性水平。这项试验通常是在痰结核杆菌培养的基础上进行的，故所需时更长。
(4)分枝杆菌菌种鉴定，根据不同分枝杆菌的理化特性，可以精确地鉴定出分枝杆菌的菌种，但操作复杂，且个别试验使用的药品有一定的危险性。
(5)痰结核杆菌快速培养系统，该方法阳性检出时间较罗氏培养法明显缩短，从常规培养的8周缩短到3-14天，且具有操作简便、自动化强、灵敏度高的优点，在结核病的细菌学诊断中起到了重要作用，促进了结核病细菌学诊断的发展。但仪器与试剂价格昂贵，难以广泛使用。
随着分子生物学技术的发展，使用聚合酶链反应(PCR)和探针杂交等分子生物学方法以非培养方式直接检测痰样品中的分枝杆菌菌种及其耐药基因成为可能。基因芯片具有高通量的特点，能够在一次反应中鉴别多种分枝杆菌及检测多种基因的突变位点来判断是否有结核分枝杆菌耐药菌的存在，具有快速、简便及特异性高等优点。但从痰样品中如何高效、快捷地提取分枝杆菌核酸进行PCR反应，是分子生物学方法推广和应用的一个瓶颈。
痰中含有大量粘液，粘液以一种蛋白质为主链，由二硫键交联结合到含糖的蛋白质侧链上构成，因此不易分离其中的细胞成份，提取DNA存在一定困难。桥木等人首先应用DTT法对痰进行液化，研究结果表明，该方法对痰的液化效果较好，其作用机制是破坏粘液中的二硫链，使蛋白质分解破坏。但也有研究表明单纯应用DTT法液化痰样品，效果不甚理想，可能是由于二硫键破坏的同时，其分子内部或分子间的结构也发生改变，粘液迅速地从溶液状态转变为凝胶状态，从而部分抵消了DTT的溶解液化作用；另外痰液中的细菌及外界环境也可能使粘液蛋白分子内部或分子间的结构发生改变，从而向凝胶状态转化。分枝杆菌细胞壁是由高分子量脂肪酸、脂质、蛋白质及多糖类组成，较难破壁，结核杆菌DNA的提取尚无统一常规化的方法，目前分枝杆菌细胞的裂解方法主要有：1)蛋白酶K加表面活性剂法；2)蛋白变性剂加表面活性剂煮沸法；3)反复冻融法；4)超声波法；5)溶菌酶加表面活性剂法。提取分枝杆菌DNA的方法主要有：1)酚-氯仿提取法；2)二氧化硅吸附法；3)直接煮沸法。但上述方法都存在操作繁琐、提取效率较低、获得的DNA量不足的缺点。
利福平和异烟肼是治疗结核最主要的一线药物，通过各种分子生物学工具对这两种药物的耐药性的遗传基础进行了深入研究，结果显示，在正常情况下，利福平(RFP)与RNA聚合酶B亚基(rpoB)特异性结合，通过阻断RNA的合成而起到抑制细菌生长的作用。rpoB基因在利福平的药物选择压力下发生突变而改变所编码的rpoB亚基构象，从而降低与利福平的亲和力(Jin，D.J.，and C.A.Gross.1988.Mapping andsequencing of mutations in the Escherichia coli rpoB gene that lead to rifampicinresistance.J.Mol.Biol.202：45-58.)。在利福平耐药的临床结核分枝杆菌中，约有96％的突变位于81bp的利福平耐药决定区(RRDR)，包括密码子507到533位点(该“密码子507到533位点”是指以大肠杆菌rpoB编码基因的编号系统为参考)(Ramaswamy，S.，and J.M.Musser.1998.Molecular genetic basis of antimicrobialagent resistance in Mycobacterium tuberculosis：1998 update.Tuber.Lung Dis.79：3-29.Telenti，A.，P.Imboden，F.Marchesi，D.Lowrie，S.Cole，M.J.Colston，L.Matter，K.Schopfer，and T.Bodmer.1993.Detection of rifampicin-resistance mutations inMycobacterium tuberculosis.Lancet 341：647-650.)。其中，第531位点的脱氧核糖核苷酸由C突变为T的占40％，第526位点的脱氧核糖核苷酸由C突变为G、C突变为T、由A突变为G、由A突变为T的共占34％，第516位点的脱氧核糖核苷酸由A突变为T的占8％，以上这些错义突变是最常见的。其突变类型包括点突变、小的缺失和插入等，其中点突变是最主要的突变形式。
异烟肼耐药性的分子基础比较复杂，已发现几个涉及异烟肼体内代谢过程中活性中间体形成有关的基因，其中与过氧化氢酶-过氧化物酶编码基因katG和/或烯酰基还原酶编码基因inhA等基因突变有关。这两种酶都直接或间接的参与异烟肼中间活性体的形成。最常见的突变是katG编码基因第315位脱氧核糖核苷酸发生突变，它的发生频率约为67.2％(van Soolingen，D.，P.E.de Haas，H.R.van Doorn，E.Kuijper，H.Rinder，and M.W.Borgdorff，M.W.2000.Mutations at amino acid position315 of the katG gene are associated with high-level resistance to isoniazid，other drugresistance，and successful transmission of Mycobacterium tuberculosis in TheNetherlands.J.Infect.Dis.182：1788-1790.)。inhA基因的耐异烟肼突变主要发生在其启动子区的-15位脱氧核糖核苷酸上。
链霉素是一种氨基糖苷类药物，在结核病的治疗中也是一种常见的一线药物。链霉素与结核杆菌16S rRNA结合后干扰翻译，从而抑制蛋白的合成。与链霉素耐药性相关的突变包括编码结核杆菌16S rRNA的基因(rrs基因)(Douglass，J.，andL.M.Steyn.1993.A ribosomal gene mutation in streptomycin-resistant Mycobacteriumtuberculosis isolates.J.Infect.Dis.167：1505-1506)和编码核糖体蛋白S12的基因(rpsL基因)(Heym，B.，N.Honore′，C.Truffot-Pernot，A.Banerjee，C.Schurra，W.R.Jacobs，Jr.，J.D.A.van Embden，J.H.Grosset，and S.T.Cole.1994.Implications ofmultidrug resistance for the future of short-course chemotherapy of tuberculosis：amolecular study.Lancet 344：293-298.Honore′，N.，and S.T.Cole.1994.Streptomycinresistance in mycobacteria.Antimicrob.Agents Chemother.38：238-242.)的突变。S12可稳定16S rRNA形成的高度保守的假结结果(Noller，H.F.1984.Structure ofribosomal RNA.Annu.Rev.Biochem.53：119-162.)。rpsL的氨基酸替代可影响16SrRNA的高级结构(Allen，P.N.，and H.F.Noller.1989.Mutations in ribosomal S4 andS12 influence the higher order structure of 16S ribosomal RNA.J.Mol.Biol.208：457-468)，从而导致链霉素耐药。而16S rRNA的突变破坏其与链霉素的结合，从而导致链霉素耐药(De Stasio，E.A.，D.Moazed，H.F.Noller，and A.E.Dahlberg.1989.Mutations in 16S ribosomal RNA disrupt antibiotic-RNA interactions.EMBO J.8：1213-1216)。目前，临床结核分枝杆菌耐药性的检测以培养加药敏试验为主，方法可靠但费时，一般需要4-6周，难以满足临床需要。因此，结核分枝杆菌耐药性快速检测系统的研制对临床治疗具有重要意义和实际应用价值。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种从痰中提取细菌核酸的方法及其试剂盒。
本发明所提供的从痰中提取细菌核酸的试剂盒，它的组成为：1)痰液化试剂；2)含有固体颗粒的缓冲液；
所述痰液化试剂为N-乙酰-L-半胱氨酸、NaOH或硫苏糖醇(DTT)中的至少一种，优选为NaOH。
所述缓冲液为10-50mM Tris.HCl(TE)缓冲液，优选为10mM。
所述固体颗粒为不溶于水且不与核酸发生反应的大小为100-1500μm的玻璃珠或磁珠等，优选为玻璃珠。
所述玻璃珠为两种直径大小不同的玻璃珠混合物，其中大玻璃珠的直径为500-1500μm，小玻璃珠的直径为100-300μm，两种大小玻璃珠的质量比为1∶0.5-1∶10。
利用所述试剂盒可以从痰中提取细菌核酸，具体包括以下步骤：(a)利用所述痰液化试剂对痰样品进行液化处理后，再与所述含有固体颗粒的缓冲液混合，利用缓冲液中的固体颗粒使液化痰中的细菌破壁，制备裂解物溶液；(b)灭活裂解物溶液中的杂质和抑制剂，分离得到细菌核酸。
上述从痰中提取细菌核酸的方法中，所述细菌具体可为分枝杆菌。
本发明的第二个目的是提供一种鉴定痰液中分枝杆菌的方法及其专用试剂盒。
本发明所提供的鉴定痰液中分枝杆菌的试剂盒包括以下组分：1)上述从痰中提取细菌核酸的试剂盒；2)分枝杆菌核酸PCR扩增试剂；3)固定有质控探针和分枝杆菌菌种特异探针的芯片；
所述分枝杆菌核酸PCR扩增试剂包括分枝杆菌16S rDNA基因特异性引物对，其核苷酸序列如序列表中序列1-4；
为了便于检测，所述分枝杆菌16S rDNA基因特异性引物对上还可带有TAMARA荧光标记；
所述分枝杆菌菌种特异探针选自下述探针组中的至少一种：结核分枝杆菌复合群特异探针、鸟分枝杆菌特异探针、胞内分枝杆菌特异探针、堪萨斯分枝杆菌特异探针、瘰疬分枝杆菌特异探针、龟分枝杆菌或脓肿分枝杆菌特异探针、偶然分枝杆菌特异探针、戈登分枝杆菌特异探针、耻垢分枝杆菌特异探针、金色分枝杆菌特异探针、土分枝杆菌特异探针、蟾蜍分枝杆菌特异探针、海分枝杆菌或溃疡分枝杆菌特异探针、草分枝杆菌特异探针、不产色分枝杆菌特异探针、浅黄分枝杆菌特异探针和玛尔摩分枝杆菌特异探针；
所述结核分枝杆菌复合群特异探针的核苷酸序列如序列表中序列19所示；所述鸟分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列20所示；所述胞内分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列21所示；所述堪萨斯分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列35所示；所述瘰疬分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列31所示；所述龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列29所示；所述偶然分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列32所示；所述戈登分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列25所示；所述玛尔摩分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列33所示；所述耻垢分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列26所示；所述金色分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列28所示；所述土分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列23所示；所述蟾蜍分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列24所示；所述海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列34所示；所述草分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列27所示；所述不产色分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列22所示；所述浅黄分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列30所示。
所述质控探针包括点样质控探针，其核苷酸序列如序列表中序列15所示、杂交质控探针，其核苷酸序列如序列表中序列16所示、内对照质控探针，其核苷酸序列如序列表中序列18所示和阴性对照质控探针，其核苷酸序列如序列表中序列17所示；
所述分枝杆菌选自下述分枝杆菌中的至少一种：结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、龟分枝杆菌或脓肿分枝杆菌、偶然分枝杆菌、戈登分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、金色分枝杆菌、土分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、海分枝杆菌或溃疡分枝杆菌、草分枝杆菌、不产色分枝杆菌和浅黄分枝杆菌。
所述芯片上还包括空白质控。
本发明所提供的利用上述鉴定痰液中分枝杆菌的试剂盒对分枝杆菌进行菌种鉴定的方法，具体包括以下步骤：(a)按照上述提取细菌核酸的方法从痰液中得到分枝杆菌核酸；(b)用所述分枝杆菌核酸PCR扩增试剂进行PCR扩增；(c)将PCR产物与所述固定有分枝杆菌菌种探针的芯片进行杂交；(d)用扫描仪扫描芯片，根据杂交结果确定痰液中所含的分枝杆菌。
如果杂交结果有阳性信号，则痰液中含有与阳性杂交信号所述的分枝杆菌菌种特异探针对应的分枝杆菌。
本发明的第三个目的是提供一种检测痰液中结核分枝杆菌的以下基因位点是突变型还是野生型的方法及其专用试剂盒。
本发明所提供的检测痰液中结核分枝杆菌的以下基因位点是突变型还是野生型的试剂盒包括以下组分：1)上述从痰中提取细菌核酸的试剂盒；2)结核分枝杆菌核酸PCR扩增试剂；3)固定有质控探针和结核分枝杆菌以下基因位点的突变型和野生型探针的芯片。
所述基因位点选自下述1)-12)中的至少一个：
1)rpoB的511位；
2)rpoB的513位；
3)rpoB的516位；
4)rpoB的526位；
5)rpoB的531位；
6)rpoB的533位；
7)katG的315位；
8)inhA的-15位；
9)rrs的514位；
10)rrs的517位；
11)rpsL的43位；
12)rpsL的88位；
所述结核分枝杆菌核酸PCR扩增试剂包括下述5个引物对中的至少一对：扩增结核分枝杆菌rpoB基因的特异性引物对，其核苷酸序列如序列表中序列5和序列6所示；扩增结核分枝杆菌katG基因的特异性引物对，其核苷酸序列如序列表中序列7和序列8所示；扩增结核分枝杆菌inhA基因的特异性引物对，其核苷酸序列如序列表中序列9和序列10所示；扩增结核分枝杆菌rrs基因的特异性引物对，其核苷酸序列如序列表中序列11和序列12所示和扩增结核分枝杆菌rpsL基因的特异性引物对，其核苷酸序列如序列表中序列13和序列14所示；
为了便于检测，所述结核分枝杆菌rpoB、katG、inhA、rrs和rpsL基因的特异性引物对上还可带有TAMARA荧光标记。
所述质控探针包括点样质控探针，其核苷酸序列如序列表中序列15所示、杂交质控探针，其核苷酸序列如序列表中序列16所示、内对照质控探针，其核苷酸序列如序列表中序列36、54、59、64和71所示和阴性对照质控探针，其核苷酸序列如序列表中序列17所示；
所述rpoB基因的511位的野生型探针为511-WT，其核苷酸序列如序列表中序列50所示，所述rpoB基因的511位的突变型探针为511(T→C)，其核苷酸序列如序列表中序列51所示；
所述rpoB基因的513位的野生型探针为513-WT，其核苷酸序列如序列表中序列52所示，所述rpoB基因的513位的突变型探针为513(C→A)，其核苷酸序列如序列表中序列53所示；
所述rpoB基因的516位的野生型探针为516-WT，其核苷酸序列如序列表中序列47所示，所述rpoB基因的516位的突变型探针包括516(A→T)和516(A→G)，其核苷酸序列如序列表中序列48和49所示；
所述rpoB基因的526位的野生型探针为526-WT，其核苷酸序列如序列表中序列41所示，所述rpoB基因的526位的突变型探针包括526(C→T)、526(C→G)、526(A→G)、526(A→T)和526(C→A)，其核苷酸序列如序列表中序列42-46所示；
所述rpoB基因的531位的野生型探针为531-WT，其核苷酸序列如序列表中序列37所示，所述rpoB基因的531位的突变型探针为531(C→T)，其核苷酸序列如序列表中序列38所示；
所述rpoB基因的533位的野生型探针为533-WT，其核苷酸序列如序列表中序列39所示，所述rpoB基因的533位的突变型探针为533(T→C)，其核苷酸序列如序列表中序列40所示；
所述katG基因的315位的野生型探针为315-WT，其核苷酸序列如序列表中序列65所示，所述katG基因的315位的突变型探针包括315(G→A)、315(G→C)和315(C→A)，其核苷酸序列如序列表中序列66、67和68所示；
所述inhA基因的-15位的野生型探针为-15-WT，其核苷酸序列如序列表中序列69所示，所述inhA基因的-15位的突变型探针为-15(C→T)，其核苷酸序列如序列表中序列70所示；
所述rrs基因的514位的野生型探针为514-WT，其核苷酸序列如序列表中序列55所示，所述rrs基因的514位的突变型探针包括514(A→C)和514(A→T)，其核苷酸序列如序列表中序列56和57所示；
所述rrs基因的517位的野生型探针为517-WT，其核苷酸序列如序列表中序列55所示，所述rrs基因的517位的突变型探针为517(C→T)，其核苷酸序列如序列表中序列58所示；
所述rpsL基因的43位的野生型探针为43-WT，其核苷酸序列如序列表中序列60所示，所述rpsL基因的43位的突变型探针为43(A→G)，其核苷酸序列如序列表中序列61和57所示；
所述rpsL基因的88位的野生型探针为88-WT，其核苷酸序列如序列表中序列62所示，所述rpsL基因的88位的突变型探针为88(A→G)，其核苷酸序列如序列表中序列63所示。
所述芯片上还包括空白质控。
本发明所提供的利用上述检测痰液中结核分枝杆菌的所述基因位点是突变型还是野生型的方法，具体包括以下步骤：(a)按照上述提取细菌核酸的方法从痰液中得到结核分枝杆菌核酸；(b)用所述结核分枝杆菌核酸PCR扩增试剂进行PCR扩增；(c)将PCR产物与所述固定有结核分枝杆菌的所述蛋白的氨基酸位点探针的芯片进行杂交；(d)用扫描仪扫描芯片，根据杂交结果确定待检测位点是野生型还是突变型，当待检测位点的野生型探针信号大于突变型探针的信号时，该待检测位点是野生型；当待检测位点的突变型探针信号大于野生型探针的信号时，该待检测位点是突变型的。
本发明采用液化试剂液化痰样品，通过加入固体颗粒裂解细胞，从痰样品中提取核酸。克服了常规方法从痰样品中提取细菌核酸步骤复杂、时间长、操作繁琐以及核酸样品量低的缺点，采用本发明方法从痰中提取核酸样品操作方便、快速、核酸样品量高、成本低，易于实现自动化。
本发明的细菌核酸提取方法和试剂盒可以应用于分枝杆菌菌种鉴定和结核杆菌基因位点野生型和突变型的检测，结合相应的菌种鉴定芯片和野生型和突变型检测芯片，能够快速、准确、高通量地实现分枝杆菌菌种鉴定和结核杆菌基因位点野生型和突变型的检测。
附图说明
图1为耻垢分枝杆菌核酸的PCR扩增结果
图2为点阵组合的特征图
图3为分枝杆菌菌种鉴定的杂交反应结果
图4为结核分枝杆菌rpoB基因的511位、513位、516位、526、531位或533位的野生型和突变型检测的杂交反应结果
图5为结核分枝杆菌katG基因的315位、inhA基因的-15位、rrs基因的514位和517位或rpsL基因的43位和88位检测的杂交反应结果
具体实施方式
实施例1、痰液样品中耻垢分枝杆菌核酸的提取
1、取抗酸染色结果为阴性的人的痰液样品(由北京市人民医院提供)，将其作为试验材料备用。
2、向上述痰液样品中掺入浓度分别为102-107CFU/ml的耻垢分枝杆菌(美国典型培养物保藏中心ATCC 700084)，作为提取耻垢分枝杆菌核酸的痰液样品。
3、向上述掺有不同浓度耻垢分枝杆菌的痰液样品中再加入等体积20％(质量百分含量)的NaOH溶液，混合均匀，37℃液化30分钟，得到液化痰。
4、取1ml上述液化痰，12000rpm离心5分钟，去上清；加入1ml含100mM EDTA的灭菌水，涡旋后12000rpm离心5分钟，去上清；加入80μl 10mM TE，混匀后转入装有100mg直径为200μm和10mg直径为1000μm玻璃珠的1.5mL离心管中，使用晶芯
Figure A20081010517200161
ExtractorTM 36核酸快速提取仪振荡5分钟，使玻璃珠水平或者垂直地运动，得到裂解物溶液。
5、将上述得到的裂解物溶液94℃水浴5分钟，以灭活其中的DNA酶，5000rpm离心1分钟，弃上清，即得到耻垢分枝杆菌的核酸提取液，-20℃保存备用。
6、对提取得到的细菌核酸进行PCR验证
同时按照上述步骤1至步骤5的方法从不含有任何分枝杆菌的痰液样品中提取的核酸作为阴性对照。以耻垢分枝杆菌(美国典型培养物保藏中心ATCC 700084)的基因组DNA为阳性对照。该耻垢分枝杆菌(美国典型培养物保藏中心ATCC 700084)的基因组DNA用结核分枝杆菌核酸扩增荧光检测试剂盒(深圳市匹基生物工程股份有限公司)进行提取。
用分枝杆菌16S rDNA基因特异性引物(序列如序列表中序列3和序列4)对提取的核酸进行PCR扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。具体检测结果如图1所示。其中，泳道1为DL2000的DNA分子量标准(TAKARA)；泳道2-7分别为每毫升痰液中掺入107、106、105、104、103、102CFU耻垢分枝杆菌的核酸提取液的PCR扩增结果；泳道8为阳性对照的PCR扩增结果；泳道9为阴性对照的PCR扩增结果。结果表明，除了每毫升痰液中掺入102CFU耻垢分枝杆菌的核酸提取液没有扩增条带外，其余浓度的耻垢分枝杆菌的核酸提取液均有不同亮度的条带；作为阴性对照的不含耻垢分枝杆菌的痰液样品也没有扩增条带，说明使用上述细菌核酸提取方法从痰样品中提取的核酸可以满足PCR扩增模板的需要，可以进行特异的PCR扩增反应。
实施例2、痰样品中分枝杆菌菌种的鉴定
1、痰样品中分枝杆菌核酸的提取
将实施例1步骤1的不含分枝杆菌的痰液样品作为试验材料，向该痰液样品中掺入浓度为1×105CFU细菌/ml的结核分枝杆菌(美国典型培养物保藏中心ATCC27294)，提取痰样品中结核分枝杆菌的核酸，具体的核酸提取过程同实施例1。
将实施例1步骤1的不含分枝杆菌的痰液样品作为试验材料，向该痰液样品中分别掺入浓度为1×105CFU细菌/ml的勘萨斯分枝杆菌(美国典型培养物保藏中心ATCC 12478)、胞内分枝杆菌(美国典型培养物保藏中心ATCC 13950)、龟分枝杆菌(美国典型培养物保藏中心ATCC 14472)、偶然分枝杆菌(美国典型培养物保藏中心ATCC 6481)、戈登分枝杆菌(美国典型培养物保藏中心ATCC 14470)、金色分枝杆菌(美国典型培养物保藏中心ATCC 23366)、海分枝杆菌(美国典型培养物保藏中心ATCC 927)、浅黄分枝杆菌(美国典型培养物保藏中心ATCC 43909)、耻垢分枝杆菌(美国典型培养物保藏中心ATCC 19420)、土分枝杆菌(美国典型培养物保藏中心ATCC 19619)、不产色分枝杆菌(美国典型培养物保藏中心ATCC19530)、鸟分枝杆菌(美国典型培养物保藏中心ATCC 25291)、草分枝杆菌(美国典型培养物保藏中心ATCC 11758)、瘰疬分枝杆菌(美国典型培养物保藏中心ATCC 19981)、蟾蜍分枝杆菌(美国典型培养物保藏中心ATCC 19250)、脓肿分枝杆菌(美国典型培养物保藏中心ATCC 19977)、溃疡分枝杆菌(美国典型培养物保藏中心ATCC 19423)和玛尔摩分枝杆菌(美国典型培养物保藏中心ATCC 29571)，提取痰样品中分枝杆菌的核酸，具体的核酸提取过程同实施例1。
2、寡核苷酸引物和探针的制备
分枝杆菌菌种鉴定所用的引物包括扩增分枝杆菌16S rDNA的引物，其核苷酸序列如表1所示。
表1分枝杆菌菌种鉴定的PCR扩增引物
分枝杆菌菌种鉴定所用的探针包括区分结核分枝杆菌复合群特异性探针、鸟分枝杆菌特异性探针、胞内分枝杆菌特异性探针、堪萨斯分枝杆菌特异性探针、瘰疬分枝杆菌特异性探针、龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌特异性探针、偶然分枝杆菌特异性探针、戈登分枝杆菌特异性探针、耻垢分枝杆菌特异性探针、金色分枝杆菌特异性探针、土分枝杆菌特异性探针、蟾蜍分枝杆菌特异性探针、海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌特异性探针、草分枝杆菌特异性探针、不产色分枝杆菌特异性探针、浅黄分枝杆菌特异性探针和玛尔摩分枝杆菌特异性探针。其核苷酸序列分别如表2所示。引物和探针均由上海英骏生物技术有限公司合成。
表2  分枝杆菌菌种鉴定的探针组合的核苷酸序列
  探针名称   SEQ ID NO.   序列(5’-3’)
  点样质控探针(QC)   15   NH2-T25-GCAAGACAAGTGGAAGTGTG-HEX
  杂交质控探针(EC)   16   NH2-T25-GCAACCACCACCGGAGG
  阴性对照质控探针(NC)   17   NH2-T25-CCTCTCTCGGACTAATCGCC
  内对照质控探针(IC)   18   NH2-T25-GCGGGCTCATCCCACAC
  结核分枝杆菌复合群探针   19   NH2-T25-ACAAGACATGCATCCCGT
  鸟分枝杆菌探针   20   NH2-T25-GACATGCGTCTTGAGGTC
  胞内分枝杆菌探针   21   NH2-T25-TAAAGACATGCGCCTAAA
  不产色分枝杆菌探针   22   NH2-T25-CACACCATGCAGCATG
  土分枝杆菌探针   23   NH2-T25-CAGAACATGCATCCCA
  蟾蜍分枝杆菌探针   24   NH2-T25-CGCAGAATGGTCCTATCC
  戈登分枝杆菌探针   25   NH2-T25-CATGTGTCCTGTGGTCCT
  耻抗分枝杆菌探针   26   NH2-T25-CGACCAGCAGGGTGTATT
  草分枝杆菌探针   27   NH2-T25-TCCCAGCCATGCAACCAG
  金色分枝杆菌探针   28   NH2-T25-GACATGCATCGCGTAG
  龟、脓肿分枝杆菌探针   29   NH2-T25-TGCACCACTCACCATGAAGTGTGTG
  浅黄分枝杆菌探针   30   NH2-T25-CACACACCATGAAGCATG
  瘰疬分枝杆菌探针   31   NH2-T25-CAACCCACAAAGTGAGCC
  偶然分枝杆菌探针   32   NH2-T25-ATGAAGCGCGTGGTCATA
  玛尔摩分枝杆菌探针   33   NH2-T25-CATACGCCTCGGGGTCCT
  海、溃疡分枝杆菌探针   34   NH2-T25-GACATGAATCCCGTCG
  勘萨斯分枝杆菌探针   35   NH2-T25-TTATGCCGGTGTGCAG
表2中，NH2表示氨基修饰，T25表示连续25个胸腺嘧啶核苷T，HEX表示荧光染料。
3、菌种鉴定芯片的制备
采用GeneMachine点样仪，将溶解在50％DMSO溶液中的浓度为2-10μM的步骤2的寡核苷酸探针分别点制在醛基修饰的基片上，干燥固定后备用。点阵排布具有以下特征：共包括4种质控探针和空白质控探针，其中点样质控探针(QC)用于质控点样位置、表面化学修饰情况和固定情况；杂交质控探针(EC)用于质控杂交过程是否成功；内对照质控探针(IC)是对于分枝杆菌阳性的样品，用于质控包括样品制备和PCR扩增在内的全程质控探针，用于质控整个操作过程是否成功；阴性对照质控探针(NC)是用于质控非特异性杂交情况；空白质控探针(BC)是50％的DMSO溶液，不含探针，用于质控芯片的背景和信噪比情况。各种质控探针位于点阵的上部和下部，其排列顺序是特定的，点阵的中间部分是用于检测的探针，具体的排列情况如图2所示。分枝杆菌菌种鉴定包括的检测探针是区分结核杆菌和非结核分枝杆菌的种特异性探针。该鉴定芯片的探针排列具体如表4所示。
表4  分枝杆菌菌种鉴定芯片的探针组合排布
4、PCR扩增及杂交检测
首先用TAMARA标记的分枝杆菌16S rDNA基因特异性引物(序列1-4)对步骤1提取的核酸进行PCR扩增，然后将所得到的PCR产物与步骤3的芯片杂交。杂交信号通过Luxscan激光扫描仪进行检测，获得的图像用分枝杆菌菌种鉴定分析软件分析每个探针位点的杂交信号，从而确定所检测的核酸样品中分枝杆菌的种属特性。图3为分枝杆菌菌种鉴定的杂交反应结果，其中，A为结核分枝杆菌的杂交反应结果，B为勘萨斯分枝杆菌的杂交反应结果，C为胞内分枝杆菌的杂交反应结果，D为龟分枝杆菌的杂交反应结果，E为偶然分枝杆菌的杂交反应结果，F为戈登分枝杆菌的杂交反应结果，G为金色分枝杆菌的杂交反应结果，H为海分枝杆菌的杂交反应结果，I为浅黄分枝杆菌的杂交反应结果，J为耻垢分枝杆菌的杂交反应结果，K为土分枝杆菌的杂交反应结果，L为不产色分枝杆菌的杂交反应结果，M为鸟分枝杆菌的杂交反应结果，N为草分枝杆菌的杂交反应结果，O为瘰疠分枝杆菌的杂交反应结果，P为蟾蜍分枝杆菌的杂交反应结果，Q为脓肿分枝杆菌的杂交反应结果，R为溃疡分枝杆菌的杂交反应结果，S为玛尔摩分枝杆菌的杂交反应结果。它们在相应的种特异探针处的杂交信号为阳性信号，而在其它探针处的杂交信号为阴性信号，说明本方法能特异地检测出分枝杆菌菌种，其中偶然分枝杆菌、浅黄分枝杆菌和不产色分枝杆菌是通过不同探针组合进行鉴定的。
实施例3、检测结核分枝杆菌的基因位点是突变型还是野生型
1、痰样品中结核分枝杆菌核酸的提取
取实施例1步骤1的不含分枝杆菌痰液样品作为试验材料，向该痰液样品中掺入浓度为1×105CFU细菌/ml的结核分枝杆菌(美国典型培养物保藏中心ATCC27294)，提取痰样品中结核分枝杆菌的核酸，具体的核酸提取过程同实施例1。
2、寡核苷酸引物和探针的制备
结核分枝杆菌rpoB、katG、inhA、rrs和rpsL基因位点是突变型还是野生型检测使用的引物包括扩增结核分枝杆菌rpoB、katG、inhA、rrs和rpsL基因的引物，其核苷酸序列如表7所示。结核分枝杆菌rpoB、katG、inhA、rrs和rpsL基因位点是突变型还是野生型检测所用的探针形成两个探针组合，探针组合1用于检测结核分枝杆菌rpoB基因的511、513、516、526、531和533位发生突变的突变型探针和野生型探针，共17条探针；探针组合2用于检测结核分枝杆菌katG基因的315位发生突变的1条野生型和3条突变型探针、inhA基因的-15位发生突变的1条野生型和1条突变型探针、rrs基因的514和517位发生突变的1条野生型和3条突变型探针及rpsL基因的43和88位发生突变的2条野生型和2条突变型探针。探针组合1和探针组合2分别点在两张芯片上。探针的核苷酸序列如表3所示，引物和探针均由上海英骏生物技术有限公司合成。
表7  结核分枝杆菌的基因位点是突变型还是野生型检测的PCR扩增引物
Figure A20081010517200211
Figure A20081010517200221
表3  结核分枝杆菌耐药基因检测探针的核苷酸序列
Figure A20081010517200231
表3中，NH2表示氨基修饰，T25表示连续25个胸腺嘧啶核苷T，HEX表示荧光染料。
3、结核分枝杆菌的基因位点是突变型还是野生型检测基因芯片的制备
采用GeneMachine点样仪，将溶解在50％DMSO溶液中的浓度为2-10μM的步骤2的寡核苷酸探针分别点制在醛基修饰的基片上，干燥固定后备用。点阵排布具有以下特征，共包括4种质控探针和空白质控探针，其中点样质控探针(QC)用于质控点样位置、表面化学修饰情况和固定情况；杂交质控探针(EC)用于质控杂交过程是否成功；内对照质控探针(IC)是包括样品制备和PCR扩增在内的全程质控探针，用于质控整个操作过程是否成功；阴性对照质控探针(NC)是用于质控非特异性杂交情况；空白质控探针(BC)50％DMSO溶液，不含探针，用于质控芯片的背景和信噪比情况。各种质控探针位于点阵的上部和下部，其排列顺序是特定的，点阵的中间部分是用于检测的探针，具体的排列情况如图2所示。
结核分枝杆菌rpoB、katG、inhA、rrs和rpsL基因位点是突变型还是野生型检测所用的探针形成两个探针组合，探针组合1用于检测结核分枝杆菌rpoB的511、513、516、526、531、533位基因发生突变的突变型探针和野生型探针，共17条探针。探针组合1点在芯片1上，具体的点阵排布如表5所示。探针组合2用于检测结核分枝杆菌katG的315位基因发生突变的1条野生型和4条突变型探针、inhA的-15位基因发生突变的1条野生型和1条突变型探针、rrs的514和517位基因发生突变的1条野生型和3条突变型探针及rpsL的43和88位基因发生突变的2条野生型和2条突变型探针。探针组合2点在芯片2上。具体的点阵排布如表6所示。
表5  芯片1的探针排布
表6  芯片2的探针排布
Figure A20081010517200242
4、PCR扩增及杂交检测
首先用TAMARA标记的结核分枝杆菌rpoB、katG、inhA、rrs和rpsL基因特异性引物(引物序列如表7所示)分别对步骤1提取的核酸进行PCR扩增，其中，rpoB的PCR扩增产物与芯片1杂交，katG、inhA、rrs和rpsL的PCR扩增产物与芯片2杂交。杂交信号通过Luxscan激光扫描仪进行检测，获得的图像用结核分枝杆菌的基因位点是突变型还是野生型检测分析软件分析每个探针位点的杂交信号，从而确定所检测的核酸样品中结核分枝杆菌的基因位点的突变情况，提示耐药性。杂交结果如图4和图5所示。其中，图4是rpoB的511、513、516、526和533位点的PCR产物与芯片1的杂交结果，rpoB的511、513、516、531、526和533位点的野生型探针的信号高于突变型探针的信号，表明该痰样品中的结核分枝杆菌的rpoB基因是野生型的，提示对利福平敏感。图5是katG、inhA、rrs和rpsL的PCR产物与芯片2的杂交结果，katG、inhA、rrs和rpsL基因检测位点的野生型探针的信号均大于突变型探针的信号，表明该痰样品中结核分枝杆菌的katG、inhA、rrs和rpsL基因均是野生型，提示对异烟肼和链霉素敏感。
序列表
<160>71
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
ttggagagtt tgatcctggc tca                            23
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
ccaacatctc acgacacgag ctg                            23
<210>3
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
tggctcagga cgaacg                                    16
<210>4
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
gtgagatttc acgaaca                                  17
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
aggcgatcac accgcagacg t                             21
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
cgagccgatc agaccgatgt                               20
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
gatcgtcggc ggtcacactt tc                            22
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
ctcttcgtca gctcccactc gtag                            24
<210>9
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
cacccgcagc cagggcc                                    17
<210>10
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
cgatcccccg gtttcctcc                                  19
<210>11
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
gccttcgggt tgtaaac                               17
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
agttaagccg tgagatttca                            20
<210>13
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
gaccgcggct ctgaag                                16
<210>14
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
cgcggatgat cttgtagc                              18
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
gcaagacaag tggaagtgtg                  20
<210>16
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
gcaaccacca ccggagg                     17
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
cctctctcgg actaatcgcc                  20
<210>18
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
gcgggctcat cccacac                     17
<210>19
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
acaagacatg catcccgt                                   18
<210>20
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
gacatgcgtc ttgaggtc                                   18
<210>21
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
taaagacatg cgcctaaa                                   18
<210>22
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
cacaccatgc agcatg                                     16
<210>23
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>23
cagaacatgc atccca                                   16
<210>24
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
cgcagaatgg tcctatcc                                 18
<210>25
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>25
catgtgtcct gtggtcct                                 18
<210>26
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>26
cgaccagcag ggtgtatt                 18
<210>27
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>27
tcccagccat gcaaccag                 18
<210>28
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>28
gacatgcatc gcgtag                   16
<210>29
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>29
tgcaccactc accatgaagt gtgtg         25
<210>30
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>30
cacacaccat gaagcatg                                    18
<210>31
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>31
caacccacaa agtgagcc                                    18
<210>32
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>32
atgaagcgcg tggtcata                                    18
<210>33
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>33
catacgcctc ggggtcct                                    18
<210>34
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>34
gacatgaatc ccgtcg                            16
<210>35
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>35
ttatgccggt gtgcag                            16
<210>36
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>36
cgggcacatc cggccg                            16
<210>37
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>37
cccagcgccg acagtc                            16
<210>38
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<400>38
agcgccaaca gtcgg                                    15
<210>39
<211>18
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<213>人工序列
<400>71
gtggctgtgg cagtcac                                        17

Claims (16)

1、一种从痰中提取细菌核酸的试剂盒，它的组成为：1)痰液化试剂，2)含有固体颗粒的缓冲液；
所述痰液化试剂为N-乙酰-L-半胱氨酸、NaOH或硫苏糖醇中的至少一种；
所述固体颗粒不溶于水且不与核酸发生反应，大小为100-1500μm。
2、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述缓冲液为10-50mM的Tris.HCl缓冲液；优选为10mM的Tris.HCl缓冲液。
3、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述固体颗粒为玻璃珠或磁珠。
4、根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述玻璃珠为两种直径大小不同的玻璃珠混合物；所述大玻璃珠的直径为500-1500μm，小玻璃珠的直径为100-300μm。
5、根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述大玻璃珠和小玻璃珠的质量比为1∶0.5-1∶10。
6、根据权利要求1-5中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述细菌为分枝杆菌。
7、一种利用权利要求1-6中任一所述的试剂盒从痰中提取细菌核酸的方法，包括以下步骤：(a)利用所述痰液化试剂对痰样品进行液化处理后，再与所述含有固体颗粒的缓冲液混合，制备裂解物溶液；(b)灭活裂解物溶液中的杂质和抑制剂，分离得到细菌核酸。
8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述细菌为分枝杆菌。
9、一种鉴定痰液中分枝杆菌菌种的试剂盒，它的组成为：1)权利要求1-6中任一所述的试剂盒；2)分枝杆菌核酸PCR扩增试剂；3)固定有质控探针和分枝杆菌菌种特异探针的芯片；
所述分枝杆菌核酸PCR扩增试剂包括分枝杆菌16S rDNA基因特异性引物对，其核苷酸序列如序列表中序列序列1-4；
所述分枝杆菌菌种特异探针选自下述探针组中的至少一种：结核分枝杆菌复合群特异探针、鸟分枝杆菌特异探针、胞内分枝杆菌特异探针、堪萨斯分枝杆菌特异探针、瘰疬分枝杆菌特异探针、龟分枝杆菌或脓肿分枝杆菌特异探针、偶然分枝杆菌特异探针、戈登分枝杆菌特异探针、耻垢分枝杆菌特异探针、金色分枝杆菌特异探针、土分枝杆菌特异探针、蟾蜍分枝杆菌特异探针、海分枝杆菌或溃疡分枝杆菌特异探针、草分枝杆菌特异探针、不产色分枝杆菌特异探针、浅黄分枝杆菌特异探针和玛尔摩分枝杆菌探针；
所述质控探针包括点样质控探针、杂交质控探针、内对照质控探针和阴性对照质控探针；
所述分枝杆菌选自下述分枝杆菌中的至少一种：结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、龟分枝杆菌或脓肿分枝杆菌、偶然分枝杆菌、戈登分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、金色分枝杆菌、土分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、海分枝杆菌或溃疡分枝杆菌、草分枝杆菌、不产色分枝杆菌、浅黄分枝杆菌和玛尔摩分枝杆菌。
10、根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述芯片上还包括空白质控；所述点样质控探针的核苷酸序列如序列表中序列15所示；所述杂交质控探针的核苷酸序列如序列表中序列16所示；所述内对照质控探针的核苷酸序列如序列表中序列18所示；所述阴性对照质控探针的核苷酸序列如序列表中序列17所示。
11、根据权利要求9或10所述的试剂盒，其特征在于：所述结核分枝杆菌复合群特异探针的核苷酸序列如序列表中序列19所示；所述鸟分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列20所示；所述胞内分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列21所示；所述堪萨斯分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列35所示；所述瘰疬分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列31所示；所述龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列29所示；所述偶然分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列32所示；所述戈登分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列25所示；所述玛尔摩分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列33所示；所述耻垢分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列26所示；所述金色分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列28所示；所述土分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列23所示；所述蟾蜍分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列24所示；所述海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列34所示；所述草分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列27所示；所述不产色分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列22所示；所述浅黄分枝杆菌特异探针的核苷酸序列如序列表中序列30所示。
12、一种利用权利要求9-11中任一种鉴定痰液中分枝杆菌的试剂盒鉴定痰液中分枝杆菌菌种的方法，包括以下步骤：(a)按照权利要求7或8所述的提取细菌核酸的方法从痰液中得到分枝杆菌核酸；(b)利用权利要求9-11中任一种试剂盒中的所述分枝杆菌核酸PCR扩增试剂进行PCR扩增；(c)将PCR产物与权利要求9-11中任一种试剂盒中的所述芯片进行杂交；(d)用扫描仪扫描芯片，根据杂交结果确定痰液中所含的分枝杆菌。
13、一种检测痰液中结核分枝杆菌的以下基因位点是突变型还是野生型的试剂盒，包括以下组分：1)权利要求1-6中任一所述的试剂盒；2)结核分枝杆菌核酸PCR扩增试剂；3)固定有质控探针和结核分枝杆菌以下基因位点的突变型和野生型探针的芯片；
所述基因位点选自下述1)-12)中的至少一个：
1)rpoB的511位；
2)rpoB的513位；
3)rpoB的516位；
4)rpoB的526位；
5)rpoB的531位；
6)rpoB的533位；
7)katG的315位；
8)inhA的-15位；
9)rrs的514位；
10)rrs的517位；
11)rpsL的43位；
12)rpsL的88位；
所述结核分枝杆菌核酸PCR扩增试剂包括下述5个引物对中的至少一对：扩增结核分枝杆菌rpoB基因的特异性引物对，其核苷酸序列如序列表中序列5和序列6所示；扩增结核分枝杆菌katG基因的特异性引物对，其核苷酸序列如序列表中序列7和序列8所示；扩增结核分枝杆菌inhA基因的特异性引物对，其核苷酸序列如序列表中序列9和序列10所示；扩增结核分枝杆菌rrs基因的特异性引物对，其核苷酸序列如序列表中序列11和序列12所示和扩增结核分枝杆菌rpsL基因的特异性引物对，其核苷酸序列如序列表中序列13和序列14所示；
所述质控探针包括点样质控探针、杂交质控探针、内对照质控探针和阴性对照质控探针。
14、根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于：所述rpoB的511位的野生型探针为511-WT，其核苷酸序列如序列表中序列50所示；所述rpoB的511位的突变型探针为511(T→C)，其核苷酸序列如序列表中序列51所示；
所述rpoB的513位的野生型探针为513-WT，其核苷酸序列如序列表中序列52所示；所述rpoB的513位的突变型探针为513(C→A)，其核苷酸序列如序列表中序列53所示；
所述rpoB的516位的野生型探针为516-WT，其核苷酸序列如序列表中序列47所示；所述rpoB的516位的突变型探针包括516(A→T)和516(A→G)，其核苷酸序列分别如序列表中序列48和49所示；
所述rpoB的526位的野生型探针为526-WT，其核苷酸序列如序列表中序列41所示；所述rpoB的526位的突变型探针包括526(C→T)、526(C→G)、526(A→G)、526(A→T)和526(C→A)，其核苷酸序列分别如序列表中序列42-46所示；
所述rpoB的531位的野生型探针为531-WT，其核苷酸序列如序列表中序列37所示；所述rpoB的531位的突变型探针为531(C→T)，其核苷酸序列如序列表中序列38所示；
所述rpoB的533位的野生型探针为533-WT，其核苷酸序列如序列表中序列39所示；所述rpoB的533位的突变型探针为533(T→C)，其核苷酸序列如序列表中序列40所示；
所述katG的315位的野生型探针为315-WT，其核苷酸序列如序列表中序列65所示；所述katG的315位的突变型探针包括315(G→A)、315(G→C)和315(C→A)，其核苷酸序列分别如序列表中序列66、67和68所示；
所述inhA的-15位的野生型探针为-15-WT，其核苷酸序列如序列表中序列69所示；所述inhA的-15位的突变型探针为-15(C→T)，其核苷酸序列如序列表中序列70所示；
所述rrs的514位的野生型探针为514-WT，其核苷酸序列如序列表中序列55所示；所述rrs的514位的突变型探针包括514(A→C)和514(A→T)，其核苷酸序列分别如序列表中序列56和57所示；
所述rrs的517位的野生型探针为517-WT，其核苷酸序列如序列表中序列55所示；所述rrs的517位的突变型探针为517(C→T)，其核苷酸序列如序列表中序列58所示；
所述rpsL的43位的野生型探针为43-WT，其核苷酸序列如序列表中序列60所示；所述rpsL的43位的突变型探针为43(A→G)，其核苷酸序列如序列表中序列61和57所示；
所述rpsL的88位的野生型探针为88-WT，其核苷酸序列如序列表中序列62所示；所述rpsL的88位的突变型探针为88(A→G)，其核苷酸序列如序列表中序列63所示。
15、根据权利要求13或14所述的试剂盒，其特征在于：所述芯片上还包括空白质控；所述点样质控探针的核苷酸序列如序列表中序列15所示；所述杂交质控探针的核苷酸序列如序列表中序列16所示；所述内对照质控探针的核苷酸序列如序列表中序列36、54、59、64和71所示；所述阴性对照质控探针的核苷酸序列如序列表中序列17所示。
16、一种利用权利要求13-15中任一所述的试剂盒检测痰液中结核分枝杆菌的所述基因位点是突变型还是野生型的方法，包括以下步骤：(a)按照权利要求7或8所述的提取细菌核酸的方法从痰液中得到结核分枝杆菌核酸；(b)利用权利要求13-15中任一所述的试剂盒中的结核分枝杆菌核酸PCR扩增试剂进行PCR扩增；(c)将PCR产物与权利要求13-15中任一所述的试剂盒中的芯片进行杂交；(d)用扫描仪扫描芯片，根据杂交结果确定痰液中所含的结核分枝杆菌的所述基因位点是突变型还是野生型，当待检测位点的野生型探针信号大于突变型探针的信号时，该待检测位点是野生型；当待检测位点的突变型探针信号大于野生型探针的信号时，该待检测位点是突变型的。
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