CN109628617B - 用于检测结核分枝杆菌耐药性的核酸试剂、试剂盒、系统及方法 - Google Patents

用于检测结核分枝杆菌耐药性的核酸试剂、试剂盒、系统及方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种用于检测结核分枝杆菌耐药性的核酸试剂、试剂盒、系统及方法，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQ ID NO.1‑6所示的引物和SEQ ID NO.11‑18所示的探针。本公开通过以上所述的引物和探针建立了检测结核分枝杆菌耐药性的核酸试剂、试剂盒、系统及方法，能够实现快速、全面、敏感、特异、自动的检测结果判定。

Description

用于检测结核分枝杆菌耐药性的核酸试剂、试剂盒、系统及 方法
技术领域
本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种用于检测结核分枝杆菌耐药性的核酸试剂、试剂盒、系统及方法。
背景技术
人类结核病的主要病原体是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)，它属于分枝杆菌属的结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC)。分枝杆菌属除MTBC外，还包括麻风分枝杆菌和至少140种非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)，而NTM中至少有40种是肺部病原体。MTBC除结核分枝杆菌外，还包括牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、M.caprae、M.canetti和M.pinnipedii，它们种间基因组同源性很高，均能引起结核病，但表型特征和宿主范围不同。
根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)的报告，2016年全球结核总患病人数为1040万，新增630万，其中47.6万结核病患者为HIV(Human immunodeficiencyvirus)阳性；有130万人因结核病死亡，其中37万为HIV阳性。我国是结核病高发区，据2011年我国第五次结核病流行病学抽样调查数据显示，我国结核病年新发病人数为130万，仅次于印度，位居全球第2位。
只要治疗合理并严格按医嘱规律服药，结核病的治愈率可达90％以上。但是结核患者在治疗过程中需要长期服用大量药物，可能出现严重不良反应，导致患者治疗意愿降低，进而以不合理的方式服药或不能按疗程完成治疗，因此患者体内的血药浓度会随着这种不规律的服药而变化起伏。另一方面，临床治疗中还存在着患者自身药物吸收能力欠佳、药物质量低或剂量组合方案不合理等问题，这些又会降低患者体内血药浓度，进一步诱发结核菌产生耐药性。此外，耐药结核菌传播所引发的耐药初始感染也会产生耐药结核病。因此，和结核发病人数下降的成效相比，耐多药结核病(multidrug-resistanttuberculosis，MDR)(指同时对异烟肼和利福平耐药)却呈现严重的流行态势。超级耐药结核又称广泛性耐药结核是2006年年初世界卫生组织和美国CDC首次提出的概念，是指对异烟肼(INH)及利福平(RFP)耐药、并且至少对6种二线抗结核药(氨基糖苷类、多肽类、氟喹喏酮类、硫胺类、环丝氨酸和对氨基水杨酸)中3种药物耐受的结核病。
利福平是利福霉素的半合成衍生物，一直是结核病化疗方案中的一个关键药物。它通过与细菌RNA聚合酶β亚基结合，干扰、抑制细菌的转录过程，实现杀菌效果。rpoB基因是细菌RNA聚合酶β亚基的编码基因，全长3534个碱基，当其中长81个碱基的核心区域——耐利福平决定区(RRDR)发生突变时，使DNA依赖性RNA聚合酶β亚单位酶活性改变，利福平不能与细菌RNA聚合酶β亚单位结合而表现为耐药。
异烟肼的化学结构很简单，由一个吡啶环和一个酰肼基构成，这两个组分都是异烟肼高效杀菌活性所必需的，它的药物作用机制尚未完全明确。目前认为，异烟肼是前体药物，通过被动扩散进入结核分枝杆菌菌体，在菌体内被katG基因编码的过氧化氢-过氧化物酶(catalase/peroxidase，KatG)激活生成异烟碱酰自由基(isonicotinoyl acylradical)，继而与NAD+/NADH偶合形成INH-NADH加合物。加合物首先抑制脂肪酸合成酶系统II中由inhA基因编码的NADH依赖的ACP还原酶(enoyl acyl-carrier protein reductase，InhA)的活性，进而破坏细胞壁关键组分分枝茵酸的合成，导致长链脂肪酸聚集和细菌最终死亡。
到目前为止，除卡介苗外还没有更有效的疫苗可以应用于临床，所以化疗一直是结核病控制的主要手段之一。鉴于新药研发周期很长，因此目前结核病防控的主要手段是快速检测结核病及其耐药性，并在现有药物基础上进行合理治疗，以减少耐药发生和传播。
结核分枝杆菌菌体呈细长杆状，生长缓慢，最适实验条件下分裂一次需16个小时。在人类宿主中，它的生长速率取决于感染部位和机体免疫状态，调控过程涉及毒力因子、基因调节子和代谢酶等一系列不同的基因。
临床上结核病常规细菌学检查方法为涂片镜检法和培养法。结核菌的细胞壁含有大量分枝菌酸，着色后能抵抗酸性乙醇的脱色，所以又称为抗酸杆菌。临床上经典的萋-尼氏染色法就是基于这一特性而建立的。直接对痰标本涂片染色后镜检是检测结核分枝杆菌最简便的手段，但是通常需5000～10000菌/毫升痰液才能得到阳性结果，不能用于识别少菌型结核和肺外结核。
培养法的灵敏度高于镜检法，只需10～100个菌就可得到结果，而且还可以进一步进行菌种鉴定和药敏实验，是结核病诊断的“金标准”。但是由于结核分枝杆菌生长缓慢，世代时间为15～20小时，因此常规的改良罗氏固体培养基需要4～6周才能得到结果，而且阳性率较低。近年来液体快速培养系统如BACTEC MGIT960、ESP II、BacT/ALERT 3D等得到很大发展，能大大缩短培养时间，结核菌阳性检出时间为9～14天，阳性检出率也提高了10％。这三种均为自动非放射性检测系统，操作简便应用较广，但是总体而言，这些快速培养系统还存在易受杂菌污染和检测费用较高等问题。
发明内容
本公开的目的是提供一种快速、准确的检测结核分枝杆菌耐药性的核酸试剂、试剂盒、系统及方法。
为了实现上述目的，本公开第一方面：提供一种用于检测结核分枝杆菌耐药性的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQ IDNO.1-6所示的引物和SEQ ID NO.11-18所示的探针。
可选地，相对于0.5μM的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.2-6所示的引物的含量各自为1.0～1.2μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM和0.9～1.1μM，分别由SEQ ID NO.11-18所示的探针的含量各自为0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM和0.1～0.3μM。
可选地，所述核酸试剂还包括阴性内质控和阳性内质控；
所述阳性内质控含有SEQ ID NO.7-8所示的引物和SEQ ID NO.19所示的探针，所述阴性内质控含有SEQ ID NO.9-10所示的引物和SEQ ID NO.20所示的探针。
可选地，所述核酸试剂包括A管、B管、C管和D管；A管含有SEQ ID NO.1,2,7-10所示的引物和SEQ ID NO.12,15,19,20所示的探针；B管含有SEQ ID NO.1,2,7-10所示的引物和SEQ ID NO.13,16,19,20所示的探针；C管含有SEQ ID NO.1,2,7-10所示的引物和SEQ IDNO.11,14,19,20所示的探针；D管含有SEQ ID NO.3-10所示的引物和SEQ ID NO.17-20所示的探针。
可选地，SEQ ID NO.12-14,17所示的探针具有第一荧光标记；SEQ ID NO.11,15,16,18所示的探针具有第二荧光标记；SEQ ID NO.19所示的探针具有第三荧光标记；SEQ IDNO.20所示的探针具有第四荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记各不相同，且各自独立地选自FAM荧光标记、JOE荧光标记、TAMRA荧光标记和CY5荧光标记中的一种。
可选地，所述结核分枝杆菌耐药性包括结核分枝杆菌利福平耐药性和结核分枝杆菌异烟肼耐药性。
本公开第二方面：提供一种用于检测结核分枝杆菌耐药性的试剂盒，该试剂盒含有本公开第一方面所述的核酸试剂，并且可选地，所述试剂盒还含有反应体系缓冲液、DNA聚合酶、镁离子、dNTP和水中的至少一种。
本公开第三方面：提供本公开第一方面所述的核酸试剂在制备用于检测结核分枝杆菌耐药性的试剂盒中的用途。
本公开第四方面：提供一种用于检测结核分枝杆菌耐药性的系统，该系统包括具有A管检测器、B管检测器、C管检测器和D管检测器的PCR仪、计算装置和输出装置，所述A管检测器、B管检测器、C管检测器和D管检测器分别为装载有上述核酸试剂的核酸试剂储藏容器，所述PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道，所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地为FAM荧光通道、JOE荧光通道、TAMRA荧光通道或CY5荧光通道；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：
若阳性对照和阴性对照成立，则检测结果有效；
若A管第一荧光通道有Tm值为69℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第531位野生型基因，若A管第二荧光通道有Tm值为62℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第513位野生型基因，若A管第三荧光通道有Tm值为62℃对应的熔解峰曲线判定为阳性内质控合格，若A管第四荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定为阴性内质控合格；
若B管第一荧光通道有Tm值为67℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第526位野生型基因，若B管第二荧光通道有Tm值为65℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第511位野生型基因，若B管第三荧光通道有Tm值为62℃对应的熔解峰曲线判定为阳性内质控合格，若B管第四荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定为阴性内质控合格；
若C管第一荧光通道有Tm值为64℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第516位野生型基因，若C管第二荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第533位野生型基因，若C管第三荧光通道有Tm值为62℃对应的熔解峰曲线判定为阳性内质控合格，若C管第四荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定为阴性内质控合格；
若D管第一荧光通道有Tm值为66℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有katG第315位野生型基因，若D管第二荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有inhA第94位野生型基因，若D管第三荧光通道有Tm值为62℃对应的熔解峰曲线判定为阳性内质控合格，若D管第四荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定为阴性内质控合格；
在阳性内质控和阴性内质控合格的前提下，若样品中不含有rpoB第531位野生型基因、rpoB第511位野生型基因、rpoB第526位野生型基因、rpoB第513位野生型基因、rpoB第516位野生型基因和rpoB第533位野生型基因中的至少一种，则判定样品具有结核分枝杆菌利福平耐药性；若样品中不含有katG第315位野生型基因和/或inhA第94位野生型基因，则判定样品具有结核分枝杆菌异烟肼耐药性。
本公开第五方面：提供一种用于检测结核分枝杆菌耐药性的方法，其中，该方法包括：采用上述核酸试剂，对待测样本的DNA进行PCR扩增；进行所述PCR扩增的PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地为FAM荧光通道、JOE荧光通道、TAMRA荧光通道或CY5荧光通道；并且进行如下的判别：
若阳性对照和阴性对照成立，则检测结果有效；
若A管第一荧光通道有Tm值为69℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第531位野生型基因，若A管第二荧光通道有Tm值为62℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第513位野生型基因，若A管第三荧光通道有Tm值为62℃对应的熔解峰曲线判定为阳性内质控合格，若A管第四荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定为阴性内质控合格；
若B管第一荧光通道有Tm值为67℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第526位野生型基因，若B管第二荧光通道有Tm值为65℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第511位野生型基因，若B管第三荧光通道有Tm值为62℃对应的熔解峰曲线判定为阳性内质控合格，若B管第四荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定为阴性内质控合格；
若C管第一荧光通道有Tm值为64℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第516位野生型基因，若C管第二荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第533位野生型基因，若C管第三荧光通道有Tm值为62℃对应的熔解峰曲线判定为阳性内质控合格，若C管第四荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定为阴性内质控合格；
若D管第一荧光通道有Tm值为66℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有katG第315位野生型基因，若D管第二荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有inhA第94位野生型基因，若D管第三荧光通道有Tm值为62℃对应的熔解峰曲线判定为阳性内质控合格，若D管第四荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定为阴性内质控合格；
在阳性内质控和阴性内质控合格的前提下，若样品中不含有rpoB第531位野生型基因、rpoB第511位野生型基因、rpoB第526位野生型基因、rpoB第513位野生型基因、rpoB第516位野生型基因和rpoB第533位野生型基因中的至少一种，则判定样品具有结核分枝杆菌利福平耐药性；若样品中不含有katG第315位野生型基因和/或inhA第94位野生型基因，则判定样品具有结核分枝杆菌异烟肼耐药性。
本公开的有益效果在于：
本公开通过ParaDNA及Hybeacon探针技术检测结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB第533、531、526、516、513和511位、异烟肼耐药基因KatG315位、inhA第94位和aphC，能够实现形态学、免疫学及RT-PCR检测所无法完成的快速、全面、敏感、特异、自动的结果判定，达到如下的检测效果：
(一)较高的多重检测能力
本公开所建立的检测方法可以一次性检测结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB第533、531、526、516、513和511位、异烟肼耐药基因KatG 315位、inhA第94位和aphC九种目标，检测流程简单，结果自动判读且可靠，节省了时间、人力和物力成本。
(二)简易的操作环节
病人痰液样本液化后可通过采样器直接放置于ParaDNA的反应器中检测即可获得可靠的结果，避免了费时费力的样本提取步骤，实现了除专业实验室外的应急检测。
(三)较高程度的检测一体化
本公开提供了一套全面、快速、准确及操作简便的检测结核分枝杆菌利福平、异烟肼耐药基因的一体化解决方案，包括了核酸的快速提取、荧光PCR扩增及自动化结果的判定。
(四)特异性好
Hybeacon探针可识别引物结合区的SNP，使得其对非检测目标有极强的辨识能力。本公开所建立的检测方法特异性体现在一整套引物探针的特异性：所有引物探针都经过blast比对分析，具有高度的保守性和特异性；同时经过特异性实验验证能够很好的区分萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、土地分枝杆菌、次要分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、戈登分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、鸟分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、苏加分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、偶然分枝杆菌、胃分枝杆菌、胞内分枝杆菌、草分枝杆菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌、隐球菌、金黄色葡萄球菌、诺卡氏菌、绿脓杆菌、白色念珠菌等其他分枝杆菌和其他病原体。
(五)最低检出限
本公开所建立的检测方法的最低检出限可达到10拷贝/反应。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开第一方面：提供一种用于检测结核分枝杆菌耐药性的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQ ID NO.1-6所示的引物和SEQID NO.11-18所示的探针。
本公开通过ParaDNA及Hybeacon探针技术检测结核分枝杆菌耐药性，避免了涂片、培养及RT-PCR检测等方法操作时间长及操作繁琐，能够快速、准确、高通量的并行检测结核分枝杆菌福平耐药性和菌异烟肼耐药性。
Hybeacon探针技术对探针的要求较高，探针的Tm值尤为重要；此外，探针与引物的组合效果对扩增效果也有重要的影响。上述引物和探针在设计过程中，不仅考虑到了不同目标基因的引物和探针在一个反应体系内共扩增的问题，即评估Tm值、目标对应探针的Tm值的差值、GC含量、避免出现发夹结构及二聚体等情况，而且要保证备选引物和探针区段分别能够全面覆盖上述多种肠道病毒，特异性良好并且覆盖度高。
进一步地，相对于0.5μM的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.2-6所示的引物的含量各自可以为1.0～1.2μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM和0.9～1.1μM，分别由SEQ ID NO.11-18所示的探针的含量各自可以为0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM和0.1～0.3μM。根据本公开，为做好质量控制，所述核酸试剂还可以包括阴性内质控和阳性内质控。进一步地，所述阳性内质控含有SEQ ID NO.7-8所示的引物和SEQ ID NO.19所示的探针，所述阴性内质控含有SEQ IDNO.9-10所示的引物和SEQ ID NO.20所示的探针。这时，相对于0.5μM的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.7-10所示的引物的含量各自可以为0.5～1.0μM、0.1～0.5μM、0.5～1.0μM和0.1～0.5μM，分别由SEQ ID NO.19-20所示的探针的含量各自可以为0.1～0.3μM和0.1～0.3μM。过加入所述阴性内质控和阳性内质控，既能够准确鉴定结核分枝杆菌，避免造成假阳性的耐药结果；同时可以有效地提示因为操作失误、PCR抑制物等原因造成的假阴性检测结果。
根据本公开，为了增强检测结果的准确性，所述核酸试剂可以分为四管，即所述核酸试剂可以包括A管、B管、C管和D管。其中，A管可以含有SEQ ID NO.1,2,7-10所示的引物和SEQ ID NO.12,15,19,20所示的探针；B管可以含有SEQ ID NO.1,2,7-10所示的引物和SEQID NO.13,16,19,20所示的探针；C管可以含有SEQ ID NO.1,2,7-10所示的引物和SEQ IDNO.11,14,19,20所示的探针；D管可以含有SEQ ID NO.3-10所示的引物和SEQ ID NO.17-20所示的探针。
进一步地，可以根据探针各自的Tm值进行荧光标记的排列组合，使得同一体系中的不同探针的扩增被分别识别。例如，作为一种实施方式，SEQ ID NO.12-14,17所示的探针具有第一荧光标记；SEQ ID NO.11,15,16,18所示的探针具有第二荧光标记；SEQ ID NO.19所示的探针具有第三荧光标记；SEQ ID NO.20所示的探针具有第四荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记各不相同，且各自独立地选自FAM荧光标记、JOE荧光标记、TAMRA荧光标记和CY5荧光标记中的一种。作为一种特别优选的实施方式，SEQ ID NO.12-14,17所示的探针具有FAM荧光标记；SEQ ID NO.11,15,16,18所示的探针具有JOE荧光标记；SEQ ID NO.19所示的探针具有TAMRA荧光标记；SEQ IDNO.20所示的探针具有CY5荧光标记。为了增强溶解峰效果，上述目标探针均可为双标记探针。探针中FAM为6-羧基荧光素，JOE为2,7-二甲基-4,5二氯-6-羧基荧光素，TAMRA为6-羧基四甲基罗丹明，CY5为5H-吲哚菁。
根据本公开，所述结核分枝杆菌耐药性可以包括结核分枝杆菌利福平耐药性和结核分枝杆菌异烟肼耐药性。
本公开第二方面：提供一种用于检测结核分枝杆菌耐药性的试剂盒，该试剂盒含有本公开第一方面所述的核酸试剂，并且可选地，所述试剂盒还含有反应体系缓冲液、DNA聚合酶、镁离子、dNTP和水中的至少一种。
本公开的试剂盒能够实现快速、准确、敏感、特异、自动的检测结果判定，显著提高了对结核分枝杆菌福平耐药性和结核分枝杆菌异烟肼耐药性进行检测的敏感性、特异性和简便性。
本公开第三方面：提供本公开第一方面所述的核酸试剂在制备用于检测结核分枝杆菌耐药性的试剂盒中的用途。
本公开第四方面：提供一种用于检测结核分枝杆菌耐药性的系统，该系统包括具有A管检测器、B管检测器、C管检测器和D管检测器的PCR仪、计算装置和输出装置，所述A管检测器、B管检测器、C管检测器和D管检测器分别为装载有上述包括A管、B管、C管和D管的核酸试剂的核酸试剂储藏容器，所述PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道，所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地为FAM荧光通道、JOE荧光通道、TAMRA荧光通道或CY5荧光通道；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：
若阳性对照和阴性对照成立，则检测结果有效；
若A管第一荧光通道有Tm值为69℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第531位野生型基因，若A管第二荧光通道有Tm值为62℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第513位野生型基因，若A管第三荧光通道有Tm值为62℃对应的熔解峰曲线判定为阳性内质控合格，若A管第四荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定为阴性内质控合格；
若B管第一荧光通道有Tm值为67℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第526位野生型基因，若B管第二荧光通道有Tm值为65℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第511位野生型基因，若B管第三荧光通道有Tm值为62℃对应的熔解峰曲线判定为阳性内质控合格，若B管第四荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定为阴性内质控合格；
若C管第一荧光通道有Tm值为64℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第516位野生型基因，若C管第二荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第533位野生型基因，若C管第三荧光通道有Tm值为62℃对应的熔解峰曲线判定为阳性内质控合格，若C管第四荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定为阴性内质控合格；
若D管第一荧光通道有Tm值为66℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有katG第315位野生型基因，若D管第二荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有inhA第94位野生型基因，若D管第三荧光通道有Tm值为62℃对应的熔解峰曲线判定为阳性内质控合格，若D管第四荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定为阴性内质控合格；上述野生型基因是指未发生突变的基因，即非突变型基因，不具有结核分枝杆菌耐药性。换句话说，当上述野生型基因发生突变，形成突变型基因后，在荧光通道中无法检测到具有上述Tm值对应的熔解峰，那么就可以认为样品具有结核分枝杆菌耐药性。因此，所述处理器可进一步实现如下的判别：在阳性内质控和阴性内质控合格的前提下，若样品中不含有rpoB第531位野生型基因、rpoB第511位野生型基因、rpoB第526位野生型基因、rpoB第513位野生型基因、rpoB第516位野生型基因和rpoB第533位野生型基因中的至少一种，即，样品中含有rpoB第531位突变型基因、rpoB第511位突变型基因、rpoB第526位突变型基因、rpoB第513位突变型基因、rpoB第516位突变型基因和rpoB第533位突变型基因中的至少一种，则判定样品具有结核分枝杆菌利福平耐药性；若样品中不含有katG第315位野生型基因和/或inhA第94位野生型基因，即，样品中含有katG第315位突变型基因和/或inhA第94位突变型基因，则判定样品具有结核分枝杆菌异烟肼耐药性。
本公开第五方面：提供一种用于检测结核分枝杆菌耐药性的方法，其中，该方法包括：采用上述包括A管、B管、C管和D管的核酸试剂，对待测样本的DNA进行PCR扩增；进行所述PCR扩增的PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地为FAM荧光通道、JOE荧光通道、TAMRA荧光通道或CY5荧光通道；并且进行如下的判别：
若阳性对照和阴性对照成立，则检测结果有效；
若A管第一荧光通道有Tm值为69℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第531位野生型基因，若A管第二荧光通道有Tm值为62℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第513位野生型基因，若A管第三荧光通道有Tm值为62℃对应的熔解峰曲线判定为阳性内质控合格，若A管第四荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定为阴性内质控合格；
若B管第一荧光通道有Tm值为67℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第526位野生型基因，若B管第二荧光通道有Tm值为65℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第511位野生型基因，若B管第三荧光通道有Tm值为62℃对应的熔解峰曲线判定为阳性内质控合格，若B管第四荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定为阴性内质控合格；
若C管第一荧光通道有Tm值为64℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第516位野生型基因，若C管第二荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第533位野生型基因，若C管第三荧光通道有Tm值为62℃对应的熔解峰曲线判定为阳性内质控合格，若C管第四荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定为阴性内质控合格；
若D管第一荧光通道有Tm值为66℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有katG第315位野生型基因，若D管第二荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有inhA第94位野生型基因，若D管第三荧光通道有Tm值为62℃对应的熔解峰曲线判定为阳性内质控合格，若D管第四荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定为阴性内质控合格；上述野生型基因是指未发生突变的基因，即非突变型基因，不具有结核分枝杆菌耐药性。换句话说，当上述野生型基因发生突变，形成突变型基因后，在荧光通道中无法检测到具有上述Tm值对应的熔解峰，那么就可以认为样品具有结核分枝杆菌耐药性。因此，所述处理器可进一步实现如下的判别：在阳性内质控和阴性内质控合格的前提下，若样品中不含有rpoB第531位野生型基因、rpoB第511位野生型基因、rpoB第526位野生型基因、rpoB第513位野生型基因、rpoB第516位野生型基因和rpoB第533位野生型基因中的至少一种，即，样品中含有rpoB第531位突变型基因、rpoB第511位突变型基因、rpoB第526位突变型基因、rpoB第513位突变型基因、rpoB第516位突变型基因和rpoB第533位突变型基因中的至少一种，则判定样品具有结核分枝杆菌利福平耐药性；若样品中不含有katG第315位野生型基因和/或inhA第94位野生型基因，即，样品中含有katG第315位突变型基因和/或inhA第94位突变型基因，则判定样品具有结核分枝杆菌异烟肼耐药性。
其中，所述待测样本可以为病人痰液样本，所述PCR扩增的条件可以为：98℃，60s，(98℃，5s，58℃，5s，72℃，5s，49个循环)；溶解曲线分析：98℃，60s，35℃，60s，降率为1.0℃/s；80℃，5s，升率为0.5℃/s，该阶段收集荧光。
本公开的方法能快速敏感特异地实现结核分枝杆菌利福平耐药基因和异烟肼耐药基因的系统筛检，检测流程简单，结果自动判读且可靠，节省了时间、人力和试剂成本。
以下通过实施例进行进一步详细说明本公开，但是本公开并不因此受到任何限制。
以下实施例中试剂均为商购产品，引物、探针均在Biosearch(USA)公司合成。
实施例
1、引物、探针合成
按照表1所示的引物序列和表2所示的探针序列，进行序列合成。探针中FAM为6-羧基荧光素，JOE为2,7-二甲基-4,5二氯-6-羧基荧光素、TAMRA为6-羧基四甲基罗丹明、CY5为5H-吲哚菁。表2的探针序列中的括号表示括号左侧的t具有荧光标记，括号中的内容表示荧光标记的选择。
表1
Figure BDA0001916064710000151
表2
检测目标 探针序列 Tm值(℃) SEQ ID NO
rpoB 533 g t(joe)cccag t(joe)gccgccagtc 60 11
rpoB 531 ag t(fam)gccg t(fam)ctgtcggcgct 69 12
rpoB 526 cggg t(fam)tgttc t(fam)ggtccatgaatt 67 13
rpoB 516 cggg t(fam)tgttc t(fam)ggtccatgaatt 64 14
rpoB 513 ag t(joe)cagc t(joe)gagccaattcatg 62 15
rpoB 511 gt(joe)cagt(joe)cagctgagccaattc 65 16
KatG 315 gt(fam)cgcgat(fam)caccagcggcatc 66 17
inhA 94 gt(joe)caat(joe)acacccgcagccag 60 18
IS1081 agt(tamra)gcacacc t(tamra)tgatcgccac 62 19
RNaseP gt(cy5)tctgacc t(cy5)gaaggctct 60 20
2、样本处理
常规方法采集病人痰液痰液样本后，用NaOH将痰液液化处理。
使用与ParaDNA配套的采样器采集处理后的痰液样本，直接置于ParaDNA的反应器中即可扩增。
3、构建Hybeacon探针技术检测体系
聚合酶Phire Hot Start II DNA Polymerase(货号F122L)，Mg2+、dNTPS购自ThermoFisher公司，其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯；荧光检测仪为ParaDNA。
按照如下操作配制反应体系：总体系30μL，缓冲液6μL，包括1.2μL的聚合酶，1mM的dNTP，10-105拷贝/μL的DNA模板，上游引物的最终使用浓度为500nM，下游引物最终使用浓度为1μM，每条探针的最终使用浓度各自为200nM。
试剂盒分为A管、B管、C管和D管4个反应管，A管含有上表1中SEQ ID NO.1,2,7-10所示的引物和上表2中SEQ ID NO.12,15,19,20所示的探针；B管含有上表1中SEQ ID NO.1,2,7-10所示的引物和上表2中SEQ ID NO.13,16,19,20所示的探针；C管含有上表1中SEQ IDNO.1,2,7-10所示的引物和上表2中SEQ ID NO.11,14,19,20所示的探针；D管含有上表1中SEQ ID NO.3-10所示的引物和上表2中SEQ ID NO.17-20所示的探针。
将PCR管放入荧光定量PCR仪中，选择FAM、JOE、TARMA、CY5作为报告基团，反应程序如下：98℃，60s，(98℃，5s，58℃，5s，72℃，5s，49个循环)；溶解曲线分析：98℃，60s，35℃，60s，降率为1.0℃/s；80℃，5s，升率为0.5℃/s，该阶段收集荧光。
反应结果判断：若阳性对照和阴性对照成立，则检测结果有效；
若A管FAM荧光通道有Tm值为69℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第531位野生型基因，若A管JOE荧光通道有Tm值为62℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第513位野生型基因，若A管TARMA荧光通道有Tm值为62℃对应的熔解峰曲线判定为阳性内质控合格，若A管CY5荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定为阴性内质控合格；
若B管FAM荧光通道有Tm值为67℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第526位野生型基因，若B管JOE荧光通道有Tm值为65℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第511位野生型基因，若B管TARMA荧光通道有Tm值为62℃对应的熔解峰曲线判定为阳性内质控合格，若B管CY5荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定为阴性内质控合格；
若C管FAM荧光通道有Tm值为64℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第516位野生型基因，若C管JOE荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第533位野生型基因，若C管TARMA荧光通道有Tm值为62℃对应的熔解峰曲线判定为阳性内质控合格，若C管CY5荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定为阴性内质控合格；
若D管FAM荧光通道有Tm值为66℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有katG第315位野生型基因，若D管JOE荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有inhA第94位野生型基因，若D管TARMA荧光通道有Tm值为62℃对应的熔解峰曲线判定为阳性内质控合格，若D管CY5荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定为阴性内质控合格；
在阳性内质控和阴性内质控合格的前提下，若样品中不含有rpoB第531位野生型基因、rpoB第511位野生型基因、rpoB第526位野生型基因、rpoB第513位野生型基因、rpoB第516位野生型基因和rpoB第533位野生型基因中的至少一种，则判定样品具有结核分枝杆菌利福平耐药性；若样品中不含有katG第315位野生型基因和/或inhA第94位野生型基因，则判定样品具有结核分枝杆菌异烟肼耐药。
4、特异性验证
选择堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、土地分枝杆菌、次要分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、戈登分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、鸟分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、苏加分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、偶然分枝杆菌、胃分枝杆菌、胞内分枝杆菌、草分枝杆菌样本和其他病原体如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌、隐球菌、金黄色葡萄球菌、诺卡氏菌、绿脓杆菌、白色念珠菌(中国疾病预防控制中心细菌病预防控制所提供)作为特异性评估样本，采用系统检测中的采样器采集痰液(液化)样本后，利用前期建立和优化的反应条件在ParaDNA上进行检测。
结果显示在阳性对照成立的条件下，待检目标均无特异性的溶解峰，表明本公开的核酸试剂能够有效区分检测目标与非检测目标，具有较好的特异性。
5、最低检出限验证
评估用检测样本：选取初始浓度为105拷贝/μL的利福平耐药基因rpoB、异烟肼耐药基因KatG 315位、inhA第94位和aphC核酸梯度稀释为104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL、101拷贝/μL、100拷贝/μL，作为最低检出限评估的模板。
结果显示本公开试剂盒检测目标耐药基因的最低检出限均可达到10拷贝/反应。
6、覆盖度验证
选择500株评价用阳性痰液样本作为覆盖度评估用模板。按照以上所述反应体系及反应程序进行试验。
结果显示对所有样本均可覆盖检测出。
7、试剂盒的保存期试验
以100拷贝/μL的rpoB第533、531、526、516、513和511位突变、异烟肼耐药基因KatG315位突变和inhA第94位突变临床样本作为评估用样本。
在第0天时，分装成10份冻存于-70℃冰箱中。将组建完毕的试剂盒放置于-20℃保存，分别取0、10、15、30、60、90、120、150、180和360天的试剂盒进行保存期试验。
结果显示本公开试剂盒保存在-20℃冰箱，在不同保存期检测均为阳性，表明该试剂盒的保存期至少为一年。
对比例
1、引物、探针合成
按照表3和表4所示的引物、探针序列，进行序列合成。JOE为2,7-二甲基-4,5二氯-6-羧基荧光素、TAMRA为6-羧基四甲基罗丹明、CY5为5H-吲哚菁。表4的探针序列中的括号表示括号左侧的t具有荧光标记，括号中的内容表示荧光标记的选择。
表3
Figure BDA0001916064710000191
表4
检测目标 探针序列 Tm值(℃) SEQ ID NO
rpoB 533 c t(joe)g t(joe)cggcgctggggc 64 31
rpoB 531 gcg t(fam)cgac t(fam)gtcggcgct 66 32
rpoB 526 c t(fam)gtcggggt t(fam)gacccacaagcgc 64 33
rpoB 516 gg t(fam)tgttc t(fam)ggtccatgaatt 68 34
rpoB 513 cc t(joe)gccagc t(joe)gagccaattcat 67 35
rpoB 511 ggc t(joe)gcc t(joe)gctgagccaatt 60 36
KatG 315 g t(fam)cgcga t(fam)caccagcggcatc 65 37
inhA 94 gcg t(joe)caa t(joe)acacccgcagccag 60 38
IS1081 ag t(cy5)gcacacc t(cy5)tgatcgc 60 39
RNaseP cct(cy5)gaaggctct(cy5)gcgcggact 60 40
2、特异性验证
按照实施例的方法进行特异性验证。结果显示，对比例的引物、探针的反应结果均为阴性。
3、最低检出限验证
按照实施例的方法进行最低检出限验证。实施例与对比例的最低检出限对比如下表5。
表5
检测目标 实施例 对比例
rpoB 533 10拷贝/反应 100拷贝/反应
rpoB 531 10拷贝/反应 100拷贝/反应
rpoB 526 10拷贝/反应 100拷贝/反应
rpoB 516 10拷贝/反应 100拷贝/反应
rpoB 513 10拷贝/反应 100拷贝/反应
rpoB 511 10拷贝/反应 100拷贝/反应
KatG 315 10拷贝/反应 100拷贝/反应
inhA 94 10拷贝/反应 100拷贝/反应
ahpC 10拷贝/反应 100拷贝/反应
由表5可知，对于样本中痕量的rpoB第533、531、526、516、513和511位、异烟肼耐药基因KatG 315位和inhA第94位的核酸，本公开试剂盒比对比例有更强的检测能力。
4、覆盖度验证
按照实施例的方法进行覆盖度验证。实施例与对比例的覆盖度对比如下表6。
表6
检测目标 实施例 对比例
rpoB 533 30 24
rpoB 531 100 89
rpoB 526 80 72
rpoB 516 70 60
rpoB 513 30 20
rpoB 511 20 13
KatG 315 100 91
inhA 94 70 58
由表6可知，本公开试剂盒的检测覆盖度远远大于对比例的检测覆盖度。
由实施例和对比例的对比可以看出，本公开可以检测出结核分枝杆菌利福平耐药基因和异烟肼耐药基因，特异性高，最低检出限更低，覆盖度更广。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司
<120> 用于检测结核分枝杆菌耐药性的核酸试剂、试剂盒、系统及方法
<130> 12328ABT
<160> 40
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atcaaggagt tcttcggca 19
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tagtgcgacg ggtgca 16
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caccggaacc ggtaa 15
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaaactgttg tcccattt 18
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
catacctgct gcgcaattcg ta 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtgacgtttg tcggtgtgac tc 22
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tataccttcc tcgccgccga 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acctggatgc ccaggatctc t 21
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tttggacctg cgagcg 16
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gagcggctgt ctccacaagt 20
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtcccagtgc cgccagtc 18
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agtgccgtct gtcggcgct 19
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgggttgttc tggtccatga att 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgggttgttc tggtccatga att 23
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agtcagctga gccaattcat g 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtcagtcagc tgagccaatt c 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gtcgcgatca ccagcggcat c 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gtcaatacac ccgcagccag 20
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
agtgcacacc ttgatcgcca c 21
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gttctgacct gaaggctct 19
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tcgccgcgat caaggagtt 19
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ggcacgctca cgtgacaga 19
<210> 23
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gctggaagag ctcgtat 17
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ccatttcgtc ggggtgtt 18
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
catacctgct gcgcaatt 18
<210> 26
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tttgtcggtg tgactc 16
<210> 27
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tataccttcc tcgccgc 17
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tggatgccca ggatctct 18
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
atggcggtgt ttgcagattt 20
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gattgatagc aacaactgaa tagccaa 27
<210> 31
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ctgtcggcgc tggggc 16
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gcgtcgactg tcggcgct 18
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ctgtcggggt tgacccacaa gcgc 24
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ggttgttctg gtccatgaat t 21
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cctgccagct gagccaattc at 22
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ggctgcctgc tgagccaatt 20
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gtcgcgatca ccagcggcat c 21
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gcgtcaatac acccgcagcc ag 22
<210> 39
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
agtgcacacc ttgatcgc 18
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cctgaaggct ctgcgcggac t 21

Claims (7)

1.一种用于检测结核分枝杆菌耐药性的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括按照如下组合存放的SEQ ID NO.1-6所示的引物和SEQ ID NO.11-18所示的Hybeacon探针；
所述核酸试剂还包括阴性内质控和阳性内质控；
所述阳性内质控含有SEQ ID NO.7-8所示的引物和SEQ ID NO.19所示的Hybeacon探针，所述阴性内质控含有SEQ ID NO.9-10所示的引物和SEQ ID NO.20所示的Hybeacon探针；
所述核酸试剂包括A管、B管、C管和D管；A管含有SEQ ID NO.1,2,7-10所示的引物和SEQID NO.12,15,19,20所示的Hybeacon探针；B管含有SEQ ID NO.1,2,7-10所示的引物和SEQID NO.13,16,19,20所示的Hybeacon探针；C管含有SEQ ID NO.1,2,7-10所示的引物和SEQID NO.11,14,19,20所示的Hybeacon探针；D管含有SEQ ID NO.3-10所示的引物和SEQ IDNO.17-20所示的Hybeacon探针；
SEQ ID NO.12-14,17所示的Hybeacon探针具有第一荧光标记；SEQ ID NO.11,15,16,18所示的Hybeacon探针具有第二荧光标记；SEQ ID NO.19所示的Hybeacon探针具有第三荧光标记；SEQ ID NO.20所示的Hybeacon探针具有第四荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记各不相同，且各自独立地选自FAM荧光标记、JOE荧光标记、TAMRA荧光标记和CY5荧光标记中的一种。
2.根据权利要求1所述的核酸试剂，其中，相对于0.5μM的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.2-6所示的引物的含量各自为1.0~1.2μM、0.4~0.6μM、0.9~1.1μM、0.4~0.6μM和0.9~1.1μM，分别由SEQ ID NO.11-18所示的Hybeacon探针的含量各自为0.1~0.3μM、0.1~0.3μM、0.1~0.3μM、0.1~0.3μM、0.1~0.3μM、0.1~0.3μM、0.1~0.3μM和0.1~0.3μM。
3.根据权利要求1~2中任意一项所述的核酸试剂，其中，所述结核分枝杆菌耐药性包括结核分枝杆菌利福平耐药性和结核分枝杆菌异烟肼耐药性。
4.一种用于检测结核分枝杆菌耐药性的试剂盒，该试剂盒含有权利要求1~3中任意一项所述的核酸试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还含有反应体系缓冲液、DNA聚合酶、镁离子、dNTP和水中的至少一种。
6.权利要求1~3中任意一项所述的核酸试剂在制备用于检测结核分枝杆菌耐药性的试剂盒中的用途。
7.一种用于检测结核分枝杆菌耐药性的系统，该系统包括具有A管检测器、B管检测器、C管检测器和D管检测器的PCR仪、计算装置和输出装置，所述A管检测器、B管检测器、C管检测器和D管检测器分别为装载有权利要求1~2中任意一项所述的A管、B管、C管和D管核酸试剂的核酸试剂储藏容器，所述PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道，所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地为FAM荧光通道、JOE荧光通道、TAMRA荧光通道或CY5荧光通道；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：
若阳性对照和阴性对照成立，则检测结果有效；
若A管第一荧光通道有Tm值为69℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第531位野生型基因，若A管第二荧光通道有Tm值为62℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第513位野生型基因，若A管第三荧光通道有Tm值为62℃对应的熔解峰曲线判定为阳性内质控合格，若A管第四荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定为阴性内质控合格；
若B管第一荧光通道有Tm值为67℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第526位野生型基因，若B管第二荧光通道有Tm值为65℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第511位野生型基因，若B管第三荧光通道有Tm值为62℃对应的熔解峰曲线判定为阳性内质控合格，若B管第四荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定为阴性内质控合格；
若C管第一荧光通道有Tm值为64℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第516位野生型基因，若C管第二荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有rpoB第533位野生型基因，若C管第三荧光通道有Tm值为62℃对应的熔解峰曲线判定为阳性内质控合格，若C管第四荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定为阴性内质控合格；
若D管第一荧光通道有Tm值为66℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有katG第315位野生型基因，若D管第二荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定样品中含有inhA第94位野生型基因，若D管第三荧光通道有Tm值为62℃对应的熔解峰曲线判定为阳性内质控合格，若D管第四荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线判定为阴性内质控合格；
在阳性内质控和阴性内质控合格的前提下，若样品中不含有rpoB第531位野生型基因、rpoB第511位野生型基因、rpoB第526位野生型基因、rpoB第513位野生型基因、rpoB第516位野生型基因和rpoB第533位野生型基因中的至少一种，则判定样品具有结核分枝杆菌利福平耐药性；若样品中不含有katG第315位野生型基因和/或inhA第94位野生型基因，则判定样品具有结核分枝杆菌异烟肼耐药性。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110791577A (zh) * 2019-10-25 2020-02-14 中山大学达安基因股份有限公司 一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变基因的试剂盒及方法
CN112941210A (zh) * 2021-02-07 2021-06-11 中山大学达安基因股份有限公司 结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变检测试剂盒及方法
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CN117187425B (zh) * 2023-11-03 2024-02-20 迪飞医学科技(南京)有限公司 As-rapid结核耐药双联检测引物探针组、试剂盒以及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101845503A (zh) * 2010-06-10 2010-09-29 无锡锐奇基因生物科技有限公司 检测耐药结核分支杆菌(mdr-tb)的方法和试剂盒
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Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101845503A (zh) * 2010-06-10 2010-09-29 无锡锐奇基因生物科技有限公司 检测耐药结核分支杆菌(mdr-tb)的方法和试剂盒
CN107002146A (zh) * 2014-12-18 2017-08-01 豪夫迈·罗氏有限公司 用于检测耐药性结核分枝杆菌的组合物和方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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探针熔解曲线法快速检测结核分枝杆菌利福平、异烟肼、乙胺丁醇及链霉素耐药突变;严虹等;《临床检验杂志》;20151028;第729-733页 *

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